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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-02
(45)【発行日】2023-02-10
(54)【発明の名称】ポルフィリン錯体
(51)【国際特許分類】
C07D 487/22 20060101AFI20230203BHJP
A61K 31/409 20060101ALI20230203BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20230203BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20230203BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230203BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230203BHJP
C08B 30/20 20060101ALI20230203BHJP
C08B 37/00 20060101ALI20230203BHJP
【ＦＩ】
C07D487/22
A61K31/409
A61K41/00
A61K47/61
A61K49/00
A61P35/00
C08B30/20
C08B37/00 A
C08B37/00 D
C08B37/00 Q
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2019030928
(22)【出願日】2019-02-22
(65)【公開番号】P2020132596
(43)【公開日】2020-08-31
【審査請求日】2021-12-14
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001427
【氏名又は名称】弁理士法人前田特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】池田 篤志
【審査官】伊佐地 公美
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０９２２２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】船田 陸師、等，β-グルカンによるポルフィリン誘導体の水溶化と光線力学活性，日本化学会第９８春季年会 講演予稿集，2018年，2 PB-048
【文献】ACS Medicinal Chemistry Letters，2017年，Vol. 8，pp. 555-559
【文献】Angewandte Chemie, International Edition ，2017年，Vol. 56，pp. 15279-15283
【文献】Chemical Communications，2018年，Vol. 54，pp. 13829-13832
【文献】Organic & Biomolecular Chemistry，2019年，Vol. 17，pp. 3141-3149
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ０８Ｂ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（２）で表されるポルフィリンと多糖類とから構成され、上記多糖類は、グルカン、カラギーナン、プルラン及びタマリンドガムよりなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
上記ポルフィリンは、上記多糖類に包接されていることを特徴とするポルフィリン錯体。
【化2】
【請求項2】
上記ポルフィリンは、上記多糖類に包接されていることにより、可視光を照射されたときに水溶液中において蛍光を発しない一方、細胞内においては蛍光を発することを特徴とする請求項１に記載のポルフィリン錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポルフィリン錯体に関する。
【背景技術】
【0002】
光線力学的療法（Photo Dynamic Therapy：ＰＤＴ）は、光増感剤を投与してがん細胞等に集積させ、光励起によって活性酸素種を生成させることによって、がん細胞等を壊死させる治療方法である。正常な細胞に影響を与えるおそれが少ないことから、近年非常に注目されている。
【0003】
ところで、分子全体に共役が広がっているポルフィリンは、可視領域の光を吸収して蛍光を発する特性があり、光を照射することによって溶存酸素を活性酸素に変換することができる。さらには、生体細胞への特異的な集積性を有するため、これらの特性を活かして、ポルフィリン誘導体を光増感剤としてＰＤＴに利用する研究が盛んにされており、既に認可を受けて市販されているものもある。
【0004】
しかし、従来の光増感剤は、特定の細胞への集積が不十分であることや、細胞外において可視光の照射によってエネルギーを受け渡し、活性酸素を発生させてしまうおそれがあり、これにより、血管やリンパ節等を傷つけてしまうおそれがあった。また、ポルフィリンは水に溶かすと容易に自己集合し、不溶化してしまう特性があるため、いかに水溶性を付与させるかという課題もある。そのため、水溶液中で安定し、かつ、細胞内でのみ高い活性を示す光増感剤のさらなる開発が求められている。
【0005】
特許文献１では、正常組織からの排出速度が速く、光毒性を低減させた光増感剤としてのポルフィリン誘導体が開示されており、特許文献２では、生体内の環境に応答して、抗酸化活性を向上させることのできるポルフィリン誘導体が開示されている。
【0006】
これらのポルフィリン誘導体は、ポルフィリン骨格へ様々な置換基を導入することよって光増感剤としての特性を制御しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特許第３７１８８８７号公報
【文献】特許第６４４４２１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
このように、特殊な置換基をポルフィリンへ導入する研究は多くされているものの、新たなメカニズムで蛍光のオン－オフを切り替えることが可能なポルフィリンの開発が要求されており、それが開発されれば、光線力学療法だけでなく、生化学分野で広く用いられる細胞マーカーの分野において、大きなブレイクスルーになりうることとなる。
【0009】
そこで、本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的は、水中で安定かつ細胞外では蛍光を発せず、細胞内において蛍光を発して細胞死を起こすことが可能なポルフィリン錯体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記目的を達成するために、本発明のポルフィリン錯体は、下記式（１）で表されるポ
ルフィリンと多糖類とから構成され、上記ポルフィリンは、多糖類に包接されていることを特徴とする。
ルフィリンと多糖類とから構成され、上記ポルフィリンは、多糖類に包接されていることを特徴とする。
【0011】
【化1】
【0012】
また、本発明のポルフィリン錯体は、下記式（２）で表されるポルフィリンと多糖類とから構成され、上記ポルフィリンは、多糖類に包接されていることを特徴とするものでもよい。
【0013】
【化2】
【0014】
また、上記多糖類は、グルカン、カラギーナン、プルラン及びタマリンドガムよりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする。
【0015】
そして、上記ポルフィリンは、上記多糖類に包接されていることにより、可視光を照射されたときに水溶液中において蛍光を発しない一方、細胞内においては蛍光を発することを特徴とする。
【発明の効果】
【0016】
本発明のポルフィリン錯体によれば、水中では安定で蛍光を発しないが、細胞内では蛍光を発して細胞死を起こすことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のスペクトルを含む紫外可視吸収スペクトルデータである。
【図2】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のスペクトルを含む蛍光スペクトルデータである。
【図3】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のスペクトルを含む１ＨＮＭＲスペクトルデータである。
【図4】本発明の実施例１および比較例１に係るポルフィリン錯体をそれぞれ添加した際のＨｅＬａ細胞の位相差像と蛍光像を示す画像である。
【図5】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のリポソーム存在下におけるスペクトルを含む紫外可視吸収スペクトルデータである。
【図6】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のリポソーム存在下におけるスペクトルを含む蛍光スペクトルデータである。
【図7】本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体のリポソーム存在下における一重項酸素発生能を示すグラフである。
【図8A】暗所において本発明の実施例１に係るポルフィリン錯体をＨｅＬａ細胞へ添加した際の細胞生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の実施形態に係るポルフィリン錯体は、ポルフィリンと多糖類とを高速振動粉砕によって粉砕混合することにより得られるものであり、多糖類によって形成される会合体の中空内部にポルフィリンが包接されて錯体を形成したものである。
【0019】
ポルフィリン錯体を構成するポルフィリンとしては、例えば、下記式（３）乃至（８）で表される化合物を用いることが可能である。
【0020】
【化3】
【0021】
【化4】
【0022】
【化5】
【0023】
【化6】
【0024】
【化7】
【0025】
【化8】
【0026】
式（３）で表されるポルフィリンは、５，１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリンであり、式（１）においてＸが全てアミノ基で置換されたものである。以下、ＴＡＰＰと記載することがある。式（４）で表されるポルフィリンは、５，１０，１５，２０－テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）ポルフィリンであり、式（１）においてＸが全てヒドロキシ基で置換されたものである。以下、ＴＨＰＰと記載することがある。式（５）で表されるポルフィリンは、（５－（４－カルボキシフェニル）－１０，１５，２０－トリフェニルポルフィリン）であり、式（１）においてフェニル基上のＸのうち３つが水素原子であり、１つがカルボキシ基で置換されたものである。以下、ＴＣＰＰ１と記載することがある。
【0027】
また、式（６）で表されるポルフィリンは（１０，２０－ジフェニル－５，１５－ジアザポルフィリン）であり、式（２）においてＹを全て水素原子としたものである。以下、Ｐｈ－ＤＡＰと記載することがある。式（７）で表されるポルフィリンは（１０，２０－ビス（４－ヒドロキシフェニル）－５，１５－ジアザポルフィリン）であり、式（２）においてパラ位のＹがそれぞれヒドロキシ基で置換されたものである。以下、４－ＯＨ－ＤＡＰと記載することがある。式（８）で表されるポルフィリンは（１０，２０－ビス（３，５－ジメトキシフェニル）－５，１５－ジアザポルフィリン）であり、式（２）においてメタ位のＹが全てメトキシ基で置換されたものである。以下、３，５－ＭｅＯ－ＤＡＰと記載することがある。
【0028】
ポルフィリン錯体を構成する多糖類は、多数の単糖が結合した高分子化合物であり、包接作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、グルカン、カラギーナン、プルラン及びタマリンドガムから選択することができる。なかでも、ポルフィリンの溶解性及び水溶液の安定性が高いことから、λ－カラギーナン又はプルランを用いることが好ましい。
【0029】
このポルフィリン錯体は、可視光を照射されたときに水溶液中で安定かつ蛍光を発しないが、細胞内においてはミトコンドリア近傍にて蛍光を発し、活性酸素を発生させることが可能である。これは、水溶液中においては、ポルフィリンは多糖類に包接されているため蛍光を発しないが、細胞内の組織（リソソーム）にポルフィリン錯体が吸着されると構造変化を起こすことにより、蛍光を発することが可能になるため、と推測される。
【0030】
従って、本発明の実施形態に係るポルフィリン錯体は、従来ＰＤＴに利用する目的で開発されてきたポルフィリン誘導体とは全く異なるメカニズムで蛍光のオン・オフを切り替えることが可能となった。また、安定かつ細胞内でのみ活性な光増感剤又は蛍光マーカー
として、広く利用可能である。
として、広く利用可能である。
【実施例】
【0031】
以下に、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、これらの実施例を本発明の趣旨に基づいて変形、変更することが可能であり、それらを本発明の範囲から除外するものではない。
【0032】
（実施例１）
（ポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）の合成）
ポルフィリンとして、上記式（３）で表される５，１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリンを用い、多糖類としてβ－（１，３－１，６）－Ｄ－グルカンを用いたポルフィリン錯体（以下、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と記載する）を合成した。
（ポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）の合成）
ポルフィリンとして、上記式（３）で表される５，１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリンを用い、多糖類としてβ－（１，３－１，６）－Ｄ－グルカンを用いたポルフィリン錯体（以下、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と記載する）を合成した。
【0033】
より具体的には、まず、５，１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリン１．２ｇ（１．８μｍｏｌ）と、アルカリ処理済みのβ－グルカン１０．０ｍｇとを、メノウボールとともに円筒形状のメノウ容器に入れ、振動粉砕装置（Ｒｅｔｓｃｈ製、ＭＭ２００型）を用いて、３０Ｈｚ、２０分の高速振動粉砕を行った。その後、この混合物に超純水２．０ｍＬを加えて抽出した。得られた抽出液に６０分の超音波照射を行った後、遠心分離機（４５００ｒｐｍ、２０分）により不溶なＴＡＰＰを沈殿させ、上澄みを分取した。この上澄み液がＴＡＰＰ・β－グルカン錯体水溶液である。
【0034】
（比較例１）
（ポルフィリン錯体（ＴＰＰ・β－グルカン錯体）の合成）
ポルフィリンとして、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）を用い、多糖類としてβ－グルカンを用いたポルフィリン錯体（以下、ＴＰＰ・β－グルカン錯体と記載する）を合成した。
（ポルフィリン錯体（ＴＰＰ・β－グルカン錯体）の合成）
ポルフィリンとして、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）を用い、多糖類としてβ－グルカンを用いたポルフィリン錯体（以下、ＴＰＰ・β－グルカン錯体と記載する）を合成した。
【0035】
より具体的には、まず、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）１．１ｇ（１．８μｍｏｌ）と、アルカリ処理済みのβ－グルカン１０．０ｍｇとを、メノウボールとともに円筒形状のメノウ容器に入れ、振動粉砕装置（Ｒｅｔｓｃｈ製、ＭＭ２００型）を用いて、３０Ｈｚ、２０分の高速振動粉砕を行った。その後、この混合物に超純水２．０ｍＬを加えて抽出した。得られた抽出液に６０分の超音波照射を行った後、遠心分離機（４５００ｒｐｍ、２０分）により不溶なＴＰＰを沈殿させ、上澄みを分取した。この上澄み液がＴＰＰ・β－グルカン錯体水溶液である。
【0036】
（紫外可視吸収スペクトルの測定）
実施例１で得られたＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と、比較例１で得られたＴＰＰ・β－グルカン錯体の紫外可視吸収スペクトルを測定し、スペクトルの形状からポルフィリン錯体の構造を推測した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、テトラフェニルポルフィリン又は１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリンと、トリメチル－β－シクロデキストリンとを其々、実施例１及び比較例１と同様の手法にて混合し、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成して、紫外可視吸収スペクトルを測定した。
実施例１で得られたＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と、比較例１で得られたＴＰＰ・β－グルカン錯体の紫外可視吸収スペクトルを測定し、スペクトルの形状からポルフィリン錯体の構造を推測した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、テトラフェニルポルフィリン又は１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリンと、トリメチル－β－シクロデキストリンとを其々、実施例１及び比較例１と同様の手法にて混合し、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成して、紫外可視吸収スペクトルを測定した。
【0037】
具体的には、５μＭのポルフィリン錯体の水溶液を１ｍｍセルのセルに入れ、紫外可視分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製、ＵＶ－３６００）により測定した。測定結果を図１に示す。
【0038】
図１中、黒実線はＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルを示し、灰実線はＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルを示す。また、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルを灰破線で示し、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルを黒破線で示す。
【0039】
ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体及びＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルはシャープであることから、ポルフィリンを孤立分散していることが推測できた。これに対して、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体とＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルはブロードであった。このことは、ポルフィリンがβ－グルカン内で会合していることを示していると言える。
【0040】
（蛍光スペクトルの測定）
実施例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）と、比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＰＰ・β－グルカン錯体）の蛍光スペクトルを測定し、ポルフィリンがβ－グルカンに包接されていることを確認した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成し、同様に蛍光スペクトルを測定した。
実施例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）と、比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＰＰ・β－グルカン錯体）の蛍光スペクトルを測定し、ポルフィリンがβ－グルカンに包接されていることを確認した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成し、同様に蛍光スペクトルを測定した。
【0041】
具体的には、各ポルフィリン錯体は５μＭの水溶液とし、５４０ｎｍの励起波長で光照射を行い、蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ製、Ｆ－２７００）により測定した。測定結果を図２に示す。
【0042】
図２中、黒実線はＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルを示し、灰実線はＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルを示す。また、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルを灰破線で示し、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルを黒破線で示す。なお、図２中矢印で示すように、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトル（黒実線）は横軸とほぼ重なっている。
【0043】
ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及びＴＰＰ・β－グルカン錯体では、蛍光はほとんど見られなかった。このことは、ポルフィリンが会合した状態でβ－グルカンに包接されていることを示していると言える。
【0044】
（１ＨＮＭＲスペクトルの測定）
次に、実施例１で得られたＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と、比較例１で得られたＴＰＰ・β－グルカン錯体の１ＨＮＭＲスペクトルを測定し、ポルフィリンがβ－グルカンに包接されていることを確認した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成し、同様にスペクトルを測定した。
次に、実施例１で得られたＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と、比較例１で得られたＴＰＰ・β－グルカン錯体の１ＨＮＭＲスペクトルを測定し、ポルフィリンがβ－グルカンに包接されていることを確認した。また、環状の糖であり、ゲスト分子を取り込んで包接錯体を形成可能なトリメチル－β－シクロデキストリンとの比較を行うため、ＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体と、ＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体とをそれぞれ生成し、同様にスペクトルを測定した。
【0045】
具体的には、１ＨＮＭＲスペクトルの測定は、内部基準としてＤ２Ｏを使用し、核磁気共鳴測定装置（Ｖａｒｉａｎ製、４００－ＭＲ）の周波数を４００ＭＨｚに設定して行った。測定結果を図３に示す。
【0046】
図３中、（ａ）はβ－グルカンのみ、（ｂ）はＴＰＰ・β－グルカン錯体、（ｃ）はＴＡＰＰ・β－グルカン錯体、（ｄ）はＴＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体、そして、（ｅ）はＴＡＰＰ・トリメチル－β－シクロデキストリン錯体のスペクトルである。
【0047】
トリメチル－β－シクロデキストリンとの錯体（ｄ）及び（ｅ）は、ポルフィリン由来のシグナルが６．７～９．０ｐｐｍ付近に観測されたが、β－グルカンとの錯体（ｂ）及び（ｃ）では、ポルフィリン由来のシグナルは観測されなかった。このことは、ポルフィリンがβ－グルカンに包接されることによってピークが幅広化し観測できなかったことを示していると言える。紫外可視吸収スペクトルで水溶化できているが、ＮＭＲスペクトルにおいてピークが観測できなかったことから、ポルフィリンが会合してβ－グルカンに包接されていると言える。
【0048】
（細胞蛍光染色像の観察）
実施例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）が、細胞内において蛍光を示すことを確認するため、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん由来の細胞）の培地にポルフィリン錯体を加え、蛍光顕微鏡にて観察した。ポルフィリン錯体を加えるＨｅＬａ細胞は以下の方法で準備した。
実施例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）が、細胞内において蛍光を示すことを確認するため、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん由来の細胞）の培地にポルフィリン錯体を加え、蛍光顕微鏡にて観察した。ポルフィリン錯体を加えるＨｅＬａ細胞は以下の方法で準備した。
【0049】
（ＨｅＬａ細胞の準備）
ＨｅＬａ細胞株の入ったディッシュ中の培地をアスピレーターで取り除き、調製したＰＢＳを５ｍＬ用いて洗浄した後、調製したトリプシン－ＥＤＴＡ溶液５００μＬを加え、３７℃においてＣＯ２インキュベーターにて５分間培養した。５分間の処理後、遊離したＨｅＬａ細胞株は、１ｍＬの培地を入れた２．７ｃｍガラス製ディッシュへ５０μＬ入れ、ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、２日間）。プラスチック製ではなくガラス製のディッシュを用いたのは、ポルフィリン類縁体のディッシュへの吸着を抑えるためである。
ＨｅＬａ細胞株の入ったディッシュ中の培地をアスピレーターで取り除き、調製したＰＢＳを５ｍＬ用いて洗浄した後、調製したトリプシン－ＥＤＴＡ溶液５００μＬを加え、３７℃においてＣＯ２インキュベーターにて５分間培養した。５分間の処理後、遊離したＨｅＬａ細胞株は、１ｍＬの培地を入れた２．７ｃｍガラス製ディッシュへ５０μＬ入れ、ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、２日間）。プラスチック製ではなくガラス製のディッシュを用いたのは、ポルフィリン類縁体のディッシュへの吸着を抑えるためである。
【0050】
（蛍光顕微鏡による撮影）
次に、ＨｅＬａ細胞を培養した２．７ｃｍガラス製ディッシュから培地をアスピレーターで取り除き、調製したＰＢＳを１ｍＬ用いて洗浄した後、４０μＭのＴＡＰＰ・β－グルカン錯体１００μＬ、調製培地９００μＬをディッシュに加え、同条件で２４時間培養した。２４時間後、培地を取り除き、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Ｄ－ＭＥＭ）を１０００μＬ用いて洗浄した。そこへ、Ｄ－ＭＥＭを１０００μＬ加え、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製、ＩＸ７１型）で観察した。蛍光フィルターにはＣｙ５ＦＲＥＴ（励起光：５１１－５５１ｎｍ、蛍光：６６２－６９１ｎｍ）を用いて蛍光画像を取得した。その結果を図４に示す。
次に、ＨｅＬａ細胞を培養した２．７ｃｍガラス製ディッシュから培地をアスピレーターで取り除き、調製したＰＢＳを１ｍＬ用いて洗浄した後、４０μＭのＴＡＰＰ・β－グルカン錯体１００μＬ、調製培地９００μＬをディッシュに加え、同条件で２４時間培養した。２４時間後、培地を取り除き、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Ｄ－ＭＥＭ）を１０００μＬ用いて洗浄した。そこへ、Ｄ－ＭＥＭを１０００μＬ加え、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製、ＩＸ７１型）で観察した。蛍光フィルターにはＣｙ５ＦＲＥＴ（励起光：５１１－５５１ｎｍ、蛍光：６６２－６９１ｎｍ）を用いて蛍光画像を取得した。その結果を図４に示す。
【0051】
図４において、（Ａ）及び（Ｃ）はＨｅＬａ細胞の位相差像であり、（Ｂ）及び（Ｄ）は蛍光像である。また、（Ａ）及び（Ｂ）は比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＰＰ・β－グルカン錯体）を添加したものであり、（Ｃ）及び（Ｄ）は実施例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）を添加したものである。なお、図４中のスケールバーは１００μｍである。
【0052】
ＴＰＰ・β－グルカン錯体では、ＨｅＬａ細胞が蛍光を発しなかったのに対し、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体ではＨｅＬａ細胞が蛍光を発することが確認できた。これにより、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は細胞内で蛍光を発することが示されたと言える。
【0053】
（細胞内における活性の評価）
次に、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体の細胞内における活性を評価するため、細胞モデルとしてリポソームを混合し、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体がＤＭＰＣリポソーム存在下で蛍光を発し、一重項酸素発生能を有することを確認した。ポルフィリン錯体に混合したＤＭＰＣリポソームは以下の方法で準備した。
次に、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体の細胞内における活性を評価するため、細胞モデルとしてリポソームを混合し、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体がＤＭＰＣリポソーム存在下で蛍光を発し、一重項酸素発生能を有することを確認した。ポルフィリン錯体に混合したＤＭＰＣリポソームは以下の方法で準備した。
【0054】
（ＤＭＰＣリポソームの調製）
５０ｍＭのＤＭＰＣクロロホルム溶液３２０μＬをサンプル瓶に入れ、窒素ガスを吹き付けることにより溶媒を除去して薄膜を形成した。この薄膜にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）４．０ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、凍結融解を５回繰り返した。その後、ドライヤーで温めながらエクストルーダーによって孔径５０ｎｍのメンブレンフィルターに１１回通し、希釈することによりリポソーム溶液を得た（ＤＭＰＣ、４．０ｍＭ）。
５０ｍＭのＤＭＰＣクロロホルム溶液３２０μＬをサンプル瓶に入れ、窒素ガスを吹き付けることにより溶媒を除去して薄膜を形成した。この薄膜にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）４．０ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、凍結融解を５回繰り返した。その後、ドライヤーで温めながらエクストルーダーによって孔径５０ｎｍのメンブレンフィルターに１１回通し、希釈することによりリポソーム溶液を得た（ＤＭＰＣ、４．０ｍＭ）。
【0055】
（紫外可視吸収スペクトルの測定）
実施例１及び比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及びＴＰＰ・β－グルカン錯体）の細胞内における性質を確認するため、これらのポルフィリン錯体のＤＭＰＣリポソーム混合サンプルを生成した。
実施例１及び比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及びＴＰＰ・β－グルカン錯体）の細胞内における性質を確認するため、これらのポルフィリン錯体のＤＭＰＣリポソーム混合サンプルを生成した。
【0056】
具体的には、ポルフィリン錯体を５μＭの水溶液とし、ＤＭＰＣリポソームを加えて混合した。また、ポルフィリン錯体に界面活性剤（トリトンＸ－１００）を加えて混合し、紫外可視分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製、ＵＶ－３６００）により測定した。測定結果を図５に示す。
【0057】
図５中、灰実線はリポソーム非存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルであり、一点鎖線はリポソーム存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルである。また、黒実線はリポソーム非存在下のＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルであり、黒破線はリポソーム存在下のＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルである。
【0058】
ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は、リポソーム非存在下と比べて、リポソーム存在下におけるスペクトルがシャープになっているため、細胞内においてはポルフィリン錯体の構造に変化が起きることが示されたと言える。この結果から、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は、細胞内の組織（リソソーム）に吸着することで構造変化を起こすと推測される。
【0059】
（蛍光スペクトルの測定）
実施例１及び比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及びＴＰＰ・β－グルカン錯体）の細胞内における性質を確認するため、これらのポルフィリン錯体のＤＭＰＣリポソーム混合サンプルを生成した。
実施例１及び比較例１で得られたポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及びＴＰＰ・β－グルカン錯体）の細胞内における性質を確認するため、これらのポルフィリン錯体のＤＭＰＣリポソーム混合サンプルを生成した。
【0060】
具体的には、各ポルフィリン錯体は５μＭの水溶液とし、５４０ｎｍの励起波長で光照射を行い、蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ製、Ｆ－２７００）により測定した。測定結果を図６に示す。
【0061】
図６中、灰実線はリポソーム非存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルであり、一点鎖線はリポソーム存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルである。また、黒実線はリポソーム非存在下のＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルであり、（黒破線はリポソーム存在下のＴＰＰ・β－グルカン錯体のスペクトルである。
【0062】
リポソーム非存在下において、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は全く蛍光を示さなかったが、リポソーム存在下では、蛍光を発した。これにより、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体が、細胞から離れた位置では蛍光を発しないが、細胞膜近傍においては蛍光を発することが示されたと言える。
【0063】
（一重項酸素発生能の評価）
次に、一重項酸素によって退色する特性を有する色素である9,10-Anthracenediyl-bis(methylene) dimalonic acid（ＡＢＤＡ）を用いて一重項酸素発生能を評価した。
次に、一重項酸素によって退色する特性を有する色素である9,10-Anthracenediyl-bis(methylene) dimalonic acid（ＡＢＤＡ）を用いて一重項酸素発生能を評価した。
【0064】
具体的には、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体のＴＡＰＰ濃度を３０μＭにした後、１ｃｍ石英セルに１５００μＬ入れた。そこへ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１４７０μＬを加えた後、遮光しながら酸素ガスを１５分間バブリングした。その溶液に２．５ｍＭのＡＢＤＡ ＤＭＳＯ溶液３０μＬを加え、紫外可視吸収スペクトルを測定した。このときのスペクトルを光照射時間０分後として光照射（≧６２０ｎｍ）を行い、７．５分、１５分、３０分、６０分後における紫外可視吸収スペクトルを測定した。これを３回行い、その平均と標準誤差を算出した。測定時の最終濃度は、ＴＡＰＰは１５μＭであり、ＡＢＤＡが２５μＭである。なお、ＡＢＤＡの３つの吸収（３６０ｎｍ、３８０ｎｍ、４００ｎｍ付近）のうち、３８０ｎｍのピークの吸光度を評価した。図７は、光照射時間０分後の吸光度を１として減少率を示しており、吸光度の低下によって、一重項酸素の発生を確認することができる。
【0065】
図７中、９，１０－アントラセンジニル－ビス(メチレン)ジマロン酸（ＡＢＤＡ）存在下において、点線（三角）はリポソーム非存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体の吸収変化であり、一点鎖線（四角）はリポソーム存在下のＴＡＰＰ・β－グルカン錯体の吸収変化であり、実線（丸）はリポソーム非存在下のＴＰＰ・β－グルカン錯体の吸収変化である。
【0066】
ＴＰＰ・β－グルカン錯体は、リポソーム非存在下においても吸光度が低下しているため、一重項酸素を発生させていることが分かる。また、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は、リポソーム非存在下においては一重項酸素をほとんど発生させておらず、リポソーム存在下で一重項酸素を発生させていることが分かる。このことから、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体は、細胞から離れた場所においては一重項酸素を発生させないが、細胞膜近傍においては一重項酸素を発生させると言える。
【0067】
（光線力学活性の評価）
（光照射サンプルの生成）
調製培地、１×ＰＢＳ、トリプシン－ＥＤＴＡを３７℃の恒温槽で温めた。ＨｅＬａ細胞が８０％コンフェルトに達した状態で、クリーンベンチ内でディッシュ中の培地を吸い取り、１×ＰＢＳを５ｍＬ加えて洗浄した。１×ＰＢＳを吸い取った後、トリプシン－ＥＤＴＡを５００μＬ添加し、インキュベーターで５分程度温め、細胞をディッシュから剥離させた。顕微鏡で細胞が完全に剥離したことを確認した後、培地１．５ｍＬを用いて浮遊細胞をコニカルチューブに回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分間）を行った。上澄みを除いた後、沈殿した細胞に培地５ｍＬを添加して懸濁させ、細胞数をカウントし、細胞懸濁溶液を８．５５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３となるように希釈した。４８well plateに細胞懸濁溶液を２００μＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内で２４時間インキュベートした。４８well plateから培地を取り除き、１×ＰＢＳ ２００μＬで洗浄し、取り込まれていない錯体を除き、培地２００μＬを加えたものを光照射サンプルとした。
（光照射サンプルの生成）
調製培地、１×ＰＢＳ、トリプシン－ＥＤＴＡを３７℃の恒温槽で温めた。ＨｅＬａ細胞が８０％コンフェルトに達した状態で、クリーンベンチ内でディッシュ中の培地を吸い取り、１×ＰＢＳを５ｍＬ加えて洗浄した。１×ＰＢＳを吸い取った後、トリプシン－ＥＤＴＡを５００μＬ添加し、インキュベーターで５分程度温め、細胞をディッシュから剥離させた。顕微鏡で細胞が完全に剥離したことを確認した後、培地１．５ｍＬを用いて浮遊細胞をコニカルチューブに回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分間）を行った。上澄みを除いた後、沈殿した細胞に培地５ｍＬを添加して懸濁させ、細胞数をカウントし、細胞懸濁溶液を８．５５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３となるように希釈した。４８well plateに細胞懸濁溶液を２００μＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内で２４時間インキュベートした。４８well plateから培地を取り除き、１×ＰＢＳ ２００μＬで洗浄し、取り込まれていない錯体を除き、培地２００μＬを加えたものを光照射サンプルとした。
【0068】
（細胞への光照射）
光照射サンプルの４８well plateを２５℃のインキュベーター内に移し、石英ファイバー付キセノンランプ光源（朝日分光製、ＭＡＸ－３０１型）を用い、光照射を行った（６１０－７４０ｎｍ、３０分、９．０ｍＷ／ｃｍ２）。その後、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内に移し、２４時間インキュベートした。
光照射サンプルの４８well plateを２５℃のインキュベーター内に移し、石英ファイバー付キセノンランプ光源（朝日分光製、ＭＡＸ－３０１型）を用い、光照射を行った（６１０－７４０ｎｍ、３０分、９．０ｍＷ／ｃｍ２）。その後、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内に移し、２４時間インキュベートした。
【0069】
（ＷＳＴ－８アッセイによる細胞生存率の算出）
クリーンベンチ内にて、５％ＷＳＴ－８混合培地溶液を調製した。暗所保管及び光照射サンプルの４８well plateから培地を取り除き、５％ＷＳＴ－８混合培地溶液２００μＬ
ずつ各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内に移し、３０分インキュベートした。その後、呈色した溶液を９６well plateに１００μＬずつ移し、マイクロプレートリーダー（アズワン社製、ＭＰＲ－Ａ１００型）を用い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することで、生細胞数の定量を行った。本実験は３回行い、平均値及び標準偏差を算出した。その結果を図８に示す。
クリーンベンチ内にて、５％ＷＳＴ－８混合培地溶液を調製した。暗所保管及び光照射サンプルの４８well plateから培地を取り除き、５％ＷＳＴ－８混合培地溶液２００μＬ
ずつ各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件に設定したインキュベーター内に移し、３０分インキュベートした。その後、呈色した溶液を９６well plateに１００μＬずつ移し、マイクロプレートリーダー（アズワン社製、ＭＰＲ－Ａ１００型）を用い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することで、生細胞数の定量を行った。本実験は３回行い、平均値及び標準偏差を算出した。その結果を図８に示す。
【0070】
図８Ａは、暗所における測定結果であり、図８Ｂは、３０分間の光照射を行った測定結果を示す。また、点線（三角）はＴＡＰＰ・β－グルカン錯体を添加した結果であり、実線（丸）はＴＰＰ・β－グルカン錯体を添加した結果である。
【0071】
暗所において、実施例１に係るＴＡＰＰ・β－グルカン錯体及び比較例１に係るＴＰＰ・β－グルカン錯体はともに生細胞数にほとんど変化が見られず、細胞毒性はないことが分かった。３０分間の光照射を行った場合、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体はポルフィリン添加量が少ない状態においても細胞生存率の低下が著しかった。これは、ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体が光照射によって細胞毒性を発現し、その活性が高いことが示されたと言える。
【0072】
（その他のポルフィリン錯体）
（種々の多糖類との組み合わせによる評価）
他のポルフィリン錯体について、上記ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と同様の効果を示すものはないか検討を行った。まずは、ポルフィリンとしてＴＡＰＰとＴＨＰＰを用い、β－グルカン以外の多糖について、適用可能なものを検討した。
（種々の多糖類との組み合わせによる評価）
他のポルフィリン錯体について、上記ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と同様の効果を示すものはないか検討を行った。まずは、ポルフィリンとしてＴＡＰＰとＴＨＰＰを用い、β－グルカン以外の多糖について、適用可能なものを検討した。
【0073】
具体的には、上記式（１）においてＸが全てアミノ基で置換され、上記式（３）で表される５，１０，１５，２０－テトラキス（４－アミノフェニル）ポルフィリン（ＴＡＰＰ）を用い、種々の多糖（β－グルカン、λ－カラギーナン、プルラン、グアーガム及びタマリンドガム）と粉砕混合することにより、実施例１と同様の手順で種々のポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ－多糖錯体）を得た。また、上記式（１）においてＸが全てヒドロキシ基で置換され、上記式（４）で表される５，１０，１５，２０－テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）ポルフィリン（ＴＨＰＰ）を用い、種々の多糖と粉砕混合することにより、実施例１と同様の手順で種々のポルフィリン錯体（ＴＨＰＰ－多糖錯体）を得た。
【0074】
そして、各ＴＡＰＰ－多糖錯体及びＴＨＰＰ－多糖錯体について、実施例１に係るポルフィリン錯体（ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体）と同様に、紫外可視吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び１ＨＮＭＲスペクトルによって、ポルフィリンが多糖へ包接されていることが確認された（データの掲載は省略する）。また、これらのポルフィリン錯体について、高速振動粉砕による溶解性、水溶液中における安定性、及び、赤色光照射による毒性の有無について評価した。評価結果を表１に示す。
【0075】
【表1】
【0076】
溶解性については、全て、多糖のグラム数とポルフィリン類のモル数を揃えて評価を行った。表１中、溶解性についての数値はポルフィリン化合物の濃度（μＭ）を示し、値が大きい組み合わせは溶解性が高いことを示す。
【0077】
安定性については、高速振動粉砕によって溶解させたものを1日室温で放置した結果、沈殿が無い水溶液を○、沈殿があるものを×とした。－と表記したものはＴＡＰＰにおいてすでに安定性が低かったため、評価を実施していない。
【0078】
光毒性については、細胞死の割合が５０％のときのポルフィリン化合物の添加濃度を数値で示したものである。値が小さいほど、少量で効く、つまり光線力学活性が高いことを示す。
【0079】
ＴＡＰＰ及びＴＨＰＰはともに、β－グルカン、λ－カラギーナン、プルラン、及びタマリンドガムとの錯体について、全ての項目で良好な結果が得られた。
【0080】
（その他のポルフィリン化合物の評価）
次に、種々のポルフィリン化合物について、多糖と混合したポルフィリン錯体を生成し、上記ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と同様の効果を示すものはないか検討を行った。
次に、種々のポルフィリン化合物について、多糖と混合したポルフィリン錯体を生成し、上記ＴＡＰＰ・β－グルカン錯体と同様の効果を示すものはないか検討を行った。
【0081】
具体的には、ポルフィリンとして、式（１）においてフェニル基上のＸのうち３つが水素原子であり、１つがカルボキシ基で置換されたものであり、式（５）で表される（５－（４－カルボキシフェニル）－１０，１５，２０－トリフェニルポルフィリン）（ＴＣＰＰ１）、式（２）においてＹを全て水素原子としたものであり、式（６）で表される（１０，２０－ジフェニル－５，１５－ジアザポルフィリン）（Ｐｈ－ＤＡＰ）、式（２）においてパラ位のＹがそれぞれヒドロキシ基で置換されたものであり、式（７）で表される（１０，２０－ビス（４－ヒドロキシフェニル）－５，１５－ジアザポルフィリン）（４－ＯＨ－ＤＡＰ）、及び、式（２）においてメタ位のＹが全てメトキシ基で置換されたものであり、式（８）で表される１０，２０－ビス（３，５－ジメトキシフェニル）－５，１５－ジアザポルフィリン）（３，５－ＭｅＯ－ＤＡＰ）を用い、β－グルカンと粉砕混合することにより、実施例１と同様の手順で種々のポルフィリン錯体（ポルフィリン－β－グルカン錯体）を得た。
【0082】
また、これらのポルフィリン錯体について、高速振動粉砕による溶解性、水溶液中における安定性、及び、赤色光照射による毒性の有無について表１と同様の方法で評価した。評価結果を表２に示す。
【0083】
【表2】
【0084】
ＴＣＰＰ１、Ｐｈ－ＤＡＰ、３，５－ＭｅＯ－ＤＡＰ、及び、４－ＯＨ－ＤＡＰと、β－グルカンとの錯体について、ほぼ全ての項目において良好な結果が得られた。
【0085】
なお、５，１０，１５，２０－テトラキス（４－メトキシフェニル）ポルフィリン及び５，１０，１５，２０－テトラ（４－ピリジル）ポルフィリンにおいても同様の評価を行ったところ、多糖で水溶化することはできたが、細胞内において蛍光が見られず、光細胞毒性も有しないことがわかった。
【0086】
以上より、本発明に係るポルフィリン錯体によれば、水中では安定で蛍光を発しないが、細胞内では蛍光を発して細胞死を起こすことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【0087】
本発明の活用例としては、蛍光マーカーや光線力学治療薬等として、生化学分野や製薬分野への応用が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
