特許 7253198 脂質膜デバイスの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-29

(45)【発行日】2023-04-06

(54)【発明の名称】脂質膜デバイスの製造方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/02 20060101AFI20230330BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20230330BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230330BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20230330BHJP

   G01N 21/64 20060101ALN20230330BHJP

【ＦＩ】

G01N35/02 A

G01N37/00 102

C12M1/00

C07K14/005

G01N21/64 F

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019135688

(22)【出願日】2019-07-23

(65)【公開番号】P2021018210

(43)【公開日】2021-02-15

【審査請求日】2021-11-02

(73)【特許権者】

【識別番号】000004226

【氏名又は名称】日本電信電話株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(73)【特許権者】

【識別番号】513099603

【氏名又は名称】兵庫県公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】110001634

【氏名又は名称】弁理士法人志賀国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大嶋 梓

(72)【発明者】

【氏名】河西 奈保子

(72)【発明者】

【氏名】中島 寛

(72)【発明者】

【氏名】湊元 幹太

(72)【発明者】

【氏名】住友 弘二

【審査官】外川 敬之

(56)【参考文献】

【文献】再公表特許第２００５／０７１４０５（ＪＰ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／０４１７２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１９－０３７２１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／０２５８２２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３５／０２

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ０７Ｋ １４／００５

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記基板の前記一方面上に形成され、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備える脂質膜デバイスの前記脂質二重膜に、
脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を融合させ、その結果、前記脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入される工程を含み、
前記基板の前記一方面と前記脂質二重膜との間に薄膜層が積層され、前記薄膜層は、前記井戸構造の前記開口部に延在するオーバーハング部を有する、
脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法。

【請求項2】

一方面上に開口する井戸構造を有する基板の前記一方面に、
脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を接触させ、その結果、前記脂質小胞が開裂して前記膜タンパク質を含む脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて前記井戸構造の開口部を封止し、前記脂質二重膜に膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスが形成される工程を含む、
脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法。

【請求項3】

前記脂質小胞が、前記膜タンパク質を発現したウイルス由来の出芽ベシクルである、請求項１又は２に記載の脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法。

【請求項4】

前記脂質小胞が、前記膜タンパク質を発現したウイルス由来の出芽ベシクルと巨大脂質ベシクルを融合させたものである、請求項１又は２に記載の脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法。

【請求項5】

一方面上に開口する複数の井戸構造を有する基板の前記一方面に、第１の脂質小胞を接触させ、その結果、前記第１の脂質小胞が開裂して第１の脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて一部の前記井戸構造の開口部を封止する工程と、
前記開口部の前記第１の脂質二重膜に、脂質膜内に第１の膜タンパク質を含む第２の脂質小胞を融合させ、その結果、前記開口部の前記第１の脂質二重膜に前記第１の膜タンパク質が導入される工程と、
前記基板の前記一方面に、脂質膜内に第２の膜タンパク質を含む第３の脂質小胞を接触させ、その結果、前記第３の脂質小胞が開裂して前記第２の膜タンパク質を含む第２の脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて前記井戸構造の開口部を封止し、前記第２の脂質二重膜に第２の膜タンパク質が導入される工程と、を含む、脂質二重膜に前記第１の膜タンパク質及び前記第２の膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法。

【請求項6】

一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、
前記脂質二重膜は膜タンパク質を含み、
前記膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されており、
前記膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されており、
前記基板の前記一方面と前記脂質二重膜との間に薄膜層が積層され、前記薄膜層は、前記井戸構造の前記開口部に延在するオーバーハング部を有する、
脂質膜デバイス。

【請求項7】

一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、
前記脂質二重膜は膜タンパク質を含み、
前記膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されており、
前記膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されている、脂質膜デバイス。

【請求項8】

一方面上に開口した第１の井戸構造及び第２の井戸構造を有する基板と、前記第１の井戸構造の開口部を封止する第１の脂質二重膜と、前記第２の井戸構造の開口部を封止する第２の脂質二重膜とを備え、
前記第１の脂質二重膜は第１の膜タンパク質を含み、
前記第２の脂質二重膜は第２の膜タンパク質を含み、
前記第１の膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記第１の井戸構造の外部に配置されており、
前記第１の膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記第１の井戸構造の内部に配置されており、
前記第２の膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記第２の井戸構造の内部に配置されており、
前記第２の膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記第２の井戸構造の外部に配置されている、脂質膜デバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脂質膜デバイス及び脂質膜デバイスの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞膜に存在する膜タンパク質は多種多様であり創薬のターゲットになっている。膜タンパク質は取り扱いが難しいため、機能解析には膨大な時間と費用がかかるという問題がある。膜タンパク質を半導体基板上にアレイ化した超小型のバイオチップが実現できれば、多くの膜タンパク質の機能を同時かつ高速に解析することが可能となるため、新薬開発に要する時間の短縮や費用の低減等多くの効果が期待される。

【0003】

膜タンパク質を基板上で解析する方法としては、細胞そのものを基板上に配列し、パッチクランプ法により機能計測を行う方法がある。しかしながら、通常細胞膜上には目的とする膜タンパク質以外の膜タンパク質も複数存在しており、ある薬剤で刺激しても得られた応答が目的の膜タンパク質に起因するものなのか不明瞭であるという問題があった。そのため、精製した膜タンパク質を用いたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での測定系の構築が産業上あるいは研究上の実用的側面で要求されている。

【0004】

インビトロ系で代表的な膜タンパク質を配置する方法として、脂質分子をｎ－デカン等の有機溶媒に溶解し、水溶液中で脂質溶液を基板上に設けられた小孔に塗りつけることにより形成した黒膜に、膜タンパク質を融合させる方法（例えば、非特許文献１参照）がある。しかしながら、この手法では、形成された黒膜の残留有機溶媒や不均一性が、膜タンパク質の生理活性に影響を与える可能性が指摘されている。

【0005】

これらの問題を改善するために、本発明者らは、シリコン等の基板上に人工的に井戸構造部を作製し、井戸開口部に巨大脂質膜ベシクルを展開させ、得られた基板上の人工脂質二重膜上に膜タンパク質を導入する手法を提案した（非特許文献２）。このように作製した人工脂質二重膜基板は、巨大脂質膜ベシクルを用いているため有機溶剤を含まない。この脂質膜中に再構成した膜タンパク質の活性は、光学的手法（蛍光観察）によって確認することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】「最新パッチクランプ実験技術法」岡田泰伸 編 (2011年、吉岡書店）

【文献】Sumitomo K et al., Biosensors and Bioelectronics, vol.31, 445-450, 2012.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

人工脂質二重膜へ膜タンパク質を導入するために、膜タンパク質を含んだ膜画分やプロテオリポソーム（膜タンパク質を再構成した脂質ベシクル）を人工脂質二重膜に融合させる方法がある。しかしながら、この手法では、人工脂質二重膜における膜タンパク質の配向を制御できないという問題があった。膜タンパク質はその機能と向き（配向性）に関連があるため、膜タンパク質の機能を正しく解析するためには配向制御が必要である。

【0008】

上記事情に鑑み、本発明は、人工脂質二重膜における膜タンパク質の配向を制御する技術を提供することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一態様は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記基板の前記一方面上に形成され、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備える脂質膜デバイスの前記脂質二重膜に、脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を融合させ、その結果、前記脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入される工程を含む、脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法である。

【0010】

また、本発明の一態様は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板の前記一方面に、脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を接触させ、その結果、前記脂質小胞が開裂して前記膜タンパク質を含む脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて前記井戸構造の開口部を封止し、前記脂質二重膜に膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスが形成される工程を含む、脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法である。

【0011】

また、本発明の一態様は、上記の脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法であって、前記脂質小胞が、前記膜タンパク質を発現したウイルス由来の出芽ベシクルである。

【0012】

また、本発明の一態様は、上記の脂質二重膜に前記膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法であって、前記脂質小胞が、前記膜タンパク質を発現したウイルス由来の出芽ベシクルと巨大脂質ベシクルを融合させたものである。

【0013】

また、本発明の一態様は、一方面上に開口する複数の井戸構造を有する基板の前記一方面に、第１の脂質小胞を接触させ、その結果、前記第１の脂質小胞が開裂して第１の脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて一部の前記井戸構造の開口部を封止する工程と、前記開口部の前記第１の脂質二重膜に、脂質膜内に第１の膜タンパク質を含む第２の脂質小胞を融合させ、その結果、前記開口部の前記第１の脂質二重膜に前記第１の膜タンパク質が導入される工程と、前記基板の前記一方面に、脂質膜内に第２の膜タンパク質を含む第３の脂質小胞を接触させ、その結果、前記第３の脂質小胞が開裂して前記第２の膜タンパク質を含む第２の脂質二重膜となり、前記一方面上に形成されて前記井戸構造の開口部を封止し、前記第２の脂質二重膜に第２の膜タンパク質が導入される工程と、を含む、脂質二重膜に前記第１の膜タンパク質及び前記第２の膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法である。

【0014】

また、本発明の一態様は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、前記脂質二重膜は膜タンパク質を含み、前記膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されており、前記膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されている、脂質膜デバイスである。

【0015】

また、本発明の一態様は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、前記井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、前記脂質二重膜は膜タンパク質を含み、前記膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されており、前記膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されている、脂質膜デバイスである。

【0016】

また、本発明の一態様は、一方面上に開口した第１の井戸構造及び第２の井戸構造を有する基板と、前記第１の開口部を封止する第１の脂質二重膜と、前記第２の開口部を封止する第２の脂質二重膜とを備え、前記第１の脂質二重膜は第１の膜タンパク質を含み、前記第２の脂質二重膜は第２の膜タンパク質を含み、前記第１の膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されており、前記第１の膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されており、前記第２の膜タンパク質の細胞外領域は封止された前記井戸構造の内部に配置されており、前記第２の膜タンパク質の細胞内領域は封止された前記井戸構造の外部に配置されている、脂質膜デバイスである。

【発明の効果】

【0017】

本発明により、人工脂質二重膜における膜タンパク質の配向を制御することが可能となる。

【0018】

細胞、ウイルス等に発現させた膜タンパク質を、単純に可溶化した後に脂質膜上に再構成した場合、脂質膜における膜タンパク質は２種の配向をとりうる。この場合、脂質膜における膜タンパク質の配向性を制御することは困難であり、膜タンパク質の配向性はランダムとなる。

【0019】

本発明によれば、表面に所望の膜タンパク質を発現したウイルス由来の出芽ベシクル（エンベロープウイルスが形成する出芽ウイルス粒子および／またはその脱核粒子）を用いて、脂質二重膜に膜タンパク質の導入を行うことにより、導入される膜タンパク質の配向性（向きの偏り）を制御することができる。

【0020】

本明細書において「配向性を制御する」とは、脂質膜における膜タンパク質の向きが単一の方向に偏るように制御することをいう。膜タンパク質の配向性が高い、すなわち、膜タンパク質の向きが強く単一の方向に偏るほど、配向性を良く制御できているといえる。

【0021】

ウイルスにおいて発現させた膜タンパク質は、その膜タンパク質が天然で発現している細胞等における向きと同一の向きに揃って出芽ベシクル表面に存在している。
出芽ベシクルの表面には、発現させた所望の膜タンパク質以外に、ウイルスが感染するときに必要とされるエンベロープタンパク質であるＧＰ６４が存在する。ＧＰ６４は、膜融合に関与するタンパク質である。
ＧＰ６４は、ＰＳ（ホスファチジルセリン）等の負電荷脂質に対して特異的に融合する。脂質膜に融合する際、導入されるタンパク質の向きは出芽ベシクルに存在していたときの配向性を維持する。

【0022】

井戸構造上に形成した負電荷脂質を含む脂質二重膜に出芽ウイルスを融合させると、膜タンパク質の配向性は維持されて、井戸構造外部を細胞外部とみなした配向になる。
一方、巨大脂質ベシクルに出芽ウイルスを融合させると、同様に膜タンパク質の配向性は維持されて導入される。出芽ウイルスを融合させた巨大脂質ベシクルを井戸構造上で展開すると、巨大脂質ベシクルの外側は基板側に接し、内側が表面に現れるため膜タンパク質の向きが反転する。
井戸構造に架橋する脂質膜に出芽ベシクルを融合させる場合（１）と、出芽ベシクルを融合させた巨大脂質ベシクルを展開させる場合（２）で、膜タンパク質を逆向きに配置することができる。この二つの導入方法を使い分けること、あるいは組み合わせる事で、井戸構造を架橋する脂質膜への膜タンパク質導入において配向を制御する事が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】（ａ）は、脂質膜５０内に膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル５０ａの断面図である。（ｂ）は、脂質膜デバイス１の井戸構造２０付近の正断面図である。（ｃ）は、膜タンパク質６０が導入された脂質膜デバイス１Ａの井戸構造２０付近の正断面図である。

【図2】（ａ）は、出芽ベシクル５０ａが巨大脂質ベシクル７０に融合し、脂質膜７０内に膜タンパク質６０を含む巨大脂質ベシクル７０ａが合成される様子を示す模式図である。（ｂ）は、基板１０の井戸構造２０付近の正断面図である。（ｃ）は、脂質膜内に膜タンパク質６０を有する巨大脂質ベシクル７０ａによって、基板１０の井戸構造２０の開口部２１が封止された後の、脂質膜デバイス１Ｂの模式図である。

【図3】脂質膜デバイス１Ｃの井戸構造２０付近の正断面図である。

【図4】電極が配置された脂質膜デバイスの模式図である。

【図5】（ａ）は、脂質膜により井戸構造を封止したデバイスを、４８８ｎｍレーザーによって励起し、上から撮影して得られた蛍光画像である。（ｂ）は、５６１ｎｍレーザーによって励起した蛍光画像である。

【図6】（ａ）は、膜タンパク質を含む脂質膜により井戸構造を封止したデバイスを、４８８ｎｍレーザーによって励起し、上から撮影して得られた蛍光画像である。（ｂ）は５６１ｎｍレーザーによって励起した蛍光画像である。

【図7】図５（ｂ）及び図６（ｂ）の破線における、ＲＦＰの蛍光強度を測定した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

［製造方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、基板の一方面上に形成され、井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備える脂質膜デバイスの脂質二重膜に、脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を融合させ、その結果、脂質二重膜に膜タンパク質が導入される工程を含む、脂質二重膜に膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法を提供する。

【0025】

本発明の１実施形態にかかる脂質膜デバイス１Ａの製造方法について、図面を参照して説明する。脂質膜デバイスは、基板の一方面（上面）に井戸構造を有している。
図１（ａ）は、脂質膜５０内に膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル５０ａの断面図である。図１（ｂ）は、脂質膜デバイス１の井戸構造２０付近の正断面図である。図１（ｃ）は、膜タンパク質６０が導入された脂質膜デバイス１Ａの井戸構造２０付近の正断面図である。
なお、図１（ｂ）、（ｃ）において、上側を上、下側を下として説明する。
一方面とは、基板１０の井戸構造２０が開口している方向をいう。

【0026】

本実施形態において、膜タンパク質を含む脂質小胞は、次に述べるような、ウイルスが分泌を誘導する出芽ベシクル５０ａであってもよい。
図１（ａ）に例示されるように、出芽ベシクル５０ａは、脂質膜５０内に膜タンパク質６０を含んでいる。膜タンパク質６０の膜貫通領域は、脂質膜５０内に埋め込まれている。
ウイルスが分泌を誘導する出芽ベシクル５０ａにおいては、膜タンパク質６０の配向性は揃っている。すなわち、出芽ベシクル５０ａが有する膜タンパク質６０の、脂質膜５０の外側部分は、膜タンパク質６０の細胞外領域である。出芽ベシクル５０ａの膜タンパク質６０の、脂質膜５０の内側部分は、膜タンパク質６０の細胞内領域である。

【0027】

図１（ｂ）に例示されるように、脂質膜デバイス１は、基板１０と、基板１０の上面の凹部である井戸構造２０を有し、井戸構造２０の開口部２１は脂質二重膜３０により封止されている。
基板１０の上面と脂質二重膜３０の間には、薄膜層１１が積層されていてもよい。薄膜層１１の末端（オーバーハング部１１ａ）は、井戸構造２０の開口部２１に延在していてもよい。

【0028】

脂質膜５０内に膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル（脂質小胞）５０ａを、井戸構造２０の開口部２１の脂質二重膜３０に融合させる工程を行うことにより、膜タンパク質６０を、開口部２１の脂質二重膜３０に導入することができる。

【0029】

図１（ｃ）は、出芽ベシクル（脂質小胞）５０の膜タンパク質６０が、開口部２１を封止する脂質二重膜３０に融合した後の様子を示す模式図である。
出芽ベシクル５０ａを脂質二重膜３０に融合させると、膜タンパク質６０の細胞外領域は開口部２１の脂質二重膜３０の外側（井戸構造２０の外部）に配置され、膜タンパク質６０の細胞内領域は開口部２１の脂質二重膜３０の内側（井戸構造２０の内部）に配置される。
本明細書において、井戸構造２０の内部とは、脂質二重膜３０の下側にあって、井戸構造２０と脂質二重膜３０により閉じられた内部の空間を意味する。また、井戸構造２０の外部とは、脂質二重膜３０の上側の空間を意味する。
すなわち、開口部２１の脂質二重膜３０の膜タンパク質６０は、出芽ベシクル５０ａにおける配向性、細胞における膜タンパク質の配向性を維持している。

【0030】

本実施形態において、脂質膜５０内に膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル５０ａを、開口部２１の脂質二重膜３０に融合させるために、出芽ベシクル５０ａの外形寸法は、開口部２１の外形寸法よりも小さく設定することが好ましい。

【0031】

本実施形態の製造方法により、次のような脂質膜デバイス（脂質膜デバイス１Ａ）を製造することができる。
一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、脂質二重膜は膜タンパク質を含み、膜タンパク質の細胞外領域は封止された井戸構造の外部に配置されており、膜タンパク質の細胞内領域は封止された井戸構造の内部に配置されている、脂質膜デバイス。

【0032】

（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、一方面上に開口する井戸構造を有する基板の一方面に、脂質膜内に膜タンパク質を含む脂質小胞を接触させ、その結果、脂質小胞が開裂して膜タンパク質を含む脂質二重膜となり、一方面上に形成されて井戸構造の開口部を封止し、脂質二重膜に膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスが形成される工程を含む、脂質二重膜に膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法を提供する。

【0033】

本発明の１実施形態にかかる脂質膜デバイス１Ｂの製造方法について、図面を参照して説明する。図２（ａ）は、出芽ベシクル５０ａが巨大脂質ベシクル７０に融合し、脂質膜７０内に膜タンパク質６０を含む巨大脂質ベシクル７０ａが合成される様子を示す模式図である。図２（ｂ）は、基板１０の井戸構造２０付近の正断面図である。図２（ｃ）は、脂質膜内に膜タンパク質６０を有する巨大脂質ベシクル７０ａによって、基板１０の井戸構造２０の開口部２１が封止された後の、脂質膜デバイス１Ｂの模式図である。
なお、図２（ｂ）、（ｃ）において、上側を上、下側を下として説明する。
一方面とは、基板１０の井戸構造２０が開口している方向をいう。

【0034】

本実施形態において、膜タンパク質を含む脂質小胞は、次に述べるような、巨大脂質ベシクル（脂質小胞）７０ａであってもよい。
巨大脂質ベシクル７０ａは、例えば、上述した膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル５０ａを、後述する巨大脂質ベシクル７０に融合させて得られたものであってもよい。出芽ベシクル５０ａにおいて膜タンパク質６０の配向は揃っているため、出芽ベシクル５０ａを巨大脂質ベシクル７０に融合させて得られた巨大脂質ベシクル７０ａにおいても、膜タンパク質６０の配向性は維持される。得られた巨大脂質ベシクル７０ａの膜タンパク質６０の、脂質膜７０の外側部分は、膜タンパク質６０の細胞外領域である。得られた巨大脂質ベシクル７０ａの膜タンパク質６０の、脂質膜７０の内側部分は、膜タンパク質６０の細胞内領域である。

【0035】

上述の膜タンパク質６０が導入された巨大脂質ベシクル７０ａを、基板１０の上面に接触させ、巨大脂質ベシクル７０ａを開裂させる。
その結果、図２（ｃ）に例示されるように、膜タンパク質６０を含む脂質二重膜３０は、井戸構造２０の開口部２１を封止する。このようにして、脂質二重膜３０に膜タンパク質６０が導入された脂質膜デバイス１Ｂが形成される。

【0036】

上述の脂質膜デバイス１Ｂにおいて、膜タンパク質６０の細胞外領域は開口部２１の脂質二重膜３０の内側（井戸構造２０の内部）に配置され、膜タンパク質６０の細胞内領域は開口部２１の脂質二重膜３０の外側（井戸構造２０の外部）に配置される。

【0037】

本実施形態において、脂質膜７０内に膜タンパク質６０を含む巨大脂質ベシクル７０ａを開裂させて、開口部２１の脂質二重膜３０を封止するために、脂質小胞７０ａの外形寸法は、開口部２１の外形寸法よりも大きく設定することが必要である。巨大脂質ベシクル７０ａの外形寸法が、開口部２１の外形寸法よりも小さい場合、巨大脂質ベシクル７０ａは井戸構造２０の内部に落ち込み、開口部２１を覆うことができない。

【0038】

本実施形態の製造方法により、次のような脂質膜デバイス（脂質膜デバイス１Ｂ）を製造することができる。
一方面上に開口する井戸構造を有する基板と、井戸構造の開口部を封止する脂質二重膜とを備え、脂質二重膜は膜タンパク質を含み、膜タンパク質の細胞外領域は封止された井戸構造の内部に配置されており、膜タンパク質の細胞内領域は封止された井戸構造外部に配置されている、脂質膜デバイス。

【0039】

（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、一方面上に開口する複数の井戸構造を有する基板の一方面に、第１の脂質小胞を接触させ、その結果、第１の脂質小胞が開裂して第１の脂質二重膜となり、一方面上に形成されて一部の井戸構造の開口部を封止する工程と、開口部の第１の脂質二重膜に、脂質膜内に第１の膜タンパク質を含む第２の脂質小胞を融合させ、その結果、開口部の第１の脂質二重膜に第１の膜タンパク質が導入される工程と、基板の一方面に、脂質膜内に第２の膜タンパク質を含む第３の脂質小胞を接触させ、その結果、第３の脂質小胞が開裂して第２の膜タンパク質を含む第２の脂質二重膜となり、一方面上に形成されて井戸構造の開口部を封止し、第２の脂質二重膜に第２の膜タンパク質が導入される工程と、を含む、脂質二重膜に第１の膜タンパク質及び第２の膜タンパク質が導入された脂質膜デバイスの製造方法を提供する。

【0040】

本発明の１実施形態にかかる脂質膜デバイス１Ｃの製造方法について、図面を参照して説明する。図３は、出芽ベシクル５０ａと巨大脂質ベシクル７０とから形成された、脂質膜デバイス１Ｃの井戸構造２０付近の正断面図である。脂質膜デバイス１Ｃは、開口部２１を封止する脂質二重膜３０に第１の膜タンパク質６０及び第２の膜タンパク質６１が導入されている。
本実施形態において、同一の基板１０において、各井戸構造２０毎に異なる向きに膜タンパク質６０及び膜タンパク質６１を配置することができる。各井戸構造２０においては、膜タンパク質６０及び膜タンパク質６１の向きは揃っている。
膜タンパク質６０と膜タンパク質６１は同一のタンパク質であってもよいし、異なるタンパク質であってもよい。

【0041】

本実施形態では、同一の基板１０を用いて、第１実施形態において上述した製造方法により、井戸構造２０の開口部２１の脂質二重膜に膜タンパク質６０を導入し、第２実施形態において上述した製造方法により、井戸構造２０の開口部２１に膜タンパク質６１を導入する。これについて詳細に説明する。

【0042】

まず、複数の井戸構造２０を有する基板の前記一方面に、膜タンパク質６０を有しない第１の脂質小胞７０を接触させる。第１の脂質小胞７０は、後述する巨大脂質ベシクルであってもよい。
その結果、第１の脂質小胞７０は開裂して第１の脂質二重膜３０となり、基板１０上の複数の井戸構造２０のうち、一部の井戸構造２０の開口部２１を封止する。すなわち、この段階では、基板１０上に、開口部２１が脂質二重膜３０によって封止されている井戸構造２０と、開口部２１が脂質二重膜によって封止されていない井戸構造２０とが、基板１０上に存在する。

【0043】

続いて、開口部２１を封止している第１の脂質二重膜に、脂質膜内に第１の膜タンパク質６０を含む第２の脂質小胞を融合させる。第２の脂質小胞は、上述した出芽ベシクル５０ａであってもよい。
その結果、開口部２１を封止している第１の脂質二重膜に、第１の膜タンパク質６０が導入される。第１の膜タンパク質６０の配向性は、第１実施形態における、開口部２１の膜タンパク質６０の配向性と同一である。
この段階において、基板１０上に、開口部２１が脂質二重膜によって封止されていない井戸構造２０が基板１０上に存在する。

【0044】

続いて、基板１０の一方面に、脂質膜内に第２の膜タンパク質６１を含む第３の脂質小胞を接触させる。第３の脂質小胞は、上述した巨大脂質ベシクル７０ａであってもよい。
その結果、第３の脂質小胞が開裂して第２の膜タンパク質６１を含む第２の脂質二重膜となる。脂質二重膜により封止されていなかった開口部は、第２の脂質二重膜により封止され、第２の脂質二重膜に第２の膜タンパク質６１が導入される。
導入された膜タンパク質６１の細胞外領域は井戸構造２０の内部に配置され、膜タンパク質６１の細胞内領域は井戸構造２０の外部に配置される。

【0045】

なお、次に示すような方法によって、同一の基板１０において、異なる向きに膜タンパク質６０を配置し、各井戸構造２０の脂質二重膜３０に導入された膜タンパク質の向きを同定することができる。
以下、基板１０には複数の井戸構造２０が形成されている場合について、説明する。
まず、基板１０の上面に蛍光物質２３を接触させて、基板１０の井戸構造２０の内部に蛍光物質２３を流入させる。続いて、脂質膜を井戸構造２０の開口部２１付近で開裂させる。すると、一部の開口部２１は脂質二重膜により封止されるため、蛍光物質２３は井戸構造２０の内部に閉じ込められる。
続いて、脂質膜内に膜タンパク質６０を含む出芽ベシクル５０ａを、開口部２１の脂質二重膜３０に融合させる。すると、井戸構造２０に蛍光物質２３が内包され、かつ、その井戸構造２０の開口部２１の脂質二重膜３０に膜タンパク質６０が導入される。
この時、導入された膜タンパク質６０の細胞外領域は井戸構造２０の外側に配置され、膜タンパク質６０の細胞内領域は井戸構造２０の内側に配置される。

【0046】

続いて、基板１０の上面から蛍光物質２３を除去し、基板１０の上面に蛍光物質２４を接触させて、開口部２１が脂質二重膜で封止されていない井戸構造２０の内部に蛍光物質２４を流入させる。続いて、脂質膜内に膜タンパク質６１を含む巨大脂質ベシクル７０ａを、基板１０の上面に接触させる。すると、開口部２１は、膜タンパク質６１を含む脂質二重膜３０により封止され、蛍光物質２４は井戸構造２０の内部に閉じ込められる。
この時、導入された膜タンパク質６１の細胞外領域は井戸構造２０の内側に配置され、膜タンパク質６１の細胞内領域は井戸構造２０の外側に配置される。

【0047】

上述のように、異なる蛍光を発する蛍光物質２３、２４を用いることにより、開口部２１の脂質二重膜の膜タンパク質６０の配向性を区別できる。

【0048】

本実施形態の製造方法により、次のような脂質膜デバイス（脂質膜デバイス１Ｃ）を製造することができる。
一方面上に開口した第１の井戸構造及び第２の井戸構造を有する基板と、第１の開口部を封止する第１の脂質二重膜と、第２の開口部を封止する第２の脂質二重膜とを備え、第１の脂質二重膜は第１の膜タンパク質を含み、第２の脂質二重膜は第２の膜タンパク質を含み、第１の膜タンパク質の細胞外領域は封止された井戸構造の外部に配置されており、第１の膜タンパク質の細胞内領域は封止された井戸構造の内部に配置されており、第２の膜タンパク質の細胞外領域は封止された井戸構造の内部に配置されており、第２の膜タンパク質の細胞内領域は封止された井戸構造の外部に配置されている、脂質膜デバイス。

【0049】

（第４実施形態）
図４は、電極が配置された脂質膜デバイスの模式図である。図４に例示されるように、脂質二重膜３０を形成した基板１０に電極４０を配置することにより、井戸構造２０の内外の電流を測定することができる。
脂質二重膜３０は高抵抗であるため、井戸構造２０の開口部２１が脂質二重膜３０によって封止されると、電流値は変化する。

【0050】

第３実施形態において上述したように、開口部２１の脂質二重膜３０における膜タンパク質６０、６１の向きを制御することができる。
ここで、巨大脂質ベシクル７０で開口部２１を封止した後に、膜タンパク質６０を有する出芽ベシクル５０ａを融合させた場合、巨大脂質ベシクル７０で開口部２１を封止した際に電流値が変化する。
また、膜タンパク質６１を有する巨大脂質７０ａベシクルにより開口部２１封止した場合、その際に電流値が変化する。
さらに、脂質二重膜３０で封止した際の井戸構造２０内外の電流値の変化を、井戸構造２０の位置情報を関連付けることで、各井戸構造２０における膜タンパク質の向きを識別することができる。

【0051】

また、図４に示すような電極４０、または井戸構造２０の内部に流路５０を配置することにより、膜タンパク質６０を有する脂質二重膜３０のマニュピレーションを行うことができる。

【0052】

電極４０は、基板１０の表面－井戸構造２０の外部、井戸構造２０内部－井戸構造２０の外部に、電位差を生じさせることができる。流路５０は井戸内部へ溶液の流れを生じさせることができる。

【0053】

脂質二重膜基板は、図４に示すように、基板１０に井戸構造２０が形成されている。脂質二重膜による井戸のシール効率を上げ、また脂質膜の架橋構造を安定に保つために井戸構造部２０の開口部（開口）２１には、オーバーハング部（ひさし部）１１ａが設けられていることが望ましい。井戸構造２０内部には、膜タンパク質の機能計測のための蛍光物質２３あるいは電極４０が配置されている。蛍光物質２３や電極４０は、そのどちらかを配置、あるいは両方を配置することも可能である。

【0054】

基板１０の材質は、蛍光顕微鏡による井戸構造２０の蛍光観察を妨げず、生理的実験に通常用いる緩衝溶液のｐＨ範囲内（３～１０）で基板表面が負に荷電するものが好ましい。
基板１０の材質としては、例えば、シリコン、シリコン酸化物、シリコン窒化物、石英、マイカ、ガラス等を挙げることができる。

【0055】

基板１０が有する井戸構造２０の個数は特に限定されない。井戸構造２０の代わりに、底面を有しない貫通孔であってもよい。
井戸構造２０の開口部２１の形状は，脂質二重膜を安定に形成する観点から，円形状または四角形状であることが望ましい．円形状の開口部２１の直径あるいは四角形状の開口部２１の一辺は，１００ｎｍ～１０μｍの範囲であることが好ましい。
膜タンパク質６０のサイズは、一般的には、１０～２０ｎｍ程度である。１００ｎｍを下限値とするのは、膜タンパク質６０を、開口部２１の脂質二重膜３０に保持させるためである。上限値を１０μｍとするのは，脂質小胞の脂質二重膜が封止することのできる井戸のサイズの上限が１０μｍ程度であることによる。

【0056】

基板１０への井戸構造２０の形成方法は、例えば、フォトリソグラフィ法，電子ビームリソグラフィ法，ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。
基板１０の表面には，井戸構造２０の開口部２１にオーバーハング部１１ａを形成するための薄膜層１１が設けられていてもよい。オーバーハング部１１ａは，基板１０の上面を延長するように、井戸構造２０の開口部２１の開口を狭める方向に延ばして形成されている。
薄膜層１１の材質は、脂質二重膜３０が付着すれば、基板１０の材質と同じでもよいし、違う材質でもよい。オーバーハング部１１ａの作製過程において、選択的エッチング法を適用できることから、異なる材質を用いることが望ましい。薄膜層１１の厚さは、５０ｎｍ～５００ｎｍであることが望ましい。

【0057】

膜タンパク質を細胞等に発現させ、得られた膜タンパク質を、界面活性剤を用いて可溶化した後に、界面活性剤を除去して再構成する場合、膜タンパク質の配向性の制御は困難である。
しかしながら、上述したように、膜タンパク質を含むウイルス由来の出芽ベシクルにおいては、膜タンパク質の配向性を揃えることができる。この場合、膜タンパク質を有する脂質膜には界面活性剤が混入しないため、膜タンパク質の活性は安定的に維持される。また、膜タンパク質の配向性が揃っているため、膜タンパク質の機能を高効率で利用することができる。

【0058】

また、この出芽ベシクルを巨大脂質ベシクルに融合させた場合、融合した小胞においても膜タンパク質の配向性を揃えることができる（例えば、Kamiya K et al., Confocal microscopic observation of fusion between baculovirus budded virus envelopes and single giant unilamellar vesicles., Biochim Biophys Acta. 2010 Sep;1798(9):1625-31.）。
出芽ベシクル及び融合した小胞において、膜タンパク質の細胞外領域は、それぞれの膜の外側に配置される。すなわち、出芽ベシクル及び融合した小胞において、膜タンパク質の配向性は、天然の細胞における配向性と同一である。

【0059】

出芽ベシクルを誘導して分泌するウイルス（膜タンパク質６０を発現させるウイルス）としては、例えば、レトロウイルス、パラミクソウイルスであってもよい。バキュロウイルスは、環状二本鎖DNA を遺伝子としてもつ昆虫の病原ウイルスである。具体的には Nucleopolyhedronvirus(NPVs)とGranolovirus(GVs)の2種類に加えてnon-occluded virusesが知られている。このうち、NPV (核多角体病ウイルス) は、感染した細胞の核内に核多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパク質の４０～５０％ に達するほど大量につくるので、バイオテクノロジーに多用されている。

【0060】

バキュロウイルスは真核生物を用いたタンパクの発現系として、大量にしかも生物学的粋一性を保持した状態で発現できるため注目されている。簡便なキットが市販され、ルーチンに用いられる技術になりつつあり、バキュロウイルスを用いることで、簡便で安価に上記出芽ベシクルを得ることができるとともに、後述する膜融合タンパクがよく知られているタンパク質であるため、融合の条件等が既知であり当該の目的のために使用しやすい。

【0061】

膜タンパク質６０としては、脂質膜を貫通する部位を有する膜受容体であってもよい。膜受容体としては、例えば、１回膜貫通型受容体、４回膜貫通型受容体、７回膜貫通型受容体であってもよい。膜受容体は、種々のリガンドを受容する。リガンドは多種多様で、例えば、アミノ酸、低分子の有機化合物、ステロイド、アミノ酸やその誘導体、ペプチド、タンパク質等がある。

【0062】

１回膜貫通型受容体としては、例えば、Ｉ型サイトカイン受容体、細胞質側で酵素活性を持つ酵素共役型受容体が挙げられる。このタイプの受容体では、リガンドの結合によって受容体のリン酸化の程度が変化し、キナーゼ活性やホスファターゼ活性等の酵素活性の作用が発現する。チロシンキナーゼ、セリン・スレオニンキナーゼ活性を持つ受容体がある。

【0063】

４回膜貫通型受容体としては、例えば、サブユニット構造を形成し、イオンチャネルとしての機能をもつものが挙げられる。イオンチャネル型受容体は、リガンドが結合すると、イオンチャネルが開き、イオンの流入や流出が起こって、特有の効果が発現する。

【0064】

７回膜貫通型受容体としては、例えば、各種Ｇタンパク質と共役して作用を発現するものが挙げられる。Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、ド一パミンやセロトニン等の生体アミン、プロスタグランジン等の脂質誘導体、アデノシン等の核酸、ＧＡＢＡ等のアミノ酸、生理活性ペプチド類 (例えば、アンジオテンシン、ブラジキニン、コレシストキニン等)をリガンドとするレセプターファミリーを形成している。さらに、ＧＰＣＲは光、味覚、臭覚に関連する生体外情報伝達物質のレセプターともなっている。ＧＰＣＲは、情報伝達の中核を担う重要な膜タンパク質である。ヒトゲノム配列を解析することにより、ＧＰＣＲに属するオーファンレセプターが多く見出されるものと期待されている。このよぅなＧＰＣＲに対応するリガンドの発見によって、有効な医薬品開発が可能になると考えられている。
７回膜貫通型受容体の具体例としては、ムスカリン型アセチルコリン受容体、Ａ１アドレナリン受容体、ド一パミン受容体、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、グループＩ代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ１／５） ＧＡＢＡＢ受容体、ＡＴＰ受容体、ロイコトリエン受容体、血小板活性化因子（ＰＡＦ）受容体、オピオイド受容体、オレキシン受容体、エンドセリン受容体、ニューロペプチドＰＡＣＡＰ受容体、ＣＲＨ受容体、ケモカイン受容体、非神経性ムスカリン受容体、アドレナリン受容体、プロスタノイド受容体、プロスタグランジンＥ受容体、プロスタグランジンＥ２受容体、ノシセプチン受容体、カルシトニン受容体、ブラジキニン受容体、グルカゴンファミリーペプチドホルモン受容体、その他のオーファン７回膜貫通型受容体がある。
上記の膜受容体のうち、特に７回膜貫通型受容体は、多種なリガンドに結合し、疾患や医薬品への関与が深い。

【0065】

井戸構造２０内に電極４０を配置する場合は、前述の井戸構造２０の形成前に、電極４０を埋め込む方法がある。電極４０の材質としては、銀／塩化銀や、金、白金等が挙げられる。電極４０を埋め込む基板１０は、絶縁性に優れている事が必要である。その材質としては、シリコン酸化物やシリコン窒化物、アルミナ、酸化タンタル、レジスト膜等が挙げられる。

【0066】

脂質二重膜３０の脂質分子の種類としては、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等の中性脂質分子とホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスフォグリセロール（ＰＧ）、等の負電荷性脂質分子との混合物を用いる。また、コレステロール等を混合してもよい。
脂質二重膜３０の形成方法としては、例えば、その直径が１０μｍ以上の中性脂質／負電荷脂質／コレステロールの三成分系から構成される巨大脂質ベシクルを、基板上で展開することにより脂質二重膜３０を得てもよい。この形成方法を採用すると、基板１０に複数の井戸構造２０を設けた場合に、それら複数の井戸構造２０を、一度に隙間なく、また安定に脂質二重膜３０で覆うことが可能となる。

【0067】

蛍光物質を井戸構造２０内部に配置する場合には、蛍光物質を含む溶液を井戸構造２０の内部に接触させた状態で、前述と同様に、巨大脂質ベシクルを展開する。その結果、井戸構造２０内部に蛍光物質を封じ込んだ状態で井戸構造２０の開口部２１を脂質二重膜３０で覆う事ができる。井戸構造２０の外部に残存する蛍光物質は、井戸構造２０外部の溶液を蛍光物質が含まれない溶液で置換する事で除外する事ができる。

【0068】

開口部２１を封止するための巨大脂質ベシクルを作製する代表的な手法としては、静置水和法や電界形成法がある。ベシクルの作製手法は特に限定されないが、巨大脂質ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に、脂質分子を薄膜化した後、交流電場をかけて水溶液中に巨大脂質膜ベシクルを形成する手法である。
サイズのそろった脂質小胞を得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ数十ｎｍ～数μｍの均一な脂質分子の薄膜を形成することが好ましく、また、交流電場は数百ｍＶ～２Ｖ程度の印加条件が好ましい。該電場範囲よりも低い電場強度では、ベシクルの収量が低く、該電場範囲よりも高い電場強度では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性があるからである。

【実施例】

【0069】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0070】

［実験例１］
（井戸構造を有する基板の作製）
基板に、井戸構造と、井戸構造の開口部にオーバーハング部を形成させた。

【0071】

まず、基板１０として、シリコン基板を用意した。基板１０の上面に、１２０ｎｍの厚さのシリコン酸化膜層（薄膜層）１１を、熱酸化法により形成した。続いて、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法を用いて、円形状の開口部（直径１μｍ）を持つ井戸構造２０を形成した。井戸構造の深さは１μｍに設定した。

【0072】

続いて、井戸構造２０を形成させた上述の基板１０に、水酸化カリウム溶液（１０重量％）を接触させた。これにより、シリコン酸化膜層１１の下の基板１０を、選択的にエッチングし、井戸構造２０の開口部２１の四隅にオーバーハング部１１ａを形成した。

【0073】

［実験例２］
（巨大脂質膜ベシクルの作製および基板への展開）
実験例１において得られた基板上で、脂質膜を開裂し、井戸構造の開口部を脂質二重膜で封止した。

【0074】

まず、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）（８０モル％）とジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）（２０モル％）の混合クロロホルム溶液（濃度２．５ｍＭ）を調製し、得られた溶液に、脂質二重膜用蛍光ラベル剤としてＮＢＤ（ＮＢＤ‐ＤＯＰＥ）を０．５モル％含有させた。

【0075】

続いて、ＩＴＯ基板（ガラス上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｍｍ、５０～１００Ω）上に、前記クロロホルム溶液２００μＬを均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム溶媒を完全に除去することで、均一な脂質分子薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。

【0076】

続いて、ＩＴＯ基板上に、窓部を有するシリコンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に３０ｍＭのスクロース水溶液５００μＬを滴下した。続いて、その上部にＩＴＯ基板を気泡が入らないように配置し、シリコンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んだ。

【0077】

続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、室温で交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により巨大脂質膜ベシクルをスクロース溶液中に分散して形成させた。

【0078】

井戸構造２０を有する基板１０の上に、溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液 ｐＨ４．５）１００μＬを滴下した。さらに、前記巨大脂質膜ベシクル分散液２μＬを溶液中に滴下し、２分間静置することで巨大脂質膜ベシクルを基板上に展開した。球状構造を有するベシクルは基板に衝突し、その球状構造が破壊されることで井戸構造２０を覆うように脂質二重膜を形成する。

【0079】

続いて、励起光として４８８ｎｍおよび５６１ｎｍの波長レーザーを使用し、蛍光観察像を取得した。結果を図５に示す。図５（ａ）は、脂質二重膜を標識するＮＢＤ－ＤＯＰＥに由来する蛍光を、脂質膜デバイスの上から撮影した蛍光画像である。図５（ｂ）は５６１ｎｍレーザーによって励起することで得られた図５（ａ）と同じ位置の蛍光画像である。

【0080】

［実験例３］
（出芽ベシクルによるタンパク質導入）
実験例２において作製した、脂質二重膜３０で覆われた基板に、バキュロウイルス由来の出芽ベシクル（ＢＶ）を添加した。ＢＶには膜タンパク質であるヒトアドレナリン受容体β２（ＡＤＲＢ２）に蛍光プローブＲＦＰを前記受容体のＣ末端に融合して発現させたものを用いた。

【0081】

ＢＶ添加後、室温で静置し、共焦点顕微鏡で蛍光画像を取得した。結果を図６に示す。図６（ａ）は、膜タンパク質を含む脂質膜により井戸構造を封止したデバイスを、４８８ｎｍレーザーによって励起し、上から撮影して得られた蛍光画像である。図６（ｂ）は５６１ｎｍレーザーによって励起した蛍光画像である。図６（ｂ）においては赤い輝点が観察された。

【0082】

図７は、図５（ｂ）及び図６（ｂ）の破線における、ＲＦＰの蛍光強度を測定した結果である。図７中、「融合前」は図５（ｂ）の破線における蛍光強度を示し、「融合後」は図６（ｂ）の破線における蛍光強度を示す。「自立膜部」は、破線部上にある井戸構造の開口部が脂質二重膜によって封止された部分を示す。

【0083】

その結果、基板上の脂質二重膜だけでなく、自立膜部においても、図５（ｂ）における蛍光強度よりも、図７（ｂ）における蛍光強度の値は大きいことが明らかになった。

【0084】

これは５６１ｎｍレーザーで励起されるヒトアドレナリン受容体β２を標識している蛍光タグＲＦＰ由来であり、ヒトアドレナリン受容体β２が脂質二重膜に導入されたことを示している。矢印で示している脂質二重膜で覆われた井戸構造２０にＡＤＲＢ２を標識しているＲＦＰ由来の蛍光が観察された。

【0085】

ＢＶを使用する本手法によってタンパク質機能解析可能箇所である脂質二重膜で覆われた井戸構造２０へタンパク質を導入することに成功した。

【産業上の利用可能性】

【0086】

本発明により、人工脂質二重膜における膜タンパク質の配向を制御することが可能となる。

【符号の説明】

【0087】

１…脂質膜デバイス、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ…脂質膜デバイス、１０…基板、１１…薄膜層、１１ａ…オーバーハング部、２０…井戸構造、２１…開口部、２３、２４…蛍光物質、３０…脂質二重膜、４０…電極（電極層）、５０…出芽ベシクル（脂質膜）、５０ａ…（膜タンパク質６０を含む）出芽ベシクル、６０…（第１の）膜タンパク質、６１…第２の膜タンパク質、７０…巨大脂質ベシクル、７０ａ…（膜タンパク質６０を含む）巨大脂質ベシクル、８０…流路

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】