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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-27
(45)【発行日】2023-05-10
(54)【発明の名称】抗菌活性評価方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230428BHJP
C12M 1/34 20060101ALN20230428BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12M1/34 C
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019111806
(22)【出願日】2019-06-17
(65)【公開番号】P2020202777
(43)【公開日】2020-12-24
【審査請求日】2022-01-05
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000241500
【氏名又は名称】トヨタ紡織株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000497
【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】竹内 昌治
(72)【発明者】
【氏名】酒井 香苗
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】実開昭５３－０９６０９７（ＪＰ，Ｕ）
【文献】特開平０８－２２４０７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－２９９３８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５０－１４２７７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１４７７６８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開平０９－０５６３７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５２－１５４５８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－０６１０２３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
窪みたるウェルを３５０個以上有するシリコーン樹脂製のマイクロチャンバーを用いた抗菌活性評価方法であって、各前記ウェル間の距離は１５０μｍ～４５０μｍであり、
寒天培地に菌を塗布する工程と、
前記ウェルに評価物質を内包させる工程と、
前記菌が塗布された前記寒天培地に、前記評価物質が接触するように、前記マイクロチャンバーを載せる工程と、
前記寒天培地に前記マイクロチャンバーが載せられた状態にて所定温度範囲で保温する工程と、
前記寒天培地から、前記マイクロチャンバーを除去する工程と、を備え、
前記マイクロチャンバーを除去した前記寒天培地上に形成された白濁領域と透明領域の状態を観察して、前記透明領域に対応する前記ウェルに内包された前記評価物質が抗菌性を有すると判断する抗菌活性評価方法。
【請求項2】
前記マイクロチャンバーの前記ウェルをＯ
２
アッシャーで親水化処理する工程を備える請求項１に記載の抗菌活性評価方法。
【請求項3】
複数の前記ウェルのうち少なくとも２つには、互いに相違する種類の前記評価物質がそれぞれ内包されている請求項１又は２に記載の抗菌活性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、抗菌活性評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
病原菌の生育を阻害する物質たる抗生物質の多くは、微生物によって生産される。微生物は地球上に１００万種類以上存在すると言われており、その中で新規抗生物質を生産するものも数多く存在すると考えられている。
このような状況の下、微生物が生産する未だに発見されていない新規抗生物質の活性を評価するシステムが求められている。
従来から、病原菌への抗菌活性評価方法として、ディスク拡散法が知られている（非特許文献１参照）。このディスク拡散法は、病原菌液を塗布した寒天培地上に抗菌活性物質を含浸させたΦ数ｍｍのペーパーディスクを置き、抗生物質を拡散させてその活性能を評価する方法である。ペーパーディスク周辺では菌は増殖せず透明となる。この透明部分をハロと呼ぶ。他方、ペーパーディスクから離れたところでは菌は増殖するので黄白濁する。菌が増殖しない範囲は透明の円形となり、これは阻止円と呼ばれ、その直径を測定することで抗菌活性を評価する。
このような状況の下、微生物が生産する未だに発見されていない新規抗生物質の活性を評価するシステムが求められている。
従来から、病原菌への抗菌活性評価方法として、ディスク拡散法が知られている（非特許文献１参照）。このディスク拡散法は、病原菌液を塗布した寒天培地上に抗菌活性物質を含浸させたΦ数ｍｍのペーパーディスクを置き、抗生物質を拡散させてその活性能を評価する方法である。ペーパーディスク周辺では菌は増殖せず透明となる。この透明部分をハロと呼ぶ。他方、ペーパーディスクから離れたところでは菌は増殖するので黄白濁する。菌が増殖しない範囲は透明の円形となり、これは阻止円と呼ばれ、その直径を測定することで抗菌活性を評価する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Ｊａｍｅｓ Ｈ． Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｒｙ Ｊａｎｅ Ｆｅｒｒａｒｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００９； ４９：１７４９～５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、従来のディスク拡散法では、１つの寒天培地（例えば、Φ６０ｍｍのプレート）に対して、５サンプル程度を評価できるに過ぎなかった。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能な抗菌活性評価方法を提供することを目的とする。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能な抗菌活性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、新規な抗菌活性評価方法を開発した。
そして、この方法によれば、従来法による問題点を解決でき、より多くのサンプルの評価ができるということを見いだした。この成果に基づいて、次の発明を提供する。
そして、この方法によれば、従来法による問題点を解決でき、より多くのサンプルの評価ができるということを見いだした。この成果に基づいて、次の発明を提供する。
【0006】
〔１〕複数のウェルを有するマイクロチャンバーを用いた抗菌活性評価方法であって、
寒天培地に菌を塗布する工程と、
前記ウェルに評価物質を内包させる工程と、
前記菌が塗布された前記寒天培地に、前記評価物質が接触するように、前記マイクロチャンバーを載せる工程と、
前記寒天培地に前記マイクロチャンバーが載せられた状態にて所定温度範囲で保温する工程と、
前記寒天培地から、前記マイクロチャンバーを除去する工程と、を備え、
前記マイクロチャンバーを除去した前記寒天培地上に形成された白濁領域と透明領域の状態を観察して、前記透明領域に対応する前記ウェルに内包された前記評価物質が抗菌性を有すると判断する抗菌活性評価方法。
寒天培地に菌を塗布する工程と、
前記ウェルに評価物質を内包させる工程と、
前記菌が塗布された前記寒天培地に、前記評価物質が接触するように、前記マイクロチャンバーを載せる工程と、
前記寒天培地に前記マイクロチャンバーが載せられた状態にて所定温度範囲で保温する工程と、
前記寒天培地から、前記マイクロチャンバーを除去する工程と、を備え、
前記マイクロチャンバーを除去した前記寒天培地上に形成された白濁領域と透明領域の状態を観察して、前記透明領域に対応する前記ウェルに内包された前記評価物質が抗菌性を有すると判断する抗菌活性評価方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明の抗菌活性評価方法によれば、複数のウェルを有するマイクロチャンバーを用い、ウェルの数を増やすことで、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】マイクロチャンバーの一例を示す斜視図である。
【図2】ウェルの一例を示す斜視図である。
【図3】寒天培地の一例を示す斜視図である。
【図4】菌を塗布した寒天培地の一例を示す斜視図である。
【図5】マイクロチャンバーの一例を示す斜視図である。
【図6】ウェルに評価物質を内包させたマイクロチャンバーの一例を示す斜視図である。
【図7】寒天培地にマイクロチャンバーを載せた状態を示す断面図である。
【図8】所定温度範囲で保温した後の、寒天培地にマイクロチャンバーを載せた状態を示す断面図である。
【図9】マイクロチャンバーを除去した寒天培地を示す断面図である。
【図10】マイクロチャンバーを除去した寒天培地を示す平面図である。
【図11】マイクロチャンバーの実体顕微鏡写真である。
【図12】マイクロチャンバーの電子顕微鏡写真である。
【図13】ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像である。
【図14】ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像である。
【図15】ウェルの平面形状が円形（径：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像である。
【図16】ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像である。
【図17】ハロ形成率（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
ここで、本開示の望ましい例を示す。
〔２〕前記マイクロチャンバーの前記ウェルを親水化処理する工程を備える〔１〕に記載の抗菌活性評価方法。
評価物質は、通常、水溶液又は懸濁液とした状態でウェルに内包させる。ウェルを親水化処理すると、評価物質の水溶液又は懸濁液がウェル内にスムーズに流れ込んで内包できる。
〔２〕前記マイクロチャンバーの前記ウェルを親水化処理する工程を備える〔１〕に記載の抗菌活性評価方法。
評価物質は、通常、水溶液又は懸濁液とした状態でウェルに内包させる。ウェルを親水化処理すると、評価物質の水溶液又は懸濁液がウェル内にスムーズに流れ込んで内包できる。
【0010】
〔３〕複数の前記ウェルのうち少なくとも２つには、互いに相違する種類の前記評価物質がそれぞれ内包されている〔１〕又は〔２〕に記載の抗菌活性評価方法。
このようにすれば、一度に、種類の異なる評価物質を評価できる。
このようにすれば、一度に、種類の異なる評価物質を評価できる。
【0011】
以下、本開示を詳しく説明する。なお、"ｘ～ｙ"という範囲を示す表記は、特に断りが無い限り、当該範囲にｘとｙが入るものとする。
【0012】
１．抗菌活性評価方法
抗菌活性評価方法は、複数のウェル１を有するマイクロチャンバー３を用いる（図１，２参照）。
抗菌活性評価方法は、以下の工程を備える。なお、図３～１０には、抗菌活性評価方法の一例の概念が模式的に示されている。
〔１〕寒天培地５に菌７を塗布する工程（図３，４参照）。
〔２〕ウェル１に評価物質９を内包させる工程（図５，６参照）。
〔３〕菌７が塗布された寒天培地５に、評価物質９が接触するように、マイクロチャンバー３を載せる工程（図７参照）。
〔４〕寒天培地５に前記マイクロチャンバー３が載せられた状態にて所定温度範囲で保温する工程（図８参照）。
〔５〕寒天培地５から、マイクロチャンバー３を除去する工程（図９，１０参照）。
抗菌活性評価方法は、マイクロチャンバー３を除去した寒天培地５上に形成された白濁領域５Ａと透明領域５Ｂの状態を観察して、透明領域５Ｂに対応するウェル１に内包された評価物質９が抗菌性を有すると判断する。
例えば、図２～１０に示された抗菌活性評価方法では、図１０の透明領域５Ｂに対応するウェル１に内包された評価物質９、すなわち、図６の全てのウェル１に内包された評価物質９が抗菌性を有すると判断される。
抗菌活性評価方法は、複数のウェル１を有するマイクロチャンバー３を用いる（図１，２参照）。
抗菌活性評価方法は、以下の工程を備える。なお、図３～１０には、抗菌活性評価方法の一例の概念が模式的に示されている。
〔１〕寒天培地５に菌７を塗布する工程（図３，４参照）。
〔２〕ウェル１に評価物質９を内包させる工程（図５，６参照）。
〔３〕菌７が塗布された寒天培地５に、評価物質９が接触するように、マイクロチャンバー３を載せる工程（図７参照）。
〔４〕寒天培地５に前記マイクロチャンバー３が載せられた状態にて所定温度範囲で保温する工程（図８参照）。
〔５〕寒天培地５から、マイクロチャンバー３を除去する工程（図９，１０参照）。
抗菌活性評価方法は、マイクロチャンバー３を除去した寒天培地５上に形成された白濁領域５Ａと透明領域５Ｂの状態を観察して、透明領域５Ｂに対応するウェル１に内包された評価物質９が抗菌性を有すると判断する。
例えば、図２～１０に示された抗菌活性評価方法では、図１０の透明領域５Ｂに対応するウェル１に内包された評価物質９、すなわち、図６の全てのウェル１に内包された評価物質９が抗菌性を有すると判断される。
【0013】
以下、各用語について詳細に説明する。
（１）マイクロチャンバー３
マイクロチャンバー３は、複数の窪みたるウェル１を有する平板状部材である。
マイクロチャンバー３の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が好適に用いられる。シリコーン樹脂としては、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、柔軟で弾力性があり、菌が塗布された寒天培地に接触した場合に、寒天培地に密着するから、特に好ましい。
（１）マイクロチャンバー３
マイクロチャンバー３は、複数の窪みたるウェル１を有する平板状部材である。
マイクロチャンバー３の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が好適に用いられる。シリコーン樹脂としては、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、柔軟で弾力性があり、菌が塗布された寒天培地に接触した場合に、寒天培地に密着するから、特に好ましい。
【0014】
マイクロチャンバー３の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
マイクロチャンバー３の平面形状は、例えば矩形状、円形等を採用することができる。
マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、取扱い性及び生産性の観点から、５ｍｍ×１０ｍｍ以上が好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ以上がより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の大きさは、取扱い性及び生産性の観点から、３５ｍｍ×４０ｍｍ以下が好ましく、３３ｍｍ×３８ｍｍ以下がより好ましく、２５ｍｍ×３０ｍｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、５ｍｍ×１０ｍｍ～３５ｍｍ×４０ｍｍが好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ～３３ｍｍ×３８ｍｍがより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ～２５ｍｍ×３０ｍｍが更に好ましい。
マイクロチャンバー３の平面形状は、例えば矩形状、円形等を採用することができる。
マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、取扱い性及び生産性の観点から、５ｍｍ×１０ｍｍ以上が好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ以上がより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の大きさは、取扱い性及び生産性の観点から、３５ｍｍ×４０ｍｍ以下が好ましく、３３ｍｍ×３８ｍｍ以下がより好ましく、２５ｍｍ×３０ｍｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の大きさは、その平面形状が矩形状の場合には、５ｍｍ×１０ｍｍ～３５ｍｍ×４０ｍｍが好ましく、７ｍｍ×１２ｍｍ～３３ｍｍ×３８ｍｍがより好ましく、１０ｍｍ×１５ｍｍ～２５ｍｍ×３０ｍｍが更に好ましい。
【0015】
マイクロチャンバー３の厚みは、特に限定されない。
マイクロチャンバー３の厚みは、ウェル１の深さを十分に確保する観点から、３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の厚みは、取扱い性及び生産性の観点から、６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の厚みは、３５０μｍ～６５０μｍが好ましく、４００μｍ～６００μｍより好ましく、４５０μｍ～５５０μｍが更に好ましい。
マイクロチャンバー３の厚みは、ウェル１の深さを十分に確保する観点から、３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、マイクロチャンバー３の厚みは、取扱い性及び生産性の観点から、６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、マイクロチャンバー３の厚みは、３５０μｍ～６５０μｍが好ましく、４００μｍ～６００μｍより好ましく、４５０μｍ～５５０μｍが更に好ましい。
【0016】
マイクロチャンバー３は、ウェル１内に評価物質９をスムーズに内包できるという観点から、親水化処理されていることが好ましい。親水化処理は、特に限定されないが、例えば、Ｏ２アッシャーによる親水化処理が好適に採用される。
【0017】
（２）ウェル１
ウェル１の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
ウェル１の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。ウェル１の平面形状は、ウェル１内に評価物質９をスムーズに内包できるという観点から、円形が好ましい。
ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、抗菌活性を感度よく評価するという観点から、径１Ａ（図２参照）は３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル１の大きさは、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、径１Ａは６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、径１Ａは３５０μｍ～６５０μｍが好ましく、４００μｍ～６００μｍより好ましく、４５０μｍ～５５０μｍが更に好ましい。
ウェル１の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
ウェル１の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。ウェル１の平面形状は、ウェル１内に評価物質９をスムーズに内包できるという観点から、円形が好ましい。
ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、抗菌活性を感度よく評価するという観点から、径１Ａ（図２参照）は３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル１の大きさは、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、径１Ａは６５０μｍ以下が好ましく、６００μｍ以下がより好ましく、５５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル１の大きさは、その平面形状が円形の場合には、径１Ａは３５０μｍ～６５０μｍが好ましく、４００μｍ～６００μｍより好ましく、４５０μｍ～５５０μｍが更に好ましい。
【0018】
ウェル間距離１Ｂ（図２参照）は、特に限定されない。
ウェル間距離１Ｂは、隣り合うハロ（透明領域５Ｂ）が連結することを抑制する観点から、１５０μｍ以上が好ましく、２００μｍ以上がより好ましく、２５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル間距離１Ｂは、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、４５０μｍ以下が好ましく、４００μｍ以下がより好ましく、３５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル間距離１Ｂは、１５０μｍ～４５０μｍが好ましく、２００μｍ～４００μｍより好ましく、２５０μｍ～３５０μｍが更に好ましい。
ウェル間距離１Ｂは、隣り合うハロ（透明領域５Ｂ）が連結することを抑制する観点から、１５０μｍ以上が好ましく、２００μｍ以上がより好ましく、２５０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル間距離１Ｂは、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、４５０μｍ以下が好ましく、４００μｍ以下がより好ましく、３５０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル間距離１Ｂは、１５０μｍ～４５０μｍが好ましく、２００μｍ～４００μｍより好ましく、２５０μｍ～３５０μｍが更に好ましい。
【0019】
ウェル１の深さ１Ｃは、特に限定されない。
ウェル１の深さ１Ｃは、ウェル１内に評価に十分な評価物質９を内包する観点から、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル１の深さ１Ｃは、ウェル１内に評価に過剰な評価物質９を内包しないという観点から、１６０μｍ以下が好ましく、１４０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル１の深さ１Ｃは、４０μｍ～１６０μｍが好ましく、６０μｍ～１４０μｍより好ましく、８０μｍ～１２０μｍが更に好ましい。
ウェル１の深さ１Ｃは、ウェル１内に評価に十分な評価物質９を内包する観点から、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル１の深さ１Ｃは、ウェル１内に評価に過剰な評価物質９を内包しないという観点から、１６０μｍ以下が好ましく、１４０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル１の深さ１Ｃは、４０μｍ～１６０μｍが好ましく、６０μｍ～１４０μｍより好ましく、８０μｍ～１２０μｍが更に好ましい。
【0020】
１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数は、特に限定されず、マイクロチャンバー３の大きさ等に応じて適宜選択される。
寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に使用されるマイクロチャンバー３では、１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数は、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、３５０個以上が好ましく、４００個以上がより好ましく、４５０個以上が更に好ましい。他方、１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数の上限は、特に限定されないが、寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に使用されるマイクロチャンバー３では、通常は、１００００個以下である。
寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に使用されるマイクロチャンバー３では、１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数は、より多くの評価物質９を同時に評価するという観点から、３５０個以上が好ましく、４００個以上がより好ましく、４５０個以上が更に好ましい。他方、１つのマイクロチャンバー３におけるウェル１の個数の上限は、特に限定されないが、寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に使用されるマイクロチャンバー３では、通常は、１００００個以下である。
【0021】
（３）寒天培地５
寒天培地５は、寒天を用いた培地であり、寒天の濃度は特に限定されない。寒天培地５は、取り扱い性の観点から固形培地であることが好ましく、平板培地がより好ましい。
寒天培地５は、寒天を用いた培地であり、寒天の濃度は特に限定されない。寒天培地５は、取り扱い性の観点から固形培地であることが好ましく、平板培地がより好ましい。
【0022】
（４）菌７
菌７の種類は、特に限定されない。菌７の例としては、病原菌が挙げられる。
菌７の種類は、特に限定されない。菌７の例としては、病原菌が挙げられる。
【0023】
（５）評価物質９
評価物質９は、抗菌活性の評価対象であり、幅広い抗菌物質に適用することができる。
抗菌活性を評価する評価物質９の種類は、特に限定されず、１種又は２種以上である。評価物質９の種類が１種の場合には、本発明の抗菌活性評価方法を用いることで、ｎ数（サンプルサイズ）を確保し、より正確に抗菌評価をすることができる。評価物質９の種類が２種以上の場合には、本発明の抗菌活性評価方法を用いることで、一度に、種類の異なる評価物質９を評価できる。
評価物質９は、抗菌活性の評価対象であり、幅広い抗菌物質に適用することができる。
抗菌活性を評価する評価物質９の種類は、特に限定されず、１種又は２種以上である。評価物質９の種類が１種の場合には、本発明の抗菌活性評価方法を用いることで、ｎ数（サンプルサイズ）を確保し、より正確に抗菌評価をすることができる。評価物質９の種類が２種以上の場合には、本発明の抗菌活性評価方法を用いることで、一度に、種類の異なる評価物質９を評価できる。
【0024】
（６）〔１〕の工程における塗布方法
菌７の塗布方法は、特に限定されないが、均一に菌７を塗布するとの観点から、スピンコーターを用いた塗布方法が好ましく採用される。
菌７の塗布方法は、特に限定されないが、均一に菌７を塗布するとの観点から、スピンコーターを用いた塗布方法が好ましく採用される。
【0025】
（７）〔２〕の工程における内包方法
評価物質９の内包方法は、特に限定されないが、例えば、板状体を用いてウェル１内に評価物質９を押し込むことで、内包させる方法が採用される。板状体としては、カバーグラス等が好適に用いられる。
なお、この工程において、マイクロチャンバー３のウェル１のみに評価物質９を内包させる。ウェル１以外の部分（例えば、隣り合うウェル１とウェル１の間の部分）は、評価物質９が存在しない状態とする。なぜならば、ウェル１以外の部分に評価物質９が存在すると、隣り合うハロ（透明領域５Ｂ）が連結することになって、評価が困難になるからである。
本開示の〔２〕の工程における「内包」は、評価物質９自体をウェル１内に入れることのみならず、評価物質９を生産する微生物をウェル１内に入れて、ウェル１内で培養してウェル１内に評価物質９を内包することも意味する。
評価物質９の内包方法は、特に限定されないが、例えば、板状体を用いてウェル１内に評価物質９を押し込むことで、内包させる方法が採用される。板状体としては、カバーグラス等が好適に用いられる。
なお、この工程において、マイクロチャンバー３のウェル１のみに評価物質９を内包させる。ウェル１以外の部分（例えば、隣り合うウェル１とウェル１の間の部分）は、評価物質９が存在しない状態とする。なぜならば、ウェル１以外の部分に評価物質９が存在すると、隣り合うハロ（透明領域５Ｂ）が連結することになって、評価が困難になるからである。
本開示の〔２〕の工程における「内包」は、評価物質９自体をウェル１内に入れることのみならず、評価物質９を生産する微生物をウェル１内に入れて、ウェル１内で培養してウェル１内に評価物質９を内包することも意味する。
【0026】
（８）〔３〕の工程における寒天培地５にマイクロチャンバー３を載せる方法
菌７が塗布された寒天培地５に、評価物質９が接触するように、マイクロチャンバー３を載せる際には、マイクロチャンバー３を寒天培地５に押し付けることが好ましい。このようにすると、ウェル１に内包された評価物質９が寒天培地５に密着し、抗菌活性の評価がより適切に行える。
菌７が塗布された寒天培地５に、評価物質９が接触するように、マイクロチャンバー３を載せる際には、マイクロチャンバー３を寒天培地５に押し付けることが好ましい。このようにすると、ウェル１に内包された評価物質９が寒天培地５に密着し、抗菌活性の評価がより適切に行える。
【0027】
（９）〔４〕の工程における所定温度範囲
〔４〕の工程における保温する温度範囲（所定温度範囲）は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。この範囲内であると、菌の増殖を促進して白濁領域５Ａを明確化でき、白濁領域５Ａと透明領域５Ｂ（ハロ）とのコントラストが強まり、抗菌活性の評価が容易になる。
なお、所定温度範囲で保温する時間は、特に限定されず、菌７や評価物質９に応じて適宜変更できる。保温時間は、好ましくは２時間～２４時間であり、より好ましくは３時間～１８時間である。
なお、〔４〕の工程では、寒天培地５は、図７に示されるように、マイクロチャンバー３が載せられた状態で所定温度範囲に保温されている。この状態では、隣り合うウェル１同士の間の部分２が、隣り合うウェル１にそれぞれ内包された評価物質９の仕切り壁となり、隣り合う評価物質９の混合が抑制されるから、適切に抗菌活性を評価できる。
〔４〕の工程における保温する温度範囲（所定温度範囲）は、特に限定されないが、好ましくは２０℃～４５℃であり、より好ましくは３５～４０℃である。この範囲内であると、菌の増殖を促進して白濁領域５Ａを明確化でき、白濁領域５Ａと透明領域５Ｂ（ハロ）とのコントラストが強まり、抗菌活性の評価が容易になる。
なお、所定温度範囲で保温する時間は、特に限定されず、菌７や評価物質９に応じて適宜変更できる。保温時間は、好ましくは２時間～２４時間であり、より好ましくは３時間～１８時間である。
なお、〔４〕の工程では、寒天培地５は、図７に示されるように、マイクロチャンバー３が載せられた状態で所定温度範囲に保温されている。この状態では、隣り合うウェル１同士の間の部分２が、隣り合うウェル１にそれぞれ内包された評価物質９の仕切り壁となり、隣り合う評価物質９の混合が抑制されるから、適切に抗菌活性を評価できる。
【0028】
（１０）寒天培地５の観察方法
寒天培地５の観察方法は、マイクロチャンバー３を除去した寒天培地５上に形成された白濁領域５Ａと透明領域５Ｂ（ハロ）の状態を観察することができれば、特に限定されない。例えば、位相差顕微鏡による観察方法を採用できる。
寒天培地５の観察方法は、マイクロチャンバー３を除去した寒天培地５上に形成された白濁領域５Ａと透明領域５Ｂ（ハロ）の状態を観察することができれば、特に限定されない。例えば、位相差顕微鏡による観察方法を採用できる。
【0029】
２．本実施形態の効果
本実施形態の抗菌活性評価方法によれば、複数のウェル１を有するマイクロチャンバー３を用いるから、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能となる。
本実施形態の抗菌活性評価方法によれば、複数のウェル１を有するマイクロチャンバー３を用いるから、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能となる。
【実施例】
【0030】
以下、実施例により更に具体的に説明する。
【0031】
以下の実験では、後述するように、全てのウェルに、抗菌活性が既に確認されている同一の抗生物質を内包させている。この実験において、寒天培地プレートのうち、ウェルに内包された抗生物質が接触した部分が透明となり、抗生物質が接触していない部分が不透明となる場合には、次のことを意味している。すなわち、抗生物質が接触した部分が透明となることは、抗生物質により菌の生育が阻害されていることを意味し、抗生物質が接触していない部分が不透明となることは、抗生物質がないから菌が増殖して白濁していることを意味している。つまり、このような透明部分と不透明部分が観察されることは、抗生物質の存在により菌が死滅し、抗生物質の不存在により菌が増殖することを確認できることになり、結局のところ、抗生物質の抗菌活性が評価可能であることの指標となる。
また、全ウェル数に対してどれ程の割合で、透明部分が形成されているかを把握することで、この抗菌活性評価方法の感度を確認することができる。すなわち、透明部分の割合（後述する「ハロ形成率」に相当）が低くても、透明部分の存在が確認できれば、抗菌活性が確認できるから、抗菌活性評価方法として有益である。更に、透明部分の割合が高くなると、高い確率で抗菌活性が確認できることになるから、抗菌活性評価方法としてより有益であることが分かる。
また、全ウェル数に対してどれ程の割合で、透明部分が形成されているかを把握することで、この抗菌活性評価方法の感度を確認することができる。すなわち、透明部分の割合（後述する「ハロ形成率」に相当）が低くても、透明部分の存在が確認できれば、抗菌活性が確認できるから、抗菌活性評価方法として有益である。更に、透明部分の割合が高くなると、高い確率で抗菌活性が確認できることになるから、抗菌活性評価方法としてより有益であることが分かる。
【0032】
１．マイクロチャンバーの作製
（１）マイクロチャンバー鋳型の作製
２．５インチのシリコンウエハに、ＳＵ８－５０（レジスト、日本化薬社製）を１ｍＬ載せた。ＳＵ８－５０中の気泡を除去した後、スピンコーターで回転数１０００ｒｐｍとすることで、シリコンウエハにＳＵ８－５０を塗布した。ＳＵ８－５０を塗布したシリコンウエハに対して、６５℃１５分の加熱、９５℃４０分の加熱、放冷一時間（４０℃以下まで冷ます）を順に実施した。その後、ＳＵ８－５０を塗布したシリコンウエハの上に、マイクロチャンバーをパターニングしたクロムマスク（鋳型）を被せ、マスクアライナーで１９秒露光した。そして、６５℃２分、９５℃１５分のポストベイクをした後、ＳＵ８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ とイソプロピルアルコールでシリコンウエハを洗浄し現像することで、高さ１００μｍのＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型を作製した。
（１）マイクロチャンバー鋳型の作製
２．５インチのシリコンウエハに、ＳＵ８－５０（レジスト、日本化薬社製）を１ｍＬ載せた。ＳＵ８－５０中の気泡を除去した後、スピンコーターで回転数１０００ｒｐｍとすることで、シリコンウエハにＳＵ８－５０を塗布した。ＳＵ８－５０を塗布したシリコンウエハに対して、６５℃１５分の加熱、９５℃４０分の加熱、放冷一時間（４０℃以下まで冷ます）を順に実施した。その後、ＳＵ８－５０を塗布したシリコンウエハの上に、マイクロチャンバーをパターニングしたクロムマスク（鋳型）を被せ、マスクアライナーで１９秒露光した。そして、６５℃２分、９５℃１５分のポストベイクをした後、ＳＵ８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ とイソプロピルアルコールでシリコンウエハを洗浄し現像することで、高さ１００μｍのＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型を作製した。
【0033】
（２）マイクロチャンバーの作製
ＰＤＭＳ主剤と硬化剤を１０：１で混合し、脱気した溶液５ｇを、ＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型に流し込み、１時間真空引きした後、７５℃で２時間硬化させた。固まったＰＤＭＳからＳＵ８の鋳型を除去することで、ＰＤＭＳ製のマイクロチャンバーを得た。
マイクロチャンバーは、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：３００μｍ）、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：５００μｍ）、ウェルの平面形状が円形（径：３００μｍ）、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）の４種類を用意した。いずれのマイクロチャンバーも、ウェルの深さは１００μｍであり、ウェル間距離は３００μｍであり、ウェル数は５００であった。
なお、図１１には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーの実体顕微鏡写真が示されている。図１２には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーの電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）が示されている。
ＰＤＭＳ主剤と硬化剤を１０：１で混合し、脱気した溶液５ｇを、ＳＵ８のマイクロチャンバー鋳型に流し込み、１時間真空引きした後、７５℃で２時間硬化させた。固まったＰＤＭＳからＳＵ８の鋳型を除去することで、ＰＤＭＳ製のマイクロチャンバーを得た。
マイクロチャンバーは、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：３００μｍ）、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：５００μｍ）、ウェルの平面形状が円形（径：３００μｍ）、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）の４種類を用意した。いずれのマイクロチャンバーも、ウェルの深さは１００μｍであり、ウェル間距離は３００μｍであり、ウェル数は５００であった。
なお、図１１には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーの実体顕微鏡写真が示されている。図１２には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーの電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）が示されている。
【0034】
２．抗菌活性評価
上述の４種の各マイクロチャンバーを用いて、それぞれ以下の操作を行うことで、抗菌活性を評価した。
アガロース寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に濁度を０．２に調整した微生物液を５００μＬ添加し、スピンコーター（回転数１０００ｒｐｍ）で均一に塗布した。なお、微生物としては、大腸菌を用いた。
ＰＤＭＳ製マイクロチャンバーをＯ２アッシャーで親水化処理し（１２５Ｗ、１０ｓｅｃ）、厚さ０．３ｍｍ、縦横４０ｍｍ×３０ｍｍのカバーグラス（松浪硝子工業株式会社）を用い、マイクロチャンバーに抗生物質（カナマイシン）を内包した。なお、この抗生物質は、大腸菌に対して抗菌性があることが予め分かっている。
作製した微生物液を塗布したアガロース寒天培地プレートに、抗生物質を添加したマイクロチャンバーを載せた。
この状態で、３７℃、１２時間静置した後、アガロース寒天培地プレートからマイクロチャンバーを除去して、アガロース寒天培地プレート上のハロ形成を位相差顕微鏡で評価し、ハロの数をカウントした。そして、下記式より、ハロ形成率（％）を求めた。
ハロ形成率（％）＝{（ハロとみなせる個数）／（全ウェル数）｝×１００
上述の４種の各マイクロチャンバーを用いて、それぞれ以下の操作を行うことで、抗菌活性を評価した。
アガロース寒天培地プレート（Φ６０ｍｍ）に濁度を０．２に調整した微生物液を５００μＬ添加し、スピンコーター（回転数１０００ｒｐｍ）で均一に塗布した。なお、微生物としては、大腸菌を用いた。
ＰＤＭＳ製マイクロチャンバーをＯ２アッシャーで親水化処理し（１２５Ｗ、１０ｓｅｃ）、厚さ０．３ｍｍ、縦横４０ｍｍ×３０ｍｍのカバーグラス（松浪硝子工業株式会社）を用い、マイクロチャンバーに抗生物質（カナマイシン）を内包した。なお、この抗生物質は、大腸菌に対して抗菌性があることが予め分かっている。
作製した微生物液を塗布したアガロース寒天培地プレートに、抗生物質を添加したマイクロチャンバーを載せた。
この状態で、３７℃、１２時間静置した後、アガロース寒天培地プレートからマイクロチャンバーを除去して、アガロース寒天培地プレート上のハロ形成を位相差顕微鏡で評価し、ハロの数をカウントした。そして、下記式より、ハロ形成率（％）を求めた。
ハロ形成率（％）＝{（ハロとみなせる個数）／（全ウェル数）｝×１００
【0035】
３．評価結果
図１３には、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。この画像は、全体画像の一部である（以下、図１４～１６で同様である）。破線で囲まれた部分でハロが観察されている（以下、図１４～１６で同様である）。
図１４には、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
図１５には、ウェルの平面形状が円形（径：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
図１６には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
図１３には、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。この画像は、全体画像の一部である（以下、図１４～１６で同様である）。破線で囲まれた部分でハロが観察されている（以下、図１４～１６で同様である）。
図１４には、ウェルの平面形状が正方形（１辺の長さ：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
図１５には、ウェルの平面形状が円形（径：３００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
図１６には、ウェルの平面形状が円形（径：５００μｍ）のマイクロチャンバーを用いた場合の位相差顕微鏡の画像が示されている。
【0036】
表１、及び図１７にハロ形成率（％）が示されている。いずれのマイクロチャンバーを用いてもハロの形成が確認されることから、いずれの場合も抗生物質の抗菌活性を評価できることが確認された。
但し、ウェルの形状が円形の方が、正方形よりもハロ形成率が高いことから、ウェルの形状が円形の方が抗菌活性を感度よく評価できることが確認された。
また、ウェルの形状が円形の場合、径が３００μｍよりも径が５００μｍの場合の方がハロ形成率が高いことから、径が３５０μｍ～６５０μｍの場合はより感度よく評価できることが確認された。
但し、ウェルの形状が円形の方が、正方形よりもハロ形成率が高いことから、ウェルの形状が円形の方が抗菌活性を感度よく評価できることが確認された。
また、ウェルの形状が円形の場合、径が３００μｍよりも径が５００μｍの場合の方がハロ形成率が高いことから、径が３５０μｍ～６５０μｍの場合はより感度よく評価できることが確認された。
【0037】
【表1】
【0038】
４．実施例の効果
本実施例の抗菌活性評価方法によれば、多数のウェルを有するマイクロチャンバーを用いるから、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能となる。例えば、従来法が５サンプルしか評価できないとすると、本実施形態の抗菌活性評価方法によれば、約１００倍多くのサンプルを評価可能である。また、従来法よりも多数のサンプルを同時に評価できるから、評価にかかるコストを著しく削減できる。
本実施例の抗菌活性評価方法によれば、多数のウェルを有するマイクロチャンバーを用いるから、従来法よりも多くのサンプルの評価が可能となる。例えば、従来法が５サンプルしか評価できないとすると、本実施形態の抗菌活性評価方法によれば、約１００倍多くのサンプルを評価可能である。また、従来法よりも多数のサンプルを同時に評価できるから、評価にかかるコストを著しく削減できる。
【0039】
前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述及び図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的及び例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲又は本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料及び実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。
【0040】
本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【0041】
本発明の抗菌活性評価方法を用いれば、新規抗生物質の活性を多検体評価できる。
【符号の説明】
【0042】
１ …ウェル
１Ａ…径
１Ｂ…ウェル間距離
１Ｃ…深さ
２ …隣り合うウェル同士の間の部分
３ …マイクロチャンバー
５ …寒天培地
５Ａ…白濁領域
５Ｂ…透明領域（ハロ）
７ …菌
９ …評価物質
１Ａ…径
１Ｂ…ウェル間距離
１Ｃ…深さ
２ …隣り合うウェル同士の間の部分
３ …マイクロチャンバー
５ …寒天培地
５Ａ…白濁領域
５Ｂ…透明領域（ハロ）
７ …菌
９ …評価物質
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】