特許 7263763 レジオネラ属菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-17

(45)【発行日】2023-04-25

(54)【発明の名称】レジオネラ属菌検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20230418BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230418BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230418BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/689 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

C12N15/09 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2018238513

(22)【出願日】2018-12-20

(65)【公開番号】P2020099214

(43)【公開日】2020-07-02

【審査請求日】2021-11-10

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】東田 悟

(72)【発明者】

【氏名】俵田 隆哉

(72)【発明者】

【氏名】宇根 蔵人

【審査官】進士 千尋

(56)【参考文献】

【文献】特開平０９－１０７９９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００－２１７６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 62 (2008) 125-132

【文献】"Legionella pneumophila subsp. pneumophila strain Philadelphia 1 23S ribosomal RNA gene, complete sequence", NCBI Reference Sequence: NR_076222.1，[online], National Center for Biotechnology Information, 2015年2月3日掲載, 2022年9月27日検索, インターネット, <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_076222.1 >

【文献】FEMS Microbiology Letters, 1996, Vol.140, pp.111-119

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８９

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＮＣＢＩ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列の一部と相同的な配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブと、前記特定塩基配列またはその相補配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列またはその相補配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を一定温度条件下で増幅するためのプライマー・プローブセットであって、
以下の（１）～（４）の何れかである、
前記プライマー・プローブセット：
（１）蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５または７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第一のプライマーが配列番号２５に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第二のプライマーが配列番号３３，３９、４１，４３、４５、４７、４９または５１に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（２）蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５または７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第一のプライマーが配列番号２７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第二のプライマーが配列番号３９、４１，４３、４９または５１に記載の塩基配列またはその相補配列であるプライマーセット、
（３）蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５または７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第一のプライマーが配列番号１７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第二のプライマーが配列番号４３に記載の塩基配列またはその相補配列であるプライマーセット、
（４）蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号５または７に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第一のプライマーが配列番号１９に記載の塩基配列またはその相補配列であり、第二のプライマーが配列番号３９、４３または４５に記載の塩基配列またはその相補配列であるプライマーセット。

【請求項2】

前記蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが相補的な２本鎖を形成すると、蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする請求項１に記載のプライマー・プローブセット。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドプローブがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする請求項２に記載のプライマー・プローブセット。

【請求項4】

レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列又はその相補配列を検出する方法であって、請求項１～３の何れか一項に記載のプライマー・プローブセットを使用し、レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列又はその相補配列を一定温度条件で増幅する工程を含むことを特徴とするレジオネラ属菌の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に含まれるレジオネラ属菌を迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドを用いたレジオネラ属菌の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

レジオネラ属菌は水中や湿った土壌中などにアメーバ等の原虫類を宿主として存在するグラム陰性桿菌である。レジオネラ属菌は約５０種に分類され、すべての菌種によってレジオネラ症が発症しうるとされている。近年、クーリングタワー、循環温泉水、２４時間風呂などの人工環境中でレジオネラ属菌が増殖し、発生したエアロゾルの吸入によるレジオネラ症への感染が問題となっている。例年主に7月にピークがみられることが特徴である。病型は、一過性のポンティアック熱と劇症型の肺炎がある。前者は一過性で治癒するが、後者のレジオネラ肺炎は、病状の進行が早く、早期に治療する必要があるが、特有な症状はないため、症状のみでは他の肺炎との鑑別は困難である。また、本菌は主にマクロファージなどの細胞内で増殖するため、他の細菌感染症の治療に使用されているペニシリン系、セフェム系、アミノグリコジド系抗生物質は細胞内移行性が悪いため効果がなく、エリスロマイシン、リファンピシン、ニューキノロンなどの細胞移行性がある抗菌薬が必要となる。有効な抗菌薬の投与がなされない場合は、７日以内に死亡することが多い。そのため、早期にレジオネラ症と診断する必要がある。

【0003】

臨床的に用いられているレジオネラ属菌の検出法として、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１の尿中抗原に対する抗体を用いて検出する方法や、レジオネラ属菌特有の塩基配列を増幅して検出する遺伝子検査法等があげられる。しかし、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１の尿中抗原に対する抗体を用いて検出する方法は感度が６０％程度と低く、また、検出できるのはレジオネラ・ニューモフィラ血清型１に限られ、他の菌種に対する感度は不十分である。遺伝子検査法では、ＬＡＭＰ法（特許文献１、非特許文献１）等の核酸増幅による検出法が利用されており、感度、特異性とも極めて高いが、検査に時間がかかり迅速性が不足しており、操作が煩雑である。また、ＬＡＭＰ法は、一部のレジオネラ属菌に対する感度が不十分であり、見逃す可能性がある。このため、感度が高く迅速で簡便な検査が望まれている。

【0004】

本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。

【0005】

増幅対象核酸がレジオネラ属菌１６Ｓ ｒＲＮＡ（リボゾーム ＲＮＡ）またはその遺伝子の場合、他の菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）との間で塩基配列の相同性が高い交差反応性菌が多数存在するため、レジオネラ属菌１６Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。他の肺炎起因菌との識別が困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００９－１３１１７４号公報

【文献】特開２０００－１４４００号公報

【文献】特開２００１－３７５００号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】日本臨床微生物学雑誌Ｖｏｌ． ２３ Ｎｏ． ２ ２０１３．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、試料中に存在するレジオネラ属菌に由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドを用いたレジオネラ属菌の検出方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に記載の塩基配列もしくは該配列の相補配列の少なくとも連続する１４塩基を含む特徴とするレジオネラ属菌を検出するためのオリゴヌクレオチド。
（２）前記オリゴヌクレオチドが蛍光色素で標識されたことを特徴とする（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
（３）前記蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが相補的な２本鎖を形成すると、蛍光特性が変化するように構成されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする（２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（４）前記オリゴヌクレオチドがインターカレーター性蛍光色素で標識されてなることを特徴とする（３）に記載のオリゴヌクレオチド。
（５）レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を検出する方法であって（１）～（４）の何れかに記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするレジオネラ属菌の検出方法。
（６）一組のプライマーセットを用いて、特定塩基配列又はその相補配列を増幅する工程を含むことを特徴とする（５）に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
（７）前記一組のプライマーセットが、配列番号１１に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー、および／または配列番号３１に記載の配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー、からなることを特徴とする（６）に記載のレジオネラ属菌の検出方法。
（８）前記第一のプライマーが、配列番号１１に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～３１塩基からなり、かつ第二プライマーが配列番号３１に記載の配列又は相補配列中、連続する１６～３１塩基からなることを特徴とする（７）に記載のレジオネラ属菌の検出方法。

【0011】

以下に本発明を詳細に説明する。

【0012】

本発明中において試料とは、咽頭ぬぐい液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、胸水、血液、髄液、培養液、環境試験水などがあげられる。

【0013】

本発明において、レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの特定塩基配列とは、レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡに配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列を含む連続した４００塩基以下の塩基配列のことをいう。
すなわち本発明では、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が検出されることになる。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いたレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸を、一組のプライマーセットを用いて増幅した増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識オリゴヌクレオチドや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0014】

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの一例として、レジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドがある。前記オリゴヌクレオチドはレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。

【0015】

前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドとして、特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能であって、配列番号１に記載の塩基配列中、少なくとも１４塩基からなる連続する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを上げることができる。より好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４９３番目から３６４５１１番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４９３番目から３６４５０９番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５０１番目から３６４５１５番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５０１番目から３６４５１４番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0016】

本発明における「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８ ０％ 以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃ でのハイブリダイゼーション、続いて０ ．２×ＳＳＣ 、０ ．１％ ＳＤＳ中、５０～６ ５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。「ストリンジェントな条件」の別の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。

【0017】

本発明は、試料中に含まれるレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５３５番目から３６４６１１番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれるレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号３１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４３２９番目から３６４４８３番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。

【0018】

その中でも第一のプライマー及び第二のプライマーが１６～３１塩基からなることが好ましい。

【0019】

第一のプライマーの一例として、配列番号１１に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１６～３１塩基であるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５３５番目から３６４５５３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５３８番目から３６４５５３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５３８番目から３６４５５７番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５５４番目から３６４５７３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５７０番目から３６４６００番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５７７番目から３４６６００番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５８１番目から３６４６００番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５９１番目から３６４６１１番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0020】

第ニのプライマーの一例として、配列番号３１に記載の塩基配列またはその相補配列中、連続する１６～３１塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４３２９番目から３６４３４８番目までの塩基配列）および配列番号３５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４３４７番目から３６４３６８番目までの塩基配列）、配列番号３７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４３８８番目から３６４４０６番目までの塩基配列）、配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４２０番目から３６４４４９番目までの塩基配列）および配列番号４１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４２９番目から３６４４４９番目までの塩基配列）、配列番号４３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４３１番目から３６４４５１番目までの塩基配列）、配列番号４５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４３９番目から３６４４５９番目までの塩基配列）、配列番号４７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４５５番目から３６４４７５番目までの塩基配列）、配列番号４９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４６４番目から３６４４８３番目までの塩基配列）、配列番号５１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４６７番目から３６４４８２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0021】

中でもレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号１９と３８、２０と３７、１９と４２、２０と４１、１９と４４、２０と４３、２５と３４、２６と３３、２５と３８、２６と３７、２５と３８、２６と３９、２５と４２、２６と４１、２５と４４、２６と４３、２５と４６、２６と４５、２５と４８、２６と４７、２５と５０、２６と４９、２７と４０、２８と３９、２７と４４、２８と４３、２７と５０、２８と４９、２７と５２、２８と５１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。

【0022】

本発明のプライマーセットは、ＲＴ－ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、レジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号５５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0023】

本発明のオリゴヌクレオチドを用いてレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１１記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号３１記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号１またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列に対し、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。

【0024】

前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。

【0025】

前述した態様によるレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１７から３１塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。

【0026】

前述した態様によるレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。

【0027】

前述した態様によるレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含むレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のレジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号３～１０記載の塩基配列からなるものが好ましい。

【発明の効果】

【0028】

本発明のオリゴヌクレオチドは、レジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にハイブリダイズすることより、レジオネラ属菌２３Ｓ ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に検出させることができる。

【0029】

本発明のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを用いたレジオネラ属菌の検出方法は、試料中に含まれるレジオネラ属菌を迅速、高感度に検出でき、かつ偽陽性の発生も極めて少なく特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。

【実施例】

【0030】

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

【0031】

実施例１ 標準ＲＮＡ調製 もしくは菌培養液の希釈物
後述の実施例で使用する、レジオネラ属菌の一種であるレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）標準ＲＮＡを以下に示す方法で調製した。なお調製した標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）レジオネラ・ニューモフィラ標準ＲＮＡ
レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６１７２０番目から３６４６２１番目までの塩基配列）に基づき人工的に２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、レジオネラ・ニューモフィラ標準ＲＮＡを調製した。

【0032】

実施例２ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００－３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４９３番目から３６４５１１番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４４９３番目から３６４５０９番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５０１番目から３６４５１５番目までの塩基配列）またはその相補配列、配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＥ０１７３５４．１の３６４５０１番目から３６４５１４番目までの塩基配列）またはその相補配列、からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号３及び５においては５’末端から１３番目のグアニンと１４番目のアデニンとの間に、配列番号７及び９においては、５’末端から１１番目のシトシンと１２番目のグアニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。

【0033】

実施例３ レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、レジオネラ・ニューモフィラ標準ＲＮＡ（実施例１（１））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。

【0034】

反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．３９ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．５ｍＭ ＧＴＰ
３．２ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号５５）を付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー
２５ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２００ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。

【0035】

酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
９．００％ ジメチルスルホキシド
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
１３０ｍＭ 塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。

【0036】

開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．４５を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１、２及び３に示すあ実験は、各々の組合せごとに２回数測定し、その平均値を使用した。「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．４５以下（陰性判定）であったことを意味する。

【0037】

レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ４３）のうち、Ａ１１、Ａ１８、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３６、Ａ３７、Ａ３９を除く、いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのレジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡを１０分以内に検出しており、レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

【0038】

【表1】

【0039】

本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、検出時間が１０分以内であった組合せのうちからＡ２８を用いて、
レジオネラ属菌の検出（表２）及び交差反応性（表３）を実施した。
レジオネラ属菌の検出については、１ＣＦＵ／ｔｅｓｔのレジオネラ属菌９種を検出し、交差反応性については、１０^６ＣＦＵ／ｔｅｓｔの肺炎起因性菌２１菌種を検出せず、レジオネラ属菌に対して高い特異性を有しており、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせは、レジオネラ属菌の２３Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。

【0040】

【表2】

【0041】

【表3】

【配列表】

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