特許 7240674 前立腺癌の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-08

(45)【発行日】2023-03-16

(54)【発明の名称】前立腺癌の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20230309BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230309BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20230309BHJP

   C07K 14/375 20060101ALI20230309BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 B ZNA

G01N33/543 501B

C12N15/31

C07K14/37

C07K14/375

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019545075

(86)(22)【出願日】2018-09-21

(86)【国際出願番号】 JP2018035155

(87)【国際公開番号】W WO2019065527

(87)【国際公開日】2019-04-04

【審査請求日】2021-09-06

(31)【優先権主張番号】P 2017191505

(32)【優先日】2017-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】522158557

【氏名又は名称】ＭＧＣウッドケム株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106448

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 伸介

(72)【発明者】

【氏名】藤田 和利

(72)【発明者】

【氏名】野々村 祝夫

(72)【発明者】

【氏名】三善 英知

(72)【発明者】

【氏名】小林 夕香

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１３８４５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特許第４５１４１６３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】国際公開第２０１０／０９０２６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】桝田実花ほか，前立腺がんの革新的な糖鎖バイオマーカーとしての尿中フコシル化PSA，日本分子腫瘍マーカー研究会プログラム・講演抄録，2017年08月30日，Vol.37th，PP.40-41

【文献】斎藤誠一ほか，糖鎖マーカー，日本臨床，2011年06月20日，Vol.69,増刊号5，PP.129-134

【文献】Kazutoshi FUJITA et al.，Decreased fucosylated PSA as a urinary marker for high Gleason score prostate cancer，Oncotarget，2016年08月，Vol.7,No.35，PP.56643-56649

【文献】LI, Q.K. et al.，Serum Fucosylated Prostate-specific Antigen (PSA) Improves the Differentiation of Aggressive from No，Theranostics，2015年01月01日，Vol. 5, Issue 3，PP.267-276

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ０７Ｋ １４／３７５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者から採取された血清からなる検体に含まれるフコシル化ＰＳＡと、フコースα１→６特異的レクチンとを反応させ、反応した前記レクチンを検出することを含む前立腺癌の検出方法であって、
前記フコシル化ＰＳＡと前記レクチンとの反応工程及びそれ以降の処理工程からなる工程群の少なくとも一工程のｐHを７．４以上１１．０未満に調整することを特徴とする、前記前立腺癌の検出方法。

【請求項2】

前記ｐHは、８．５よりも高い、請求項１に記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項3】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する担子菌から抽出されたものである、請求項１又は２に記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項4】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、スギタケレクチン、ツチスギタケレクチン、サケツバタケレクチン、クリタケレクチン、コムラサキシメジレクチン、及びベニテングタケレクチンの少なくとも一種である、請求項１～３のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項5】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、
（ａ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、又は、
（ｂ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
を含み、かつ、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質又はペプチドである、請求項１～４のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項6】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、標識されていることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項7】

前記フコースα１→６特異的レクチンと、抗体とを用いて前記フコシル化ＰＳＡを検出することを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項8】

前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応が、アルブミンの存在下で行われる、請求項１～７のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項9】

前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応によるシグナル（反応値）が、グリソンスコア６以下の者から得られているシグナル（参照値）と比べて高い場合に、前記被験者での高リスク前立腺癌が示唆される、請求項１～８のいずれかに記載の前立腺癌の検出方法。

【請求項10】

フコースα１→６特異的レクチンと、被験者から採取される血清からなる検体に含まれる前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐHを７．４以上１１．０未満に調整するためのアルカリ性試薬とを含む前立腺癌検出用診断薬キット。

【請求項11】

前記ｐHは、８．５よりも高い、請求項１０に記載の前立腺癌検出用診断薬キット。

【請求項12】

さらに、抗ＰＳＡ抗体を含む、請求項１０又は１１に記載の前立腺癌検出用診断薬キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、前立腺癌の検出方法に関し、より詳細には、血清中フコシル化ＰＳＡの測定を用いる前記検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺は、男性の膀胱の真下に尿道を取り囲むように存在する生殖器である。前立腺癌が、近年、増加している。前立腺癌の検診方法として、血中ＰＳＡ検診が公知である。ＰＳＡは、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）である。ＰＳＡには、遊離型ＰＳＡ（「Ｆ－ＰＳＡ」又は「フリーＰＳＡ」ともいう）と、α１－アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）と結合した複合型ＰＳＡ（「ＰＳＡ－ＡＣＴ」ともいう）とがある。ヒトの血中ＰＳＡ値は、遊離型ＰＳＡと複合型ＰＳＡの合計値となる。健常者の血中ＰＳＡ値は、加齢とともに上昇するが、一般に、４ｎｇ／ｍＬ未満とされる。４ｎｇ／ｍＬ以上の異常高値が測定された場合には、前立腺癌が疑われ、検査陽性となる。

【0003】

ＰＳＡ検診によって検査陽性となった者は、確定診断のために前立腺生検が行われる。この生検では、臨床医が前立腺針を用いて前立腺癌の疑われる領域から組織を採取し、その組織や細胞を病理組織学的検査にかけ、前立腺癌のリスク分類（悪性度や重症度）を決定する。

【0004】

上記リスク分類は、血中ＰＳＡ値、グリソンスコア、及び病期分類（ＴＮＭ分類）の３つの因子を組み合わせて総合的に判別される。グリソンスコア（以下、ＧＳともいう）とは、組織内の癌の悪性度を判断する指標である。まず、採取した検体の癌組織学形態を、組織の状況と浸潤の状況に基づいて、Ｇ１～Ｇ５のパターンに分類する（前立腺癌取扱い規約第４版）。Ｇ３～Ｇ５の評価は、以下の通りである。
グリソンパターン
Ｇ３：明瞭な管腔を有する独立腺管よりなる。既存の非腫瘍性腺管の間に浸潤する。
Ｇ４：癒合腺管、篩状腺管、ｈｙｐｅｒｎｅｈｒｏｍａｔｏｉｄ、不明瞭な腺管形成を示すもの。
Ｇ５：充実性増殖、索状配列、弧在性増殖、面疱状壊死を示すもの。

【0005】

最も多い病変（優勢病変）と２番目に多い病変（随伴病変）のパターン判定をそれぞれ行い、それらの数値の合計をグリソンスコア（ＧＳ）とする。ＧＳが高いほど、癌の悪性度が高い。ＧＳ７以上の前立腺癌は、進行し、また転移するため、外科的手術等の治療を早期に要する高リスク前立腺癌と呼ばれる。

【0006】

ＴＮＭ分類とは、前立腺癌を、腫瘍の大きさ（Ｔ）、リンパ節への転移（Ｎ）、及び遠隔転移（Ｍ）の観点で評価する国際規格である。ＴＮＭ分類から、さらにステージ（病期）が決定される。

【0007】

血中ＰＳＡ値は、加齢、前立腺の炎症、及び前立腺肥大症によっても上昇する。血中ＰＳＡ値が異常に高い患者を生検しても、前立腺癌細胞の検出率は３０％程度である。また、表６に示す前立腺患者群の血中ＰＳＡ値及びＧＳを見ると、血中ＰＳＡ値が高いからといって、前立腺癌の悪性度が高いわけではない。

【0008】

このような状況において、前立腺癌の検出の確度が血中ＰＳＡ検診よりも高い前立腺癌の検出方法の開発が望まれる。しかも、その検出方法は、グリソンスコア等のリスク分類と相関を持つことが望ましい。測定値からリスク分類や高リスク前立腺癌を予測できれば、生検を行なう頻度を削減できる。

【0009】

ＰＳＡに結合した糖鎖の癌性変化に基づいて前立腺癌を検出しようとする報告が公知である。例えば、特許文献１に記載のＰＳＡの分析方法は、フコースα１－２ガラクトース残基と親和性のあるレクチンとＰＳＡ含有試料とを接触させ、前記レクチンと親和性を有するＰＳＡの量を判定することを特徴とする。前立腺癌患者の血液から採取された検体はα１－２フコシル化ＰＳＡが増大するという知見に基づいて、前立腺癌及び前立腺肥大症が鑑別される。

【0010】

非特許文献１には、正常ＰＳＡには２本鎖のアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ－グリカン）がほとんど含まれず、ハイブリッドタイプや高マンノースタイプが主体であるのに対して、前立腺癌由来のＰＳＡには末端にシアル酸がα２－３で結合した分岐Ｎ－グリカンが多いことが記載されている。

【0011】

非特許文献２には、血中ＰＳＡ検査値が４～１０ｎｇ／ｍＬの前立腺癌又は前立腺肥大症患者の血中フコシル化ＰＳＡを、α１－２フコースに親和性を有するＵＥＡ－１レクチンを用いるＥＬＬＡで測定すると、前立腺癌患者のフコシル化ＰＳＡは、前立腺肥大症患者と比べて有意に高いと報告されている。

【0012】

非特許文献３は、血中フコシル化ＰＳＡレベルを、ＡＡＬを用いる多重磁性ビーズ基礎免疫分析（multiplex magnetic bead-based immunoassay）で調べたところ、血中フコシル化ＰＳＡレベルがＧＳの増大に従って増大したことを報告する。この文献は、血中フコシル化ＰＳＡレベルが悪性前立腺癌と非悪性前立腺癌とを区別するためのサロゲートバイオマーカーとなり得ると示唆する。

【0013】

非特許文献４は、尿中フコシル化ＰＳＡのレベルをＡＡＬ又はＰｈｏＳＬを用いたレクチン抗体ＥＬＩＳＡで調べたところ、ＧＳの高い前立腺癌患者ほど、そのレベルが低かったことを報告する。この文献は、尿中フコシル化ＰＳＡレベルの減少が、ＧＳの高い前立腺癌患者を検出するためのマーカーとなり得ることを示唆する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【文献】ＷＯ２０１０／０９０２６４Ａ１（ＰＳＡの分析方法、及び前記分析方法を用いた前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法）

【文献】特許４５１４１６３（フコースα１→６特異的レクチン）

【文献】特開２０１１－１４８７３６（ペプチド）

【非特許文献】

【0015】

【文献】Ｍ． Ｔａｊｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，’’Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｆｏｒｍｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｉｎ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ： ａ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｒｏａｃｈ．’’，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１，２００８，ｐ２－８

【文献】Ｍｅｒｉａｍ Ｖ．Ｄｗｅｋ ｅｔ ａｌ．，’’Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＳＡ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ’’，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，４１，（２０１０），ｐ１９３５－１９３９

【文献】Ｑｉｎｇ Ｋａｙ Ｌｉ ｅｔ．ａｌ．，’’Ｓｅｒｕｍ Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＳＡ） Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｆｒｏｍ Ｎｏｎ－ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒｓ’’，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１５；５（３）：２６７－２７６

【文献】Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ．ａｌ．，’’Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ＰＳＡ ａｓ ａ ｕｒｉｎａｒｙ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ Ｇｌｅａｓｏｎ ｓｃｏｒｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ’’，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ａｕｇ ３０；７（３５）：５６６４３－５６６４９

【文献】Ｙｕｋａ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，’’Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｅ Ｆｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｅｃｔｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｓｑｕａｒｒｏｓａ’’，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７，ｐ３３９７３－３３９８２

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明の目的は、従来のＰＳＡ検診よりも確度の高い前立腺癌の検出方法を提供する。本発明の別の目的は、測定値がリスク分類と相関する前立腺癌の検出方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者等は、上記課題を鋭意検討したところ、血清中フコシル化ＰＳＡにフコースα１→６特異的レクチンを作用させる工程及びそれ以降の処理工程の少なくとも一工程のｐＨを特定のアルカリ性域に調整することにより、前立腺癌の検出の確度が向上することを発見した。この知見に基づけば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。

【0018】

すなわち、本発明は、被験者から採取された血清からなる検体に含まれるフコシル化ＰＳＡと、フコースα１→６特異的レクチンとを反応させ、反応した前記レクチンを検出することを含む前立腺癌の検出方法であって、前記フコシル化ＰＳＡと前記レクチンとの反応工程及びそれ以降の処理工程からなる工程群の少なくとも一工程のｐＨを７．４以上１１．０未満に調整することを特徴とする、前記前立腺癌の検出方法を提供する。

【0019】

非特許文献１～２に開示の方法は、α１→６フコース糖鎖を検出していない点で、本発明の検出方法と明確に相違する。非特許文献３では、血清中フコシル化ＰＳＡを、ＡＡＬを用いて測定している。後述の比較例２に示すように、ＡＡＬは、非前立腺癌の検出率（偽陽性率）が高い。一方、本発明は、前立腺癌を検出率（陽性率）が高く、かつ非前立腺癌の検出率（偽陽性率）が低い点で、非特許文献３の方法よりも優れる。非特許文献４では、尿中フコシル化ＰＳＡを、ＰｈｏＳＬを用いて測定している。本発明の方法は、血清中フコシル化ＰＳＡを測定する点で、非特許文献４の方法と相違する。非特許文献４では、フコシル化ＰＳＡとＰｈｏＳＬとの複合体に基づくシグナルが、ＧＳの増大に伴って低下する。そのため、非特許文献４の対象は、予め測定した血中ＰＳＡ値が高いために前立腺癌の疑われる者となる。一方、前立腺癌の疑われる者に限定されない本発明の方法は、初期検診として使用される。

【0020】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する担子菌から抽出されたものである。

【0021】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、例えばスギタケレクチン、ツチスギタケレクチン、サケツバタケレクチン、クリタケレクチン、コムラサキシメジレクチン、及びベニテングタケレクチンの少なくとも一種である。

【0022】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、例えば、
（ａ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、又は、
（ｂ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
を含み、かつ、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質又はペプチドである。

【0023】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、標識されていてもよい。

【0024】

前記フコースα１→６特異的レクチンと、抗体とを用いたアッセイにより、前記フコシル化ＰＳＡを検出してもよい。

【0025】

前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応は、アルブミンの存在下で行われることが好ましい。

【0026】

前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応によるシグナル（反応値）が、グリソンスコア６以下の者から得られているシグナル（参照値）と比べて高い場合に、前記被験者での高リスク前立腺癌が示唆される。「高リスク前立腺癌」とは、本明細書において、グリソンスコアが７以上の進行性前立腺癌を意味する。

【0027】

本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンと、被験者から採取される血清からなる検体に含まれる前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを７．４以上１１．０未満に調整するためのアルカリ性試薬とを含む前立腺癌検出用診断薬を提供する。

【0028】

前記前立腺癌検出用診断薬は、さらに、抗ＰＳＡ抗体を含むことが好ましい。

【発明の効果】

【0029】

ＰＳＡ検診による血中ＰＳＡ値は、加齢や、前立腺肥大症や前立腺炎症等の非前立腺癌によっても上昇するため、血中ＰＳＡ値による前立腺癌の検出確度は低い。一方、血清中フコシル化ＰＳＡをフコースα１→６特異的レクチンと反応させる工程又はそれ以降の処理工程を特定のアルカリ性域で行うことを特徴とする本発明の検出方法は、後述の実施例で実証されるように、前立腺癌を高い確度で検出する。

【0030】

従来のＰＳＡ検診では、悪性度の高い前立腺癌と悪性度の低い前立腺癌とを区別することが困難であった。血中ＰＳＡ値が高くて前立腺癌が疑われる者は、生検によりグリソンスコア等のリスク分類を評価する必要があった。一方、本発明の方法では、前立腺癌のリスク度（悪性度）が高いほど、血中フコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体の反応値が増大する、すなわち、反応値とリスク度（悪性度）とが相関する。

【0031】

本発明の検出方法は、非侵襲性でありながら、本来治療すべき患者を容易に選別することが期待される。本発明の方法は、また、血中ＰＳＡ検査陽性の患者に対して前立腺の生検実施に先立ち、前立腺癌の有無について有用な情報を提供することも可能である。血中ＰＳＡ値がグレーゾーンの患者にとっては、前記検出レベルの高低が生検実施の必要性を判断する指標となる。また、血中ＰＳＡ値が基準値より明らかに高い患者にとっては、前記検出反応値レベルの高低が悪性度の判別の指標となる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】α１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の構造図である。

【図2】α１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の別の構造図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

以下に、本発明の実施の形態をより詳細に説明する。本発明の前立腺癌の検出方法（以下、本発明の方法という）は、ヒトの血清からなる検体に含まれるフコシル化ＰＳＡにフコースα１→６特異的レクチンを特定の条件で作用させ、フコシル化ＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとの複合体に基づくシグナル（反応値）を測定する。

【0034】

本発明の方法の対象となる第一の候補は、健康診断としてＰＳＡ検診を検討するヒト男性である。本発明の検出方法は、後述の実施例で実証されるように、ＰＳＡ検診よりも高い確度で前立腺癌を検出する。

【0035】

本発明の方法の対象となる第二の候補は、ＰＳＡ検診を受けて血中ＰＳＡ値が４ｎｇ／ｍＬ以上の異常高値となった者である。血中ＰＳＡ値が４ｎｇ／ｍＬ以上であると、前立腺癌が疑われ、検査陽性となる。検査陽性の患者には、ＧＳ６のように治療の必要のない患者や、ＧＳ７～８のように癌が進行した患者が含まれる。本発明の方法では、前立腺癌の進行度に従って、フコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体の反応値が増大するので、本発明の方法は、生検の必要性を判断する材料や患者の癌の悪性度に関する情報を提供可能である。

【0036】

特に、血中ＰＳＡ値が４～２０ｎｇ／ｍＬの患者は、検査陽性であっても、前立腺癌でない可能性が高く、もしくは前立腺癌であってもＧＳ６で治療不要である可能性が高い。本発明の方法は、このような患者が生検を必要とするか判断する材料を提供可能である。

【0037】

上記フコースα１→６特異的レクチンは、
（１）α１→６フコース糖鎖に対する結合定数の下限、及び
（２）α１→６フコースを含まない糖鎖及びα１→６フコースを含まない糖脂質系糖鎖に対する結合定数の上限
によって定義可能である。

【0038】

上記フコースα１→６特異的レクチンは、より具体的には、以下の特性〔１〕～〔３〕をすべて有する。
〔１〕フコースα１→６特異的レクチンは、下記構造式（１）：

【化1】

〔式中、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ、及びＦｕｃは、それぞれ、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、及びフコースを意味する〕
を有するα１→６フコース糖鎖Ｎｏ．４０５に対して結合定数１．０×１０^４Ｍ^－１以上（２５℃において）で示される親和性を有する。

【0039】

〔２〕フコースα１→６特異的レクチンは、下記構造式（２）：

【化2】

〔式中、ＧｌｃＮＡｃ、及びＭａｎは、それぞれ、Ｎ－アセチルグルコサミン、及びマンノースを意味する〕
を有するα１→６フコースを含まない糖鎖Ｎｏ．００３に対して結合定数が１．０×１０³Ｍ^－１以下（２５℃において）である。

【0040】

〔３〕フコースα１→６特異的レクチンは、下記構造式（３）：

【化3】

〔式中、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、及びＮｅｕ５Ａｃは、それぞれ、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、及びＮ－アセチルノイラミン酸を意味する〕
を有するα１→６フコースを含まない糖脂質系糖鎖Ｎｏ．９０９に対して、結合定数が１．０×１０³Ｍ^－１以下（２５℃において）である。
で定義される。

【0041】

前記結合定数は、本明細書において、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）を用い、分析温度２５℃において測定される数値を意味する。ＦＡＣ法の詳細は、例えば、本出願人の一部が出願した特許文献２に記載されている。

【0042】

前記フコースα１→６特異的レクチンのα１→６フコース糖鎖Ｎｏ．４０５に対する結合定数（２５℃において）は、好ましくは５．０×１０^４Ｍ^－１以上、より好ましくは１．０×１０^５Ｍ^－１以上、さらに好ましくは２．０×１０^５Ｍ^－１以上である。

【0043】

前記α１→６フコースを含まない糖鎖Ｎｏ．００３及びα１→６フコースを含まない糖脂質系糖鎖Ｎｏ．９０９に対する結合定数（２５℃において）は、通常、１．０×１０^３Ｍ^－１以下であり、好ましくは１．０×１０^２Ｍ^－１以下、特に好ましくは０であることを意味する。

【0044】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに糖鎖Ｎｏ．４０５の非還元末端にシアル酸を有するα１→６フコース糖鎖に対しても高い親和性を有してもよい。高い親和性とは、結合定数（２５℃において）が、好ましくは１．０×１０^４Ｍ^－１以上、より好ましくは５．０×１０^４Ｍ^－１以上、さらに好ましくは１．０×１０^５Ｍ^－１以上を意味する。一方、従来のレクチンは、非還元末端にシアル酸を有するα１→６フコース糖鎖に対して親和性が低いものもある。ここで低い親和性とは、結合定数（２５℃において）が１．０×１０^３Ｍ^－１以下を意味する。

【0045】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらにα１→６フコースの結合したＮ結合型の一本鎖、二本鎖、三本鎖及び／又は四本鎖の糖鎖に対する結合定数（２５℃において）が、好ましくは１．０×１０^４Ｍ^－１以上、より好ましくは５．０×１０^４Ｍ^－１以上、さらに好ましくは１．０×１０^５Ｍ^－１以上で示される親和性を有する。

【0046】

前記フコースα１→６特異的レクチンのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、通常、４，０００～４０，０００であり、好ましくは４，０００～２０，０００である。ここで、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。前記レクチンは、サブユニットが、通常、２～１０個、好ましくは２～６個、さらに好ましくは２～３個結合したものでもよい。

【0047】

天然物から取得するフコースα１→６特異的レクチンを概説する。上記天然物は、例えば担子菌、子嚢菌等のキノコである。モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科は、担子菌に属している。モエギタケ科としては、スギタケ、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。

【0048】

天然物からフコースα１→６特異的レクチンを抽出及び／又は精製する方法は、本出願人の一部による特許文献２、及び本出願人の投稿した非特許文献５に詳細に記載されている。なお、特許文献２に記載のツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）をスギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）と読み替える。

【0049】

上記担子菌又は子嚢菌のうち、フコースα１→６特異的レクチンのα１→６フコース糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が好ましい。特に好ましくは、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）、ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）、サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）、クリタケレクチン（ＮＳＬ）、コムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）、及びベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）である。ＰｈｏＳＬ、ＳＲＬ、ＬＳＬ及びＮＳＬのアミノ酸配列を表１に示す。

【0050】

配列番号１に示すＰｈｏＳＬは、スギタケから抽出することのできるレクチンである。配列番号１の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。

【0051】

配列番号２に示すＳＲＬは、サケツバタケから抽出することのできるレクチンである。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。

【0052】

配列番号３に示すＬＳＬは、コムラサキシメジから抽出することのできるレクチンである。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。

【0053】

配列番号４に示すＮＳＬは、クリタケから抽出することのできるレクチンである。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。

【0054】

配列番号５に示すＮＳＬもまた、クリタケから抽出することのできるレクチンである。配列番号５の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。なお、配列番号５は、配列番号４のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体ともいえる。

【0055】

前記フコースα１→６特異的レクチンは、（ａ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、又は、（ｂ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、を含み、かつ、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質又はペプチドであってもよい。

【0056】

上記の「１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換」には、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＧＳＴタグ等のように別の機能のために付加したアミノ酸やそれらの付加のためのスペーサー等は含まれない。また、上記（ａ）および（ｂ）の配列を複数結合したようなタンパク質又はペプチドの場合には、上記（ａ）および（ｂ）に相当する配列において、上記の「１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換」に該当するかを判断し、複数結合させるためのスペーサー等は上記の「１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換」に含まれない。

【0057】

ここで、「機能的に同等」とは、α１→６フコース糖鎖Ｎｏ．４０５に対して結合定数（２５℃において）が１．０×１０^４Ｍ^－１以上であり、好ましくは５．０×１０^４Ｍ^－１以上であり、より好ましくは１．０×１０^５Ｍ^－１以上、さらに好ましくは２．０×１０^５Ｍ^－１以上で示される親和性を有することを意味する。配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドの変異体の一例が、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドである。

【0058】

上記フコースα１→６特異的レクチンは、上記天然物からの抽出の他に、天然由来のレクチンのアミノ酸配列に基づいて化学合成されたペプチドやタンパク質であってもよい。さらに、化学合成のペプチドやタンパク質は、天然由来のレクチンのアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸がリジン及び／又はアルギニンで置換されかつ糖結合活性を有するペプチドであってもよい。フコースα１→６特異的レクチンのぺプチドの入手方法は、本出願人の一部による特許文献３に詳細に記載されている。ＰｈｏＳＬペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）を表１に示す。配列番号６に示すＰｈｏＳＬペプチドは、配列番号１のＰｈｏＳＬの具体例（ＡＰＶＰＶＴＫＬＶＣ ＤＧＤＴＹＫＣＴＡＹ ＬＤＦＧＤＧＲＷＶＡ ＱＷＤＴＮＶＦＨＴＧ）において、１番目のＡｌａ、２０番目のＴｙｒ、及び３９番目のＴｈｒがＬｙｓに置換され、さらに４０番目のＧｌｙが欠失したアミノ酸配列を有する。

【0059】

【表1】

【0060】

上記フコースα１→６特異的レクチンは、上記天然物からの抽出の他に、天然由来のレクチンのアミノ酸配列をコードする核酸を用いて天然由来とは異なる公知の宿主内で人工的に発現させたリコンビナントであってもよい。

【0061】

上記フコースα１→６特異的レクチンに属するＰｈｏＳＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ及びＬＳＬの各種糖鎖に対する結合定数（２５℃において）を表２～５に示す。比較のため、フコースα１→６に親和性を有するが特異的ではないレクチンであるヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＬ）及びエンドウ豆レクチン（ＰＳＬ）の各種糖鎖（図１～２）に対する結合定数（２５℃において）も表２～５に示す。

【0062】

【表2】

【0063】

【表3】

【0064】

【表4】

【0065】

【表5】

【0066】

ＡＡＬ及びＡＯＬは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．０１５、２０１－２０３、４０１－４１８）に結合する一方、フコースα１→６を含まない糖脂質系糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）とも結合する。ＬＣＬ及びＰＳＬは、フコースα１→６糖鎖に結合するものの、α１→６フコースを含まない糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５－０１４）にも結合する。

【0067】

ＰｈｏＳＬ等のフコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖に確実に結合し、かつ、α１→６フコースを含まない糖鎖に全く結合しない。しかも、その結合定数（２５℃において）は、従来のフコースα１→６親和性レクチンよりも大きい（結合定数が１．０×１０^４Ｍ^－１以上）。さらに、フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖にシアル酸が付加されていても、結合定数が下がらない（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）。また、フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７－４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。

【0068】

本発明の方法は、具体的には、以下の工程：
（Ａ）被験者から採取された血清からなる検体に含まれるフコシル化ＰＳＡと、フコースα１→６特異的レクチンとを反応させ、フコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体を得る、及び
（Ｂ）前記複合体を適宜の手段で検出する
を含む。

【0069】

本発明の方法は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一工程のｐＨを特定のアルカリ性域に調整することによって、フコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体の感度を高める。

【0070】

具体的には、フコシル化ＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとを反応させてフコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体を得るレクチン反応工程の溶媒、前記複合体を洗浄する洗浄工程の洗浄液、前記複合体に２次プローブ以降のプローブを反応させるプローブ反応工程の溶媒、プローブ反応後の前記複合体を洗浄する洗浄液から選ばれる少なくとも一種の溶液のｐＨを特定のアルカリ性域に調整する。好ましくは、前記レクチン反応工程のｐＨを特定のアルカリ性域に調整する。

【0071】

後述の実施例８に示すように、被験者から採取した血清中のフコシル化ＰＳＡにフコースα１→６特異的レクチンを作用させると、血清不純物によるノイズが高い等の問題がある。よって、ｐＨの下限は、複合体のシグナル／ノイズ比の改善の点では８．５よりも高いことが好ましく、特に好ましくは８．６以上、より好ましくは８．８以上、さらに好ましくは９．０以上である。また、ｐＨの上限は、１１．０未満であり、好ましくは１０．５以下である。ｐＨが８．５以下又は１１．０以上であると、複合体のシグナル／ノイズ比の改善が図れない場合がある。

【0072】

上記ｐＨの調整は、アルカリ性試薬、好ましくはアルカリ性溶液、さらに好ましくはアルカリ性緩衝液の添加によって行われる。アルカリ性緩衝液の例には、グリシン－水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）緩衝液；炭酸－重炭酸緩衝液；ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等のグッド緩衝液；ホウ酸ナトリウム緩衝液；塩化アンモニウム緩衝液；Ｂｒｉｔｔｏｎ‐Ｒｏｂｉｎｓｏｎ 緩衝液等の広域緩衝液等が挙げられる。好ましくはグリシン－ＮａＯＨ緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液及びＴＡＰＳ緩衝液から選ばれる一種以上であり、より好ましくはグリシン－ＮａＯＨ緩衝液及びＴＡＰＳ緩衝液から選ばれる一種以上である。これらの緩衝液の調製は、従来公知の方法に基づく。

【0073】

工程（Ａ）のフコシル化ＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとの反応に、アルブミン、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加することが好ましい。反応液のアルブミン濃度は、通常、０．０１～１０％でよく、好ましくは０．１～３％、特に好ましくは０．５～１％である。

【0074】

工程（Ｂ）で上記複合体を検出するために、前記レクチンは、予め標識手段が組み込まれていることが好ましい。前記標識手段としては、特に制限なく、公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。前記放射性同位元素としては、例えば^１４Ｃ、^３Ｈ及び^３２Ｐが挙げられる。また、前記レクチンと結合する抗レクチン抗体を用いて検出してもよい。

【0075】

前記標識化合物としては、例えば酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、並びに蛍光標識（フロオレッセインイソチアシアナート、ＣｙＤｙｅ（登録商標）、４－アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）、アミノピリジン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）等）を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。特に、ビオチン標識は、感度が高い点で好ましい。

【0076】

上記工程（Ｂ）において、前記複合体を検出する手段は、特に制限されない。検出手段として、例えば、ＥＬＩＳＡ（直接吸着法、サンドウィッチ法、及び競合法）、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、レクチン染色、レクチンチップ、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法、凝集法、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム）、電気泳動、ビーズ等を使用可能である。いくつかの代表的な検出方法を、以下に概説する。

【0077】

直接吸着ＥＬＩＳＡ法では、検体（血清）をプレートに添加して固定化する。次いで、ビオチン標識した前記レクチンを添加して、ＰＳＡと前記レクチンとを反応させる。２次標識化合物としてＨＲＰ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の糖鎖を含む標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。

【0078】

サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、フコシル化ＰＳＡと親和性を有するレクチン、抗体（例えば抗ＰＳＡ抗体）又はそれらの断片から選ばれる少なくとも一種をプレートに添加し固定化する。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれでもよい。次いで、検体（血清）をプレートに曝す。次いで、ビオチン標識した前記フコースα１→６特異的レクチンを添加して、血清中のフコシル化ＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとを反応させる。この反応により、フコシル化ＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとの複合体が生成される。２次標識化合物としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、α１→６フコース糖鎖の定量化も可能である。

【0079】

レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、担体に固定化されたレクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。ＨＰＬＣと組み合わせることでハイスループットを期待することができる。

【0080】

レクチンの固定化担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Ｂやセファロース６Ｂ（共にＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。

【0081】

固定化するレクチンの濃度は、通常、０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１～２０ｍｇ／ｍＬである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ_３で還元してもよい。また、ＮＨＳ－セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。

【0082】

検体（血清）をカラムに供与した後、洗浄の目的で緩衝液を流す。あるいは、緩衝液中に検体をカラムに供与する。緩衝液の一例は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等であり、モル濃度が、通常、５～５００ｍＭ、好ましくは１０～５００ｍＭであり、ｐＨが、通常、４．０～１０．０、好ましくは６．０～９．０である。また、ＮａＣｌ含量が、通常、０～０．５Ｍ、好ましくは０．１～０．２Ｍであり、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２又はＭｎＣｌ_２含量が、通常、０～１０ｍＭ、好ましくは０～５ｍＭの緩衝液である。

【0083】

アフィニティカラムの洗浄後、糖鎖の溶出は、糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１～５００ｍＭ、特に好ましくは１０～２００ｍＭである。

【0084】

工程（Ｂ）において、血清中フコシル化ＰＳＡ－フコースα１→６特異的レクチンの複合体からのシグナル（反応値）を、グリソンスコア６以下の者、好ましくは６の者で得られているシグナル（参照値）と比較することにより、高リスク前立腺癌の発症の有無や、発症の場合の悪性度を高い確度で評価することができる。すなわち、検体のシグナル（反応値）が、グリソンスコア６以下の者から得られているシグナル（参照値）と比べて高い場合に、前記被験者が高リスク前立腺癌であることが示唆される。

【0085】

血清中フコシルＰＳＡとフコースα１→６特異的レクチンとの複合体によるシグナル（反応値）のレベルは、レクチン反応条件、血中フコシル化ＰＳＡ濃度とレクチンの種類に依存する。フコシル化ＰＳＡ標準品（濃度既知）を用いて、フコシル化ＰＳＡ濃度とシグナル値との関係を表す検量線を作成することにより、シグナルを定量化できる。各レクチンにおいて、フコシル化ＰＳＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬに対応する反応値を１０Ｕ／ｍＬとする。

【0086】

本発明は、また、フコースα１→６特異的レクチンと、被験者から採取される血清からなる検体に含まれる前記フコシル化ＰＳＡと前記フコースα１→６特異的レクチンとの反応工程及びそれ以降の処理工程を含む工程群から選ばれる少なくとも一工程のｐＨを特定のアルカリ性域に調整するためのアルカリ性試薬とを含む前立腺癌検出用診断薬を提供する。上記フコースα１→６特異的レクチン及び上記アルカリ性試薬の説明は上記したとおりである。

【0087】

前記診断薬は、適宜、各種の標識化合物、緩衝液、プレート、ビーズ、反応停止液等の検出に使用する汎用のものを含んでもよい。該診断薬は、血清からなる検体中に含まれるフコシル化ＰＳＡを抽出するための試薬（例えば、抗ＰＳＡ抗体又はその断片や類縁体）を含むことが好ましい。

【実施例】

【0088】

以下に、本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0089】

１．試料の準備
本発明の検出方法に使用する試薬を、以下の手順で用意した。
（１）固相化用抗ＰＳＡ抗体
Ｈｙｔｅｓｔ社から抗ＰＳＡ抗体を購入した。この抗体の糖鎖を非特許文献５に記載の方法に従って除去してから、固相化用抗ＰＳＡ抗体として使用した。

【0090】

（２）フコシル化ＰＳＡ標準品
ＰＳＡ（標準品、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）から、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）のカラム（株式会社Ｊ－オイルミルズ社製）を使ってフコシル化ＰＳＡを精製し、フコシル化ＰＳＡ標準品とした。

【0091】

（３）ビオチン標識レクチン
本発明の方法に用いるフコースα１→６特異的レクチンとして、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）、サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）、クリタケレクチン（ＮＳＬ）、ベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）、及び、スギタケレクチンペプチド（以下、ＰｈｏＳＬペプチドという、配列番号６）を準備した。このＰｈｏＳＬペプチドは、特許文献３の実施例６の記載に基づいて合成した（ただし、特許文献３のＰＴＬをＰｈｏＳＬと読み替える）。これらのレクチンを量り取り、０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液を加え溶解した（濃度５ｍｇ／ｍＬ）。ジメチルスルホキシドに溶解したビオチン化試薬をレクチン溶液に加えて反応させた。限外ろ過（分画分子量３Ｋ）を用いて反応液を水に対して溶媒置換した。この液を凍結乾燥してビオチン標識レクチンを得た。また、α１→６フコース親和性レクチンとして、ビオチン標識ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ、株式会社Ｊ－オイルミルズ社製）を用意した。

【0092】

（４）使用する試薬等
（４－１）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
リン酸水素二ナトリウム５．７５ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、塩化カリウム１．０ｇ、及び塩化ナトリウム４０．０ｇを水５Ｌに溶解して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を得た。
（４－２）１００ｍＭグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（グリシン‐ＮａＯＨ、ｐＨ１０）
グリシン３．７６ｇを、水４００ｍＬ程度に溶解し、５Ｎ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０に合わせ、さらに水で５００ｍＬにメスアップすることにより、ｐＨ１０の緩衝液を調製した。
（４－３）１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ社製）１ｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、濃度１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液（以下、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳという）を得た。
（４－４）０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ
ウシ血清アルブミン０．１ｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、濃度０．１％のＢＳＡのＰＢＳ溶液（以下、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳという）を得た。
（４－５）０．１％ＢＳＡ／１０倍希釈ＰＢＳ＋グリシン‐ＮａＯＨ（ｐＨ９．６）
上記１％ＢＳＡ／ＰＢＳを５倍希釈した溶液５ｍＬに、上記グリシン‐ＮａＯＨ ５ｍＬを添加することにより、０．１％ＢＳＡ／１０希釈ＰＢＳ＋グリシン‐ＮａＯＨ（ｐＨ９．６）を得た。

【0093】

（５－１）被験者試料Ａ
前立腺癌と診断された患者９名及び健常者７名から採取されたヒト血清標本を、株式会社ケー・エー・シー（ＫＡＣ）より購入し、被験者試料Ａとして使用した。各標本の血中ＰＳＡ値、並びに各前立腺癌患者の血中ＰＳＡ値及び前立腺癌のリスク分類を表６に示す。

【0094】

【表6】

【0095】

（５－２）被験者試料Ｂ
大阪大学医学部付属病院で前立腺癌患者にインフォームドコンセントを行なった後、収集された血清を、被験者試料Ｂとして使用した。各検体のグリソンスコアに群分けされた内容を表７に示す。表７のＮｅｇａｔｉｖｅとは、血中ＰＳＡ値が高かったものの、前立腺の生検で前立腺癌が見つからなかった群である。

【0096】

【表7】

【0097】

〔実施例１及び８〕スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）を用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験（Ｉ）
前立腺癌患者の血清中のフコシル化ＰＳＡを高感度で検出するために、血清中フコシル化ＰＳＡとＰｈｏＳＬとの反応時のｐＨを変更する試験を実施した。

【0098】

１．サンドイッチＥＬＩＳＡ
（１）抗体固定化
糖鎖除去した抗ＰＳＡ抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した。この希釈液２５μＬを、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１２時間放置後、添加液を廃棄した。
（２）洗浄
１５０μＬの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（製品名：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ナカライ社製）添加ＰＢＳを各ウェルに添加した後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（３）ブロッキング
２５μＬの１％ ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェルに添加して、３７℃で１時間放置後、添加液を廃棄した。
（４）洗浄
1５０μＬの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを各ウェルに添加した後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（５）抗原抗体反応
検量線作成のため、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで濃度０～２００ｎｇ／ｍＬに希釈されたフコシル化ＰＳＡ標準品を２５μＬ、各ウェルに添加し、室温で１時間放置後、添加液を廃棄した。また、レクチンによる被験者血清中のフコシル化ＰＳＡの検出のために、ＰＢＳで２倍希釈した健常１及び前立腺癌４の血清２５μＬを、各ウェルに添加し、室温で１時間放置後、添加液を廃棄した。
（６）洗浄
１５０μＬの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを各ウェルに添加した後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）標識レクチン反応
実施例８では、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で濃度０．１μｇ／ｍＬに希釈されたビオチン標識ＰｈｏＳＬ ２５μＬを、各ウェルに添加して、４℃で３０分間放置後、添加液を廃棄した。実施例１では、０．１％ＢＳＡ／１０倍希釈ＰＢＳ＋グリシン‐ＮａＯＨ（ｐＨ９．６）で濃度０．１μｇ／ｍＬに希釈されたビオチン標識ＰｈｏＳＬ ２５μＬを、各ウェルに添加して、４℃で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（８）洗浄
１５０μＬの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳを各ウェルに添加した後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応
２５μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン溶液（ベクター社製、濃度０．０４μｇ／ｍＬ １％ＢＳＡ／ＰＢＳ）をウェルに添加し、室温で３０分間放置後、添加液を廃棄した。
（１０）洗浄
１５０μＬの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０添加のＰＢＳを各ウェルに添加した後、添加液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（１１）発色反応
ＨＲＰ用発色基質（製品名：ＴＭＢ、ＫＰＬ社製）を２５μＬ、各ウェルに添加し、室温で１０分間放置した。
（１２）反応停止
１Ｍ リン酸を２５μＬ添加して、反応を停止した。
（１３）吸光度測定
プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度（Ａｂ）を測定し、測定値（Ａｂ_{４５０－６３０}）を求めた。
（１４）検量線の作成
フコシル化ＰＳＡ標準品のビオチン標識ＰｈｏＳＬでのシグナル（反応値、Ａｂ_{４５０－６３０}）をプロットした検量線を作成した。フコシル化ＰＳＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬに対応するビオチン標識ＰｈｏＳＬのシグナル（Ａｂ_{４５０－６３０}）を１０Ｕ／ｍＬとした。
（１５）反応値の算出
被験者試料Ａの血清中フコシル化ＰＳＡに対するビオチン標識ＰｈｏＳＬのシグナル（Ａｂ_{４５０－６３０}）を上記検量線に当てはめて、反応値（単位：Ｕ／ｍＬ）を算出した。

【0099】

レクチン反応時のｐＨを変えた試験（実施例８及び実施例１）のＰｈｏＳＬ反応値の測定結果を、表８に示す。

【表8】

【0100】

表８から、血清中フコシル化ＰＳＡとＰｈｏＳＬとの反応工程のｐＨを本発明に従って特定のアルカリ性域で行った実施例１は、実施例８と比べて、前立腺癌のＰｈｏＳＬ反応値Ａが増大する一方で、健常１のＰｈｏＳＬ反応値Ｂが減少することがわかる。反応値ＡとＢとの差Δが拡大する結果、本発明に従う実施例１では、前立腺癌患者（ＧＳ６）を高感度に検出できることが判明した。

【0101】

〔実施例２〕ＰｈｏＳＬを用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験（ＩＩ）
被検者試料Ａに対して実施例１と同一の操作でＰｈｏＳＬ反応値を測定した。その結果を表９に示す。ＰｈｏＳＬ反応値から、平均値及び中央値を求めた。さらに、目安のカットオフ値（８９．７Ｕ／ｍＬ）を用いて、前立腺癌患者の検出率（陽性率）、及び健常者の偽検出率（偽陽性率）を求めた。結果を表１０に示す。

【0102】

表９中の比較例１は、血中ＰＳＡ値の測定結果である。血清ＰＳＡ値のカットオフ値は、４ｎｇ／ｍＬとした。実施例２と同様に、平均値、中央値、陽性率及び偽陽性率を求めた。それらの結果を表１０に示す。

【0103】

表９中の比較例２は、被験者試料Ａに対してＡＡＬを用いた血清中フコシル化ＰＳＡの検出結果（ＡＡＬ反応値）である。具体的には、実施例８において、ビオチン標識ＰｈｏＳＬをビオチン標識ＡＡＬに代えて、実施例８と同一の操作でＡＡＬ反応値を測定した。ＡＡＬ反応値の目安のカットオフ値は、８９４．８Ｕ／ｍＬとした。実施例２と同様に、ＡＡＬ反応値から、平均値、中央値、陽性率及び偽陽性率を求めた。それらの結果を表１０に示す。

【0104】

【表9】

【0105】

【表10】

【0106】

表１０に示すとおり、血中ＰＳＡ値による前立腺癌患者群の検出率（陽性率）は、７７％であった。ＡＡＬ反応値による前立腺癌患者群の検出率（陽性率）は、８９％となった。しかし、健常者群を前立腺癌と判断してしまう偽陽性率も５７％と高かった。本発明に従う実施例２では、前立腺癌患者群の陽性率は１００％であり、健常者群の偽陽性率は０％であった。以上のことから、本発明に従ってフコースα１→６特異的レクチンを特定の条件で用いると、前立腺癌を高感度及び高特異度で検出可能であることが判明した。

【0107】

次に、表９の前立腺癌患者群の測定結果を、Ｎｅｇａｔｉｖｅ（Ｇ５以下）、ＧＳ６、ＧＳ７、及びＧＳ８以上にグループ分けし、各グループの平均値及び中央値を表１１に示す。

【表11】

【0108】

表１１を見ると、血中ＰＳＡ値やＡＡＬ反応値の中央値とＧＳとの間には、相関が認められない。実施例２には、ＧＳの増大（悪性度の進行）とともに、ＰｈｏＳＬ反応値の中央値に増大傾向が認められる。

【0109】

〔実施例３〕ＰｈｏＳＬを用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験（ＩＩＩ）
実施例２でのＰｈｏＳＬ反応値の中央値とＧＳとの相関関係の存在を確認するために、被験者試料Ａよりもｎ数が多い被験者試料ＢでＰｈｏＳＬ反応値を実施例２と同一の操作で測定した。結果を表１２に示す。比較のため、血中ＰＳＡ値の測定結果も表１２に併記する。

【0110】

【表12】

【0111】

表１２に示すとおり、血中ＰＳＡ値とＧＳとの間には、相関が認められない。一方、本発明に従う実施例３では、ＰｈｏＳＬ反応値の中央値は、ＧＳとともに増大する傾向が認められる。表１１及び１２の結果から、ＰｈｏＳＬのようなフコースα１→６特異的レクチンを特定の条件で用いれば、反応値によってＧＳを予測可能である。よって、本発明の方法により、生検せずにＧＳを予見すること及びＧＳ７以上の高リスク前立腺癌を予見することが期待される。

【0112】

〔実施例４及び９〕サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）を用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験
実施例１及び実施例８において、ＰｈｏＳＬをＳＲＬに変えた以外は、実施例１及び実施例８と同じ操作で、２種類のＳＲＬ反応値を測定した。結果を表１３に示す。

【表13】

【0113】

表１３で、血清中フコシル化ＰＳＡとＳＲＬとの反応を特定のアルカリ性域で行った実施例４では、実施例９と比べて、前立腺癌患者の反応値が増大する一方で、健常者の反応値が低下する。したがって、ＳＲＬを特定の条件で用いても、血清中フコシル化ＰＳＡを高感度で検出可能である。そして、ＳＲＬは、前立腺癌の検出に有効である。

【0114】

〔実施例５及び１０〕クリタケレクチン（ＮＳＬ）を用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験
実施例１及び実施例８において、ＰｈｏＳＬをＮＳＬに変えた以外は、実施例１及び実施例８と同じ操作で、２種類のＮＳＬ反応値を測定した。結果を表１４に示す。

【表14】

【0115】

表１４で、血清中フコシル化ＰＳＡとＮＳＬとの反応を特定のアルカリ性域で行った実施例５では、実施例１０と比べて、前立腺癌患者の反応値と健常者の反応値との差Δが拡大する。したがって、ＮＳＬを特定の条件で用いても、血清中フコシル化ＰＳＡを高感度で検出可能である。そして、ＮＳＬは前立腺癌の検出に有効である。

【0116】

〔実施例６及び１１〕ベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）を用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験
実施例１及び実施例８において、ＰｈｏＳＬをＡＭＬに変えた以外は、実施例１及び実施例８と同じ操作で、２種類のＡＭＬ反応値を測定した。結果を表１５に示す。

【表15】

【0117】

表１５で、血清中フコシル化ＰＳＡとＡＭＬとの反応を特定のアルカリ性域で行った実施例６では、実施例１１と比べて、前立腺癌患者の反応値が増大する一方で、健常者の反応値が低下する。ＡＭＬを特定の条件で用いても、血清中フコシル化ＰＳＡを高感度で検出可能である。そして、ＡＭＬは、前立腺癌の検出に有効である。

【0118】

〔実施例７及び１２〕ＰｈｏＳＬペプチドを用いたフコシル化ＰＳＡ検出試験
実施例１及び実施例８において、ＰｈｏＳＬをＰｈｏＳＬペプチドに変えた以外は、実施例１及び実施例８と同じ操作で、２種類のＰｈｏＳＬペプチド反応値を測定した。結果を表１６に示す。

【表16】

【0119】

表１６で、血清中フコシル化ＰＳＡとＰｈｏＳＬペプチドとの反応を特定のアルカリ性域で行った実施例７では、実施例１２と比べて、前立腺癌患者の反応値が増大する一方で、健常者の反応値が低下する。ＰｈｏＳＬペプチドを特定の条件で用いても、血清中フコシル化ＰＳＡを高感度で検出可能である。そして、ＰｈｏＳＬペプチドは、前立腺癌の検出に有効である。

【図1】

【図2】

【配列表】

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