特許7256557遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-04
(45)【発行日】2023-04-12
(54)【発明の名称】遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞
(51)【国際特許分類】
A01H 5/00 20180101AFI20230405BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20230405BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20230405BHJP
A23L 33/00 20160101ALI20230405BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20230405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230405BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20230405BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20230405BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20230405BHJP
【ＦＩ】
A01H5/00 A
C12N15/29 ZNA
A01H6/46
A23L33/00
A01H5/10
C12N5/10
C12N15/90 Z
C12N15/82 Z
A01H1/00 A
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021001691
(22)【出願日】2021-01-07
(65)【公開番号】P2022106584
(43)【公開日】2022-07-20
【審査請求日】2022-10-12
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】小沢 憲二郎
(72)【発明者】
【氏名】若佐 雄也
(72)【発明者】
【氏名】高野 誠
(72)【発明者】
【氏名】川勝 泰二
(72)【発明者】
【氏名】林 晋平
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－３２１０７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／０５２６９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】「スギ花粉ペプチド含有イネ（7Crp、2mALS、Oryza sativa L.）（Os7Crp1、Os7Crp2）の栽培」, [online], 2020.6.5公表, 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, [2022.11.22検索], インターネット<URL: https://www.naro.go.jp/publicity_report/press/files/niaspress_20200605_R2bessi1.pdf>
【文献】「研究開発段階の遺伝子組換え生物等の第一種使用規程の申請に係る学識経験者からの意見聴取会合（平成30年度第1回）」, [online], [2022.11.22検索], インターネット<URL: https://www.lifescience.mext.go.jp/files/pdf/n2214_r.pdf>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｈ １／００－１７／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、配列番号２で示す塩基配列における１４１３番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から配列番号３で示す塩基配列における１００番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換えイネ。
【請求項3】
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有していることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子組換えイネ。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンであり、
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネから収穫されたコメであり、
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、コメ。
【請求項6】
請求項５に記載のコメを含む食品組成物。
【請求項7】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの繁殖材料であり、
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、繁殖材料。
【請求項8】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの種子であり、
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、種子。
【請求項9】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネに由来する細胞であり、
前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドをゲノム中に有している遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
スギ花粉症の根治療法の１つとして、抗原タンパク質に含まれる抗原決定基（Ｔ細胞エピトープ）や立体構造を破壊した抗原タンパク質の経口投与でも免疫寛容が誘導できる「経口免疫寛容」が、副作用が極めて少ない安全な免疫寛容誘導法として注目されている。
【0003】
７Ｃｒｐは、スギ花粉症の抗原タンパク質Ｃｒｙ ｊ １、Ｃｒｙ ｊ ２中の主用なエピトープの７ヵ所を連結した改変抗原ペプチドである（非特許文献１）。７Ｃｒｐ含有米の経口投与により、モデル生物およびヒトにおいてその経口投与による免疫寛容の誘導が報告されている（非特許文献１～４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Hidenori Takagi et Al." Oral immunotherapy against a pollen allergy using a seed-based peptide vaccine", Plant Biotechnology Journal, vol.3, p. 521－533, 2005
【文献】Domon E, et Al." 26―Week oral safety study in macaques for transgenic rice containing major human T―cell epitope peptides from Japanese cedar pollen allergens", J Agric Food Chem, vol. 57, p5633―5638, 2009
【文献】Shoji Hashimoto et Al. "Clinical trials of Cry j 1 and Cry j 2T-cell epitope peptide-expressing rice in patients with Japanese cedar pollinosis", Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, 2019
【文献】Tomonori Endo et Al." Immunological and Symptomatic Effects of OralIntake of Transgenic Rice Containing 7 Linked Major T-Cell Epitopes from Japanese Cedar Pollen Allergens", Int Arch Allergy Immunol, p1－11, 2020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、これまでに開発されたプロトタイプの７Ｃｒｐ発現イネは、実験目的で使用するには優れているが、食品としての実用化には至っていない。この理由には、プロトタイプの７Ｃｒｐ発現イネには、選抜マーカーに微生物由来のハイグロマイシン耐性遺伝子が含まれていることが挙げられる。
【0006】
本発明の一態様は、食品として実用化可能な改変スギ花粉アレルゲンペプチド質７Ｃｒｐ発現イネを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0008】
本発明の一態様によれば、「食品」として実用化可能なスギ花粉ペプチド７Ｃｒｐ発現イネを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を模式的に示す図である。
【図2】Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド（７Ｃｒｐ）配列の構成を模式的に示す図である。
【図3】Ｔ細胞エピトープ１～７のＣｒｙ ｊ １、またはＣｒｙ ｊ ２上の位置およびアミノ酸配列を示す図である。
【図4】実施例において遺伝子組換えイネの作出に使用したプラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐのマップを示す図である。
【図5】実施例で作出した遺伝子組換えイネ３系統における、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図6】実施例で作出した遺伝子組換えイネ３系統の各組織における、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図7】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２の作出系統図である。
【図8】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２を検出するためのプライマーセットの検討結果を示す図である。
【図9】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２におけるＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１による７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図10】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２におけるＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２による７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図11】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２における２ｍＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図12】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２における内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図13】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２の種子における、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図14】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２とプロトタイプ系統のイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図15】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２系統の種子における７Ｃｒｐの細胞内局在を示す図である。
【図16】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２の種子における、抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図17】実施例で作出したＯｓ７Ｃｒｐ２の異なる世代における、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図18】異なる条件で育成したＯｓ７Ｃｒｐ２の種子における、抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図19】プロトタイプの遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
〔遺伝子組換えイネ〕
下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐ（ｓｅｖｅｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐ（ｓｅｖｅｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0011】
（配列番号１に示す塩基配列）
配列番号１に示す塩基配列は、本態様の遺伝子組換えイネのゲノム中に導入されたＴ－ＤＮＡの全塩基配列をＬＢ側から示している。ここで、本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を図１に基づき説明する。図１に示すように、Ｔ－ＤＮＡ領域内には、２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットに続いてＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１および２がこの順に連結されている。ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットを２カセット挿入することにより、十分な量の有効成分を発現することが可能となった。
配列番号１に示す塩基配列は、本態様の遺伝子組換えイネのゲノム中に導入されたＴ－ＤＮＡの全塩基配列をＬＢ側から示している。ここで、本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を図１に基づき説明する。図１に示すように、Ｔ－ＤＮＡ領域内には、２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットに続いてＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１および２がこの順に連結されている。ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットを２カセット挿入することにより、十分な量の有効成分を発現することが可能となった。
【0012】
（２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセット）
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、Ｔ－ＤＮＡが導入された細胞を選抜する選抜マーカー遺伝子（２ｍＡＬＳ遺伝子）を発現させるための発現カセットである。２ｍＡＬＳ遺伝子は、２点変異型アセト乳酸合成酵素（２ｍＡＬＳ）をコードしている。２ｍＡＬＳは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の野生型のアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）（６４４アミノ酸残基）の第９５番目のグリシンをアラニンに、第６２７番目のセリンをイソロイシンに変換したものである。この遺伝子が導入された細胞は、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩存在下であってもアセト乳酸合成酵素活性が阻害されず、その結果、イネカルスはＡＬＳ阻害剤耐性を獲得する。
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、Ｔ－ＤＮＡが導入された細胞を選抜する選抜マーカー遺伝子（２ｍＡＬＳ遺伝子）を発現させるための発現カセットである。２ｍＡＬＳ遺伝子は、２点変異型アセト乳酸合成酵素（２ｍＡＬＳ）をコードしている。２ｍＡＬＳは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の野生型のアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）（６４４アミノ酸残基）の第９５番目のグリシンをアラニンに、第６２７番目のセリンをイソロイシンに変換したものである。この遺伝子が導入された細胞は、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩存在下であってもアセト乳酸合成酵素活性が阻害されず、その結果、イネカルスはＡＬＳ阻害剤耐性を獲得する。
【0013】
２ｍＡＬＳ遺伝子は、カルス選抜プロモーター（ＣＳＰ）の下流に連結されている。ＣＳＰは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の機能未知遺伝子（Ｏｓ１０ｇ０２０７５００）のプロモーターである。ＣＳＰの制御下で２ｍＡＬＳ遺伝子を発現させることで、２ｍＡＬＳ遺伝子をカルスおよび胚に発現させることができる。
【0014】
２ｍＡＬＳ遺伝子の下流には１０ｋＤａプロラミンターミネーター（１０ｋＤａｔｅｒ）が連結されている。１０ｋＤａｔｅｒは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来１０ｋＤａプロラミン遺伝子のターミネーターであり、２ｍＡＬＳ遺伝子の転写終結を規定する。
【0015】
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、全てイネゲノム由来のＤＮＡ配列からなる。
【0016】
（ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット）
２連結しているＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットは、本態様の遺伝子組換えイネの種子（コメ）において７Ｃｒｐを発現させるための発現カセットである。図１に示す通り、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１は、ＧｌｕＢ－１プロモーターおよびグリテリンシグナルペプチド（ＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ）、７Ｃｒｐ配列（７Ｃｒｐ）、ＫＤＥＬ局在化シグナル（ＫＤＥＬ）、およびＧｌｕＢ－１ターミネーター（ＧｌｕＢ１ Ｔ）、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２はＧｌｕＢ－１プロモーターおよびグリテリンシグナルペプチド（ＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ）、７Ｃｒｐ配列（７Ｃｒｐ）、ＫＤＥＬ局在化シグナル（ＫＤＥＬ）、およびＧｌｕＢ－４ターミネーター（ＧｌｕＢ４ Ｔ）からなる配列よりそれぞれ構成されている。
２連結しているＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットは、本態様の遺伝子組換えイネの種子（コメ）において７Ｃｒｐを発現させるための発現カセットである。図１に示す通り、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１は、ＧｌｕＢ－１プロモーターおよびグリテリンシグナルペプチド（ＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ）、７Ｃｒｐ配列（７Ｃｒｐ）、ＫＤＥＬ局在化シグナル（ＫＤＥＬ）、およびＧｌｕＢ－１ターミネーター（ＧｌｕＢ１ Ｔ）、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２はＧｌｕＢ－１プロモーターおよびグリテリンシグナルペプチド（ＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ）、７Ｃｒｐ配列（７Ｃｒｐ）、ＫＤＥＬ局在化シグナル（ＫＤＥＬ）、およびＧｌｕＢ－４ターミネーター（ＧｌｕＢ４ Ｔ）からなる配列よりそれぞれ構成されている。
【0017】
７Ｃｒｐ遺伝子は、ヒトのスギ花粉抗原特異的Ｔ細胞が認識する７つのエピトープのアミノ酸配列を連結させた人工ペプチドを発現する。図２および３に示すように、７Ｃｒｐはスギ花粉の抗原タンパク質であるＣｒｙ ｊ １およびＣｒｙ ｊ ２の主要なエピトープ１～７を連結させて得られた改変抗原ペプチドである。７Ｃｒｐ遺伝子の塩基配列を配列番号４に、７Ｃｒｐのアミノ酸配列を配列番号５に示す。図２および３に示す通り、エピトープ２、５、および６は、Ｃｒｙ ｊ １より由来であり、エピトープ１、２、４、および７はＣｒｙ ｊ ２由来である。
【0018】
図３および配列番号６にはＣｒｙ ｊ １タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃｒｙ ｊ １のアミノ酸配列中、エピトープ２は２１２番目から２２４番目までのアミノ酸配列（配列番号７）であり、エピトープ５は２３４番目から２４７番目までのアミノ酸配列（配列番号８）であり、エピトープ６は３１２番目から３３０番目までのアミノ酸配列（配列番号９）である。
【0019】
図３および配列番号１０にはＣｒｙ ｊ ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｃｒｙ ｊ ２のアミノ酸配列中、エピトープ１は７７番目から８９番目までのアミノ酸配列（配列番号１１）であり、エピトープ３は１９２番目から２０４番目までのアミノ酸配列（配列番号１２）であり、エピトープ４は３５６番目から３６７番目までのアミノ酸配列（配列番号１３）であり、エピトープ７は９６番目から１０７番目までのアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【0020】
７Ｃｒｐ遺伝子は、ＧｌｕＢ－１プロモーターおよびグリテリンシグナルペプチド（ＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ）の下流に連結されている。ＧｌｕＢ１ Ｐは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来グルテリンＢ１（ＧｌｕＢ１）遺伝子のプロモーターである。ＧｌｕＢ１ Ｐの制御下で７Ｃｒｐ遺伝子を発現させることで、７Ｃｒｐ遺伝子を胚乳特異的に発現させることができる。ＧｌｕＢ１ Ｓはグリテリンタンパク質の小胞体膜内への輸送に関与するシグナル配列である。
【0021】
７Ｃｒｐ遺伝子の下流には、ＫＤＥＬ局在化シグナル（ＫＤＥＬ）が連結されている。ＫＤＥＬはタンパク質の小胞体への係留に関与するシグナル配列である。上述のＧｌｕＢ１ ＳとＫＤＥＬにより、７Ｃｒｐは小胞体膜内へと輸送される。
【0022】
７Ｃｒｐ遺伝子のさらに下流にはＧｌｕＢ１ターミネーター（ＧｌｕＢ１ Ｔ）が連結されている。ＧｌｕＢ１ Ｔは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来グルテリンＢ１（ＧｌｕＢ１）遺伝子のターミネーターであり、７Ｃｒｐ遺伝子の転写終結を規定する。
【0023】
ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットのＧｌｕＢ１ Ｐ＋Ｓ、ＫＤＥＬ、およびＧｌｕＢ１ Ｔはイネゲノム由来のＤＮＡ配列からなる。
【0024】
（ゲノム領域Ａ）
ゲノム領域Ａは、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域を指す。配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。また、配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。
ゲノム領域Ａは、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域を指す。配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。また、配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。
【0025】
本発明の好ましい態様において、ゲノム領域Ａはどんとこいの第１０染色体上の領域である。
【0026】
（Ｔ－ＤＮＡ挿入位置）
下記（ａ１）または（ａ２）の７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチド（以下、「Ｔ－ＤＮＡ」）のイネゲノム中の挿入位置は、前記ゲノム領域Ａ内であれば特に制限されない。例えば、Ｔ－ＤＮＡは、配列番号２で示す塩基配列における１４１３番目、好ましくは１４５３番目、より好ましくは１４７８番目、さらに好ましくは１５１３番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から、配列番号３で示す塩基配列における１００番目、好ましくは５０番目、より好ましくは２５番目、さらに好ましくは１番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている。
下記（ａ１）または（ａ２）の７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチド（以下、「Ｔ－ＤＮＡ」）のイネゲノム中の挿入位置は、前記ゲノム領域Ａ内であれば特に制限されない。例えば、Ｔ－ＤＮＡは、配列番号２で示す塩基配列における１４１３番目、好ましくは１４５３番目、より好ましくは１４７８番目、さらに好ましくは１５１３番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から、配列番号３で示す塩基配列における１００番目、好ましくは５０番目、より好ましくは２５番目、さらに好ましくは１番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている。
【0027】
本明細書において、「（ｂ２）における対応する塩基」とは、ホモロジー解析により配列番号２に示される塩基配列のＸ番目（Ｘは任意の整数）に相当すると特定される塩基を指す。同様に、「（ｃ２）における対応する塩基」とは、ホモロジー解析により配列番号３に示される塩基配列のＸ番目（Ｘは任意の整数）に相当すると特定される塩基を指す。なお、ホモロジー解析の方法としては、例えば、Needleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignmentによる方法や、ClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法が挙げられ、当業者であれば、これら方法に基づき、配列番号２または配列番号３に示される塩基配列を基準配列として用いて、解析対象の塩基配列中における「対応する塩基」を理解することができる。解析は、デフォルトの設定で行ってもよく、適宜、必要に応じてパラメータをデフォルトから変更して行ってもよい。
【0028】
本発明の最も好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネは、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している。
【0029】
（配列番号２または３に示す塩基配列）
配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。また、配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。また、配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
【0030】
本発明の好ましい形態において、配列番号２に示す塩基配列および配列番号３に示す塩基配列はどんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドである。
【0031】
（品種）
本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいに、前述のＴ－ＤＮＡが導入されたものである。どんとこいは、良好な食味、栽培のしやすさ、栽培適地の広さ、高い収量などの利点を有している。
本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいに、前述のＴ－ＤＮＡが導入されたものである。どんとこいは、良好な食味、栽培のしやすさ、栽培適地の広さ、高い収量などの利点を有している。
【0032】
（変異体）
前記（ａ１）のポリヌクレオチド、前記（ｂ１）のポリヌクレオチド、および前記（ｃ１）のポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している遺伝子組換えイネの変異体も、本発明の範疇に含まれる。つまり、前記（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）のポリヌクレオチドの内の少なくとも１つ以上は、それぞれ、前記（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）のポリヌクレオチドであってもよい。
前記（ａ１）のポリヌクレオチド、前記（ｂ１）のポリヌクレオチド、および前記（ｃ１）のポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している遺伝子組換えイネの変異体も、本発明の範疇に含まれる。つまり、前記（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）のポリヌクレオチドの内の少なくとも１つ以上は、それぞれ、前記（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）のポリヌクレオチドであってもよい。
【0033】
前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２、１、３の塩基配列と、９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる。塩基配列の同一性は、遺伝子情報ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．９（株式会社ゼネティクス製）を用いて算出した値である。
【0034】
また、前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１、２、３の塩基配列において５０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下の塩基に変異を有する塩基配列からなる。前記「変異」は、塩基の挿入、欠失、または置換である。配列番号１で示す塩基配列における２５９４番目の塩基から６６０番目の塩基までの領域、５３９１番目の塩基から５０８９番目の塩基までの領域、および８８３５番目の塩基から８５３３番目の塩基までの領域は、それぞれ、２ｍＡＬＳタンパク質、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１中の７Ｃｒｐ配列およびＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２中の７Ｃｒｐ配列をコードしていることから、前記（ａ２）のポリヌクレオチドにおいては、配列番号１で示す塩基配列におけるこれらの領域以外の部分に変異を有していることが好ましい。
【0035】
（ａ２）のポリヌクレオチドは、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐと同じか、またはそれ以上のスギ花粉症抗原ペプチドに対する免疫寛容作用を誘導するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチドであってもよい。
【0036】
本態様の遺伝子組換えイネの変異体において、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされた改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐが、スギ花粉の抗原ペプチドに対して、免疫寛容誘導法に用いることに適していることは、任意の方法によって調べればよい。例えば、５６０μｇの７Ｃｒｐが含まれる遺伝子組換えイネ変異体の２００ｍｇのコメ粉末を経口投与したマウスのＣｒｙ ｊ １への免疫応答を、同量の野生型のコメ粉末を経口投与したマウスのＣｒｙ ｊ １への免疫応答と比較することによって、７Ｃｒｐを含むコメがスギ花粉への免疫寛容を誘導したか、確認することができる。なお、スギ花粉への免疫応答は、スギ花粉に含まれる抗原の投与による、被験体のＴ細胞およびＩｇＥレベルの変化を測定すること等によって確認することができる。
【0037】
本明細書中において、スギ花粉の抗原ペプチドとは、特に明記しない場合、抗原タンパク質Ｃｒｙ ｊ １またはＣｒｙ ｊ ２に含まれるペプチドを指す。
【0038】
配列番号２および３の塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列を示している。
【0039】
（子孫またはクローン）
本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンも本発明の範疇に含まれる。本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。本明細書においては、本態様の遺伝子組換えイネから無性生殖によって得られた子孫を、特に「クローン」と称する。また、本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖によって得られた子孫には、本態様の遺伝子組換えイネと原品種であるどんとこいとの戻し交配によって得られた子孫、および本態様の遺伝子組換えイネとどんとこい以外の品種との交配によって得られた子孫も含まれる。どんとこい以外の品種としては、特に限定されないが、例えば、コシヒカリ等であってもよい。本発明の好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンは、前記ゲノム領域Ａ中に下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドをゲノム中に保持している。
本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンも本発明の範疇に含まれる。本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。本明細書においては、本態様の遺伝子組換えイネから無性生殖によって得られた子孫を、特に「クローン」と称する。また、本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖によって得られた子孫には、本態様の遺伝子組換えイネと原品種であるどんとこいとの戻し交配によって得られた子孫、および本態様の遺伝子組換えイネとどんとこい以外の品種との交配によって得られた子孫も含まれる。どんとこい以外の品種としては、特に限定されないが、例えば、コシヒカリ等であってもよい。本発明の好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンは、前記ゲノム領域Ａ中に下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドをゲノム中に保持している。
【0040】
（本態様の遺伝子組換えイネの特徴）
本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいの第１０染色体において、配列番号１に示す塩基配列を有するＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されており、Ｔ－ＤＮＡの前後に配列番号２からなるポリヌクレオチドおよび配列番号３からなるポリヌクレオチドがそれぞれ連続している。本態様の遺伝子組換えイネでは、Ｔ－ＤＮＡ以外の余計な配列が挿入されていない。従って、本態様の遺伝子組換えイネは、食品として安全である。また、本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいの第１０染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現することができるという優れた効果を奏する。
本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいの第１０染色体において、配列番号１に示す塩基配列を有するＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されており、Ｔ－ＤＮＡの前後に配列番号２からなるポリヌクレオチドおよび配列番号３からなるポリヌクレオチドがそれぞれ連続している。本態様の遺伝子組換えイネでは、Ｔ－ＤＮＡ以外の余計な配列が挿入されていない。従って、本態様の遺伝子組換えイネは、食品として安全である。また、本態様の遺伝子組換えイネは、どんとこいの第１０染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現することができるという優れた効果を奏する。
【0041】
〔コメ〕
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメも本発明の範疇に含まれる。本態様のコメは、玄米であってもよく、胚芽精米であってもよく、精白米であってもよい。
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメも本発明の範疇に含まれる。本態様のコメは、玄米であってもよく、胚芽精米であってもよく、精白米であってもよい。
【0042】
本態様のコメに含まれる７Ｃｒｐの量は、スギ花粉アレルギーに対する免疫寛容を十分に誘導する観点から、コメ１粒あたり、５μｇ以上であることが好ましく、２０μｇ以上であることがより好ましい。また、食品としての基準を満たす観点から、１５０μｇ以下であることが好ましく、７０μｇ以下であることがより好ましい。
【0043】
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメを炊飯米として摂取を続けることにより、スギ花粉に含まれる抗原に対する免疫寛容が誘導されることが期待される。
【0044】
〔食品組成物〕
本態様のコメを含む食品組成物も本発明の範疇に含まれる。本態様の食品組成物は、本態様のコメを含んでいればよく、その含有量は特に限定されない。また、本態様の食品組成物の種類は特に限定されない。例えば、加工飯米、米麹、米粉、米粉を利用した食品等を挙げることができる。
本態様のコメを含む食品組成物も本発明の範疇に含まれる。本態様の食品組成物は、本態様のコメを含んでいればよく、その含有量は特に限定されない。また、本態様の食品組成物の種類は特に限定されない。例えば、加工飯米、米麹、米粉、米粉を利用した食品等を挙げることができる。
【0045】
また、本態様の食品組成物は、本態様のコメから抽出された７Ｃｒｐまたはその断片ペプチドを含む抽出物を含むものであってもよい。また、例えば、本態様のコメを利用した発酵食品（甘酒等）等であってもよい。
【0046】
なお、本態様の食品組成物における本態様のコメの含有量は特に限定されず、効果が得られる範囲で適宜調整してもよい。
【0047】
たとえば、本態様の食品組成物における本態様のコメの含有量は、一食あたりの７Ｃｒｐ摂取量の目安および本態様のコメにおける７Ｃｒｐの含有量より定めてもよい。一食あたりの７Ｃｒｐ摂取量の目安の算出方法は特に限定されず、たとえば人介入試験によって求めてもよい。
【0048】
一食あたりの７Ｃｒｐ摂取量はスギ花粉アレルギーに対する免疫寛容を十分に誘導する観点から１．２５ｍｇ以上であることが好ましく、７．５ｍｇ以上であることがより好ましい。また、過剰摂取を避ける観点から、３７５ｍｇ以下であることが好ましく、３０ｍｇ以下であることがより好ましい。
【0049】
本態様の食品組成物は、スギ花粉症が気になる消費者が食生活の一環として取り入れることによって当該消費者の健康の維持および増進に役立つことが期待される。
【0050】
本態様の食品組成物は、本態様のコメ以外の成分として、例えば、安定化剤、保存剤、着色料、香料、ビタミン等の配合物を適宜添加し、混合し、常法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、クリーム状、飲料等の組成物に適した形態とすることができる。または、本態様の食品組成物は、本態様のコメにさらに複数種の物質が添加されている必要はなく、本態様のコメのみから構成される食品であってもよい。
【0051】
〔繁殖材料、細胞〕
本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該遺伝子組換えイネを量産することも可能である。従って、本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンの繁殖材料または種子あるいは本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンに由来する細胞も本発明の範疇に含まれる。これらの繁殖材料および細胞は、公知の方法により本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから取得することができる。
本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該遺伝子組換えイネを量産することも可能である。従って、本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンの繁殖材料または種子あるいは本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンに由来する細胞も本発明の範疇に含まれる。これらの繁殖材料および細胞は、公知の方法により本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから取得することができる。
【0052】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明の態様１に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0053】
本発明の態様２に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１において、前記（ａ１）または（ａ２）の改変スギ花粉アレルゲンペプチド７Ｃｒｐを発現させるためのポリヌクレオチドが、配列番号２で示す塩基配列における１４１３番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から配列番号３で示す塩基配列における１００番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている構成としてもよい。
【0054】
本発明の態様３に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１または２において、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している構成としてもよい。
【0055】
本発明の態様４に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンであってもよい。
【0056】
本発明の態様５に係るコメは、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネから収穫されたコメである。
【0057】
本発明の態様６に係る食品組成物は、前記の態様５に記載のコメを含む食品組成物である。
【0058】
本発明の態様７に係る繁殖材料は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの繁殖材料である。
【0059】
本発明の態様８に係る種子は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの種子である。
【0060】
本発明の態様９に係る細胞は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネに由来する細胞である。
【実施例】
【0061】
〔１．遺伝子組換えイネの作出〕
（宿主）
どんとこいを用いた。
（宿主）
どんとこいを用いた。
【0062】
（プラスミドベクター）
プラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ２×７Ｃｒｐ（図４、以下「プラスミド１」）を用いた。
プラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ２×７Ｃｒｐ（図４、以下「プラスミド１」）を用いた。
【0063】
プラスミド１は、ｐＰＺＰ２００系バイナリーベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ－ＧＷ（参考文献：Wakasa, Y. et. al., Plant Cell Rep. 31, 075-2084, 2012；Hajdukiewicz, P. et. al., Plant Mol. Biol. 25, 989-994, 1994）を基に構築したものであり、Ｔ－ＤＮＡ領域内に２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットおよび２カセットのＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセットがこの順で連結されている（図１）。「２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセット」および「ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット」の詳細は、前述したとおりである。
【0064】
（宿主への核酸の移入方法）
公知のアグロバクテリウム法に従って行った。
公知のアグロバクテリウム法に従って行った。
【0065】
（遺伝子組換えイネの選抜方法）
プラスミド１を保持したアグロバクテリウムを宿主イネ種子胚盤由来のカルスに感染させ、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩（０．５μＭ）を含む選抜培地で２ｍＡＬＳ遺伝子が導入されたカルスを選抜した。その後、選抜したカルスを再分化させることにより、遺伝子組換えイネ再分化当代（Ｔ０）を得た。Ｔ０個体群を閉鎖系温室で育成し、これらの成葉由来全ＤＮＡのサザンブロット解析により、Ｔ－ＤＮＡが１コピー挿入されている系統を選抜した。
プラスミド１を保持したアグロバクテリウムを宿主イネ種子胚盤由来のカルスに感染させ、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩（０．５μＭ）を含む選抜培地で２ｍＡＬＳ遺伝子が導入されたカルスを選抜した。その後、選抜したカルスを再分化させることにより、遺伝子組換えイネ再分化当代（Ｔ０）を得た。Ｔ０個体群を閉鎖系温室で育成し、これらの成葉由来全ＤＮＡのサザンブロット解析により、Ｔ－ＤＮＡが１コピー挿入されている系統を選抜した。
【0066】
候補系統の育成を続行し、自殖種子（Ｔ１系統群）を得た。種子より全タンパク質を調製し、抗７Ｃｒｐウサギ抗体（以下、単に「抗７Ｃｒｐ抗体」）によるイムノブロット解析により、目的遺伝子産物（７Ｃｒｐ）が蓄積している３系統を選抜した。取得した３系統を、以下、Ｏｓ７Ｃｒｐ１系統、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統、およびＯｓ７Ｃｒｐ３系統と称する。
【0067】
組換えイネの各系統のＴ１種子について、５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて滅菌し、アグロバクテリウムや他の雑菌の除去後にＭＳ培地上に無菌播種を行った。発芽時にＭＳ培地上にアグロバクテリウムが増殖しないことを観察し、アグロバクテリウムの残存していないことを確認したＴ１からＴ２種子を得、これらから導入遺伝子がホモの系統候補を選抜した。
【0068】
〔２．選抜した３系統の比較〕
（核酸の存在状態）
本遺伝子組換えイネの移入した核酸が染色体上に存在するか否かを調べるため、本遺伝子組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ１系統、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統、およびＯｓ７Ｃｒｐ３系統のＴ１世代とどんとこいを交配し、その後代Ｆ２世代において、２ｍＡＬＳ遺伝子の有無をＰＣＲ解析し、移入した核酸の有無を確認した。移入した核酸の分離比を移入した核酸の分離比について、メンデル分離に適合しているかカイ二乗検定を行った。その結果、Ｏｓ７Ｃｒｐ１系統、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統、およびＯｓ７Ｃｒｐ３系統では実測値と理論値の間に統計学的有意差は認められなかったことから、移入した核酸の分離はメンデル分離に適合していることが確認された。したがって、本系統において、移入した核酸は染色体上に存在していると推定された。
（核酸の存在状態）
本遺伝子組換えイネの移入した核酸が染色体上に存在するか否かを調べるため、本遺伝子組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ１系統、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統、およびＯｓ７Ｃｒｐ３系統のＴ１世代とどんとこいを交配し、その後代Ｆ２世代において、２ｍＡＬＳ遺伝子の有無をＰＣＲ解析し、移入した核酸の有無を確認した。移入した核酸の分離比を移入した核酸の分離比について、メンデル分離に適合しているかカイ二乗検定を行った。その結果、Ｏｓ７Ｃｒｐ１系統、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統、およびＯｓ７Ｃｒｐ３系統では実測値と理論値の間に統計学的有意差は認められなかったことから、移入した核酸の分離はメンデル分離に適合していることが確認された。したがって、本系統において、移入した核酸は染色体上に存在していると推定された。
【0069】
（核酸のコピー数）
組換えイネの各系統のＴ１世代について、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した全ＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図５にサザンブロット解析の結果を示す。矢印を付したシグナルは導入遺伝子（Ｔ－ＤＮＡ）を示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図５に示すように、３系統の全てにおいて、Ｔ－ＤＮＡがゲノム中に１コピー移入されていることを確認した。また、それぞれの系統におけるサザンブロット解析のシグナルは異なっており、系統毎に異なる遺伝子座にＴ－ＤＮＡが導入されていることが示唆された。
組換えイネの各系統のＴ１世代について、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した全ＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図５にサザンブロット解析の結果を示す。矢印を付したシグナルは導入遺伝子（Ｔ－ＤＮＡ）を示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図５に示すように、３系統の全てにおいて、Ｔ－ＤＮＡがゲノム中に１コピー移入されていることを確認した。また、それぞれの系統におけるサザンブロット解析のシグナルは異なっており、系統毎に異なる遺伝子座にＴ－ＤＮＡが導入されていることが示唆された。
【0070】
（７Ｃｒｐの発現部位）
どんとこい並びに組換えイネの各系統の葉、茎、根および種子組織から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、７Ｃｒｐを検出した。図７にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図７に示すように、組換えイネの種子由来タンパク質のみで７Ｃｒｐのシグナルが検出された。この結果から、組換えイネの各系統において７Ｃｒｐが種子特異的に蓄積していることを確認した。
どんとこい並びに組換えイネの各系統の葉、茎、根および種子組織から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、７Ｃｒｐを検出した。図７にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図７に示すように、組換えイネの種子由来タンパク質のみで７Ｃｒｐのシグナルが検出された。この結果から、組換えイネの各系統において７Ｃｒｐが種子特異的に蓄積していることを確認した。
【0071】
（Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定）
公知の次世代シークエンス解析を行い、組換えイネの各系統のＦ２世代について、Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定を行った。その結果、系統毎に異なる遺伝子座にプラスミドが導入されていることが明らかになった。中でもＯｓ７Ｃｒｐ２系統は、どんとこいの第１０染色体の特定のゲノム領域に挿入されていた。具体的には、次世代シークエンス解析の結果、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統は、配列番号２、配列番号１、配列番号３の順に連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドをゲノム中に有していた。なお、配列番号１に示す塩基配列は、Ｏｓ７Ｃｒｐ２のゲノム中に導入されたＤＮＡの全塩基配列を示し、プラスミド１のＴ－ＤＮＡ領域の全塩基配列に相当する。配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
公知の次世代シークエンス解析を行い、組換えイネの各系統のＦ２世代について、Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定を行った。その結果、系統毎に異なる遺伝子座にプラスミドが導入されていることが明らかになった。中でもＯｓ７Ｃｒｐ２系統は、どんとこいの第１０染色体の特定のゲノム領域に挿入されていた。具体的には、次世代シークエンス解析の結果、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統は、配列番号２、配列番号１、配列番号３の順に連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドをゲノム中に有していた。なお、配列番号１に示す塩基配列は、Ｏｓ７Ｃｒｐ２のゲノム中に導入されたＤＮＡの全塩基配列を示し、プラスミド１のＴ－ＤＮＡ領域の全塩基配列に相当する。配列番号２に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。配列番号３に示す塩基配列は、どんとこいの第１０染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
【0072】
Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統においてＴ－ＤＮＡが挿入されていたゲノム領域は、公知の「日本晴」のゲノムデータベースであるイネアノテーションプロジェクトデータベース（ＲＡＰ－ＤＢ）で配列が公開されているゲノム領域であった。しかし、イネの生育に対する影響はこれまでに確認されていない。さらには、次世代シークエンス解析の結果から、Ｏｓ７Ｃｒｐ２は、ｐＰＺＰ２００系バイナリーベクターのＴ－ＤＮＡ領域外の余計な配列が挿入されることなくＴ－ＤＮＡがほぼ期待通り（理論通り）に挿入されていることが示され、食品として安全であることが確認された。
【0073】
Ｔ－ＤＮＡのゲノム挿入位置、Ｔ－ＤＮＡの挿入様式、および後述する種子における７Ｃｒｐの蓄積量の観点から、選抜した３系統の内、Ｏｓ７Ｃｒｐ２が食品として最も適した系統であると結論付けた。選抜した３系統は全てＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されているにも関わらず、種子における７Ｃｒｐの蓄積量に違いがある。選抜した３系統は全てＴ－ＤＮＡのゲノム挿入位置が異なっていることから、この違いが、種子における７Ｃｒｐの蓄積量の違いをもたらしていると考えられた。つまり、Ｏｓ７Ｃｒｐ２は、どんとこいの第１０染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量の７Ｃｒｐを発現することができると言える。
【0074】
〔３．Ｏｓ７Ｃｒｐ２の解析〕
（作出系統）
図８にＯｓ７Ｃｒｐ２の作出系統図を示す。Ｏｓ７Ｃｒｐ２のＴ１個体を発芽させた後に、閉鎖系温室で栽培してＴ２種子を得た。Ｔ２以降の種子も同様にして、更に後代（Ｔ３）の種子を得た。また、Ｔ１個体とどんとこいを交配して、得られたＦ１の後代にあたるＦ２で選抜系統Ｏｓ７Ｃｒｐ２－Ｆ２ｈｏｍｏを得て、次世代シークエンス解析に供試した。さらに、Ｏｓ７Ｃｒｐ２－Ｆ２ｈｏｍｏより、Ｆ３－Ｎを得て、この後代Ｆ４－Ｎ、およびＦ５－Ｎを得た。それぞれの種子を、Ｆ３種子、Ｆ４種子、Ｆ５種子として用いた。ただし、一部の分析ではＯｓ７Ｃｒｐ２を自殖して得られたＴ２、Ｔ３も材料として用いた。
（作出系統）
図８にＯｓ７Ｃｒｐ２の作出系統図を示す。Ｏｓ７Ｃｒｐ２のＴ１個体を発芽させた後に、閉鎖系温室で栽培してＴ２種子を得た。Ｔ２以降の種子も同様にして、更に後代（Ｔ３）の種子を得た。また、Ｔ１個体とどんとこいを交配して、得られたＦ１の後代にあたるＦ２で選抜系統Ｏｓ７Ｃｒｐ２－Ｆ２ｈｏｍｏを得て、次世代シークエンス解析に供試した。さらに、Ｏｓ７Ｃｒｐ２－Ｆ２ｈｏｍｏより、Ｆ３－Ｎを得て、この後代Ｆ４－Ｎ、およびＦ５－Ｎを得た。それぞれの種子を、Ｆ３種子、Ｆ４種子、Ｆ５種子として用いた。ただし、一部の分析ではＯｓ７Ｃｒｐ２を自殖して得られたＴ２、Ｔ３も材料として用いた。
【0075】
（世代間での安定性）
ＰＣＲによってＯｓ７Ｃｒｐ２作出系統のＴ－ＤＮＡを検出した。ＰＣＲには、どんとこい（ｗｔ）ならびにＯｓ７Ｃｒｐ２の７世代（Ｔ２、Ｔ３、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５）の全ＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲに用いたプライマーはＴ－ＤＮＡの挿入領域およびＴ－ＤＮＡ内部合計５か所に設計した。用いたプライマーセット１～５は、以下のとおりである。
ＰＣＲによってＯｓ７Ｃｒｐ２作出系統のＴ－ＤＮＡを検出した。ＰＣＲには、どんとこい（ｗｔ）ならびにＯｓ７Ｃｒｐ２の７世代（Ｔ２、Ｔ３、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、およびＦ５）の全ＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＣＲに用いたプライマーはＴ－ＤＮＡの挿入領域およびＴ－ＤＮＡ内部合計５か所に設計した。用いたプライマーセット１～５は、以下のとおりである。
【0076】
プライマーセット１：
5'-ＧＡＧＡＡＡＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号１５）
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号１６）
プライマーセット２：
5'-ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣ-3' （配列番号１７）
5'-ＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＴＧＴＣＣ-3' （配列番号１８）
プライマーセット３：
5'-ＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣ-3' （配列番号１９）
5'-ＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣ-3' （配列番号２０）
プライマーセット４：
5'-ＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣ-3' （配列番号２１）
5'-ＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡＣＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴＡＣ-3' （配列番号２２）
プライマーセット５：
5'-ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＡＴＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧ-3' （配列番号２４）
5'-ＧＡＧＡＡＡＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号１５）
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号１６）
プライマーセット２：
5'-ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣ-3' （配列番号１７）
5'-ＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＴＧＴＣＣ-3' （配列番号１８）
プライマーセット３：
5'-ＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣ-3' （配列番号１９）
5'-ＴＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣ-3' （配列番号２０）
プライマーセット４：
5'-ＡＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣ-3' （配列番号２１）
5'-ＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡＣＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＧＴＡＣ-3' （配列番号２２）
プライマーセット５：
5'-ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＡＴＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧ-3' （配列番号２４）
【0077】
図８は、プライマーセットの検討結果を示す図であり、８０１は、検討に用いた各プライマーセットによって増幅される領域を模式的に示す図であり、８０２は、各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図８の８０２に示すように、プライマーセットの検討の結果、全てのプライマーセットでＯｓ７Ｃｒｐ２特異的にＤＮＡの増幅が認められた。また、少なくともＴ－ＤＮＡとゲノムとのジャンクション領域二か所を増幅するプライマーセット１およびプライマーセット５を用いてＰＣＲを行うことで、Ｏｓ７Ｃｒｐ２においてＴ－ＤＮＡおよびそのゲノムへの挿入領域近辺が安定的に次世代に遺伝することを十分に確認できることが判った。
【0078】
（７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１）
ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１中の７Ｃｒｐ発現遺伝子である７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ５世代の幼葉、幼根、成葉、種子組織およびカルスからそれぞれＲＮＡを抽出しテンプレートとして用いた。用いたプライマーセットは、プライマーセット３（配列番号１９および配列番号２０）である。
ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１中の７Ｃｒｐ発現遺伝子である７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ５世代の幼葉、幼根、成葉、種子組織およびカルスからそれぞれＲＮＡを抽出しテンプレートとして用いた。用いたプライマーセットは、プライマーセット３（配列番号１９および配列番号２０）である。
【0079】
プラスミド１をテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１０の１００１に示すように、１００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１０の１００２に示す。なお、１００２のグラフ中の「７ｄａｆ」、「１４ｄａｆ」は、それぞれ開花後７日目、１４日目を示している。ｑＰＣＲの結果、７Ｃｒｐ遺伝子の転写物は種子由来ＲＮＡでのみ検出されたことから、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット１によって発現する７Ｃｒｐ遺伝子は、種子特異的に発現していることが確認された。
【0080】
（７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討２）
ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２中の７Ｃｒｐ発現遺伝子である７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、プライマーセット４（配列番号２１および配列番号２２）である。
ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２中の７Ｃｒｐ発現遺伝子である７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、プライマーセット４（配列番号２１および配列番号２２）である。
【0081】
プラスミド１をテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１１の１１０１に示すように、１００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１１の１１０２に示す。ｑＰＣＲの結果、７Ｃｒｐ遺伝子の転写物は種子由来ＲＮＡでのみ検出されたことから、ＧｌｕＢ１ Ｐ ７Ｃｒｐ遺伝子発現カセット２によって発現する７Ｃｒｐ遺伝子は、種子特異的に発現していることが確認された。
【0082】
（２ｍＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性の検討）
選抜マーカー遺伝子である２ｍＡＬＳ遺伝子および内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２５）
5'-ＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＧ-3' （配列番号２６）
選抜マーカー遺伝子である２ｍＡＬＳ遺伝子および内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２５）
5'-ＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＧ-3' （配列番号２６）
【0083】
プラスミド１をテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１２の１２０１に示すように、１００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１２の１２０２に示す。ｑＰＣＲの結果、２ｍＡＬＳ遺伝子の転写物はカルスで強く、開花後７日目の種子で弱く検出された。イネ植物体の根および葉では２ｍＡＬＳ遺伝子の転写物の量は検出限界以下であった。この結果は、カルスにおいては除草剤であるビスピリバックナトリウム塩に耐性であるが、発芽後は耐性を示さないＯｓ７Ｃｒｐ２の形質とほぼ一致していた。
【0084】
（内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性の検討）
内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２７）
5'-ＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧ-3' （配列番号２８）
内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「７Ｃｒｐ遺伝子の発現の組織特異性の検討１」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２７）
5'-ＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧ-3' （配列番号２８）
【0085】
配列番号２７、２８に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した内生ＡＬＳ遺伝子の部分領域を含むベクターをテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１３の１３０１に示すように、１０００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１３の１３０２に示す。ｑＰＣＲの結果、内生ＡＬＳ遺伝子の転写物は全組織で検出された。この結果から、カルス以外の組織で、２ｍＡＬＳタンパク質がイネの生長等に影響を与える可能性は低いと考えられた。
【0086】
（種子における７Ｃｒｐ発現）
どんとこいおよび組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ２のＴ２世代について、種子４粒粉末に対し、５００μＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供した。抗７Ｃｒｐ抗体により７Ｃｒｐを検出した。図１３にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１３中のＷのレーンは、どんとこいの結果を示している。図１３に示すように、７Ｃｒｐは、どんとこいには発現しておらず、組換えイネ系統のみに発現している。
どんとこいおよび組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ２のＴ２世代について、種子４粒粉末に対し、５００μＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供した。抗７Ｃｒｐ抗体により７Ｃｒｐを検出した。図１３にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１３中のＷのレーンは、どんとこいの結果を示している。図１３に示すように、７Ｃｒｐは、どんとこいには発現しておらず、組換えイネ系統のみに発現している。
【0087】
（プロトタイプとの比較）
非特許文献１～４に記載のプロトタイプ系統および組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ２系統のＦ４世代について、種子４粒粉末に対し、５００μＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロットへ供した。図１４にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。なお、プロトタイプは、キタアケを宿主にして作成された系統であり、図１９に示すＴ－ＤＮＡを３コピー有する系統である。図１４中、３５Ｓ Ｐはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ プロモーター、ＨＰＴはハイグロマイシン分解酵素、Ａｇ７ Ｔは、アグロバクテリウム ｇｅｎｅ ７ターミネーターをそれぞれ示す。
非特許文献１～４に記載のプロトタイプ系統および組換えイネＯｓ７Ｃｒｐ２系統のＦ４世代について、種子４粒粉末に対し、５００μＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍM Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロットへ供した。図１４にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。なお、プロトタイプは、キタアケを宿主にして作成された系統であり、図１９に示すＴ－ＤＮＡを３コピー有する系統である。図１４中、３５Ｓ Ｐはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ プロモーター、ＨＰＴはハイグロマイシン分解酵素、Ａｇ７ Ｔは、アグロバクテリウム ｇｅｎｅ ７ターミネーターをそれぞれ示す。
【0088】
組換えイネＯｓｒ７Ｃｒｐ２はＴ－ＤＮＡのコピー数が１コピーであるにもかかわらず、プロトタイプ系統と同程度の７Ｃｒｐを含有していることがわかった。
【0089】
（７Ｃｒｐの細胞内局在の検討）
どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ２世代の種子は開花より１５日後に採取され、抗７Ｃｒｐ抗体を用いて免疫細胞化学法に供された。ビブラトームで切り出された２００μｍの切片を３．７％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で１時間処理した。その後、切片は室温で１０分間、細胞壁分解溶液（１％セルラーゼＰＢＳ溶液）で処理した。一次抗体（抗７Ｃｒｐ抗体）は１：３００に希釈して用いた。二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートヤギ抗マウス抗体ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１：５００に希釈して用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂは小胞体輸送タンパク質体（ＰＢ－Ｉ）の染色に用いた。切片における７Ｃｒｐの細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス社製）を用いて観察した。
どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ２世代の種子は開花より１５日後に採取され、抗７Ｃｒｐ抗体を用いて免疫細胞化学法に供された。ビブラトームで切り出された２００μｍの切片を３．７％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で１時間処理した。その後、切片は室温で１０分間、細胞壁分解溶液（１％セルラーゼＰＢＳ溶液）で処理した。一次抗体（抗７Ｃｒｐ抗体）は１：３００に希釈して用いた。二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートヤギ抗マウス抗体ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１：５００に希釈して用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂは小胞体輸送タンパク質体（ＰＢ－Ｉ）の染色に用いた。切片における７Ｃｒｐの細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡ＦＬＵＯＶＩＥＷ（オリンパス社製）を用いて観察した。
【0090】
図１５は、どんとこい（Ｗｔ）およびＯｓ７Ｃｒｐ２の種子の免疫染色の結果を示している。７Ｃｒｐはどんとこい（Ｗｔ）系統では発現していないのに対して、Ｏｓ７Ｃｒｐ２系統では発現している。さらに、７ＣｒｐはＰＢ－Ｉ中のみに種子貯蔵タンパク質として蓄積されていることが判った。
【0091】
（既知アレルゲンタンパク質の量の検討）
イネ種子主要アレルゲン（１４～１６ｋＤａアレルゲン、２６ｋＤａアレルゲン、３３ｋＤａアレルゲン、５６ｋＤａアレルゲン）の量を検討した。どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ５世代の種子から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）並びに各アレルゲンに対する抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、各アレルゲンを検出した。図１６にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１６に示すように、Ｏｓ７Ｃｒｐ２のイネ種子主要アレルゲン量はどんとこいと比較して目立った増減は認められなかった。
（後代における７Ｃｒｐタンパク質の発現量の確認）
イネ種子主要アレルゲン（１４～１６ｋＤａアレルゲン、２６ｋＤａアレルゲン、３３ｋＤａアレルゲン、５６ｋＤａアレルゲン）の量を検討した。どんとこいおよびＯｓ７Ｃｒｐ２のＦ５世代の種子から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）並びに各アレルゲンに対する抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、各アレルゲンを検出した。図１６にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１６に示すように、Ｏｓ７Ｃｒｐ２のイネ種子主要アレルゲン量はどんとこいと比較して目立った増減は認められなかった。
（後代における７Ｃｒｐタンパク質の発現量の確認）
【0092】
どんとこい（ｗｔ）およびＯｓ７Ｃｒｐ２系統のＦ３～Ｆ５世代について、種子４粒粉末に対し、５００μＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥで処理した後に、抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロットへ供した。図１７に抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロット解析の結果を示す。図１７中、ｗｔはどんとこいを示す。図１７に示すように、系統間で７Ｃｒｐタンパク質量に大きな差は認められず、種子中に安定して蓄積していた。
【0093】
（種子における７Ｃｒｐタンパク質の蓄積量の確認）
育成条件１～５で育成したＯｓ７Ｃｒｐ２より採種した種子における７Ｃｒｐタンパク質の蓄積量を定量した。種子４粒粉末に対し、４ｍＬの抽出バッファを使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬを抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロットに使用した。定量のための比較対象として、大腸菌から精製した７Ｃｒｐタンパク質を用いた。タンパク質の定量にはＩｍａｇｅ Ｊ １．５２ａ （ＮＩＨ）を用いた。
育成条件１～５で育成したＯｓ７Ｃｒｐ２より採種した種子における７Ｃｒｐタンパク質の蓄積量を定量した。種子４粒粉末に対し、４ｍＬの抽出バッファを使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬを抗７Ｃｒｐ抗体によるイムノブロットに使用した。定量のための比較対象として、大腸菌から精製した７Ｃｒｐタンパク質を用いた。タンパク質の定量にはＩｍａｇｅ Ｊ １．５２ａ （ＮＩＨ）を用いた。
【0094】
結果を図１８に示す。また、育成条件１～５の具体的な条件、および種子あたりのおおよその７Ｃｒｐの蓄積量を下記表１に示す。表１中、育成年度ＡおよびＢはそれぞれイネを育成した異なる年度を示す。また、育成場所１～４のうち、育成場所１～３はそれぞれ異なる屋外圃場を示し、育成場所４は特定網室を示す。
【表1】
【0095】
以上の結果から、７Ｃｒｐ遺伝子は、異なる条件で育成しても安定的に発現し、一定量の７Ｃｒｐを種子に蓄積させることが示唆された。
【0096】
（形質）
以下の項目について、どんとこいとＯｓ７Ｃｒｐ２とを比較した。
・休眠性
・発芽率
・脱粒性（出穂から４０日目の全穂を片手で握り、脱粒した種子の割合を調査した）
・有害物質の産出性
以下の項目について、どんとこいとＯｓ７Ｃｒｐ２とを比較した。
・休眠性
・発芽率
・脱粒性（出穂から４０日目の全穂を片手で握り、脱粒した種子の割合を調査した）
・有害物質の産出性
【0097】
その結果、これらの全ての項目に関してＯｓ７Ｃｒｐ２と宿主である原品種との間で有意な差はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【0098】
本発明は、食品としての利用が期待できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】