特許 7285545 腫瘍を誘導する変異型ｐ５３遺伝子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-25

(45)【発行日】2023-06-02

(54)【発明の名称】腫瘍を誘導する変異型ｐ５３遺伝子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230526BHJP

   C07K 14/46 20060101ALI20230526BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20230526BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C07K14/46

A01K67/027

C12N5/071

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2019044844

(22)【出願日】2019-03-12

(65)【公開番号】P2020145947

(43)【公開日】2020-09-17

【審査請求日】2022-03-09

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】林 利憲

(72)【発明者】

【氏名】竹内 隆

(72)【発明者】

【氏名】梅山 穂乃香

(72)【発明者】

【氏名】中島 美英

(72)【発明者】

【氏名】山本 卓

(72)【発明者】

【氏名】佐久間 哲史

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】PLoS ONE, 2012年，Vol.7, Issue 6，e39920 (p.1-20)，doi:10.1371/journal.pone.0039920

【文献】BMC Evolutionary Biology, 2007年，Vol.7，180 (p.1-14)，http://www.biomedcentral.com/1471-2148/7/180

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ｃ１２Ｎ ５／０７１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トゲイモリ属のイモリの変異型ｐ５３遺伝子であって、配列番号：１に示すアミノ酸配列の９７位～１０１位からなる領域（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）において、Ｔｈｒ－Ｔｙｒが欠失されている変異型ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子。

【請求項2】

請求項１記載の遺伝子の産物。

【請求項3】

トゲイモリ属のイモリのｐ５３遺伝子を改変して、該トゲイモリ属のイモリが請求項１記載の変異型ｐ５３遺伝子を発現、あるいは請求項２記載の産物を産生するようにすることを含む、トゲイモリ属のイモリの製造方法。

【請求項4】

請求項１記載の変異型ｐ５３遺伝子あるいは請求項２記載の産物を有するトゲイモリ属の腫瘍モデル動物。

【請求項5】

請求項１記載の変異型ｐ５３遺伝子を発現、あるいは請求項２記載の産物を産生する細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍発生を誘導する遺伝子、該遺伝子を導入した腫瘍モデル動物などに関する。詳細には、該遺伝子は変異型ｐ５３遺伝子である。

【背景技術】

【0002】

医療および創薬分野、特にがんの研究、がんの治療および予防方法の開発、および抗がん剤の研究や開発において、腫瘍モデル動物が用いられている。腫瘍モデル動物としてマウスやラットが頻繁に用いられている（非特許文献１参照）。しかしこれらの動物を研究に供することは、飼育コストの観点から、大きな負担や問題を生じている。また市販の腫瘍モデル動物はそれ自体高価である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】日本チャールスリバー社の総合カタログ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

飼育コストの観点から、大きな負担や問題のない腫瘍モデル動物を作出する必要がある。また安価な腫瘍モデル動物を提供する必要もある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、イモリにおいて腫瘍を発生させる遺伝子を同定し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明者らは、イモリのｐ５３遺伝子のプロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間の領域を改変し、この変異型ｐ５３遺伝子を持つイモリから腫瘍が発生することを確認した。そして、複数の個体から得た腫瘍について、腫瘍を構成する細胞において、上記領域のアミノ酸配列が変異したｐ５３タンパク質を同定した。したがって、本発明は以下のものを提供する。

【0006】

（１）変異型ｐ５３遺伝子であって、配列番号：１に示すアミノ酸配列の９７位～１０１位からなる領域（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）またはそれに相当する領域において、１個～５個のアミノ酸が欠失、置換および／または挿入されている変異型ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子。
（２）配列番号：１に示すアミノ酸配列の９７位～１０１位からなる領域（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）中のＴｈｒ－Ｔｙｒまたはそれに相当するアミノ酸を欠失している変異型ｐ５３タンパク質をコードする（１）１記載の遺伝子。
（３）（１）または（２）記載の遺伝子の産物。
（４）非ヒト動物のｐ５３遺伝子を改変して、該動物が（１）または（２）記載の変異型ｐ５３遺伝子を発現する、あるいは（３）記載の産物を産生するようにすることを含む、非ヒト腫瘍モデル動物の製造方法。
（５）動物がイモリである（４）記載の方法。
（６）（１）または（２）記載の変異型ｐ５３遺伝子あるいは（３）記載の産物を有する非ヒト腫瘍モデル動物。
（７）イモリである（６）記載の動物。
（８）（１）または（２）記載の変異型ｐ５３遺伝子を発現、あるいは（３）記載の産物を産生する細胞。
（９）イモリの細胞である（８）記載の細胞。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、飼育コストの観点から、大きな負担や問題のない腫瘍モデル動物を作出することができる。また安価な腫瘍モデル動物を提供することもできる。本発明により得られるイモリなどの非ヒト動物は、マウスやラットなどの代替動物として、あるいはこれらを補完する動物として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、イモリ、マウス、ヒト、カエルのｐ５３タンパク質の部分アミノ酸配列のアラインメントを示す。

【図2】図２は、ｐ５３改変イモリ個体における腫瘍発生を示す。ＡはＦ０世代個体２８の腫瘍、ＢはＦ１世代個体１６の腫瘍、ＣはＦ０世代個体２４の腫瘍、ＤはＦ０世代個体１５の腫瘍、ＥはＦ０世代個体４の腫瘍、ＦはＦ０世代個体２３の腫瘍である。

【図3】図３は、個体２８のｐ５３標的部位の塩基配列を示す。網掛け部分は野生型と同じ塩基であることを示す。ハイフンは欠失を示す。Ｉは６塩基欠失、ＩＩは１５塩基欠失のパターンであることを示す。枠はＴＡＬＥＮの結合部位を示す。

【図4】図４は、個体２８のｐ５３標的部位のアミノ酸配列を示す。網掛け部分は野生型と同じアミノ酸であることを示す。ハイフンは欠失を示す。Ｉは２アミノ酸欠失、ＩＩは５アミノ酸欠失のパターンであることを示す。Ｘは解析不能であったことを示す。

【図5】図５は、個体６のｐ５３標的部位の塩基配列を示す。網掛け部分は野生型と同じ塩基であることを示す。ハイフンは欠失を示す。ＩＩＩは４塩基欠失、ＩＶは１８塩基欠失のパターンであることを示す。

【図6】図６は、個体６のｐ５３標的部位のアミノ酸配列を示す。網掛け部分は野生型と同じアミノ酸であることを示す。ハイフンは欠失を示す。ＩＩＩはフレームシフト変異、ＩＶは６アミノ酸欠失のパターンであることを示す。Ｘ、？は解析不能であったことを示す。

【図7】図７は、個体４３のｐ５３標的部位の塩基配列を示す。網掛け部分は野生型と同じ塩基であることを示す。ハイフンは欠失を示す。Ｖは１２塩基欠失、ＶＩは１３塩基欠失のパターンであることを示す。

【図8】図８は、個体４３のｐ５３標的部位のアミノ酸配列を示す。網掛け部分は野生型と同じアミノ酸であることを示す。ハイフンは欠失を示す。Ｖは４アミノ酸欠失、ＶＩはフレームシフト変異のパターンであることを示す。Ｘ、？は解析不能であったことを示す。

【図9】図９は、腫瘍発生個体の腫瘍部位におけるｐ５３の変異パターンをまとめたものである。Ａは個体６、４３、２８のｐ５３標的部位の塩基配列、Ｂは個体６、４３、２８のｐ５３標的部位のアミノ酸配列を示す。網掛け部分は野生型と同じ塩基またはアミノ酸であることを示す。ハイフンは欠失を示す。Ｘは解析不能であったことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、１の態様において、変異型ｐ５３遺伝子であって、配列番号：１に示すアミノ酸配列の９７位～１０１位からなる領域（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ）またはそれに相当する領域において、１個～５個のアミノ酸が欠失されている、他のアミノ酸に置換されている、および／または挿入されている変異型ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子を提供する。なお、本明細書においてアミノ酸の標記は３文字法および１文字法を使用するが、いずれも当業者に公知である。

【0010】

様々な動物種のｐ５３遺伝子およびｐ５３タンパク質（本明細書において、これらのうち一方または両方を「ｐ５３」ということがある）が公知である。それらの塩基配列およびアミノ酸配列も公知である。ｐ５３は、生体ストレスから細胞を保護し、がんを防ぐ作用を有している。ヒトをはじめとする哺乳類、は虫類、両生類など、多くの動物のｐ５３タンパク質のアミノ酸配列およびｐ５３遺伝子の塩基配列が知られている。ｐ５３タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、転写活性化ドメイン、プロリンリッチドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、多量体化ドメインおよび転写抑制ドメインを含んでいる。

【0011】

このたび、本発明者らは、イモリのｐ５３において、ヒトやマウスのｐ５３においてはプロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域に相当する領域（以下、「プロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域」という）が、がんの原因となる変異のホットスポットであることを明らかにした。これまで、がんの原因となるｐ５３の変異について、ＤＮＡ結合ドメイン内の特定の領域がホットスポットであるという報告が多く、上記領域の変異は注目されていなかった。

【0012】

変異型ｐ５３タンパク質は、野生型ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。変異型ｐ５３遺伝子は、野生型ｐ５３遺伝子の塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子をいう。変異型ｐ５３遺伝子は、変異型ｐ５３タンパク質をコードする。本発明の変異型ｐ５３タンパク質は、以下に説明する領域において１個～５個のアミノ酸の欠失、置換および／または挿入を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の変異型ｐ５３遺伝子は、本発明の変異型ｐ５３タンパク質をコードする。１個～５個とは、１個、２個、３個、４個または５個を意味する。

【0013】

イモリの野生型ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。イモリの野生型ｐ５３遺伝子の塩基配列を配列番号：２に示す。本発明の変異型ｐ５３タンパク質の例は、配列番号：１のアミノ酸配列中の９７位～１０１位のアミノ酸からなる領域（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ、本明細書においてＰＧＴＹＮ配列ともいう）において１個～５個のアミノ酸が欠失されている、他のアミノ酸に置換されている、および／または挿入されているアミノ酸配列を有するｐ５３タンパク質である。この領域は、イモリのｐ５３のプロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域である。例えば、イモリのｐ５３タンパク質のアミノ酸配列中のＰＧＴＹＮ配列においてＴＹが欠失したアミノ酸配列を有するイモリのｐ５３タンパク質は、本発明の変異型ｐ５３タンパク質に含まれる。

【0014】

本発明の変異型ｐ５３タンパク質のさらなる例は、イモリ以外の動物のｐ５３タンパク質中のＰＧＴＹＮ配列に相当する領域において、１個～５個のアミノ酸が欠失または他のアミノ酸に置換されている、イモリ以外の動物の変異型ｐ５３タンパク質である。例えば、マウスｐ５３タンパク質では、ＰＧＴＹＮ配列に相当する領域のアミノ酸配列はＱＧＮＹＧである（図１参照）。したがって、ＱＧＮＹＧ配列において１個～５個のアミノ酸が欠失または他のアミノ酸に置換されている、マウスのｐ５３タンパク質は、本発明の変異型ｐ５３タンパク質に含まれる。ＰＧＴＹＮ配列に相当する領域は、イモリのｐ５３タンパク質のアミノ酸配列と他の動物のｐ５３タンパク質のアミノ酸配列をアラインメントすることにより同定することができる。アラインメントはＢＬＡＳＴＰなどの公知の手段を用いて行うことができる。

【0015】

ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域におけるアミノ酸欠失は、連続したアミノ酸が欠失されてもよく、とびとびのアミノ酸が欠失されてもよい。ＰＧＴＹＮ配列におけるアミノ酸欠失の場合は、例えばＰＧＴＹＮ配列の５個すべてのアミノ酸の欠失、ＰＧＴＹの欠失、ＧＴＹＮの欠失、ＧＴＹの欠失、ＴＹＮの欠失、ＰＧの欠失、ＴＹの欠失、Ｔの欠失、Ｙの欠失、ＰおよびＴＹＮの欠失、Ｐ、ＴおよびＮの欠失、ＰおよびＴＹの欠失、ＧおよびＹの欠失などが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域において、少なくともＴＹまたはそれに相当するアミノ酸が欠失することが好ましい。

【0016】

ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域におけるアミノ酸置換は、連続したアミノ酸が置換されてもよく、とびとびのアミノ酸が置換されてもよい。ＰＧＴＹＮ配列におけるアミノ酸置換の場合は、例えばＰＧＴＹＮ配列の５個すべてのアミノ酸の置換、ＰＧＴＹの置換、ＧＴＹＮの置換、ＧＴＹの置換、ＴＹＮの置換、ＰＧの置換、ＴＹの置換、Ｔの置換、Ｙの置換、ＰおよびＴＹＮの置換、Ｐ、ＴおよびＮの置換、ＰおよびＴＹの置換、ＧおよびＹの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0017】

ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域中の１箇所にアミノ酸が挿入されていてもよく、２箇所以上に挿アミノ酸が挿入されていてもよい。ＰＧＴＹＮ配列におけるアミノ酸挿入の場合は、例えば任意のアミノ酸ＸがＴとＹの間に挿入されていてもよく、ＹとＮの間に挿入されていてもよい。また例えば任意の２つのアミノ酸ＸＹがＰとＧの間に挿入されていてもよく、ＧとＴの間に挿入されていてもよい。また例えば任意のアミノ酸Ｘ、ＹがＰＸＧＴＸＹＮのように挿入されていてもよい。

【0018】

ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域において、アミノ酸の欠失のみが生じてもよく、アミノ酸の置換のみが生じてもよく、あるいはアミノ酸の挿入のみが生じてもよい。さらに、ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域において、アミノ酸の欠失、置換、挿入のうち２つまたは３つの組み合わせが生じてもよい。

【0019】

本発明の変異型ｐ５３タンパク質は、ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当する領域以外の位置または領域において１個ないし複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加または修飾されていてもよい。タンパク質中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加および修飾は公知である。例えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列のＰＧＴＹＮ配列中のＴＹを欠失している変異型ｐ５３タンパク質という場合、該変異体ｐ５３タンパク質は少なくとも上記ＴＹが欠失していればよく、配列番号：１の上記以外の位置において１個ないし複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加または修飾をさらに有していてもよい。

【0020】

本発明の変異型ｐ５３遺伝子は公知の方法により調製することができる。部位特異的変異導入法とＰＣＲとの組み合わせによって本発明の変異型ｐ５３遺伝子を得てもよく、あるいはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮあるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いるゲノム編集技術を用いてｐ５３遺伝子改変動物を得て、該動物から本発明の変異型ｐ５３遺伝子をクローニングしてもよい。本発明の変異型ｐ５３遺伝子の調製方法は上記方法に限定されない。本発明において、変異型ｐ５３遺伝子という場合、２本鎖ＤＮＡの形状のもののほか、そのセンス鎖およびそのアンチセンス鎖をいうこともある。

【0021】

本発明は、もう１つの態様において、本発明の変異体ｐ５３遺伝子の産物を提供する。本発明の変異体ｐ５３遺伝子の産物は、そこから転写されるｍＲＮＡなどのＲＮＡ、および該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を包含する。

【0022】

本発明は、さらなる態様において、非ヒト動物のｐ５３遺伝子を改変して、該動物が本発明の変異型ｐ５３遺伝子を発現、あるいはその産物を産生するようにすることを含む、非ヒト腫瘍モデル動物の製造方法を提供する。

【0023】

本明細書において、「非ヒト腫瘍モデル動物」は、野生型よりも腫瘍化が起こりやすいヒト以外の動物である。非ヒト腫瘍モデル動物は、通常の飼育下において腫瘍を発生させる動物、ならびに化学物質投与や放射線照射、特定の飼料を与える、炎症を引き起こすなどの実験的操作により腫瘍を誘発する動物を包含する。本発明の非ヒト腫瘍モデル動物の動物種はヒト以外のいずれの動物であってもよく、イモリ、カエルなどの両生類、トカゲ、ヤモリなどのは虫類、ニワトリ、ウズラなどの鳥類、メダカなどの魚類、ショウジョウバエ、カイコなどの昆虫、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの哺乳類が例示されるが、これらに限定されない。本発明の非ヒト腫瘍モデル動物の好ましい動物種の例としてはイモリ、カエルなどの両生類、トカゲ、ヤモリなどのは虫類、メダカなどの魚類、マウス、ラットなどの哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。発生させる腫瘍の数は１個～複数個であり、特に限定されない。腫瘍の発生部位はいずれの部位であってもよい。腫瘍は良性、悪性いずれであってもよい。腫瘍のタイプも固形腫瘍、血液腫瘍、脳神経腫瘍など、いずれのタイプであってもよい。腫瘍の発生時期も幼生期、成熟期など、いずれの時期であってもよい。

【0024】

例えばゲノム編集技術などの公知の手法を用いて非ヒト動物のｐ５３遺伝子を改変し、本発明の変異体ｐ５３遺伝子を発現させ、あるいは該遺伝子の産物を産生させることにより、本発明の非ヒト腫瘍モデル動物を作成することができる。ゲノム編集技術を用いる場合、ＰＧＴＹＮ配列またはそれに相当するアミノ酸配列をコードするｐ５３遺伝子の領域を標的とした人工酵素（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９など）をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の状態で受精卵に注入し、仮親に移植する（動物種によっては孵化させる）ことにより、腫瘍モデル動物を作出してもよい。当業者は、公知の方法を利用して、作出した動物が該遺伝子を発現、あるいはその産物を産生しているかどうかを確認することができる。作出した動物から組織試料を得て、試料中のｐ５３遺伝子をクローニングして塩基配列を調べてもよく、あるいは遺伝子チップを用いて試料中の変異体ｐ５３遺伝子を検出してもよい。さらに、動物の外観や動物由来の試料について、動物が実際に腫瘍を有しているかどうかを肉眼（裸眼、ルーペ、顕微鏡）で観察してもよい。

【0025】

本発明は、さらなる態様において、本発明の非ヒト腫瘍モデル動物を交雑させることを含む、非ヒト腫瘍モデル動物の製造方法を提供する。とりわけ、イモリ、カエルなどの両生類、トカゲ、ヤモリなどのは虫類の場合、多くの卵が得られるため、腫瘍モデル動物を大量に得ることができる。

【0026】

本発明は、さらなる態様において、本発明の変異型ｐ５３遺伝子を発現、あるいはその産物を産生する細胞を提供する。該細胞は、いずれの動物の細胞であってもよい。当業者は、公知の方法を用いて該細胞を製造することができる。例えば、ゲノム編集技術を用いて該細胞を作製してもよく、ベクター、ＰＥＧ、パーティクルガンなどの公知の方法を用いて本発明の変異型ｐ５３遺伝子を導入することにより該細胞を作成してもよい。本発明の非ヒト腫瘍モデル動物から単離することにより該細胞を得てもよい。該細胞を公知の方法を用いて培養することができる。該細胞の増殖に及ぼす影響を調べることにより抗腫瘍剤のスクリーニングを行ってもよい。培養した該細胞を移植した動物を用いて、例えば腫瘍発生に関する研究、抗腫瘍剤の開発を行ってもよい。

【実施例1】

【0027】

（１）イモリにおけるｐ５３遺伝子改変による腫瘍誘発
ＴＡＬＥＮ法を用いてｐ５３遺伝子を改変した。イモリｐ５３遺伝子のプロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域を標的としたＴＡＬＥＮを設計し、その塩基配列に対応したｍＲＮＡを、イベリアトゲイモリの受精卵にマイクロインジェクションすることにより、ｐ５３遺伝子が改変されたイモリ１０個体（Ｆ０世代）を得た。その次世代２５個体（Ｆ１世代）も得た。これらの個体を経過観察し、１０個体において腫瘍の発生を確認した。腫瘍発生時の月齢は生後１１ヶ月以降であった。腫瘍あるいは腫瘍化が強く疑われるような異常が発生した部位や組織は膀胱、側腹部、尾部先端部、尾部中央部、背中、肝臓などであった（図２）。

【0028】

（２）腫瘍組織Ｌｙｓａｔｅの調製
腫瘍組織の一部を採取した後、Ｌｙｓａｔｅバッファー（６５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８．８，１６．６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，１ｍＭ ２－ＭＥ，６．７μＭ ＥＤＴＡ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／滅菌水）に１／３００量の２０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫを加えた溶液中で溶解し、Ｌｙｓａｔｅを調製した。

【0029】

（３）遺伝子クローニングおよびサンガー法による配列決定
上の（２）で得られた腫瘍組織Ｌｙｓａｔｅを鋳型にｐ５３遺伝子のプロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った（１^ｓｔ ＰＣＲ）。次に、１^ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型にＩｎ Ｆｕｓｉｏｎクローニングに必要な配列を付加したプライマーを用いて増幅を行った（２^ｎｄ ＰＣＲ）。このＰＣＲ産物をインサートとし、ベクターとライゲーションした後、大腸菌においてトランスフォーメーションを起こさせた。得られた大腸菌をＬＢプレートに播種し、一晩３７℃でインキュベートした。コロニーＰＣＲによって、インサートの挿入が確認された任意のコロニーを、ＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩振とう培養した。翌日、それぞれのクローンからＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅを使用してプラスミドを抽出し、これを鋳型にＢｉｇ Ｄｙｅ反応系を用いたシークエンシングを行った。

【0030】

（４）ｐ５３の変異パターン
サンガー法によりｐ５３遺伝子の塩基配列を調べ、変異部位のアミノ酸配列を決定した。腫瘍が発生した３つの個体（個体２８、６および４３、いずれもＦ０世代）のｐ５３の標的部位（プロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域）の塩基配列を図３、図５、図７に、アミノ酸配列を図４、図６、図８にそれぞれ示す。個体２８のｐ５３の変異パターンは、２アミノ酸欠失（６塩基欠失）および５アミノ酸欠失（１５塩基欠失）の２パターンであった。個体６のｐ５３の変異パターンは、４塩基欠失（フレームシフト変異）および６アミノ酸欠失（１８塩基欠失）の２パターンであった。個体４３のｐ５３の変異パターンは、４アミノ酸欠失（１２塩基欠失）および１３塩基欠失（フレームシフト変異）の２パターンであった。変異のパターンを図９にまとめた。なお、個体４３についてはＰＧＴＹＮ配列中のアミノ酸が置換されているサンプルもあった（図８、リードナンバー１６および１７）。

【0031】

個体６および４３のｐ５３の変異は「フレームシフト変異（ナンセンス変異）」と「数アミノ酸欠失」の２パターンに限定されていたが、個体２８では２パターンとも「数アミノ酸欠失」の変異に限定されていた（図９Ａ）。「数アミノ酸欠失」のみの変異でも腫瘍が形成されたことから、「フレームシフト変異（ナンセンス変異）」は腫瘍の形成には関与しておらず、「数アミノ酸欠失」が腫瘍形成の原因であると考えられた。さらに、３個体それぞれのアミノ酸欠失パターンに注目すると、共通の欠失パターンがあることが分かった。個体６はＰＧＴＹＮＦ欠失、個体４３はＰＧＴＹ欠失、個体２８はＴＹ欠失とＰＧＴＹＮ欠失であり、全てにおいてＴＹが欠失していた（図９Ｂ）。以上のことより、腫瘍が発生するためにはｐ５３遺伝子にＴＹ欠失を含む変異が入る必要があるということが示唆された。また、個体６および４３はＴＹを含む欠失が片側アレルのみであったが腫瘍が発生した。フレームシフト変異が腫瘍形成に関与しないことを踏まえると、少なくとも片側アレルにＴＹ欠失を含む変異が入っていれば、腫瘍が発生すると考えられた。
上記３個体のほかに、腫瘍を発生した個体１６について次世代シークエンサーによる解析を行った。変異のパターンはＴＹ欠失とフレームシフト変異の２種類であった。
これらの結果から、腫瘍形成には、プロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域の数アミノ酸が欠失した型のｐ５３が関与していることが示された。さらに、個体４３についてはＰＧＴＹＮ配列中にアミノ酸置換が見られるサンプルがあったことから、プロリンリッチドメインとＤＮＡ結合ドメインの境界領域のアミノ酸置換も腫瘍形成に関与していると考えられた。

【産業上の利用可能性】

【0032】

本発明は、腫瘍やがんの発生の研究、抗がん剤の開発等に有用である。したがって、本発明は、生物学や医学の研究分野、および製薬分野などにおいて有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0033】

配列番号：１はイベリアトゲイモリの野生型ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２はイベリアトゲイモリの野生型ｐ５３遺伝子の塩基配列を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

0007285545000001.app