特許 7270948 物質検出装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-28

(45)【発行日】2023-05-11

(54)【発明の名称】物質検出装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20230501BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20230501BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 521

G01N21/78 A

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2018142651

(22)【出願日】2018-07-30

(65)【公開番号】P2020020601

(43)【公開日】2020-02-06

【審査請求日】2021-07-12

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ［開催日］平成３０年３月５日 ［講義名、開催場所］ＫＩＳＴＥＣ教育講座「ペーパーマイクロ分析チップの技術と可能性」、かながわサイエンスパーク（ＫＳＰ）（神奈川県川崎市高津区坂戸３－２－１） ［開催日］平成３０年５月２７日 ［集会名及び講義名、開催場所］第７８回分析化学討論会「ペーパー分析デバイスの潮流」、国立大学法人山口大学 常盤キャンパス（山口県宇部市常盤台２－１６－１） ［公開日］平成３０年７月３０日 ［講義名、開催場所］第１回ＫＩＳＴＥＣ理科実験室、かながわサイエンスパーク（ＫＳＰ）（神奈川県川崎市高津区坂戸３－２－１）

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001841

【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ

(72)【発明者】

【氏名】渡慶次 学

(72)【発明者】

【氏名】石田 晃彦

(72)【発明者】

【氏名】小松 雄士

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 優樹

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３５５１３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５１１８１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－１００８８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】CAMPLISSON, C. K. et al.，Two-ply channels for faster wicking in paperbased microfluidic devices，Lab on a Chip，2015年，Vol.15，pp.4461-4466

【文献】MORBIOLI, G. G. et al.，Improving Sample Distribution Homogeneity in Three-Dimensional Microfluidic Paper-Based Analytical Devices by Rational Device Design，Analytical Chemistry，Vol.89，pp.4786-4792

【文献】BUSA, L. S. A. et al.，A competitive immunoassay system for microfluidic paper-based analytical detection of small size molecules，Analyst，2016年，Vol.141，pp.6598-6603

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｇ０１Ｎ ２１／７８

Ｇ０１Ｎ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１発色関与物質と第２発色関与物質との作用に起因して発生する発色の強度に基づいて水溶液中の物質の濃度を検出する物質検出装置であって、
親水性領域と当該親水性領域の外縁を画定する疎水性領域とを有する、複数のシートが積層された積層体を備えており、
前記積層体の親水性領域に、
検出対象である被検出物質と同一の物質が前記第１発色関与物質と結合した第１複合体及び前記被検出物質を含んだ試料液、又は、前記被検出物質をターゲットとする抗体が前記第１発色関与物質と結合した第２複合体及び前記被検出物質を含んだ試料液が供給される試料供給部と、
前記第２発色関与物質が固定されたテスト側発色部及びコントロール側発色部と、
前記被検出物質及び前記第１複合体を捕捉する第１捕捉物質、又は、前記第２複合体を捕捉する第２捕捉物質が固定された捕捉部と、が形成されており、
前記試料供給部と、前記試料供給部から前記テスト側発色部までを結ぶテスト側流路と、前記試料供給部から前記コントロール側発色部までを結ぶコントロール側流路とが、前記複数のシートのうちの１つである第１シートの親水性領域に形成されており、
前記テスト側流路の形状と前記コントロール側流路の形状とが、互いに同じであるか、又は鏡像の関係にあり、
前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記テスト側流路中の第１親水部と接触した親水性領域からなる第２親水部が形成されており、
前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記コントロール側流路における前記第１親水部に対応する第３親水部と接触した親水性領域からなる第４親水部が形成されており、
前記第１親水部及び前記第２親水部のいずれか一方が前記捕捉部であり、
前記第１親水部に接触する前記第２親水部と前記第３親水部に接触する前記第４親水部とがあることにより、前記捕捉部における捕捉効率が向上していると共に、前記コントロール側発色部の発色強度値の平均値に対する前記テスト側発色部の発色強度値の平均値の比にばらつきが生じにくくなっていることを特徴とする物質検出装置。

【請求項2】

前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記テスト側流路における前記試料供給部とは反対側の端部と接触した親水性領域からなる第５親水部が形成されており、
前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記コントロール側流路における前記試料供給部とは反対側の端部と接触した親水性領域からなる第６親水部が形成されており、
前記第５親水部が前記テスト側発色部であり、
前記第６親水部が前記コントロール側発色部であることを特徴とする請求項１に記載の物質検出装置。

【請求項3】

前記第２親水部、前記第４親水部、前記第５親水部及び前記第６親水部が、一体の１シートである第２シートに形成されていることを特徴とする請求項２に記載の物質検出装置。

【請求項4】

前記複数のシートのうちの１つであり前記第２シート上に積層された第３シートに、前記テスト側発色部及び前記コントロール側発色部と重なる位置に形成された観察孔と、前記第２親水部及び第４親水部を被覆する疎水性領域と、が形成されており、
前記第２シート及び第３シートが、前記試料供給部へと前記試料液を導入する親水性領域からなる導入流路が形成されていることを特徴とする請求項３に記載の物質検出装置。

【請求項5】

前記第１シート、前記第２シート及び前記第３シートが、３つ折りにされた一体の１枚のシートにおける折れ線によって区分された３つの領域に対応することを特徴とする請求項４に記載の物質検出装置。

【請求項6】

前記テスト側流路及び前記コントロール側流路の少なくとも一部が、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートの疎水性領域によって被覆されていることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の物質検出装置。

【請求項7】

前記テスト側発色部、前記コントロール側発色部及び前記捕捉部のそれぞれを形成する親水性領域が円板の形状を有していることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の物質検出装置。

【請求項8】

前記積層体の疎水性領域が、疎水性インクの乾燥物を内部に含んでいることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の物質検出装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シートを使用した物質検出装置に関する。

【背景技術】

【0002】

紙等のシートを使用した物質検出装置に関する従来技術として、特許文献１及び非特許文献１の技術がある。いずれの文献においても、紙製のシートが使用され、シート上に親水性の流路が形成されている。シート上の流路の一端には、被検出物質が溶解した水溶液が供給される試料供給部が設定されている。流路の他端かその途中には被検出物質の検出結果を表示する表示部分が設定されている。試料供給部に水溶液が供給されると、そこから流路の他端に向かって毛細管現象により水溶液が移動していく。そして、検出結果の表示部分に水溶液が到達すると、水溶液中に被検出物質が含まれるか否か等の検出結果が表示される。

【0003】

特に、非特許文献１においては、以下のように、検出結果を表示するために、ある物質の発色作用が利用されている。この発色作用には少なくとも２つの物質（西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという。）及び３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（以下、ＴＭＢＺという。））が関わっている。非特許文献１の流路は、試料供給部から他端に向かって２本に分岐している。分岐した流路の各他端には、上記２つの物質のうちの一方（ＴＭＢＺ）が固定された発色部が設けられている。これら２つの発色部の一方はテスト領域であり、他方はコントロール領域である。上記２つの物質のうちの他方（ＨＲＰ）は、被検出物質（例えば、ビオチン）をターゲットとする抗体に結合している。この抗体と被検出物質とが溶解した水溶液が上記試料供給部に供給される。水溶液中では、抗体の一部が被検出物質と結合している。試料供給部からテスト領域である発色部までの流路には、抗体を捕捉させるために被検出物質と同一の物質が固定された捕捉部が設けられている。

【0004】

非特許文献１の装置は以下のように使用される。試料供給部に水溶液が供給されると、試料供給部から流路の他端の２つの発色部に向かって毛細管現象により水溶液が移動していく。一方の流路においては、被検出物質と結合していない水溶液中の抗体が、途中の捕捉部に固定された物質に捕捉される。被検出物質と結合した水溶液中の抗体はテスト側の発色部に到達する。他方の流路においては、被検出物質と結合した抗体も結合していない抗体もいずれもコントロール側の発色部に到達する。そして、各発色部に固定された上記２つの物質の一方と、抗体と結合した上記２つの物質の他方との間の作用により、各発色部に到達した水溶液中の抗体の濃度に応じた強さで発色が発生する。テスト側の発色部に到達する水溶液中の抗体の濃度は、捕捉部に捕捉された抗体の量に応じて変動する。捕捉部に捕捉される抗体の量は、水溶液中の被検出物質の濃度に応じて変動する。よって、テスト側の発色部における発色の強さとコントロール側の発色部における発色の強さとを比較することで、水溶液中の被検出物質の濃度が検出される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第２９３０４２６号

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｌ.Ｓ.Ａ.ブサ他（L.S.A. Busa et al.）著「小型分子の微小流体的紙ベースの分析的検出のための競合イムノアッセイシステム（A competitive immunoassay system for microfluidic paper-based analytical detection of small size molecules）」、アナリスト（Analyst）、２０１６年、１４１、ｐ．６５９８～６６０３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、上記従来技術によると、テスト側の発色部とコントロール側の発色部との間で発色の強度にそれほど大きな差が生じず、また、検出結果にばらつきが生じやすい。テスト側の発色部とコントロール側の発色部との間で発色の強度に差が出にくかったり、検出結果にばらつきが生じやすかったりすると、装置において被検出物質の濃度の違いを区別する能力が低くなる。つまり、例えば、被検出物質の濃度が異なる２つの水溶液があるとき、その濃度の差異について装置が検出可能な最小値が大きくなってしまう。

【0008】

本発明の目的は、水溶液における被検出物質の濃度の違いを区別する能力が高められた物質検出装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の物質検出装置は、第１発色関与物質と第２発色関与物質との作用に起因して発生する発色の強度に基づいて水溶液中の物質の濃度を検出する物質検出装置であって、親水性領域と当該親水性領域の外縁を画定する疎水性領域とを有する、複数のシートが積層された積層体を備えており、前記積層体の親水性領域に、検出対象である被検出物質と同一の物質が前記第１発色関与物質と結合した第１複合体及び前記被検出物質を含んだ試料液、又は、前記被検出物質をターゲットとする抗体が前記第１発色関与物質と結合した第２複合体及び前記被検出物質を含んだ試料液が供給される試料供給部と、前記第２発色関与物質が固定されたテスト側発色部及びコントロール側発色部と、前記被検出物質及び前記第１複合体を捕捉する第１捕捉物質、又は、前記第２複合体を捕捉する第２捕捉物質が固定された捕捉部と、が形成されており、前記試料供給部と、前記試料供給部から前記テスト側発色部までを結ぶテスト側流路と、前記試料供給部から前記コントロール側発色部までを結ぶコントロール側流路とが、前記複数のシートのうちの１つである第１シートの親水性領域に形成されており、前記テスト側流路の形状と前記コントロール側流路の形状とが、互いに同じであるか、又は鏡像の関係にあり、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記テスト側流路中の第１親水部と接触した親水性領域からなる第２親水部が形成されており、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記コントロール側流路における前記第１親水部に対応する第３親水部と接触した親水性領域からなる第４親水部が形成されており、前記第１親水部及び前記第２親水部のいずれか一方が前記捕捉部であり、前記第１親水部に接触する前記第２親水部と前記第３親水部に接触する前記第４親水部とがあることにより、前記捕捉部における捕捉効率が向上していると共に、前記コントロール側発色部の発色強度値の平均値に対する前記テスト側発色部の発色強度値の平均値の比にばらつきが生じにくくなっている。

【0010】

本発明の物質検出装置によると、テスト側流路においては、試料液中の被検出物質及び第１複合体、又は、第２複合体が捕捉部に捕捉され、捕捉されなかった残余の物質を含んだ水溶液がテスト側発色部に到達する。第１複合体及び第２複合体には第１発色関与物質が含まれており、テスト側発色部には第２発色関与物質が固定されている。したがって、テスト側発色部においては、第１複合体又は第２複合体中の第１発色関与物質と第２発色関与物質との作用に応じた発色が起こる。テスト側発色部に到達する第１複合体又は第２複合体の濃度は、試料液の調製時の被検出物質の濃度に応じて変動する。よって、テスト側発色部における発色強度は、試料液の調製時の被検出物質の濃度に応じて変動する。これに対し、コントロール側流路では、第１複合体又は第２複合体が流路の途中で捕捉されることなく試料液がコントロール側発色部に到達する。したがって、テスト側発色部における発色強度とコントロール側発色部における発色強度とを比較すると、捕捉部において第１複合体又は第２複合体が捕捉される分、前者の発色強度が後者の発色強度より低くなる。

【0011】

本発明においては、テスト側発色部における発色強度を、上記のようなコントロール側発色部における発色強度との比較によって適切に評価可能である。つまり、コントロール側流路の発色強度を基準としてテスト側発色部の発色強度を適切に評価できる。このように、コントロール側発色部の発色強度を適切な基準として用いることができるのは、本発明のテスト側流路とコントロール側流路とが、互いに同じ形状を有するか、互いに鏡像の関係にある形状を有するように構成されているためである。仮に、これらの形状が互いに同じでなく鏡像の関係にもないとすると、流路間の形状の違いによって試料液の流れ方に違いが生じるおそれがある。試料液の流れ方に違いが生じると、流れ方の差によって発色に差が出たのか、その他の要因で差が出たのかを切り分けにくい。これに対し、本発明は、テスト側流路の形状とコントロール側流路の形状とが、互いに同じであるか、互いに鏡像の関係にある。このため、流路の形状の違いを要因とする発色強度の違いが生じにくい。したがって、流路の形状以外の要因、つまり、捕捉部における第１複合体又は第２複合体の捕捉による発色強度の違いを適切に評価しやすい。

【0012】

さらに、本発明においては、テスト側流路の一部である第１親水部と接触した親水性領域からなる第２親水部が設けられていると共に、第１親水部及び第２親水部のいずれか一方が捕捉部となっている。そして、コントロール側流路における第１親水部と対応する第３親水部と接触した親水性領域からなる第４親水部が設けられている。これらにより、後述の実施例３に示すように、以下の２つの効果が確保される。第１に、捕捉部における物質の捕捉効率が向上することにより、テスト側発色部の発色強度にコントロール側発色部の発色強度との差が生じやすくなっている。したがって、テスト側発色部の発色強度をコントロール側発色部の発色強度との比較に基づいて評価しやすい。第２に、コントロール側発色部の発色強度に対するテスト側発色部の発色強度の相対的な大きさ（以下、相対発色強度という。）にばらつきが生じにくい。相対発色強度にばらつきが生じにくいと、例えば、被検出物質の濃度が異なる２つの試料液があるとき、その濃度の差異について装置が検出可能な最小値が小さくなる。以上の２つの効果により、本発明は、テスト側発色部とコントロール側発色部との発色強度の比較に基づく被検出物質の濃度の検出において、試料液における被検出物質の濃度の違いを区別する能力が高められている。なお、本発明の試料液は、被検出物質と第１複合体又は第２複合体と被検出物質とを含んだものであれば、どのように調製されてもよい。例えば、被検出物質の水溶液と第１複合体又は第２複合体の水溶液とを用意した後、これらの水溶液同士を混合させてもよい。また、被検出物質の水溶液を用意した後、第１複合体又は第２複合体をその水溶液に溶解させてもよい。さらに、第１複合体又は第２複合体の水溶液をあらかじめ調製しておき、その水溶液に被検出物質を溶解させてもよい。

【0013】

なお、「前記第１シート上に積層された別のシート」とは、第１シートと一体に繋がったシートが折り畳まれることで第１シート上に積層されたものであってもよいし、第１シートとは分離されたシートが第１シート上に積層されたものであってもよい。また、第２親水部が形成された「別のシート」と、第４親水部が形成された「別のシート」とは、互いに共通のシートであってもよいし、互いに異なるシートであってもよい。

【0014】

また、本発明においては、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記テスト側流路における前記試料供給部とは反対側の端部と接触した親水性領域からなる第５親水部が形成されており、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された別のシートに、前記コントロール側流路における前記試料供給部とは反対側の端部と接触した親水性領域からなる第６親水部が形成されており、前記第５親水部が前記テスト側発色部であり、前記第６親水部が前記コントロール側発色部であることが好ましい。従来技術（例えば、非特許文献１）によると、１枚のシートに形成されたテスト側流路の端部に発色部が設けられている。このため、従来技術では、発色部における発色は、１枚のシートに沿った方向に関する試料液の浸透のみによって進んでいく。したがって、シートに沿った方向に関する発色のむらが生じやすい。発色のむらが生じると、発色部の発色強度を適切に評価できず、発色部の発色強度に基づく被検出物質の濃度の検出が適切に行えないおそれがある。これに対し、本発明における上記構成によると、試料供給部からテスト側流路の端部まで到達した試料液は、第１シートに沿ってテスト側流路の端部の奥へと浸透しながら、さらに第１シートから第４シートへと、テスト側発色部である第５親水部に向かって浸透していく。つまり、１枚のシートに沿った水溶液の浸透のみによって発色が進んでいく従来技術とは異なり、本発明においては、１枚のシート内での試料液の浸透のみならず、第１シートから第４シートへとシート間を跨ぐように試料液の浸透が進むことによっても発色が進んでいく。このため、従来技術のようなシートに沿った方向に関する発色のむらが生じにくい。同様に、コントロール側流路の端部においても、これと接触した第６親水部にコントロール側発色部が設けられていることによって発色のむらが生じにくくなっている。以上により、テスト側発色部及びコントロール側発色部の発色強度に基づいて被検出物質を適切に検出できる。なお、第２親水部が形成された「別のシート」、第４親水部が形成された「別のシート」、第５親水部が形成された「別のシート」及び第６親水部が形成された「別のシート」は、互いに共通のシートであってもよいし、互いに異なるシートであってもよい。

【0015】

また、本発明においては、前記第２親水部、前記第４親水部、前記第５親水部及び前記第６親水部が、一体の１シートである第２シートに形成されていることが好ましい。これによると、第２親水部～第６親水部が１枚のシートにまとめられているため、本発明の装置が比較的簡易な構造で実現される。

【0016】

また、本発明においては、前記複数のシートのうちの１つであり前記第２シート上に積層された第３シートに、前記テスト側発色部及び前記コントロール側発色部と重なる位置に形成された観察孔と、前記第２親水部及び第４親水部 を被覆する疎水性領域と、が形成されており、前記第２シート及び第３シートが、前記試料供給部へと前記試料液を導入する親水性領域からなる導入流路が形成されていることが好ましい。これによると、第２シート上に積層された第３シートの疎水性領域が第２親水部及び第４親水部を被覆することによって、これらの部分からの試料液の蒸発が抑制される。また、第２シート及び第３シートに形成された導入流路により、試料供給部に試料液を導入する経路が確保されている。さらに、テスト側発色部及びコントロール側発色部における発色を検出するための観察孔が第３シートに確保されている。

【0017】

また、本発明においては、前記第１シート、前記第２シート及び前記第３シートが、３つ折りにされた一体の１枚のシートにおける折れ線によって区分された３つの領域に対応することが好ましい。これによると、第１シート～第３シートが１枚のシートにまとめられているため、本発明の装置が簡易な構造で実現される。

【0018】

また、発明においては、前記テスト側流路及び前記コントロール側流路の少なくとも一部が、前記複数のシートのうちの１つであり前記第１シート上に積層された前記第１シートとは別のシートの疎水性領域によって被覆されていることが好ましい。これによると、テスト側流路及びコントロール側流路からの試料液の蒸発が抑制される。

【0019】

また、発明においては、前記テスト側発色部、前記コントロール側発色部及び前記捕捉部のそれぞれを形成する親水性領域が円板の形状を有していることが好ましい。装置の作製過程において、第１シートにおけるテスト側発色部、コントロール側発色部又は捕捉部となるべき部分に液体を滴下する場合がある。例えば、これらの部分に、第２発色関与物質又は第１捕捉物質若しくは第２補足物質の溶液を滴下することでこれらの物質を固定する場合である。このような場合、本発明の上記構成のように各部が円板形状を有していることにより、滴下すべき領域の外縁が明確に規定されている。よって、液体をこれら各部に対応する領域に滴下するに当たって、その領域をちょうど満たす液体の量を規定しやすい。

【0020】

また、本発明においては、前記積層体の疎水性領域が、疎水性インクの乾燥物を内部に含んでいることが好ましい。これによると、プリンター等を用いて疎水性インクによるパターンを形成することで、親水性領域からなる流路を画定する疎水性領域を容易にシート上に形成できる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明の一実施形態に係る紙デバイスの分解斜視図である。

【図2】図１の紙デバイスのII－II線断面図である。

【図3】図１の紙デバイスの展開図である。

【図4】図１の紙デバイスに形成された流路の模式図である。

【図5】図１の紙デバイスの使用方法を示すフロー図である。

【図6】図１の発色部が発色した状態の紙デバイスの平面図である。

【図7】図１の紙デバイスを用いた試験である実施例１の結果を示すグラフである。

【図8】図１の紙デバイスを用いた試験である実施例２の結果を示すグラフである。

【図9】図８に係る実施例２に対する比較例（従来例）の結果を示すグラフである。

【図10】図１の紙デバイスを用いた試験である実施例３の結果及びこれに対する比較例の結果を示すグラフである。

【図11】流路の変形例を示す図である。

【図12】流路の別の変形例を示す図である。

【図13】紙デバイスの変形例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

［紙デバイス１］
以下、本発明の一実施形態に係る紙デバイス１について説明する。紙デバイス１は、試料液中の被検出物質の濃度を検出する装置である。本装置は、例えば、動物の血液等の検体に含まれる特定の物質を検出するために用いられる。被検出物質としては、抗体との複合体が作成可能な物質であれば、どのような物質であってもよい。例えば、後述の実施例において用いられるプロゲステロン、ビオチンの他、コルチゾール、エストロゲン、テストステロン、プロラクチン、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、アフラトキシン、オクラトキシン、パツリン、デオキシニバレノール、ニバレノール等が対象とされてよい。

【0023】

紙デバイス１においては、少なくとも２つの物質が関わって生じる発色が利用されている。２つの物質の一方（本発明における第１発色関与物質）は酵素であり、後述の通り、被検出物質と結合した複合体か、あるいは、被検出物質をターゲットとする抗体と結合した複合体として試料液に含まれた状態で用いられる。２つの物質の他方（本発明における第２発色関与物質）は発色基質１（色原体）であり、後述の通り、紙デバイス１に部分的に固定されて用いられている。酵素及び発色基質１の組み合わせによっては、発色のために発色基質２が必要となる場合がある。この場合、発色基質２は、後述の通り、例えば、試料液に含まれた状態で用いられる。かかる酵素、発色基質１及び２としては、表１に掲げる物質が使用されてもよい。表１に示すように、酵素の候補としてＨＲＰ、β－ＧＡＬ等のいずれか１つが使用可能であり、酵素の各候補に対して複数の発色基質１の候補が存在する。例えば、ＨＲＰに対しては１,２－フェニレンジアミン、ＴＭＢＺ等のいずれか１つが使用可能である。発色基質２としては、酵素及び発色基質１の組み合わせに応じて決定される。例えば、酵素及び発色基質１としてＨＲＰ及びＴＰＭ－ＰＳが使用される場合、発色基質２としてＨ₂Ｏ₂が使用される。また、酵素及び発色基質１としてＨＲＰ及びＡＬＰＳが使用される場合、発色基質２としてＨ₂Ｏ₂及び４－ＡＡの両方が使用される。一方、例えば、酵素及び発色基質１としてＡＬＰ及びＮＡＤＰが用いられる場合、発色基質２は不要である。

【0024】

［表１］

【0025】

次に、紙デバイス１の構成について、図１～図４を参照しつつ説明する。紙デバイス１は、図１及び図２に示すように、濾紙製のシート１０（本発明における第３シート）、シート２０（本発明における第２シート）、及びシート３０（本発明における第１シート）が積層した積層体２を備えている。以下、シートが積層された方向を積層方向という。シート１０～３０は、図３に示す１枚のシートが山折り線１ａ及び谷折り線１ｂでＺ型に３つ折りに折り畳まれることで、積層方向に関してシート１０、２０及び３０がこの順序で並んだ３層のシートからなる積層体２になるように構成されている。シート１０～３０は、山折り線１ａ及び谷折り線１ｂによって区分される３つの領域に対応している。つまり、図３に示す１枚のシートにおいて、シート１０は山折り線１ａより左側の領域を、シート２０は山折り線１ａから谷折り線１ｂまでの領域を、シート３０は谷折り線１ｂより右側の領域を占めている。

【0026】

積層体２は、図２に示すように、左上から右下に向かう方向に沿った斜線からなるハッチングの領域２ａと、右上から左下に向かう方向に沿った斜線からなるハッチングの領域２ｂとを含んでいる。領域２ｂは、疎水性のインクを含侵させた疎水性を有する領域である。以下、領域２ｂを疎水性領域２ｂという。これに対し、領域２ａにはかかるインクを含侵させていない。このため、領域２ａは親水性を有する領域である。以下、領域２ａを親水性領域２ａという。親水性領域２ａの一か所に水や水溶液からなる液体を含ませると、その液体は、時間の経過に伴ってその一か所から周囲へと毛細管現象により広がっていく。液体の広がりは、親水性領域２ａと疎水性領域２ｂとの境界に到達するまで継続する。

【0027】

疎水性領域２ｂのパターンは、例えば、疎水性のソリッドインクを用い、ソリッドインク用のインクジェットプリンターを使用してシート上に印刷することで形成する。パターンの印刷後、乾燥機を用いてシートを加熱することにより、シート上のインクを融解させつつシート中に浸透させる。これにより、シートの一方の表面から他方の表面まで疎水性のインクを含浸した疎水性領域２ｂが形成される。疎水性領域２ｂは、疎水性のインクの乾燥物がシート中に存在した状態となる。なお、シート上へのパターンの形成には、ソリッドインク式以外のインクジェットプリントの他、スクリーンプリント、フォトリソグラフィー等が使用されてもよい。

【0028】

積層体２は、親水性領域２ａによって形成された流路を有している。この流路は、シート１０～３０のそれぞれの親水性領域２ａが互いに連通することで形成されている。流路の一部として、シート１０には導入部１１が形成されている。導入部１１は、図２の左右方向に関してシート１０のほぼ中央に配置されている。以下、図２の左右方向を横方向といい、シートの積層方向及び横方向の両方と直交する方向を縦方向という。導入部１１は、図４に示すように円板形状を有している。導入部１１には試料液が導入される。試料液は、２つの水溶液のいずれかである。２つの水溶液の一方は、検出対象としての被検出物質の水溶液（例えば、被検出物質を含んだ検体）に、酵素を含む複合体（第１複合体）の水溶液を混合させたものである。この試料液は、プロゲステロンに係る後述の実施例１で使用されるものに対応する。上記複合体は、検出対象とは別に準備された被検出物質と同一の物質と酵素とを結合させたものである。以下、この複合体を被検出物質－酵素複合体という。２つの水溶液の他方は、検出対象としての被検出物質の水溶液（例えば、被検出物質を含んだ検体）に、酵素を含む複合体（第２複合体）の水溶液を混合させたものである。この試料液は、ビオチンに係る後述の実施例２で使用されるものに対応する。上記複合体は、被検出物質に対する抗体と酵素とを結合させたものである。以下、この複合体を抗体－酵素複合体という。また、発色のために発色基質２も必要となる場合、試料液はさらに発色基質２を含んだものとする。なお、シート１０には、平面視において円形の観察孔１２及び１３が形成されている。観察孔１２及び１３は、導入部１１と共に、横方向に沿って一列に配列されている。観察孔１２及び１３並びに導入部１１は互いに等間隔に配置されている。

【0029】

シート２０には、上記流路の一部として、連通部２１～２３並びに発色部２４及び２５が形成されている。連通部２１～２３並びに発色部２４及び２５は、図１に示すように横方向に沿って等間隔で一列に配列されている。これらのうち、連通部２１は、横方向及び縦方向に関して導入部１１と同じ位置に、導入部１１と同じ形状で形成されている。発色部２４及び２５は、横方向及び縦方向に関して観察孔１２及び１３と同じ位置に配置されている。連通部２２（本発明における第２親水部）は連通部２１と発色部２４との間に配置され、連通部２３（本発明における第４親水部）は連通部２１と発色部２５との間に配置されている。連通部２１～２３並びに発色部２４及び２５は、図４に示すように、互いに同じ円板形状を有している。発色部２４及び２５には、それぞれ発色基質１が固定されている。なお、発色部２４は、本発明における第５親水部及びテスト側発色部に対応する。また、発色部２５は、本発明における第６親水部及びコントロール側発色部に対応する。

【0030】

シート３０には、上記流路の一部として、試料供給部３２、捕捉部３３（本発明における第１親水部）、擬捕捉部３４（本発明における第３親水部）、並びに連通部３５～３７が形成されている。これらのうち、試料供給部３２、捕捉部３３及び擬捕捉部３４並びに連通部３５及び３６は、図４に示すように互いに同じ円板形状を有している。また、これらは、シート２０の連通部２１等と同じ形状を有している。連通部３７は、図４に示すように横方向に沿って直線状に延びている。試料供給部３２、捕捉部３３及び擬捕捉部３４並びに連通部３５及び３６は、図１に示すように、それぞれ、シート２０の連通部２１～２３並びに発色部２４及び２５と横方向及び縦方向に関して同じ位置に配置されている。連通部３７は、試料供給部３２、捕捉部３３及び擬捕捉部３４並びに連通部３５及び３６の各部分同士を横方向に連通させている。捕捉部３３には、試料液中の物質を捕捉する物質（以下、捕捉物質という。）が固定されている。本実施形態に係る捕捉物質としては、以下の被検出物質捕捉物質及び抗体捕捉物質のいずれかが用いられる。被検出物質捕捉物質は、試料液中の被検出物質及び被検出物質－酵素複合体を捕捉する物質である。被検出物質捕捉物質としては、例えば、被検出物質に対する抗体が用いられてもよい。この抗体としては、被検出物質と直接結合する抗体のみが用いられてもよいし、一次抗体及び二次抗体が用いられてもよい。抗体捕捉物質は、試料液中の抗体－酵素複合体を捕捉する物質である。抗体捕捉物質としては、例えば、被検出物質と同一の物質が用いられてよい。

【0031】

以上の構成において、シート１０～３０に形成された流路の各部は、積層方向に関して接触することにより互いに連通している。これにより、図２及び図４に示すように、導入流路５１、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３の３本の流路が積層体２に形成されている。導入流路５１は、図２及び図４に示すように、導入部１１及び連通部２１によって構成されており、試料供給部３２まで試料液を導入する流路である。テスト側流路５２及びコントロール側流路５３は互いに同一の形状を有している。つまり、テスト側流路５２は、図４に示す導入流路５１の中心軸Ｃ周りに１８０度回転させると、コントロール側流路５３とちょうど重なり合う形状を有している。また、テスト側流路５２とコントロール側流路５３とは、中心軸Ｃを通り縦方向に平行な平面に関して互いに対称な関係にもある。

【0032】

テスト側流路５２は、図２及び図４に示すように、捕捉部３３並びに連通部３７及び３５によって構成されており、試料供給部３２から発色部２４までを結ぶ流路である。テスト側流路５２の一部である捕捉部３３には、シート２０側から連通部２２が積層している。また、テスト側流路５２の試料供給部３２とは反対側の端部である連通部３５には、シート２０側から発色部２４が積層している。コントロール側流路５３は、図２及び図４に示すように、擬捕捉部３４並びに連通部３７及び３６によって構成されており、試料供給部３２から発色部２５までを結ぶ流路である。コントロール側流路５３の一部である擬捕捉部３４は、捕捉部３３に対応する部分であるが、捕捉部３３と異なり、捕捉物質が固定されていない。擬捕捉部３４には、シート２０側から連通部２３が積層している。また、コントロール側流路５３の試料供給部３２とは反対側の端部である連通部３６には、シート２０側から発色部２５が積層している。

【0033】

以上の導入流路５１、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３が互いに連通することにより、導入部２１から発色部２４及び２５に至る試料液の流路が形成されている。かかる試料液の流路は、図１に示すように、１つの紙デバイス１に４系統、設けられている。

【0034】

［紙デバイス１（被検出物質捕捉物質）の使用方法］
以下、被検出物質捕捉物質が用いられた紙デバイス１の使用方法について図５を参照しつつ説明する。まず、試料液を調製する（ステップＳ１）。被検出物質捕捉物質が用いられた紙デバイス１に対する試料液の調製においては、被検出物質－酵素複合体の水溶液を準備する。この水溶液は、あらかじめ設定された所定の濃度及び所定量とする。そして、この水溶液に、検出対象としての被検出物質の水溶液（例えば、被検出物質を含む検体）を所定量、混合する。このように取得した被検出物質－酵素複合体及び被検出物質の水溶液を、必要に応じて発色基質２の水溶液をさらに混合して試料液とする。以下の表２は、被検出物質捕捉物質が用いられた紙デバイス１の使用方法において、試料液の溶質と、捕捉部３３に固定された物質と、発色部２４及び２５にそれぞれ固定された物質とを示す。

【0035】

［表２］

【0036】

次に、調製した試料液を導入部１１に導入する（ステップＳ２）。導入部１１に導入された試料液は、親水性領域２ａからなる流路中を下記のように浸透していく。まず、試料液は、導入部１１からシート１０及び２０の導入流路５１を通ってシート３０の試料供給部３２に到達する。

【0037】

試料供給部３２からは、試料液は、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３の二手に分かれる。まず、コントロール側流路５３においては、試料液は、試料供給部３２から、連通部３７を経て擬捕捉部３４に向かう。擬捕捉部３４に到達した試料液は、擬捕捉部３４に積層したシート２０側の連通部２３にも浸透しつつ、擬捕捉部３４中を連通部３６側へと向かう。捕捉部３３と異なり、擬捕捉部３４には捕捉物質が固定されていない。このため、試料液中の被検出物質及び被検出物質－酵素複合体は、擬捕捉部３４に捕捉されることなく連通部３７を経て連通部３６へと向かう。連通部３６に到達した試料液は、連通部３６に浸透しつつ、さらに連通部３６から発色部２５へと浸透していく。発色部２５においては、例えば、試料液中の被検出物質－酵素複合体における酵素と発色部２５に固定された発色基質１との作用により、場合によっては試料液中の発色基質２も関わった作用により生成物が生じ、その生成物が発色する。発色部２５における発色の強度は、被検出物質の濃度に依存することなく、試料液中の被検出物質－酵素複合体の濃度が大きいほど高い。なお、発色基質２がＨ₂Ｏ₂及び４－ＡＡである場合、発色基質１と４－ＡＡと発色基質２に酵素が作用して、生成物ができ、この生成物が発色する。

【0038】

一方、テスト側流路５２においては、試料液は、試料供給部３２から、連通部３７を経て捕捉部３３に向かう。捕捉部３３に到達した試料液は、捕捉部３３に積層したシート２０側の連通部２２にも浸透しつつ、捕捉部３３中を連通部３５側へと向かう。捕捉部３３においては、試料液中の被検出物質及び被検出物質－酵素複合体が、捕捉部３３に固定された捕捉物質に捕捉される。被検出物質及び被検出物質－酵素複合体は、試料液中のこれらの濃度比に応じた割合で捕捉部３３の捕捉物質に捕捉される。つまり、被検出物質－酵素複合体の濃度に対して被検出物質の濃度が大きいほど捕捉部３３の捕捉物質に捕捉される被検出物質－酵素複合体は少ない。また、被検出物質－酵素複合体の濃度に対して被検出物質の濃度が小さいほど捕捉部３３に捕捉される被検出物質－酵素複合体は多い。捕捉部３３における被検出物質の濃度は試料液の調製直後の被検出物質の濃度（以下、当初被検出物質濃度という。）に応じた大きさとなるので、当初被検出物質濃度が大きいほど捕捉部３３に捕捉される被検出物質－酵素複合体は少ない。そして、捕捉部３３を出た試料液は、連通部３７を経て連通部３５へと向かう。連通部３５に到達した試料液は、連通部３５に浸透しつつ、さらに連通部３５から発色部２４へと浸透していく。発色部２４においては、捕捉部３３に捕捉されることなく試料液中に残存している被検出物質－酵素複合体における酵素と発色部２４に固定された発色基質１との作用により、場合によっては試料液中の発色基質２も関わった作用を通じ、当該作用によって生成された生成物が発色する。発色部２４における発色の強度は、試料液中に残存している被検出物質－酵素複合体の濃度が大きいほど高い。発色部２４における発色の強度は、捕捉部３３に捕捉された被検出物質－酵素複合体が多いほど、発色部２５における発色の強度より低くなる。被検出物質－酵素複合体が捕捉部３３に捕捉される量は、上記の通り、当初被検出物質濃度が大きいほど小さく、当初被検出物質濃度が小さいほど大きい。このため、発色部２５における発色の強度に対して発色部２４における発色の強度がどれだけ低下したかに基づいて当初被検出物質濃度の大きさを評価できる。具体的には、発色部２５における発色の強度に対して発色部２４における発色の強度が低いほど当初被検出物質濃度は小さく、発色部２５における発色の強度に対して発色部２４における発色の強度が高いほど当初被検出物質濃度は大きい。図６には、発色部２４及び２５が発色した状態の紙デバイス１が模式的に示されている。

【0039】

次に、紙デバイス１をデジタルカメラで撮影する（ステップＳ３）。撮影は、シート１０に形成された観察孔１２及び１３を通じて発色部２４及び２５が発色した状況が撮影範囲に含まれるように実施される。

【0040】

次に、ステップＳ３の撮影結果に基づいて、当初被検出物質濃度に関する分析が実行される（ステップＳ４）。ステップＳ４の分析には、コンピュータによるデジタル画像解析が用いられる。このデジタル画像解析において、コンピュータは、ステップＳ３の撮影結果に基づき、発色部２４と発色部２５との間で発色強度の違いを比較する。具体的には、例えば、撮影画像における各発色部２４に対応する領域内に存在する各画素の画素値（例えば、ＲＧＢ値）を演算した値として、発色に対応する色成分の強度を示す発色強度値（例えば、ＣＭＹのうちのＣ値）が導出される。そして、各発色部２４に対応する領域内の画素に関して発色強度値の平均値が算出される。同様に、撮影画像における各発色部２５に対応する領域内に存在する各画素の画素値から、画素値が示す色成分に含まれる発色に対応する色成分の強度を示す発色強度値が導出される。そして、各発色部２５に対応する領域内の画素に関して発色強度値の平均値が算出される。さらに、発色部２５の発色強度値の平均値に対する発色部２４の発色強度値の平均値の比（以下、相対発色強度という。）が求められる。

【0041】

次に、コンピュータは、相対発色強度に基づいて当初被検出物質濃度を評価する。上記の通り、発色部２５における発色の強度に対して発色部２４における発色の強度が低いほど当初被検出物質濃度は小さく、発色部２５における発色の強度に対して発色部２４における発色の強度が高いほど当初被検出物質濃度は大きい。したがって、コンピュータは、相対発色強度が大きいほど当初被検出物質濃度が大きいと評価する。例えば、コンピュータは、当初被検出物質濃度と相対発色強度との関係を示すデータ（図７や図８のグラフに対応するデータ）を保持しており、当該データに基づいて、上記の通り算出した相対発色強度に対応する当初被検出物質濃度を具体的に導出してもよい。この評価結果は、コンピュータに接続された、又はコンピュータに搭載されたディスプレイ等の出力装置によって出力される。

【0042】

［紙デバイス１（抗体捕捉物質）の使用方法］
以下、抗体捕捉物質が用いられている場合における紙デバイス１の使用方法について説明する。この使用方法は、被検出物質捕捉物質が用いられている場合の使用方法と共通点が多い。この使用方法では、上記ステップＳ１～Ｓ４が実行されるが、各ステップの具体的な内容に違いがある。以下では主に、被検出物質捕捉物質が用いられている場合における紙デバイス１の使用方法との相違点について説明し、共通点については適宜省略する。

【0043】

まず、ステップＳ１の、抗体捕捉物質が用いられた紙デバイス１に対する試料液の調製においては、抗体－酵素複合体の水溶液を準備する。この水溶液は、あらかじめ設定された所定の濃度及び所定量とする。この水溶液に、検出対象としての被検出物質の水溶液（例えば、被検出物質を含んだ検体）を所定量、混合する。試料液中では、被検出物質と抗体－酵素複合体とが互いに結合してさらに複合体（以下、被検出物質－抗体－酵素複合体という。）を形成する。試料液の調製においては、被検出物質と結合していない抗体－酵素複合体と被検出物質－抗体－酵素複合体とが調製後の試料液中に混在するように、水溶液における抗体－酵素複合体の濃度が十分大きく設定される。このように取得した抗体－酵素複合体と被検出物質－抗体－酵素複合体の水溶液を、必要に応じて発色基質２の水溶液をさらに混合して試料液とする。以下の表３は、抗体捕捉物質が用いられた紙デバイス１の使用方法において、試料液の溶質と、捕捉部３３に固定された物質と、発色部２４及び２５にそれぞれ固定された物質とを示す。

【0044】

［表３］

【0045】

ステップＳ２の試料液の導入後、テスト側流路５２において試料液が捕捉部３３に到達すると、抗体－酵素複合体中の抗体が、捕捉部３３に固定された抗体捕捉物質（被検出物質と同一の物質）と結合することにより、全ての抗体－酵素複合体が捕捉部３３に捕捉される。これにより、捕捉部３３を出るときの試料液には抗体－酵素複合体が存在しなくなる。一方、既に被検出物質と結合している被検出物質－抗体－酵素複合体は捕捉部３３に捕捉されず、そのまま試料液に残存する。したがって、発色部２４においては、試料液に残存した被検出物質－抗体－酵素複合体における酵素と発色部２４に固定された発色基質１との作用により、場合によっては試料液中の発色基質２も関わった作用を通じ、当該作用によって生成された生成物が発色する。発色の強度は、試料液中に残存している被検出物質－抗体－酵素複合体の濃度が大きいほど高い。発色部２４に到達する試料液中の被検出物質－抗体－酵素複合体の濃度は、当初被検出物質濃度が大きいほど大きく、当初被検出物質濃度が小さいほど小さい。このため、発色部２４が強く発色するほど当初被検出物質濃度が大きいことになる。なお、ここでの当初被検出物質濃度は、調製直後の試料液における被検出物質－抗体－酵素複合体中の被検出物質と、抗体と結合していない被検出物質とを合わせた全体の被検出物質の濃度に対応する。

【0046】

一方、コントロール側流路５３においては、試料液中の抗体－酵素複合体が擬捕捉部３４に捕捉されないまま試料液が発色部２５に到達する。したがって、発色部２５は、発色部２５に到達した試料液における抗体－酵素複合体及び被検出物質－抗体－酵素複合体の両方の濃度を合わせた強度で発色する。

【0047】

ステップＳ４において、コンピュータは、相対発色強度に基づいて当初被検出物質濃度を評価する。上記の通り、発色部２４の発色は当初被検出物質濃度が大きいほど強くなる。したがって、コンピュータは、相対発色強度が大きいほど当初被検出物質濃度が大きいと評価する。

【0048】

［実施例１］
以下、上述の実施形態に関する実施例１について説明する。実施例１では、被検出物質としてプロゲステロン（富士フィルム和光純薬社）を用いた。被検出物質捕捉物質には、被検出物質に対する一次抗体として、抗プロゲステロン－３（Ｅ）－ＣＭＯ－ＢＳＡ抗体（コスモ・バイオ社）を用いた。また、二次抗体として、ウサギ抗プロゲステロン抗体（バイオ・ラッドラボラトリーズ社）を用いた。酵素としてはＨＲＰを、発色基質１としてはＴＭＢＺを、発色基質２としてはＨ₂Ｏ₂を用いた。まず、紙デバイス１を以下の通りに作製した。ソリッドインク式のインクジェットプリンター（ＣｏｌｏｒＱｕｂｅ ８５８０，ゼロックス社）を用い、図３に示すパターンを濾紙（ＧＥヘルスケア社、ワットマン（登録商標）無灰定量ろ紙 グレード：４１ １４４１－９１７）に複数形成する。その後、パターンを形成した濾紙を１００℃に設定した定常乾燥機に１分３０秒間入れることで、濾紙上で固化したソリッドインクを融解し、濾紙中に浸透させる。これにより、親水性領域からなる流路（導入流路５１、試料供給部３２、テスト側流路５２、コントロール側流路５３並びに発色部２４及び２５）の外縁を画定する疎水性領域のパターンを濾紙上に形成する。以下、このように疎水性領域のパターンが形成された濾紙をパターン形成濾紙という。

【0049】

次に、５０ｍＭのＨＣｌ水溶液にキトサンを溶解後、ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ３．５～５．０に調整することで得た０.２５ｍｇ／ｍＬのキトサン溶液０．３μＬをパターン形成濾紙の捕捉部３３に対応する領域（以下、捕捉部対応領域という。）に滴下し、約５分間自然乾燥させる。なお、捕捉部３３は上記の通り円板形状を有している。このため、捕捉部対応領域の外縁が明確に規定されているので、捕捉部対応領域内をちょうど満たす溶液の量を規定しやすい。次に、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳにグルタルアルデヒドを溶解させて得た２．５％グルタルアルデヒド溶液０．３μＬを捕捉部対応領域に滴下し、２時間静置する。以上のキトサン溶液及びグルタルアルデヒド溶液の滴下は、捕捉部対応領域に二次抗体を固定するために実施される。

【0050】

次に、捕捉部対応領域の洗浄を実行する。この洗浄においては、紙製の吸収シート（以下、吸収シートという。）の上にパターン形成濾紙を裏返しにして置き、捕捉部対応領域の裏面にＰＢＳＴ（１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０－９９％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ）０．３μＬを滴下する。直ちに別の吸収シートをパターン形成濾紙に重ねて、パターン形成濾紙の両面からＰＢＳＴを吸収シートに吸い取る。このような捕捉部対応領域の洗浄を３回繰り返したのち、捕捉部対応領域を乾燥させる。

【0051】

次に、パターン形成濾紙を表向きにし、２ｍｇ／ｍＬの二次抗体の水溶液０．３μＬを捕捉部対応領域に滴下した後、これを乾燥させる。これを計８回繰り返したあと２０分間静置する。これにより、捕捉部対応領域に二次抗体が固定される。次に、上記洗浄と同様の手順でＰＢＳＴによる捕捉部対応領域の洗浄を３回行う。その後、捕捉部対応領域を乾燥させる。なお、捕捉部対応領域における少量の液体が次の工程までに乾燥していればよいため、洗浄後すぐに乾燥するのであれば、この乾燥工程は必須ではない。次に、乾燥後の捕捉部対応領域に、２ｍｇ／ｍＬの一次抗体の水溶液を０．３μＬ滴下した後、これを乾燥させる。これを５回繰り返したあと２０分間静置する。これにより、捕捉部対応領域に固定された二次抗体に一次抗体が結合する。次に、上記洗浄と同様の手順でＰＢＳＴによる捕捉部対応領域の洗浄を３回行う。次に、３層目（シート３０）の流路全体に１％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液を３０μＬ滴下する。具体的には、流路の両端（連通部３５及び３６に対応する領域）と中央（試料供給部３２に対応する領域）に１０μＬずつ滴下する。滴下後、２０分間静置する。次に、１回当たり２０μＬのＰＢＳＴを流路の端から端まで一直線を描くように排出することで、試料供給部３２、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３に対応する流路全体に対してＰＢＳＴによる洗浄を３回行う。洗浄後、流路を２０～３０分間乾燥させる。次に、２層目（シート２０）の発色部２４に対応する領域と発色部２５に対応する領域とに３５．７ｍＭのＴＭＢＺのアセトニトリル溶液を１μＬずつ滴下し、約１５分間乾燥させる。なお、発色部２４及び２５は上記の通り、円板形状を有している。このため、これらに対応する領域の外縁が明確に規定されているので、これらの領域内をちょうど満たす溶液の量を規定しやすい。次に、パターン形成濾紙をＺ型に折りたたみ、紙デバイス１の大きさに裁断した後、裁断後のそれぞれの積層体２における四辺の中央付近の合計４箇所をステープラーで留めて３層（シート１０～３０）を互いに固定する。

【0052】

以上のように紙デバイス１を作製した後、この紙デバイス１を用いて、濃度を変えつつ調製したプロゲステロンの試料液の相対発色強度を導出する試験を以下のように実施した。まず、種々の濃度のプロゲステロンの試料液を調製する。各試料液は、被検出物質に対応するプロゲステロンの水溶液と、ＨＲＰを結合させたプロゲステロンの水溶液と、Ｈ₂Ｏ₂の水溶液とを混合したものとする。次に、１つの紙デバイス１に形成された４つの導入部１１のそれぞれに試料液１６μＬを滴下する。そして、試料液が発色部２４に達して発色部２４が変色し始めたことを観察孔１２を通じて確認してから５分後に、デジタルカメラで紙デバイス１の画像を撮影する。撮影は、紙デバイス１のシート１０全体、観察孔１２を通じて露出した４つの発色部２４のそれぞれ、及び、観察孔１３を通じて露出した発色部２５のそれぞれを撮影範囲として実施する。デジタルカメラの設定は、ＩＳＯ感度：１６００、Ｆ値：５．６、シャッター速度：１／２００秒とする。当該撮影結果に基づき、４つの流路における相対発色強度をコンピュータに算出させた結果が図７に示されている。図７において、横軸は被検出物質におけるプロゲステロンの当初被検出物質濃度を示し、縦軸はコンピュータの算出値を示す。グラフ中の各点は、各当初被検出物質濃度において、４組の発色部２４及び２５に関してそれぞれ算出された相対発色強度の平均値を示す。エラーバーは、４組の発色部２４及び２５に関してそれぞれ算出された相対発色強度のばらつき（±１＊標準偏差）を示す。

【0053】

［実施例２］
以下、上述の実施形態に関する実施例２について説明する。実施例２では、被検出物質としてはビオチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。抗体捕捉物質には、被検出物質と同一の物質としてビオチンを用いた。酵素としてはＨＲＰを、発色基質１としてはＴＭＢＺを、発色基質２としてはＨ₂Ｏ₂を用いた。まず、紙デバイス１を以下の通りに作製した。実施例２における紙デバイス１の作製方法は、実施例１における紙デバイス１の作製方法と共通点が多いため、以下においては、実施例１における方法との相違点について主に説明する。実施例２においては、ＢＳＡが結合したビオチン（以下、ＢＳＡ－ビオチン複合体という。）を捕捉部対応領域に固定する。ＢＳＡが捕捉部対応領域に固定されることによって、ビオチンがＢＳＡを介して捕捉部対応領域に固定される。具体的には、実施例１における二次抗体の捕捉部対応領域への滴下の代わりに、１０ｍｇ／ｍＬのビオチン－ＢＳＡ複合体の水溶液０．３μＬを捕捉部対応領域へと合計１０回滴下する。また、一次抗体の捕捉部対応領域への滴下及びその後の洗浄・静置は行わない。その他については実施例１と同様に紙デバイス１を作製した。次に、この紙デバイス１を用いて、濃度を変えつつ調製したビオチンの試料液の相対発色強度を導出する試験を以下のように実施した。まず、種々の濃度のビオチンの試料液を調製する。各試料液は、被検出物質に対応するビオチンの水溶液と、ＨＲＰを結合させた抗ビオチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の水溶液と、Ｈ₂Ｏ₂の水溶液とを混合したものとする。以降、実施例１と同様に各試料液の相対発色強度を導出する試験を行った。この試験において得られたデジタルカメラの撮影結果に基づき、１つの紙デバイス１に形成された４組の発色部２４及び２５における相対発色強度をコンピュータに算出させた結果が図８に示されている。図８において、横軸はビオチンの当初被検出物質濃度を示し、縦軸はコンピュータの算出値を示す。グラフ中の各点は、各当初被検出物質濃度において、４組の発色部２４及び２５に関してそれぞれ算出された相対発色強度の平均値を示す。エラーバーは、４組の発色部２４及び２５に関してそれぞれ算出された相対発色強度のばらつき（±１＊標準偏差）を示す。これに対する比較例として、非特許文献１におけるビオチンの試験結果が図９に示されている。この比較例においては、非特許文献１に記載されたシートを紙デバイス１の代わりに用いた他、実施例２と同じ条件で試験を行った。図８においては図９に比べ、当初被検出物質濃度の変化に対する相対発色強度の変化が大きいことが分かる。また、相対発色強度のばらつきが小さい。

【0054】

［実施例３］
以下、上述の実施形態に関する実施例３について説明する。実施例３では、上述の実施例２に準じた内容で紙デバイス１を用いた試験を実施した。併せて、比較例として、紙デバイス１とは一部構成が異なる紙デバイス１’を用いて実施例２に準じた試験を実施した。紙デバイス１’における紙デバイス１との相違点は、連通部２２及び２３を設けていないことであり、それ以外の紙デバイス１’の構成は紙デバイス１と同じとした。つまり、紙デバイス１’におけるシート２０に対応するシートについて、連通部２２及び２３に対応する領域全体を親水性領域ではなく疎水性領域とした。また、実施例３及び当該比較例においては、ビオチンの当初被検出物質濃度を０ｎｇ／ｍＬとし、実施例２と同様に試験を行った。その結果が図１０に示されている。図１０において、縦軸は４組の発色部２４及び２５に関する相対発色強度の平均値を示す。エラーバーは、４組の発色部２４及び２５に関してそれぞれ算出された相対発色強度のばらつき（±１＊標準偏差）を示す。図１０の棒グラフに示されているように、連通部２２及び２３を設けた実施例３の場合、相対発色強度が比較例に対して大幅に小さくなった。このことから、連通部２２を設けると、捕捉部３３における被検出物質及び被検出物質－酵素複合体の捕捉効率が高くなって、発色部２４に到達する被検出物質－酵素複合体の量が低下することが分かる。また、図１０のエラーバーに示されているように、連通部２２及び２３を設けた場合、相対発色強度にばらつきが生じにくくなることが分かる。

【0055】

比較例において相対発色強度にばらつきが生じるのは、テスト側流路５２とコントロール側流路５３との間に、捕捉部３３の有無による親水特性の違いが生じるためと考えられる。つまり、テスト側流路５２には捕捉部３３が存在する分、コントロール側流路５３と比べて流路の親水性が低下している。このため、テスト側流路５２への試料液の浸透しやすさとコントロール側流路５３への試料液の浸透しやすさとに不均等が生じる。その結果、相対発色強度にばらつきが生じやすくなる。これに対し、実施例３においては、連通部２２及び２３が設けられている分、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３のそれぞれにおける親水性が比較例に対して高くなっている。これにより、テスト側流路５２とコントロール側流路５３との間の親水特性の違いが抑制される。その結果、相対発色強度のばらつきが抑制されている。

【0056】

［実施形態の効果］
以上説明した本実施形態によると、発色部２５における発色強度に対する相対的な大きさを示す相対発色強度を用いて発色部２４における発色強度を評価している。このように、発色部２５の発色強度を適切な基準として用いることができるのは、テスト側流路５２とコントロール側流路５３とが、互いに同じ形状を有しているためである。仮に、これらの形状が互いに同じでないとすると、流路間の形状の違いによって試料液の流れ方に違いが生じるおそれがある。試料液の流れ方に違いが生じると、流れ方の差によって発色に差が出たのか、その他の要因で差が出たのかを切り分けにくい。これに対し、本実施形態では、テスト側流路５２の形状とコントロール側流路５３の形状とが互いに同じである。このため、流路の形状の違いを要因とする発色強度の違いが生じにくい。したがって、流路の形状以外の要因、つまり、捕捉部３３における被検出物質－酵素複合体又は抗体－酵素複合体の捕捉によって発色部２４と発色部２５の間に生じる発色強度の違いを適切に評価しやすい。なお、流路の形状の違いを要因とする発色強度の違いが生じにくいのは、テスト側流路とコントロール側流路とが同じ形状である場合のみならず、これらの流路が互いに鏡像の関係にある場合にも該当する。

【0057】

さらに、本実施形態においては、捕捉部３３と接触した親水性領域からなる連通部２２が設けられている。そして、擬捕捉部３４と接触した親水性領域からなる連通部２３が設けられている。これらにより、上記実施例３及び比較例の試験結果に示すように、以下の２つの効果が確保される。第１に、捕捉部３３における物質の捕捉効率が向上することにより、相対発色強度が小さくなっている。つまり、発色部２４の発色強度に発色部２５の発色強度との差が生じやすくなっている。したがって、発色部２４の発色強度を相対発色強度に基づいて評価しやすい。第２に、相対発色強度にばらつきが生じにくい。相対発色強度にばらつきが生じにくいと、例えば、被検出物質の濃度が異なる２つの水溶液があるとき、その濃度の差異について装置が検出可能な最小値が小さくなる。以上の２つの効果により、本実施形態は、相対発色強度に基づく当初被検出物質濃度の検出において濃度の違いを区別する能力が高められている。

【0058】

また、本実施形態においては、発色部２４は、テスト側流路５２における試料供給部３２に対して反対側の端部である連通部３５に積層している。これに対し、従来技術（例えば、非特許文献１）によると、１枚のシートに形成されたテスト側流路の端部自体が発色部に対応する。このため、従来技術では、発色部における発色は、１枚のシートに沿った方向に関する試料液の浸透のみによって進んでいく。したがって、シートに沿った方向に関する発色のむらが生じやすい。発色のむらが生じると、発色部の発色強度を適切に評価できず、発色強度に基づく被検出物質の検出が適切に行えないおそれがある。これに対し、本実施形態によると、試料供給部３２から連通部３５まで到達した試料液は、図２の二点鎖線に示すように、シート３０に沿って連通部３５の奥へと浸透しながら、さらにシート３０からシート２０へと発色部２４に向かって浸透していく。つまり、１枚のシートに沿った試料液の浸透のみによって発色が進んでいく従来技術とは異なり、本実施形態においては、１枚のシート内での水溶液の浸透のみならず、シート３０の連通部３５からシート２０の発色部２４へとシート間を跨ぐように試料液の浸透が進むことによっても発色が進んでいく。このため、従来技術のようなシートに沿った方向に関する発色のむらが生じにくい。同様に、コントロール側流路５３の端部である連通部３６においても、これに発色部２５が積層していることによって発色のむらが生じにくくなっている。以上により、発色部２４及び２５の発色強度に基づいて被検出物質の濃度を適切に検出できる。

【0059】

また、本実施形態においては、シート１０～３０が一体の１枚のシートから構成されている。これにより、紙デバイス１が簡易な構造で実現されていると共に、１枚のシート上にシート１０～３０の全ての流路を一括して形成することができるため、紙デバイス１の作製が容易になっている。また、連通部２２及び２３並びに発色部２４及び２５が１枚の一体のシート２０に形成されている。このように、これらの部分が１枚のシートにまとめられていることによって紙デバイス１が比較的簡易な構造で実現されている。

【0060】

また、本実施形態においては、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３が形成されたシート３０にシート２０が、連通部２２及び２３が形成されたシート２０にシート１０がそれぞれ積層している。これによって、試料液の流路の少なくとも一部が、それより上層に積層したシートの疎水性領域によって被覆されている。したがって、流路からの試料液の蒸発が抑制されている。なお、紙デバイス１をこのような多層構造に構成することにより、試料供給部３２や発色部２４及び２５が比較的下層に配置されている。このような下層の試料供給部３２への試料液の導入経路や、下層の発色部２４及び２５における発色の観察経路を確保するために、導入流路５１や観察孔１２及び１３が紙デバイス１に設けられている。

【0061】

＜その他の変形例＞
以上は、本発明の好適な実施形態についての説明であるが、本発明は上述の実施形態に限られるものではなく、課題を解決するための手段に記載された範囲の限りにおいて様々な変更が可能なものである。

【0062】

例えば、上述の実施形態に係る紙デバイス１の代わりに、図１３に示す紙デバイス１’が用いられてもよい。紙デバイス１’は、シート１０’、シート４１～４５及びシート３０’が積層した積層体２’からなる。シート１０’、シート４１～４５及びシート３０’は、シート１０～３０とは異なり、互いに分離したシートである。シート１０’には、シート１０と同様の導入部１１並びに観察孔１２及び１３が１組形成されている。シート３０’には、シート３０と同様の試料供給部３２、テスト流路５２及びコントロール流路５３が１組形成されている。シート４１には連通部２１が、シート４２には連通部２２が、シート４３には連通部２３が、シート４４には発色部２４が、シート４５には発色部２５が、それぞれ個別に設けられている。シート４１～４５は、連通部２１が試料供給部３２と、連通部２２が捕捉部３３と、連通部２３が擬捕捉部３４と、発色部２４が連通部３５と、発色部２５が連通部３６とそれぞれ接触するようにシート３０’上に積層される。そして、シート１０’は、導入部１１が連通部２１と接触すると共に、観察孔１２及び１３を通じて発色部２４及び２５が上方から観察可能となるようにシート４１～４５上に積層される。

【0063】

本発明における積層体は、上述の実施形態に係る積層体２のように一体に繋がった１枚のシートが折りたたまれることで構成されてもよいし、本変形例の積層体２’のように互いに分離した複数のシートが積層することで構成されてもよい。また、連通部２１～２３並びに発色部２４及び２５のうちの一部が一体に繋がった１枚のシートに構成され、その他の部分が他のシートから分離した複数のシートに個別に形成されてもよい。また、導入部１１、試料供給部３２、捕捉部３３、擬捕捉部３４、及び連通部３５～３７の少なくともいずれかが、他のシートから分離したシートに形成されてもよい。

【0064】

例えば、上述の実施形態における試料供給部３２、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３の代わりに、図１１に示す試料供給部６１、テスト側流路６６及びコントロール側流路６７が用いられてもよい。試料供給部６１、テスト側流路６６及びコントロール側流路６７は、上述の実施形態と同様に濾紙上に形成された親水性領域からなり、濾紙上に疎水性領域のパターンを形成することで形成されている。テスト側流路６６は、試料供給部６１から、発色部が積層する端部６４まで延びている。また、テスト側流路６６の途中には捕捉部３３と同様の捕捉部６２が設けられている。捕捉部６２には、連通部２２と同様の親水性領域からなる連通部が積層する。コントロール側流路６７は、試料供給部６１から、発色部が積層する端部６５まで延びている。また、コントロール側流路６７の途中には擬捕捉部３４と同様の擬捕捉部６３が設けられている。擬捕捉部６３には、連通部２３と同様の親水性領域からなる連通部が積層する。テスト側流路６６とコントロール側流路６７とは互いに同一の形状を有している。つまり、テスト側流路６６は、図１１において試料供給部６１の中心Ｏの周りに所定の角度だけ回転させると、コントロール側流路６７とちょうど重なり合う形状を有している。

【0065】

また、上述の実施形態における試料供給部３２、テスト側流路５２及びコントロール側流路５３の代わりに、図１２に示す試料供給部７１、テスト側流路７６及びコントロール側流路７７が用いられてもよい。試料供給部７１、テスト側流路７６及びコントロール側流路７７は、上述の実施形態と同様に濾紙上に形成された親水性領域からなり、濾紙上に疎水性領域のパターンを形成することで形成されている。テスト側流路７６は、試料供給部７１から、発色部が積層する端部７４まで延びている。また、テスト側流路７６の途中には捕捉部３３と同様の捕捉部７２が設けられている。捕捉部７２には、連通部２２と同様の親水性領域からなる連通部が積層する。コントロール側流路７７は、試料供給部７１から、発色部が積層する端部７５まで延びている。また、コントロール側流路７７の途中には擬捕捉部３４と同様の擬捕捉部７３が設けられている。擬捕捉部７３には、連通部２３と同様の親水性領域からなる連通部が積層する。テスト側流路７６とコントロール側流路７７とは互いに鏡像の関係を有している。つまり、テスト側流路７６とコントロール側流路７７とは、図１２において軸Ｘに関して互いに対称な形状を有している。

【0066】

また、上述の実施形態では、捕捉部３３がシート３０側に形成され、捕捉部３３上に積層した連通部２２がシート２０側に形成されている。しかし、捕捉部と連通部との配置が逆であってもよい。つまり、シート３０のテスト側流路５２の一部として連通部が形成され、その連通部上に積層した捕捉部がシート２０に形成されていてもよい。この場合も実施例３と同様、捕捉部における被検出物質及び被検出物質－酵素複合体の捕捉効率が高くなって、発色部２４に到達する被検出物質－酵素複合体の量が低下するという効果と、相対発色強度にばらつきが生じにくくなる効果とが確保される。

【符号の説明】

【0067】

１、１’ 紙デバイス
２ａ 親水性領域
２ｂ 疎水性領域
２ 積層体
１０、２０、３０ シート
１１ 導入部
１２、１３ 観察孔
２１～２３ 連通部
２４、２５ 発色部
３２、６１、７１ 試料供給部
３３、６２、７２ 捕捉部
３４、６３、７３ 擬捕捉部
３５～３７ 連通部
５１ 導入流路
５２、６６、７６ テスト側流路
５３、６７、７７ コントロール側流路

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】