特許 7280618 人工組織灌流デバイス、人工組織を用いた薬剤評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-16

(45)【発行日】2023-05-24

(54)【発明の名称】人工組織灌流デバイス、人工組織を用いた薬剤評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230517BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20230517BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230517BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12M3/00 A

C12Q1/02

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019562508

(86)(22)【出願日】2018-12-28

(86)【国際出願番号】 JP2018048493

(87)【国際公開番号】W WO2019132008

(87)【国際公開日】2019-07-04

【審査請求日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】62/611,338

(32)【優先日】2017-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、再生医療実現拠点ネットワークプログラム 幹細胞・再生医学イノベーション創出プログラム「分化・成熟過程の人為的制御による再構築腎臓組織への機能賦与」、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100140774

【弁理士】

【氏名又は名称】大浪 一徳

(72)【発明者】

【氏名】竹内 昌治

(72)【発明者】

【氏名】森本 雄矢

(72)【発明者】

【氏名】長田 翔伍

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０９１７１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】欧州特許出願公開第０２６３９２９３（ＥＰ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１２６５３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０６９８９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】BUNSEKI KAGAKU，2016年，Vol.65，p.241-247

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｃ１２Ｑ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数種の細胞が培養される共培養系を有し、
前記共培養系は、
内部に培養空間を有する筒状のウェル部と、
所定方向に延び培地が灌流可能な灌流流路を有するとともに、前記灌流流路に開口し前記ウェル部を着脱可能に保持し、厚さ方向に延びる保持部とを有する基材と、
前記保持部に保持されたときに前記灌流流路に臨む前記ウェル部の下側の端部に配置される多孔質膜状のゲル膜と、
を備え、
前記ゲル膜は、前記培養空間と対向する第１面側で組織系細胞が培養され、前記灌流流路と対向する第２面側で管腔系細胞が培養され、
前記ゲル膜が臨む前記灌流流路は、前記ゲル膜の最大径よりも大きい一定幅で長手方向に延びることを特徴とする人工組織灌流デバイス。

【請求項2】

前記ゲル膜は、細胞外マトリックス成分を含む、
請求項１に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項3】

前記管腔系細胞は、内皮細胞を含む、
請求項１または２に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項4】

前記管腔系細胞は、血管内皮細胞を含む、
請求項３に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項5】

前記組織系細胞は、神経幹細胞を含む、
請求項１から４のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項6】

前記ゲル膜の前記第２面側には、種類が異なる複数の組織層が積層される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項7】

前記保持部から離脱している前記ウェル部における前記ゲル膜側の外周面に着脱自在に嵌合する内周面を有し、
前記ウェル部の外周面と嵌合した前記内周面と、前記ゲル膜の前記第２面とに囲まれた予培養空間を形成する予培養部を備える、
請求項１から６のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項8】

前記予培養部は、前記内周面を有する筒状のキャップ部材を含む、
請求項７に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項9】

前記基材は、前記灌流流路から離間した位置に配置され前記厚さ方向に貫通する貫通孔を有し、
前記第１面及び前記第２面での共培養前に前記ウェル部が前記ゲル膜の前記第２面側を上側に向けた状態で前記貫通孔に下側から挿入されて嵌合したときに前記ゲル膜の上側の前記貫通孔に、前記第２面での予培養が行われる予培養空間が形成される、
請求項１から６のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項10】

前記組織系細胞と前記管腔系細胞の少なくとも一方の流れ刺激特性に応じて、前記灌流流路における前記培地の流速を調整する調整部を有する、
請求項１から９のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項11】

前記基材には、前記灌流流路に供給される培地を貯溜し、少なくとも一部が前記灌流流路に連通する培地貯溜部が設けられる、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイス。

【請求項12】

請求項１から１１のいずれか一項に記載の人工組織灌流デバイスを用いて人工組織を製造することと、
薬剤を前記人工組織に接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工組織の応答、または前記人工組織に対する前記薬剤の浸透性を測定することと、
を含むことを特徴とする人工組織を用いた薬剤評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人工組織灌流デバイス、人工組織を用いた薬剤評価方法に関する。
本願は、２０１７年１２月２８日に出願された米国特許仮出願６２／６１１，３３８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

例えば、血管細胞層と実質細胞層との相互作用を血流による流れ刺激を付加した状態で評価するための系として、多孔質膜を含むトランスウェル（登録商標）を用いる技術が知られている（例えば、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１３，１３，３５３８－３５４７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ところが、上記の技術では、血流に応じた細胞極性を制御することができず、精緻な解析を行うことが困難であった。

【0005】

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、血管細胞層と実質細胞層との相互作用を高精度に解析可能な人工組織灌流デバイス及び人工組織を用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の第１の態様に従えば、複数種の細胞が培養される共培養系を有し、前記共培養系は、内部に培養空間を有する筒状のウェル部と、所定方向に延び培地が灌流可能な灌流流路を有するとともに、前記灌流流路に開口し前記ウェル部を着脱可能に保持する保持部とを有する基材と、前記保持部に保持されたときに前記灌流流路に臨む前記ウェル部の端部に配置され、多孔質膜状のゲル膜と、を備え、前記ゲル膜は、前記培養空間と対向する面側で組織系細胞が培養され、前記灌流流路と対向する面側で管腔系細胞が培養されることを特徴とする人工組織灌流デバイスが提供される。

【0007】

本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の人工組織灌流デバイスを用いて人工組織を製造することと、薬剤を前記人工組織に接触させることと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工組織の応答、または前記人工組織に対する前記薬剤の浸透性を測定することと、を含むことを特徴とする人工組織を用いた薬剤評価方法が提供される。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、血管細胞層と実質細胞層との相互作用を高精度に解析可能な人工組織灌流デバイスと、薬剤に対する血管細胞層と実質細胞層との相互作用を高精度に評価可能な薬剤評価方法とを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明に係る灌流デバイス１を有する灌流システムＳＹＳの概略的な構成図である。

【図2】灌流デバイス１をウェル部１０側から視た平面図である。

【図3】ウェル部１０の外周面にキャップ部材４０の内周面が嵌合する断面図である。

【図4】流れ刺激と、神経幹細胞（上段）及び血管内皮細胞（下段）の遺伝子発現との関係を示す図である。

【図5】ゲル膜毎のアルブミン産出量の測定結果を示す図である。

【図6】（Ａ）は流れ刺激とアルブミン生産量との関係を示す図であり、（Ｂ）は流れ刺激とアルブミン透過量との関係を示す図であり、（Ｃ）は流れ刺激とバリア機能との関係を示す図である。

【図7】流れ刺激に応じた血管内皮細胞の蛍光画像を示す図である。

【図8】予培養部の変形例を示す断面図である。

【図9】培地貯溜部の変形例を示す断面図である。

【図10】培地貯溜部の変形例を示す断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明の人工組織灌流デバイス、人工組織灌流デバイスを用いた薬剤評価方法の実施の形態を、図１ないし図８を参照して説明する。なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている場合がある。

【0011】

図１は、本発明に係る灌流デバイス（人工組織灌流デバイス）１を有する灌流システムＳＹＳの概略的な構成図である。図２は、灌流デバイス１をウェル部１０側から視た平面図である。
灌流システムＳＹＳは、灌流デバイス１、培地供給部１００、供給管１０１、排出管１０２及び調整部１１０を備えている。

【0012】

培地供給部１００は、培地を貯留し灌流デバイス１に向けて当該培地を供給する。供給管１０１は、一端が灌流デバイス１に接続されている。供給管１０１は、培地供給部１００から供給された培地を灌流デバイス１に導入する。排出管１０２は、灌流デバイス１から培地を排出する。

【0013】

調整部１１０は、培地供給部１００から供給され灌流デバイス１に導入される培地の導入量を調整することで、灌流デバイス１における培地の流速を調整する。調整部１１０は、一例として、供給管１０１の中途に設けられたポンプである。調整部１１０としてのポンプの駆動量を調整し、灌流デバイス１に導入される培地の導入量を調整することにより、灌流デバイス１における培地の流速を制御できる。なお、調整部１１０としては、培地供給部１００から供給される培地の量を調整する構成であってもよい。

【0014】

灌流デバイス１は、複数種の細胞が培養される共培養系Ｃを有する。共培養系Ｃは、ウェル部１０、基材２０、ゲル膜３０及びキャップ部材（予培養部）４０（図３参照）を備えている。

【0015】

ウェル部１０は、筒状に形成されている。ウェル部１０は、例えば、透明な素材で円筒状に形成されている。ウェル部は、内部に培養空間１１を有している。ウェル部１０の素材としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等を用いることができる。

【0016】

基材２０は、上基材２１及び下基材２２を有している。図２に示されるように、上基材２１及び下基材２２は、いずれも平面視矩形状に形成されている。上基材２１及び下基材２２は、例えば、接着材等により上下方向に接合される。上基材２１の素材としては特に限定されないが、例えば、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。下基材２２の素材としては特に限定されないが、例えば、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などやガラスなどが挙げられる。

【0017】

下基材２２は、上記平面視矩形状の平板状に形成されている。

【0018】

上基材２１は、下基材２２と対向する面（下面）に開口する溝部２４を有している。溝部２４は、長手方向（図１及び図２における左右方向）に延びている。溝部２４は、周囲を上基材２１の下面に囲まれた窪みである。溝部２４の長手方向の両端部は、先端が先細る形状にそれぞれ形成されている。なお。溝部２４としては、先端が先細る形状に限定されず、同一幅で延びる構成であってもよい。

【0019】

上基材２１は、長手方向の中央及び短手方向の中央に位置して平面視円形の保持部２３を有している。保持部２３は、上基板２１を厚さ方向（図１中、上下方向）に貫通している。保持部２３は、ウェル部１０の外周面と液密に嵌合し、ウェル部１０を上基材２１に対して着脱可能に保持させる。保持部２３に保持されたときのウェル部１０の下端面は、一例として、溝部２４の底面と面一である。

【0020】

上基材２１は、短手方向の中央で長手方向の両外側に接続孔２５Ａ、２５Ｂを有している。接続孔２５Ａ、２５Ｂは、それぞれ上基材２１を厚さ方向に貫通している。接続孔２５Ａ、２５Ｂの下端は、それぞれ溝部２４に開口している。接続孔２５Ａには、供給管１０１が接続される。接続孔２５Ｂには、排出管１０２が接続される。

【0021】

上基材２１と下基材２２とが上下方向に接合されたときに、溝部２４と下基材２２の上面とに囲まれ長手方向に延びる灌流流路２６が形成される。灌流流路２６は、長手方向の一端側に供給管１０１が接続され、他端側に排出管１０２が接続されている。

【0022】

ゲル膜３０は、ウェル部１０が保持部２３に保持されたときに、灌流流路２６に臨むウェル部１０の端部側に配置されている。ゲル膜３０は、ウェル部１０の培養空間１１に臨む第１面３１と、灌流流路２６に臨む第２面３２とを有している。ウェル部１０が保持部２３に保持されたときに、第２面３２は、一例として、ウェル部１０の下端面及び溝部２４の底面と面一である。

【0023】

ゲル膜３０は、多孔質膜状に形成されている。ゲル膜３０は、ガラス化された細胞外マトリックス成分を含む。ゲル膜３０は、例えば、ハイドロゲルを乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製される。ゲル膜３０としては、例えば、コラーゲンガラス化ゲル膜であり、コラーゲン繊維が高密度で配された多孔質膜状に形成されている。

【0024】

ゲル膜３０の第１面３１には、組織系細胞が播種後に培養されて組織層４１が形成される（詳細は後述する）。ゲル膜３０の第２面３２には、管腔系細胞が播種後に培養されて平面状の管腔層４２が形成される（詳細は後述する）。ゲル膜３０の第２面３２に播種された管腔系細胞に対して、灌流流路２６を灌流する培地による流れ刺激が付与されるように、灌流流路２６の幅としては、ゲル膜３０の最大径よりも大きいことが好ましい。また、管腔系細胞に対して使用する培地量を減らすため、及び層流の培地流れを作るために、灌流流路２６の厚さ（深さ）としては、１ｍｍ以下であることが好ましい。

【0025】

図３は、ウェル部１０の外周面にキャップ部材４０の内周面が嵌合する断面図である。
キャップ部材４０は、ウェル部１０を上基材２１の保持部２３に保持させてゲル膜３０の第１面３１及び第２面３２で共培養を行う前に、第２面３２で予培養を行う際に用いられる。

【0026】

キャップ部材４０は、例えば、上基材２１及び下基材２２と同様の素材で円筒状に形成されている。キャップ部材４０の内周面４０Ａは、ゲル膜３０を上側に向けたウェル部１０の外周面１０Ａの少なくとも上側に嵌合する。ウェル部１０とキャップ部材４０とが嵌合したときに、キャップ部材４０の上側端面４０Ｂは、ゲル膜３０が設けられた側のウェル部１０の端面１０Ｂよりも上側に設けられる。ウェル部１０とキャップ部材４０とが嵌合したときに、キャップ部材４０の内周面４０Ａ、ウェル部１０の端面１０Ｂ及びゲル膜３０の第２面３２で囲まれた予培養空間６０が形成されている。

【0027】

ウェル部１０とキャップ部材４０とが嵌合して形成された予培養空間６０においては、ゲル膜３０の第２面３２に管腔系細胞（詳細は後述）が播種されるとともに、培地を供給することによりゲル膜３０の第２面３２に平面状の管腔系層を予培養することができる。

【0028】

ゲル膜３０の第２面３２に管腔系層が予培養されたウェル部１０は、キャップ部材４０を離脱させた後に、ウェル部１０の外周面１０Ａを上基材２１の保持部２３に嵌合させる。これより、ゲル膜３０の第２面３２に予培養された管腔系層は、溝部２４（灌流流路２６）に臨んで配置される。

【0029】

ゲル膜３０の第１面３１に形成される組織系細胞を用いた組織層４１としては、特に限定されない。組織層４１としては、例えば、神経系細胞を用いた神経組織、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織、肝細胞を用いた肝臓組織、膵臓系細胞を用いた膵臓組織、真皮細胞を用いた真皮組織等が挙げられる。組織層としては、単層に限らず、複数の組織層を積層してもよい。また、組織層としては、複数の細胞が混合した３次元組織層でも構わない。

【0030】

組織系細胞を培養するための培地及び細胞外マトリックス成分としては、各種選択可能である。

【0031】

ゲル膜３０の第２面３２に形成される管腔系細胞を用いた管腔層４２としては、血管系細胞を用いた血管層、尿細管系細胞を用いた尿細管層等が挙げられる。血管系細胞としては、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、 ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：HUAEC） 、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：HCAEC）、 ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：HSaVEC）、 ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：HPAEC）、 ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：HAoEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：HDMEC）、 ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：HDBEC）、 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：HDLEC）、 ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：HPMEC）、 ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：HCMEC）、 ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：HBdMEC）、 ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：HUtMEC）、ヒト脳血管内皮細胞（Human Brain Endothelial Cells : HBEC）等が挙げられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）が好ましい。

【0032】

上記の灌流システムＳＹＳにおいては、まず、上述した上基材２１と下基材２２とを接着剤等を用いて上下方向に接続する。上基材２１と下基材２２とを接続することにより、長手方向に延びる灌流流路２６が形成される。この後、上基材２１の保持部２３にウェル部１０の外周面１０Ａを嵌合させて保持させ、ゲル膜３０の第２面３２を灌流流路２６に臨ませることにより、灌流デバイス１が製造される。

【0033】

上基材２１の保持部２３にウェル部１０を保持させた際には、外周面１０Ａと保持部２３との間に接着剤を塗布し液密に固定してもよい。接着剤としては、光硬化型（ＵＶ硬化型）の上記ＰＤＭＳ等を用いることができる。

【0034】

この後、調整部１１０を介して培地供給部１００に接続された供給管１０１を接続孔２５Ａに接続し、排出管１０２を接続孔２５Ｂに接続することにより、灌流システムＳＹＳが製造される。

【0035】

続いて、上記灌流デバイス１を有する灌流システムＳＹＳを用いた共培養方法について説明する。
まず、図３に示したように、ゲル膜３０を上側に向けたウェル部１０の外周面１０Ａにキャップ部材４０の内周面４０Ａを嵌合させる。次いで、ゲル膜３０の第２面３２を細胞外マトリックス成分でコーティングし、管腔系細胞を播種するとともに、予培養空間６０に培地を導入して予培養する。

【0036】

予培養によりゲル膜３０の第２面３２に管腔系細胞が接着すると、ウェル部１０からキャップ部材４０を取り外す。次いで、キャップ部材４０が取り外されたウェル部１０を上下方向に反転させ、図１に示したように、ゲル膜３０が下側に向く状態で上基材２１の保持部２３に挿入して保持させる。これにより、管腔系細胞が接着したゲル膜３０の第２面３２は灌流流路２６に臨む。

【0037】

次に、ウェル部１０の培養空間１１の底部に露出するゲル膜３０の第１面３１に組織系細胞を播種し、培養空間１１に培地を導入し組織系細胞を培養する。なお、ウェル部１０を保持部２３に保持させた後にゲル膜３０の第１面３１に組織系細胞を播種する手順の他に、ゲル膜３０の第１面３１に組織系細胞を播種した後に、ウェル部１０を保持部２３に保持させる手順としてもよい。また、培地供給部１００から供給され調整部１１０で調整された量の培地を供給管１０１から灌流流路２６に導入する。灌流流路２６は、長手方向の端部から中央側に幅が漸次広がっているため、供給管１０１から灌流流路２６に導入された培地は、円滑に灌流流路２６に充填され灌流する。灌流流路２６を灌流する培地は、排出管１０２から排出される。

【0038】

その結果、ゲル膜３０の第１面３１に播種された組織系細胞は、培養空間１１に導入された培地により培養され、ゲル膜３０の第２面３２に接着された管腔系細胞は、灌流流路２６に導入され灌流する培地により培養される。すなわち、灌流デバイス１においては、流れ刺激を付与した状態で組織系細胞と管腔系細胞とが共培養され、例えば、実際の血管周辺等の環境を再現することができる。

【0039】

また、本実施形態の灌流デバイス１では、調整部１１０を調整することにより、灌流流路２６に培地が灌流する状態で共培養する場合と、灌流流路２６に培地が灌流せず充填された状態で共培養する場合とを比較・評価することも可能である。また、灌流流路２６に培地が灌流する状態で共培養する場合についても、調整部１１０を調整して灌流流路２６への培地の導入量を異ならせ、灌流流路２６における培地の流速を異ならせた場合を比較・評価することも可能である。

【0040】

また、本実施形態では、灌流デバイス１に灌流流路２６、保持部２３、ウェル部１０をそれぞれ複数ずつ互いに区画された状態で設けることも可能である。この場合、供給管１０１を複数に分岐させて複数の灌流流路２６に個別に培地を導入可能とし、さらに分岐後の供給管１０１にそれぞれ調整部１１０を設けることにより、上述した灌流流路２６における培地の灌流の有無、培地の流速が異なる場合等を同時に比較・評価することも可能である。

【0041】

（評価方法）
本発明は、さらにその他の態様として、本発明に係る灌流デバイス１を用いて製造された人工組織における薬剤の接触による刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の管腔層周辺等に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。

【0042】

本発明の評価方法は、例えば、薬剤を人工組織に接触させることと、薬剤の接触による刺激に対する人工組織の応答、または人工組織に対する薬剤の浸透性を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、経皮及び経内皮電気抵抗（バリア機能）を測定すること等によって行うことができる。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及有機化合物等が挙げられる。

【0043】

薬剤を人工組織に接触させることについては、例えば、組織層４１に薬剤を塗布し、当該薬剤の灌流流路２６への取り込みを評価したり、灌流流路２６に導入される培地中に薬剤を混入させ、当該薬剤が灌流流路２６から組織層４１への拡散・透過を評価することができる。

【実施例】

【0044】

［実験例１］
上記実施形態の灌流デバイス１において、ゲル膜３０としてビトリゲル膜を用いた。ビトリゲル膜の灌流流路２６側の第２面３２に、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を付着培養させ、ビトリゲル膜の培養空間１１側の第１面３１に、神経幹細胞（ＮＳＣ）を付着培養させたものを作製した。
この灌流デバイス１を用い、調整部１１０により灌流流路２６への培地の導入量を調整することにより、静置培養、遅い流速（１１ｍＬ／ｈ）での灌流培養、速い流速（１１０ｍＬ／ｈ）での灌流培養を行った後、リアルタイムＰＣＲにより、各遺伝子の発現を調べた。
図４は、流れ刺激と、神経幹細胞（上段）及び血管内皮細胞（下段）の遺伝子発現との関係を示す図である。
図４の下段に示すように、流れの刺激依存的に遺伝子発現が上昇することが報告されているＣＹＰ１Ｂ１やＤＥＣＲ１の流れ刺激依存的な発現上昇が確認された。その一方、図４の上段に示すように、神経幹細胞においては、ＮＳＣマーカーの流れ刺激依存的な発現上昇が確認されたことから、流れ刺激を受けた血管内皮細胞は、神経幹細胞の幹細胞性(stemness)を増強することが示唆された。

【0045】

［実験例２］
上記実施形態の灌流デバイス１において、ゲル膜３０の灌流流路２６側の第２面３２に、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を付着培養させ、ゲル膜３０の培養空間１１側の第１面３１に、肝がん細胞（ＨｅｐＧ２）を付着培養させたものを作製した。ゲル膜３０としては、ＰＥＴ膜、コラーゲンコートされたＰＥＴ膜、ビトリゲル膜の３種類を用いた。
肝細胞からアルブミンが出て血管内に放出されるという知見に基づき、灌流培養下における培養空間（上部）及び灌流流路（下部）におけるアルブミン生産量を各ゲル膜３０毎に測定した。図５にゲル膜毎のアルブミン産出量の測定結果を示す。
図５に示すように、ビトリゲル膜上での培養にてアルブミン産生量が上昇していることが確認された。また、アルブミンが膜を透過して下部へ拡散していることが確認された。

【0046】

更に、ビトリゲル膜を用いた上記灌流デバイス１において、静置培養及び灌流培養におけるアルブミンの生産量、上部（培養空間１１）から下部（灌流流路２６）へのアルブミン透過量、ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）を測定した。図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に示すように、灌流培養において、アルブミン生産量及び透過量が増加していることが確認された。また、図６（Ｃ）に示すように、灌流により、バリア機能が上昇していることが確認された。

【0047】

［実験例３］
実験例２で作製した灌流デバイス１を用いて、静置培養下及び灌流培養下で培養した細胞を血管内皮マーカーＣＤ３１で免疫染色した。尚、核はＤＡＰＩを用いて染色した。図７は、静置培養下及び灌流培養下で培養した細胞の流れ刺激に応じた蛍光画像を示す図である。
図７に示すように、灌流培養下では流れ刺激による細胞の配向が確認された。

【0048】

上記実験例１～３で示されるように、ゲル膜３０の灌流流路２６に臨む側に管腔系細胞を配置し、ゲル膜３０の培養空間１１に臨む側に組織系細胞を配置し、灌流流路２６に培地を灌流させながら共培養可能な灌流デバイス１を用いることにより、実際の管腔層周辺等の環境を容易に再現することができ、共培養に係る比較・分析・評価等を高精度に実施することができる。

【0049】

以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。

【0050】

例えば、上記実施形態では、予培養部として円筒状のキャップ部材４０を用いる構成を例示したが、この構成に限定されない。予培養部としては、例えば、図８に示すように、基材２０における灌流流路２６と干渉しない位置に、ウェル部１０の外周面１０Ａと嵌合する内周面２８Ａを有し基材２０を貫通する貫通孔２８を設ける構成であってもよい。予培養部が貫通孔２８である構成では、貫通孔２８の下側開口部から、ゲル膜３０を上側に向けたウェル部１０を挿入しゲル膜３０より上側に空間が形成される状態で嵌合させる。これにより、内周面２８Ａ、ウェル部１０の端面１０Ｂ及びゲル膜３０の第２面３２で囲まれた予培養空間６０が形成される。
予培養部として貫通孔２８が設けられた灌流デバイス１では、キャップ部材４０を用いる場合のように、基材２０とキャップ部材４０とを別個に流通・保管する必要がないため、灌流デバイス１の保管・流通・管理を容易とすることが可能になる。

【0051】

また、上記実施形態では、ウェル部１０が円筒状である構成を例示したが、筒状であれば、この構成に限定されず、断面が多角形の角筒状や断面が楕円形等の筒状であってもよい。また、ウェル部１０としては、例えば外周面１０Ａから径方向外側に張り出すフランジ部を設ける構成であってもよい。フランジ部の上下方向の位置としては、例えば、第１基材２１の保持部２３にウェル部１０が保持される際にはフランジ部が第１基材２１の上面に係合することでゲル膜３０の第２面３２の位置（すなわち、灌流流路２６に対する管腔系細胞の位置）が規定され、図８に示した貫通孔２８にウェル部１０が嵌合して保持される際には、フランジ部が第２基材２２の下面に係合することでゲル膜３０の第２面３２の位置（すなわち、予培養空間６０における管腔系細胞の位置）が規定される。この場合、灌流流路２６及び予培養空間６０に対する管腔系細胞の相対位置関係を容易に維持できるため、共培養の実験を複数回実施した際の変動を最小化することが可能になり、比較・分析・評価等を高精度に実施することができる。

【0052】

なお、上記実施形態では、培地貯溜部としての培地供給部１００が灌流デバイス１の外部に設けられる構成を例示したが、この構成に限定されない。培地を貯留する培地貯溜部としては、例えば、図９に示すように、少なくとも一部が灌流流路２６の上流側と連通する培地貯溜部１００Ａが基材２０と一体的に設けられる構成であってもよい。この構成を採る場合には、供給管１０１は基材２０に接続されず培地貯溜部１００Ａに接続される。調整部１１０の駆動により、培地貯溜部１００Ａに貯留された培地は、灌流流路２６に導入される。そして、灌流流路２６を灌流した培地は、排出管１０２から調整部１１０に戻り再び供給管１０１を介して培地貯溜部１００Ａに供給される。

【0053】

また、培地貯溜部１００Ａが基材２０と一体的に設けられる構成としては、図１０に示すように、少なくとも一部が灌流流路２６の下流側と連通する培地貯溜部１００Ａが基材２０と一体的に設けられる構成であってもよい。この構成を採る場合には、供給管１０１は基材２０に接続され、排出管１０２は基材２０に接続されず培地貯溜部１００Ａに接続される。調整部１１０の駆動により、培地貯溜部１００Ａに貯留された培地は、配管１０２を介して調整部１１０に戻り、供給管１０１を介して灌流流路２６に導入される。そして、灌流流路２６を灌流した培地は、再び培地貯溜部１００Ａに貯留される。
このように、培地貯溜部１００Ａが基材２０と一体的に設けられることにより、灌流デバイス１の使用性が向上する。

【0054】

また、一つの灌流流路２６に対してウェル部１０を複数直列的に設ける構成を採ることも可能である。この場合、生体内において管腔層を流れる液状体の流動方向に即した組織層を複数のウェル部１０で培養することも可能である。例えば、上述の実験例２で説明した肝がん細胞を灌流流路２６の上流側に配置したウェル部１０の培養空間で培養し、灌流流路２６の下流側に配置したウェル部１０の培養空間で膵臓組織を培養してもよい。この場合、上流側のウェル部１０で産出された後に膜を透過して灌流流路２６に拡散したアルブミンが下流側のウェル部１０で培養された膵臓組織に与える影響等の分析・評価を実施可能になる。

【産業上の利用可能性】

【0055】

本発明は、人工組織灌流デバイス、人工組織灌流デバイスを用いた薬剤評価方法に適用できる。

【符号の説明】

【0056】

１…灌流デバイス（人工組織灌流デバイス）、 １０…ウェル部、 １０Ａ…外周面、 １１…培養空間、 ２０…基材、 ２３…保持部、 ２６…灌流流路、 ２８…貫通孔（予培養部）、 ３０…ゲル膜、 ３１…第１面、 ３２…第２面、 ４０…キャップ部材（予培養部）、 ４０Ａ…内周面、 ４１…組織層、 ４２…管腔層、 ６０…予培養空間、 １１０…調整部、 Ｃ…共培養系、 ＳＹＳ…灌流システム

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】