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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-25
(45)【発行日】2023-05-08
(54)【発明の名称】遺伝子発現増強剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/05 20060101AFI20230426BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20230426BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230426BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230426BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20230426BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20230426BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20230426BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20230426BHJP
【ＦＩ】
A61K31/05 ZNA
A61K8/34
A61Q19/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61K36/185
A61K38/39
A61K38/05
A61K31/728
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019066076
(22)【出願日】2019-03-29
(65)【公開番号】P2020164456
(43)【公開日】2020-10-08
【審査請求日】2021-12-14
(73)【特許権者】
【識別番号】000006116
【氏名又は名称】森永製菓株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】下間 早織
(72)【発明者】
【氏名】山本 貴之
(72)【発明者】
【氏名】森 貞夫
(72)【発明者】
【氏名】守田 稔
【審査官】高橋 樹理
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１９５５０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国特許第１０－１６１８７２６（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】特開２０１０－０６５００９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nippon Suisan Gakkaishi，2009年，Vol.75, No.1，p.86-88
【文献】Osteoarthritics and Cartilage，2010年，Vol.18, Suppl.2，S215, No.478
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
in vitroでＨＡＳ１（hyaluronan synthase 1）遺伝子またはＨＡＳ３（hyaluronan synthase 3）遺伝子の発現を増強する遺伝子発現増強剤であって、有効成分としてピセアタンノールを含有する、遺伝子発現増強剤。
【請求項2】
コラーゲン、ヒアルロン酸及びエラスチンからなるグループから選択される少なくとも一つをさらに含有する、請求項１に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項3】
前記コラーゲンが、コラーゲンペプチドである、請求項２に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項4】
前記エラスチンが、エラスチンペプチドである、請求項２に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項5】
前記コラーゲンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－ＯＨであり、前記ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸オリゴ４糖であり、前記エラスチンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＯＨである、請求項２に記載の遺伝子発現増強剤。
【請求項6】
前記ピセアタンノールが、パッションフルーツ由来である、請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子発現増強剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＨＡＳ１（hyaluronan synthase 1）遺伝子またはＨＡＳ３（hyaluronan synthase 3）遺伝子の発現を増強する遺伝子発現増強剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ピセアタンノールは、スチルベン類の化合物であって、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１）。このピセアタンノールは、サーチュイン遺伝子の転写産物の発現増強作用、サーチュインタンパク質の発現増強作用（特許文献２）、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現増強作用（特許文献３）、グルタチオン産生促進作用（特許文献４）、マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＭＰ－１）抑制作用（特許文献５）、コラーゲン産生促進作用（特許文献６、７）があることが知られている。
ピセアタンノールが、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）遺伝子の発現を増強することが知られている（特許文献８）。
ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）遺伝子の発現が、コラーゲン由来のジペプチドやトリペプチドでも誘導されることも報告されている（非特許文献１）。
ピセアタンノールが、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）遺伝子の発現を増強することが知られている（特許文献８）。
ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）遺伝子の発現が、コラーゲン由来のジペプチドやトリペプチドでも誘導されることも報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００９－１０２２９８号公報
【文献】特開２０１６－０４１６８０号公報
【文献】特開２０１７－２１４３２２号公報
【文献】特開２０１３－１５１４５８号公報
【文献】特開２０１３－１５１４５７号公報
【文献】特開２０１０－０３０９１１号公報
【文献】特開２００９－１０２２９９号公報
【文献】特開２０１６－５３４９８２号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】The Journal of Dermatology Vol. 37, pp. 330-338（2010）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ピセアタンノールを有効成分として含有する遺伝子発現増強剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
脊椎動物のヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）ファミリーにはＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３の３種類があり、いずれも７つの膜会合ドメインを有する細胞膜タンパクであるが、その遺伝子発現制御は全く異なっていることが知られており（Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 10, pp. 23-38(1998)）、ＨＡＳ２の発現誘導とＨＡＳ１及びＨＡＳ３の発現誘導が同じように起こるかは不明であった。本願発明者らは鋭意研究の結果、ピセアタンノールがＨＡＳ１（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ １）及びＨＡＳ３（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ３）の遺伝子発現を増強することを新たに見出した。
【0007】
本願発明の主な実施態様は以下の［１］～［６］である。
［１］in vitroでＨＡＳ１遺伝子またはＨＡＳ３遺伝子の発現を増強する遺伝子発現増強剤であって、有効成分としてピセアタンノールを含有する、遺伝子発現増強剤。
［２］コラーゲン及びヒアルロン酸及びエラスチンからなるグループから選択される少なくとも一つをさらに含有する、［１］に記載の遺伝子発現増強剤。
［３］前記コラーゲンが、コラーゲンペプチドである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［４］前記エラスチンが、エラスチンペプチドである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［５］前記コラーゲンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－ＯＨであり、前記ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸オリゴ４糖であり、前記エラスチンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＯＨである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［６］前記ピセアタンノールが、パッションフルーツ由来である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の遺伝子発現増強剤。
［１］in vitroでＨＡＳ１遺伝子またはＨＡＳ３遺伝子の発現を増強する遺伝子発現増強剤であって、有効成分としてピセアタンノールを含有する、遺伝子発現増強剤。
［２］コラーゲン及びヒアルロン酸及びエラスチンからなるグループから選択される少なくとも一つをさらに含有する、［１］に記載の遺伝子発現増強剤。
［３］前記コラーゲンが、コラーゲンペプチドである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［４］前記エラスチンが、エラスチンペプチドである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［５］前記コラーゲンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－ＯＨであり、前記ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸オリゴ４糖であり、前記エラスチンが、Ｈ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－ＯＨである、［２］に記載の遺伝子発現増強剤。
［６］前記ピセアタンノールが、パッションフルーツ由来である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の遺伝子発現増強剤。
【発明の効果】
【0008】
本発明により、ピセアタンノールを有効成分として含有する遺伝子発現増強剤を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明の一実施例において、ピセアタンノールによる、ＨＡＳ１遺伝子発現増強を調べた結果を示す図である。
【図2】本発明の一実施例において、ピセアタンノールによる、ＨＡＳ３遺伝子発現増強を調べた結果を示す図である。
【図3】本発明の一実施例において、ピセアタンノール及びコラーゲンペプチドによる、ＨＡＳ３遺伝子発現増強を調べた結果を示す図である。
【図4】本発明の一実施例において、ピセアタンノール及びヒアルロン酸オリゴ４糖、あるいはピセアタンノール、ヒアルロン酸オリゴ４糖及びコラーゲンペプチドによる、ＨＡＳ１遺伝子発現増強を調べた結果を示す図である。
【図5】本発明の一実施例において、ピセアタンノール、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸オリゴ４糖及びエラスチンペプチドによる、ＨＡＳ１遺伝子発現増強を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【0011】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【0012】
＝＝遺伝子発現増強剤＝＝
本発明の一実施形態は、ＨＡＳ１及びＨＡＳ３遺伝子発現増強剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明の一実施形態は、ＨＡＳ１及びＨＡＳ３遺伝子発現増強剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有することを特徴とする。
【0013】
＜ＨＡＳ１及びＨＡＳ３遺伝子発現増強剤＞
「ＨＡＳ１（Hyaluronan Synthase 1）遺伝子」
ＨＡＳ１遺伝子は、ＨＡＳ１（EC 2.4.1.212）をコードする、マウスＨＡＳ１遺伝子およびそのホモログである。マウス由来のＨＡＳ１遺伝子及び遺伝子産物は、Entrez Gene番号15116で規定されている。
マウスＨＡＳ１遺伝子ホモログとしてはマウス以外の脊椎動物のものであっても、マウス以外のほ乳類（たとえば、ヒトやラット）のものでもよく、かかるホモログについての情報は当業者には容易に入手できる（たとえば、ヒトＨＡＳ１はEntrez Gene番号3036；ラットＨＡＳ１はEntrez Gene番号282821）。
ここで、マウスＨＡＳ１遺伝子ホモログは、Entrez Gene番号15116で規定されるいずれかの核酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するか、またはEntrez Gene番号15116で規定されるいずれかの核酸配列において、１～数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、もしくは付加を有する。
また、ＨＡＳ１遺伝子は、ＳＮＰ（一塩基多型）を含んでもよい。
「ＨＡＳ１（Hyaluronan Synthase 1）遺伝子」
ＨＡＳ１遺伝子は、ＨＡＳ１（EC 2.4.1.212）をコードする、マウスＨＡＳ１遺伝子およびそのホモログである。マウス由来のＨＡＳ１遺伝子及び遺伝子産物は、Entrez Gene番号15116で規定されている。
マウスＨＡＳ１遺伝子ホモログとしてはマウス以外の脊椎動物のものであっても、マウス以外のほ乳類（たとえば、ヒトやラット）のものでもよく、かかるホモログについての情報は当業者には容易に入手できる（たとえば、ヒトＨＡＳ１はEntrez Gene番号3036；ラットＨＡＳ１はEntrez Gene番号282821）。
ここで、マウスＨＡＳ１遺伝子ホモログは、Entrez Gene番号15116で規定されるいずれかの核酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するか、またはEntrez Gene番号15116で規定されるいずれかの核酸配列において、１～数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、もしくは付加を有する。
また、ＨＡＳ１遺伝子は、ＳＮＰ（一塩基多型）を含んでもよい。
【0014】
「ＨＡＳ３（Hyaluronan Synthase ３）遺伝子」
ＨＡＳ３遺伝子は、ＨＡＳ３（EC 2.4.1.212）をコードする、マウスＨＡＳ３遺伝子およびそのホモログである。マウス由来のＨＡＳ３遺伝子及び遺伝子産物は、Entrez Gene番号15118で規定されている。
マウスＨＡＳ３遺伝子ホモログとしてはマウス以外の脊椎動物のものであっても、マウス以外のほ乳類（たとえば、ヒトやラット）のものでもよく、かかるホモログについての情報は当業者には容易に入手できる（たとえば、ヒトＨＡＳ３はEntrez Gene番号3038；ラットＨＡＳ３はEntrez Gene番号266805）。
ここで、マウスＨＡＳ３遺伝子ホモログは、Entrez Gene番号15118で規定されるいずれかの核酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するか、またはEntrez Gene番号15118で規定されるいずれかの核酸配列において、１～数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、もしくは付加を有する。
また、ＨＡＳ３遺伝子は、ＳＮＰ（一塩基多型）を含んでもよい。
ＨＡＳ３遺伝子は、ＨＡＳ３（EC 2.4.1.212）をコードする、マウスＨＡＳ３遺伝子およびそのホモログである。マウス由来のＨＡＳ３遺伝子及び遺伝子産物は、Entrez Gene番号15118で規定されている。
マウスＨＡＳ３遺伝子ホモログとしてはマウス以外の脊椎動物のものであっても、マウス以外のほ乳類（たとえば、ヒトやラット）のものでもよく、かかるホモログについての情報は当業者には容易に入手できる（たとえば、ヒトＨＡＳ３はEntrez Gene番号3038；ラットＨＡＳ３はEntrez Gene番号266805）。
ここで、マウスＨＡＳ３遺伝子ホモログは、Entrez Gene番号15118で規定されるいずれかの核酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有するか、またはEntrez Gene番号15118で規定されるいずれかの核酸配列において、１～数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、もしくは付加を有する。
また、ＨＡＳ３遺伝子は、ＳＮＰ（一塩基多型）を含んでもよい。
【0015】
「遺伝子発現」
遺伝子発現とは、遺伝子の転写産物レベルでの発現をいうものとする。また、「遺伝子発現の増強」とは、遺伝子の転写産物が増えることであって、例えば、遺伝子の転写の活性化、転写産物の安定性の向上、転写産物分解の阻害などのメカニズムは問わないものとする。従って、「ＨＡＳ１遺伝子発現増強剤」または「ＨＡＳ３遺伝子発現増強剤」とは、そのメカニズムに関わらず、ＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子の転写産物レベルを亢進させることができる薬剤をいう。
遺伝子発現とは、遺伝子の転写産物レベルでの発現をいうものとする。また、「遺伝子発現の増強」とは、遺伝子の転写産物が増えることであって、例えば、遺伝子の転写の活性化、転写産物の安定性の向上、転写産物分解の阻害などのメカニズムは問わないものとする。従って、「ＨＡＳ１遺伝子発現増強剤」または「ＨＡＳ３遺伝子発現増強剤」とは、そのメカニズムに関わらず、ＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子の転写産物レベルを亢進させることができる薬剤をいう。
【0016】
「ピセアタンノール」
ピセアタンノールは下記構造式（Ｉ）で示される化合物である。
遺伝子発現増強剤中のピセアタンノールまたはその誘導体の含有量（ピセアタンノールまたはその誘導体の質量／遺伝子発現増強剤の質量）は特に限定されないが、０．０１％以上であることが好ましく、０．１％以上であることがより好ましく、１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上のいずれかであることがさらに好ましい。
ピセアタンノールは下記構造式（Ｉ）で示される化合物である。
【化1】
【0017】
ピセアタンノールとして、ピセアタンノールを含む植物のエキスを用いてもよい。ここで、植物の種類は、ピセアタンノールまたはその誘導体を含む植物であれば特に限定されず、パッションフルーツ（例えば、Passiflora edulis、Passiflora alata、Passiflora amethystine、Passiflora antioquiensis、Passiflora biflora、Passiflora buonapartea、Passiflora capsularis、Passiflora cearensis、Passiflora coccinea、Passiflora cochinchinesis、Passiflora filamentosa、Passiflora herbertiana、Passiflora laurifolia、Passiflora ligularis、Passiflora lunata、Passiflora lutea、Passiflora maliformis、Passiflora mixta、Passiflora mucronata、Passiflora mollissima、Passiflora nibiba、Passiflora organensis、Passiflora pallida、Passiflora parahypensis、Passiflora pedeta、Passiflora pinnatistipula、Passiflora popenovii、Passiflora quadrangularis、Passiflora riparia、Passiflora rubra、Passiflora serrate、Passiflora tiliaefolia、Passiflora tripartite、Passiflora villosa、Passiflora warmingiiなど）、テンニンカ（例えば、Rhodomyrtus tomentosaなど）、ブラシノキ（例えば、マキバブラシノキCallistemon speciosus、Callistemon rigidusなど）が例示できる。エキスを抽出するのは、植物全体のうち、どの部分であっても良く、例えば、果実、花、種子、葉、枝、樹皮、幹、茎、または、根であっても良いが、パッションフルーツを用いる場合は種子であることが好ましく、テンニンカである場合には果実であることが好ましく、ブラシノキである場合には茎であることが好ましい。以下、パッションフルーツ種子エキスを一例として、その製造方法を説明する。
【0018】
＜パッションフルーツ種子エキスの製造方法＞
ピセアタンノールを含むパッションフルーツ種子エキスの具体的な製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、パッションフルーツ種子を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得、さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。この段階のいずれのものも、本発明のパッションフルーツ種子エキスとして使用することができる。
ピセアタンノールを含むパッションフルーツ種子エキスの具体的な製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、パッションフルーツ種子を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得、さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。この段階のいずれのものも、本発明のパッションフルーツ種子エキスとして使用することができる。
【0019】
抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３-ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド、２-プロパノール、１，４-ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３-ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒であることがより好ましい。混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９～９９：１であっても良く、３：９７～８０：２０であることが好ましく、５：９５～５０：５０であることがより好ましく、１０：９０～４０：６０であることが特に好ましい。
【0020】
溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であることが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ１～ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。
【0021】
抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。
抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。
抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。
【0022】
＜ピセアタンノール以外の成分＞
この遺伝子発現増強剤は、コラーゲン及びヒアルロン酸及びエラスチンからなるグループから選択される少なくとも一つをさらに含有してもよい。このコラーゲン及び／又はヒアルロン酸及び／又はエラスチンは、ＨＡＳ１またはＨＡＳ３遺伝子発現増強剤としての有効成分であってもよい。
この遺伝子発現増強剤は、コラーゲン及びヒアルロン酸及びエラスチンからなるグループから選択される少なくとも一つをさらに含有してもよい。このコラーゲン及び／又はヒアルロン酸及び／又はエラスチンは、ＨＡＳ１またはＨＡＳ３遺伝子発現増強剤としての有効成分であってもよい。
【0023】
「コラーゲン」
コラーゲンとは、主に脊椎動物の真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質であり、少なくとも２８種類の異なるコラーゲンが存在することが報告されている（Journal of Cell Science Vol. 120, pp. 1955-1958(2007)）。２本のα１ペプチド鎖と１本のα２ペプチド鎖がらせん状に絡み合ったＩ型コラーゲンが体内に最も多い。本開示におけるコラーゲンは、いずれのコラーゲン、一種類のコラーゲン由来のコラーゲンペプチド、またはコラーゲンペプチドに含まれる一種類のペプチドであってもよく、複数種のコラーゲンの混合物または複数種のコラーゲン由来のコラーゲンペプチドでもよい。また、本開示におけるコラーゲンは、薬学的に許容できる塩を含むものとする。
コラーゲンとは、主に脊椎動物の真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質であり、少なくとも２８種類の異なるコラーゲンが存在することが報告されている（Journal of Cell Science Vol. 120, pp. 1955-1958(2007)）。２本のα１ペプチド鎖と１本のα２ペプチド鎖がらせん状に絡み合ったＩ型コラーゲンが体内に最も多い。本開示におけるコラーゲンは、いずれのコラーゲン、一種類のコラーゲン由来のコラーゲンペプチド、またはコラーゲンペプチドに含まれる一種類のペプチドであってもよく、複数種のコラーゲンの混合物または複数種のコラーゲン由来のコラーゲンペプチドでもよい。また、本開示におけるコラーゲンは、薬学的に許容できる塩を含むものとする。
【0024】
「コラーゲンペプチド」
本開示におけるコラーゲンペプチドは、コラーゲンを酵素分解して低分子にしたペプチドを意味する。主としてジペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ；ＰＯ）を含むが、他のオリゴペプチド（例えばＨｙｐ－Ｇｌｙ）を含んでもよい。ジペプチドＰＯの含有率は特に限定されないが、１０％以上が好ましく、２５％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
本開示におけるコラーゲンペプチドは、コラーゲンを酵素分解して低分子にしたペプチドを意味する。主としてジペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ；ＰＯ）を含むが、他のオリゴペプチド（例えばＨｙｐ－Ｇｌｙ）を含んでもよい。ジペプチドＰＯの含有率は特に限定されないが、１０％以上が好ましく、２５％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【0025】
「ヒアルロン酸」
ヒアルロン酸（ヒアルロナン）はグルクロン酸とN-アセチルグルコサミン(GlcAβ1-3 GlcNAcβ1-4) の二糖単位が連結した以下の構造をしている。
本開示におけるヒアルロン酸の二糖単位の数ｎは特に限定されないが、１０００以下であることが好ましく、１００以下であることがより好ましく、５０以下であることがさらに好ましく、２０以下であることがさらに好ましく、１０以下であることがさらに好ましく、６以下であることがさらに好ましい。また、本開示におけるヒアルロン酸は、薬学的に許容できる塩（たとえばナトリウム塩）を含むものとする。
ヒアルロン酸（ヒアルロナン）はグルクロン酸とN-アセチルグルコサミン(GlcAβ1-3 GlcNAcβ1-4) の二糖単位が連結した以下の構造をしている。
【化2】
【0026】
「ヒアルロン酸オリゴ糖」
本開示のヒアルロン酸オリゴ糖は、上記ヒアルロン酸の構造式において、ｎが１以上２０以下である２糖から４０糖を含むオリゴ糖を意味するが、２以上１０以下である４糖から２０糖の分子を含むことがより好ましく、２以上５以下である４糖から１０糖の分子を含むことがさらに好ましく、２である４糖のみを含むことがさらに好ましい。このヒアルロン酸オリゴ糖は、単一種類のみから構成されていてもよく、複数種類が混合していてもよい。なお、本明細書では、２糖からなるヒアルロン酸オリゴ糖をヒアルロン酸オリゴ糖２糖と呼ぶこととし、糖の数が変わっても同様に呼ぶこととする。本開示におけるヒアルロン酸オリゴ糖は、薬学的に許容できる塩（たとえばナトリウム塩）を含むものとする。
本開示のヒアルロン酸オリゴ糖は、上記ヒアルロン酸の構造式において、ｎが１以上２０以下である２糖から４０糖を含むオリゴ糖を意味するが、２以上１０以下である４糖から２０糖の分子を含むことがより好ましく、２以上５以下である４糖から１０糖の分子を含むことがさらに好ましく、２である４糖のみを含むことがさらに好ましい。このヒアルロン酸オリゴ糖は、単一種類のみから構成されていてもよく、複数種類が混合していてもよい。なお、本明細書では、２糖からなるヒアルロン酸オリゴ糖をヒアルロン酸オリゴ糖２糖と呼ぶこととし、糖の数が変わっても同様に呼ぶこととする。本開示におけるヒアルロン酸オリゴ糖は、薬学的に許容できる塩（たとえばナトリウム塩）を含むものとする。
【0027】
「エラスチン」
本開示において、「エラスチン」はトロポエラスチンやエラスチンペプチドを含んでもよい。
本開示において、「エラスチン」はトロポエラスチンやエラスチンペプチドを含んでもよい。
【0028】
「エラスチンペプチド」
本開示におけるエラスチンペプチドは、エラスチンを酵素分解して低分子にしたペプチドを意味する。主としてジペプチド（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ；ＰＧ）を含むが、ＰＧ配列を含むエラスチン由来のペンタ又はヘキサペプチドを含んでもよい（BioMol Concepts 4(1): 65-76（2013））。ジペプチド（ＰＧ）の含有率は特に限定されないが、１％以上が好ましく、８％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
本開示におけるエラスチンペプチドは、エラスチンを酵素分解して低分子にしたペプチドを意味する。主としてジペプチド（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ；ＰＧ）を含むが、ＰＧ配列を含むエラスチン由来のペンタ又はヘキサペプチドを含んでもよい（BioMol Concepts 4(1): 65-76（2013））。ジペプチド（ＰＧ）の含有率は特に限定されないが、１％以上が好ましく、８％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【0029】
＝＝ＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子発現増強方法＝＝
本発明の一実施形態は、in vitroでＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子発現を増強する方法であって、生体外の細胞に遺伝子発現増強剤を投与する工程を含む。
in vitroで用いられる細胞は、生体外にあればよく、培養条件下にあることが好ましいが、ライン化されていても、初代培養細胞であってもよく、あるいは培養組織中の細胞や培養器官中の細胞のように細胞が構造を構成していてもかまわない。
遺伝子発現増強剤は、上述したとおりである。その投与方法は特に限定されないが、あらかじめ培養する培地に含有させてもよく、細胞を培養しながら、その培地に投与してもよい。
本発明の一実施形態は、in vitroでＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子発現を増強する方法であって、生体外の細胞に遺伝子発現増強剤を投与する工程を含む。
in vitroで用いられる細胞は、生体外にあればよく、培養条件下にあることが好ましいが、ライン化されていても、初代培養細胞であってもよく、あるいは培養組織中の細胞や培養器官中の細胞のように細胞が構造を構成していてもかまわない。
遺伝子発現増強剤は、上述したとおりである。その投与方法は特に限定されないが、あらかじめ培養する培地に含有させてもよく、細胞を培養しながら、その培地に投与してもよい。
【0030】
ここで述べた方法によって、ピセアタンノールは、ＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子発現を増強することができる。増強されたＨＡＳ１遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子の発現の検出方法は特に限定されないが、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ-ＰＣＲが好ましい。タンパク質の検出方法も特に限定されないが、ウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＦ、ＣＬＩＡなどが例示できる。
【実施例】
【0031】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【0032】
＜実施例１＞
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。ピセアタンノール（Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ；Ｐｉｃ）（東京化成工業株式会社）を１０μＭの濃度で添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子、ＨＡＳ３遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量並びにＨＡＳ３遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。ピセアタンノール（Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ；Ｐｉｃ）（東京化成工業株式会社）を１０μＭの濃度で添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子、ＨＡＳ３遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量並びにＨＡＳ３遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
【0033】
図１及び図２に、１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）で７２時間刺激後のＨＡＳ１及びＨＡＳ３のｍＲＮＡ発現レベルを各々示す。このように、ピセアタンノール（Ｐｉｃ）によってＨＡＳ１遺伝子及びＨＡＳ３遺伝子の発現が増強される。
【0034】
＜実施例２＞
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）及び１００μＭコラーゲンペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ９８％含有；ＰＯ）（BACHEM社、商品コード4001630）を添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ３遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ３遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）及び１００μＭコラーゲンペプチド（Ｐｒｏ－Ｈｙｐ９８％含有；ＰＯ）（BACHEM社、商品コード4001630）を添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ３遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ３遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
【0035】
図３に示すように、ピセアタンノール（Ｐｉｃ）とコラーゲンペプチド（ＰＯ）の組み合わせによってＨＡＳ３遺伝子の発現が有意に増強される。
【0036】
＜実施例３＞
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭ ピセアタンノール（Ｐｉｃ）及び０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）、あるいは、１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）、１００μＭコラーゲンペプチド（ＰＯ）及び０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）を添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭ ピセアタンノール（Ｐｉｃ）及び０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）、あるいは、１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）、１００μＭコラーゲンペプチド（ＰＯ）及び０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）を添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
【0037】
図４に示すように、ピセアタンノール（Ｐｉｃ）、コラーゲンペプチド（ＰＯ）及びヒアルロン酸４糖（ＨＡ４）の組み合わせによってＨＡＳ１の発現が増強される。
【0038】
＜実施例４＞
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）、１００μＭコラーゲンペプチド（ＰＯ）、０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）及び１μｇ／ｍＬ エラスチンペプチド（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ；ＰＧ）（Santa Cruz Biotechnology社、商品コードSC-472028）の組み合わせを添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
マウス線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を、６．４×１０４細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、１００Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。１０μＭピセアタンノール（Ｐｉｃ）、１００μＭコラーゲンペプチド（ＰＯ）、０．１μｇ／ｍＬ ヒアルロン酸オリゴ糖４糖（ＨＡ４）及び１μｇ／ｍＬ エラスチンペプチド（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ；ＰＧ）（Santa Cruz Biotechnology社、商品コードSC-472028）の組み合わせを添加した培地に交換して、さらに７２時間培養した。
その後ＲＮＡを回収し、後述のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲ法にて、ＨＡＳ１遺伝子及び３６Ｂ４遺伝子の発現を測定し、ＨＡＳ１遺伝子発現量／３６Ｂ４遺伝子発現量を算出し、陰性対照（薬剤添加なし：Cont）に対して統計解析を行った。
【0039】
図５に示すように、ピセアタンノール（Ｐｉｃ）とコラーゲンペプチド（ＰＯ）、ヒアルロン酸４糖（ＨＡ４）及びエラスチンペプチド（ＰＧ）の組み合わせによってＨＡＳ１の発現が増強される。
【0040】
ＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマー：
３６Ｂ４Ｆ：ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG（配列番号１）
３６Ｂ４Ｒ：CTCCCACCTTGTCTCCAGTC（配列番号２）
ＨＡＳ１Ｆ：CAAGACGGAGAAGAGAGAATCC（配列番号３）
ＨＡＳ１Ｒ：CTGAGGGCTTTGGCATGT（配列番号４）
ＨＡＳ３Ｆ：CTTGGAAGAAGATCCCCAAGT（配列番号５）
ＨＡＳ３Ｒ：CCATGAATCATACTTGTTGAGGATT（配列番号６）
３６Ｂ４Ｆ：ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG（配列番号１）
３６Ｂ４Ｒ：CTCCCACCTTGTCTCCAGTC（配列番号２）
ＨＡＳ１Ｆ：CAAGACGGAGAAGAGAGAATCC（配列番号３）
ＨＡＳ１Ｒ：CTGAGGGCTTTGGCATGT（配列番号４）
ＨＡＳ３Ｆ：CTTGGAAGAAGATCCCCAAGT（配列番号５）
ＨＡＳ３Ｒ：CCATGAATCATACTTGTTGAGGATT（配列番号６）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】