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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-29
(45)【発行日】2023-06-06
(54)【発明の名称】多分化能性幹細胞分化促進剤
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20230530BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230530BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230530BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735 ZNA
C12N5/10
C12N5/0775
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020507889
(86)(22)【出願日】2019-03-20
(86)【国際出願番号】 JP2019011827
(87)【国際公開番号】W WO2019182044
(87)【国際公開日】2019-09-26
【審査請求日】2021-08-12
(31)【優先権主張番号】P 2018055186
(32)【優先日】2018-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000103840
【氏名又は名称】オリエンタル酵母工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】松尾 英典
(72)【発明者】
【氏名】何 あゆみ
(72)【発明者】
【氏名】山田 宗弘
(72)【発明者】
【氏名】富盛 賀也
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／００７２４１６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Stroke，2015年06月09日，vol. 46, no. 7，p.1966-1974
【文献】松尾英典 他，ヒト多能性幹細胞におけるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの効果，日本生化学会大会講演要旨集，2017年，Vol. 90th，1P-0891
【文献】Stem Cell Reports，2018年12月11日，Vol. 11，p. 1347-1356
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
【請求項2】
多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
【請求項3】
多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
【請求項4】
多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多分化能性幹細胞の分化を促進させられる素材、及び当該素材を使用した多分化能性幹細胞を分化させる方法に関する。
本願は、２０１８年３月２２日に日本に出願された特願２０１８－０５５１８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１８年３月２２日に日本に出願された特願２０１８－０５５１８６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
多分化能性幹細胞とは、自己複製能を有する未分化細胞であり、様々な細胞へ分化可能な細胞である。近年、患者の損なわれた組織に多分化能性幹細胞や多分化能性幹細胞から分化誘導させた細胞を移植し、その機能の再生をはかる再生医療が盛んに研究されている。再生医療では、多分化能性幹細胞やその分化細胞を、大量に準備する必要があるため、多分化能性幹細胞を効率よく増殖させる方法や、多分化能性幹細胞を効率よく分化させる方法の開発が盛んである。
【0003】
多分化能性幹細胞の分化を促進する方法としては、例えば、ヒト幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリー（分化誘導因子）を含む分化誘導用培養培地で培養する前に、予めニコチンアミド（ＮＡＭ）で培養しておくことによって、ヒト幹細胞の網膜色素上皮細胞への分化を促進できることが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、多分化能性幹細胞の培養方法としては、例えば、間葉系幹細胞を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）と繊維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）を含む培地中で培養することにより、間葉系幹細胞を効率よく増殖させられることが報告されている（例えば、特許文献２参照。）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をＮＡＭ存在下で培養すると、ＮＡＭがサーチュイン又はＰＡＲＰの機能を抑制することによって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と遺伝子発現パターンがよく類似したｉＰＳ細胞を効率的に製造できることも報告されている（例えば、特許文献３参照。）。これらの方法によって効率よく調製された多分化能性幹細胞を分化誘導用培養培地で培養することにより、効率よく分化細胞を得ることができる。その他、ＮＡＭは、多能性幹細胞の多能性の欠失や、再プログラミングの障害を解消することが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【0004】
一方で、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、補酵素ＮＡＤ＋の生合成中間代謝産物である。近年、ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献４参照。）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インスリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献５参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１０－５２４４５７号公報
【文献】特表２０１５－５０７９２１号公報
【文献】国際公開第２０１１／１０２３３３号
【文献】米国特許第７７３７１５８号明細書
【文献】国際公開第２０１４／１４６０４４号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Son，et al.，STEM CELLS，2013，vol.31，p.1121-1135.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、多分化能性幹細胞から分化細胞を効率よく得るための素材、及び当該素材を使用して多分化能性幹細胞の分化を促進させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（β－ＮＭＮ）の存在下で、多分化能性幹細胞を分化させることにより、より多くの分化細胞が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の多分化能性幹細胞分化促進剤、多分化能性幹細胞を分化させる方法、及び多分化能性幹細胞の分化を促進する方法を提供するものである。
［１］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
［２］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
［３］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
［４］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
［１］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
［２］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞を分化させる方法。
［３］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される一種以上であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を内胚葉に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
［４］ 多分化能性幹細胞を、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド換算で０．０１～１０ｍＭ含有する多分化能性を維持する培養培地で培養した後、１種以上の分化誘導因子を含有する分化誘導用培養培地で培養することを含み、
前記多分化能性幹細胞は、間葉系幹細胞であり、
前記分化誘導用培養培地は、多分化能性幹細胞を骨又は脂肪に分化誘導するための培養培地であることを特徴とする、多分化能性幹細胞の分化を促進する方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係る多分化能性幹細胞分化促進剤は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの多分化能性幹細胞に働きかけることにより、多分化能性幹細胞から分化細胞への分化を促進させることができる。このため、多分化能性幹細胞を、当該多分化能性幹細胞分化促進剤を含有させた培養培地で培養することによって、より多くの分化細胞を効率よく調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】実施例１において、β－ＮＭＮを添加した分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞の各マーカーの発現量をＲＴ－ＰＣＲで調べた結果を示した図である。
【図2】（Ａ）は、実施例２において、β－ＮＭＮを添加した外胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞の細胞数の経時的変化を示した図であり、（Ｂ）は、実施例２において、β－ＮＭＮを添加した外胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞の播種後７日目の細胞数を示した図である。
【図3】実施例２において、β－ＮＭＮを添加した外胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞をＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６の発現量で分画した結果を示した図である。
【図4】実施例３において、β－ＮＭＮを添加した中胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞の播種後７日目の細胞数を示した図である。
【図5】実施例３において、β－ＮＭＮを添加した中胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞をＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６の発現量で分画した結果を示した図である。
【図6】実施例４において、β－ＮＭＮを添加した内胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞の播種後７日目の細胞数を示した図である。
【図7】実施例４において、β－ＮＭＮを添加した内胚葉分化誘導用培養培地中で培養したｉＰＳ細胞をＳｏｘ１７とＣＸＣＲ４の発現量で分画した結果を示した図である。
【図8】実施例５において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、内胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞の播種後７日目の細胞数を示した図である。
【図9】実施例５において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、内胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞をＳｏｘ１７の発現量で分画した結果を示した図である。
【図10】実施例６において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、中胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞の播種後７日目の細胞数を示した図である。
【図11】実施例６において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、中胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞をＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６の発現量で分画した結果を示した図である。
【図12】（Ａ）は、実施例７において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、外胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞の細胞数の経時的変化を示した図であり、（Ｂ）は、実施例７において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、外胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞の播種後９日目の細胞数を示した図である。
【図13】実施例７において、β－ＮＭＮを添加したｉＰＳ細胞用培養培地中で培養した後、外胚葉分化誘導されたｉＰＳ細胞をＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６の発現量で分画した結果を示した図である。
【図14】実施例８において、β－ＮＭＮを添加した増殖用培養培地中で培養した間葉系幹細胞を骨分化誘導して得られた分化細胞の、アリザリンＳ染色画像である。
【図15】実施例９において、β－ＮＭＮを添加した増殖用培養培地中で培養した間葉系幹細胞を脂肪分化誘導して得られた分化細胞の、オイルレッドＯ染色画像である。
【図16】実施例９において、β－ＮＭＮを添加した増殖用培養培地中で培養した間葉系幹細胞を脂肪分化誘導して得られた分化細胞の、ＰＰＡＲγ遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図17】実施例９において、β－ＮＭＮを添加した増殖用培養培地中で培養した間葉系幹細胞を脂肪分化誘導して得られた分化細胞の、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明及び本願明細書において、多分化能性幹細胞とは、自己複製能を有し、かつ多分化能（多様な細胞種へ分化可能な能力）を備える未分化細胞であり、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞の他、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞が挙げられる。好ましくは外胚葉、中胚葉、内胚葉のいずれの細胞にも分化しうる多能性幹細胞である。
【0013】
本発明及び本願明細書において、「多分化能性幹細胞の分化を促進する」とは、多分化能性幹細胞を分化誘導した場合に得られる分化細胞の量が多くなることを意味する。具体的には、多分化能性幹細胞の分化促進には、多分化能性幹細胞の分化効率を向上させる態様と、分化誘導時の細胞増殖を促進する態様と、多分化能性幹細胞の分化効率を向上させ、かつ分化誘導時の細胞増殖を促進する態様と、がある。
【0014】
本発明に係る多分化能性幹細胞分化促進剤（以下、「本発明の分化促進剤」ということがある。）は、ＮＭＮ（化学式：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ２Ｏ８Ｐ）を有効成分とし、多分化能性幹細胞を分化させる際にその培養培地中に添加されるものである。ＮＭＮは、多分化能性幹細胞の各種胚葉性細胞や体細胞への分化効率を向上させたり、分化した体細胞の増殖性を高めることができる。このため、ＮＭＮの存在下で多分化能性幹細胞を分化させることにより、多分化能性幹細胞から分化細胞をより効率よく得ることができる。
【0015】
ＮＭＮには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明の分化促進剤の有効成分となるＮＭＮは、β－ＮＭＮ（ＣＡＳ番号：１０９４－６１－７）である。β－ＮＭＮの構造を下記に示す。
【0016】
【化1】
【0017】
有効成分とするβ－ＮＭＮとしては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ－ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β－ＮＭＮは広く生体に存在する成分である。このため、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ－ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ－ＮＭＮを使用してもよい。
【0018】
β－ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ＮＡＭとＬ－リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ－ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ＮＡＭと５’－ホスホリボシル－１’－ピロリン酸（ＰＲＰＰ）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によりβ－ＮＭＮを製造できる。発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ＮＡＭからβ－ＮＭＮを製造できる。
【0019】
本発明の分化促進剤の有効成分としては、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩であってもよい。β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。
【0020】
本発明の分化促進剤の有効成分としては、遊離のβ－ＮＭＮ又はβ－ＮＭＮの薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。
【0021】
本発明の分化促進剤は、β－ＮＭＮに加えてその他の有効成分を含有していてもよい。β－ＮＭＮと併用するその他の有効成分は、１種類のみであってもよく、２種類以上の組み合わせであってもよい。当該他の有効成分としては、例えば、アルブミン、アスコルビン酸、α－トコフェロール、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、Ｒｏｃｋ阻害剤などの多分化能性幹細胞の生存効率や増殖効率を高めることが知られている成分や；バルプロ酸、ジメチルスルホキシド、デキサメタゾン、酪酸、トリコスタチンＡ、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、アクチビン、ノギンなどの、多分化能性幹細胞の分化効率を高めることが知られている成分等の中から適宜選択して用いることができる。
【0022】
多分化能性幹細胞を分化誘導する際に、分化誘導用培養培地に本発明の分化促進剤を含有させることにより、多分化能性幹細胞の分化を促進させることができる。また、多分化能性幹細胞を分化誘導前に本発明の分化促進剤を含有する未分化細胞用培養培地で培養した後、本発明の分化促進剤を含有していない分化誘導用培養培地で培養することによっても、多分化能性幹細胞の分化を促進させることができる。分化誘導前に本発明の分化促進剤を含有する未分化細胞用培養培地で培養し、その後本発明の分化促進剤を含有する分化誘導用培養培地で培養してもよい。
【0023】
分化誘導用培養培地又は未分化細胞用培養培地に本発明の分化促進剤を含有させる量としては、当該分化促進剤を含有させていない培養培地で培養した場合と比較して多分化能性幹細胞を分化誘導して得られた分化細胞の量を多くするために充分な濃度となる量であれば特に限定されるものではなく、多分化能性幹細胞の種類や、目的の分化細胞の種類、培養培地への添加時期、培養培地のその他の成分とのバランス等を考慮して適宜調整することができる。培養培地のβ－ＮＭＮ濃度が低すぎる場合には、多分化能性幹細胞に対する分化促進効果が弱いおそれがある。培養培地にβ－ＮＭＮを過剰量含有させた場合には、却って分化誘導や分化誘導時の細胞増殖が抑えられる可能性がある。培養培地の本発明の分化促進剤の含有量としては、β－ＮＭＮ濃度が０．０１～１０ｍＭとなる量であることが好ましく、０．０５～５ｍＭとなる量であることがより好ましく、０．１～１ｍＭとなる量であることがさらに好ましい。β－ＮＭＮ濃度が前記範囲内であることにより、多分化能性幹細胞の分化を充分に促進することができる。
【0024】
本発明の分化促進剤の存在下での多分化能性幹細胞の培養は、分化誘導用培養培地又は未分化細胞用培養培地に本発明の分化促進剤を含有させる以外は、常法により行うことができる。例えば、培養条件は、一般的に動物細胞を培養する培養条件とすることができ、必要に応じて適宜改変してもよい。例えば、培養温度が３０～４０℃、ＣＯ２濃度が１～１０体積％、Ｏ２濃度が０．１～２５体積％で培養できる。
【0025】
また、本発明の分化促進剤を含有させる未分化細胞用培養培地としては、例えば、一般的に、多分化能性幹細胞の維持又は増殖のために用いられる培地や、動物細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。また、市販されている各種の多能性幹細胞のための培養培地を用いることもできる。本発明の分化促進剤を含有させる未分化細胞用培養培地としては、具体的には、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、αイーグル最小必須培地（αＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｆ－１２培地、Ｆ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｅ８（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８）培地、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地、ｍＴｅＳＲ１培地等が挙げられる。これらの培地に、必要に応じて、アミノ酸、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等を添加してもよい。これらの培養培地には、多分化能性幹細胞の生存効率や増殖効率を高めることが知られている成分や、多分化能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有することが知られている成分等を適宜含有させてもよい。多分化能性幹細胞の生存効率を高める成分としては、例えば、Ｒｈｏ キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が挙げられる。
【0026】
本発明の分化促進剤を含有させる分化誘導用培養培地としては、細胞の生存に必要な栄養分を含有する培養培地に、１種以上の分化誘導因子を含有させた培養培地を用いることができる。細胞の生存に必要な栄養分を含有する培養培地としては、前述の未分化細胞用培養培地が挙げられる。未分化細胞用培養培地に含有させる分化誘導因子としては、各種文献に記載されている多種多様な分化誘導因子の中から、使用する多分化能性幹細胞の種類、目的の分化細胞の種類等を考慮して適宜決定できる。その他、Ｅ６（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６）培地等の市販されている分化誘導用培養培地を用いることもできる。これらの培養培地には、本発明の分化促進剤のほかに、多分化能性幹細胞の生存効率や増殖効率を高めることが知られている成分や、多分化能性幹細胞の分化を促進する作用を有することが知られている成分等を適宜含有させてもよい。
【0027】
本発明の分化促進剤によって分化が促進される多分化能性幹細胞としては、動物由来の多分化能性幹細胞が好ましく、哺乳類に由来する多分化能性幹細胞がより好ましく、ヒトに由来する多分化能性幹細胞がさらに好ましい。また、本発明の分化促進剤によって分化が促進される多分化能性幹細胞としては、動物由来のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞であることが好ましく、哺乳類に由来するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞であることがより好ましく、ヒトに由来するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又は間葉系幹細胞であることがさらに好ましい。
【0028】
本発明の分化促進剤は、特に、外胚葉、中胚葉、内胚葉のいずれの細胞にも分化しうる多能性幹細胞の分化促進に用いられることが好ましく、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞のいずれかの胚葉への分化の促進に用いられることが特に好ましい。例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を、これらの多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉にまで分化させる１種以上の分化誘導因子と本発明の分化促進剤とを含む分化誘導用培養培地で培養することにより、目的の胚葉細胞への分化を促進できる。
【実施例】
【0029】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0030】
なお、以降の実験において、ｉＰＳ細胞用培養培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、１９．４ｍｇ／Ｌ インスリン、１０．７ｍｇ／Ｌ トランスフェリン、６４ｍｇ／Ｌ アスコルビン酸、１４μｇ／Ｌ 亜セレン酸ナトリウム、１００μｇ／Ｌ ヒトＦＧＦ２、２μｇ／Ｌ ヒトＴＧＦβ１、５４３ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウムになるように添加した培地を用いた。
【0031】
［実施例１］
ｉＰＳ細胞の三胚葉分化におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を用いた。
ｉＰＳ細胞の三胚葉分化におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を用いた。
【0032】
＜培養＞
Ｕ底９６ウェルプレート「Nunclon Sphera 96U-well plate」（Thermo Fisher Scientific社製）にｉＰＳ細胞を１０，０００細胞／ウェルになるよう播種し、分化誘導用培養培地であるＥ６培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．２５、又は１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地で１日培養した。Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｒｈｏ依存的アポトーシスを抑制するために添加した。播種後１日目と５日目に、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。
Ｕ底９６ウェルプレート「Nunclon Sphera 96U-well plate」（Thermo Fisher Scientific社製）にｉＰＳ細胞を１０，０００細胞／ウェルになるよう播種し、分化誘導用培養培地であるＥ６培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．２５、又は１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地で１日培養した。Ｒｏｃｋ阻害剤は、Ｒｈｏ依存的アポトーシスを抑制するために添加した。播種後１日目と５日目に、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。
【0033】
＜ＲＴ－ＰＣＲによる各マーカーの発現量の測定＞
播種後３日目と７日目の細胞をサンプリングし、ＲＴ－ＰＣＲを行って、未分化マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｌｉｎ２８ａ、Ｋｌｆ４）、内胚葉マーカー（Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ）、中胚葉マーカー（ＭＳＸ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６）の発現の発現量を調べた。具体的には、サンプリングした細胞から、ＲＮＡ抽出用キット「RNeasy Mini Kit」（Qiagen社製）を用いてＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型に、逆転写用キット「SuperScript（登録商標） III First-Strand Synthesis System」（Thermo scientific社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて各マーカーの発現量をＰＣＲにより評価した。内部標準遺伝子として、Ｇ３ＰＤＨをコントロールとした。
播種後３日目と７日目の細胞をサンプリングし、ＲＴ－ＰＣＲを行って、未分化マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｌｉｎ２８ａ、Ｋｌｆ４）、内胚葉マーカー（Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ）、中胚葉マーカー（ＭＳＸ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６）の発現の発現量を調べた。具体的には、サンプリングした細胞から、ＲＮＡ抽出用キット「RNeasy Mini Kit」（Qiagen社製）を用いてＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型に、逆転写用キット「SuperScript（登録商標） III First-Strand Synthesis System」（Thermo scientific社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて各マーカーの発現量をＰＣＲにより評価した。内部標準遺伝子として、Ｇ３ＰＤＨをコントロールとした。
【0034】
ＰＣＲ産物を電気泳動して分離した後、染色した結果を図１に示す。図中、「Ｄａｙ ０」は播種直前の細胞の結果を、「Ｄａｙ ３」及び「Ｄａｙ ７」はそれぞれ播種後３日目と７日目の細胞の結果を示す。この結果から、β－ＮＭＮ存在下で分化誘導した細胞では、β－ＮＭＮ非存在下で培養した細胞よりも、各未分化マーカーの発現量が低下し、分化マーカーの発現量が上昇していることが示唆された。
【0035】
［実施例２］
ｉＰＳ細胞の外胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
ｉＰＳ細胞の外胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
【0036】
＜培養＞
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた１２ウェルプレートにｉＰＳ細胞を８×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この１２ウェルプレートの細胞を、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の外胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた１２ウェルプレートにｉＰＳ細胞を８×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この１２ウェルプレートの細胞を、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の外胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。
【0037】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後２、４、又は７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の細胞数の経時的変化を図２（Ａ）に、播種後７日目の細胞数を図２（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する外胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、外胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
播種後２、４、又は７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の細胞数の経時的変化を図２（Ａ）に、播種後７日目の細胞数を図２（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する外胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、外胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
【0038】
＜フローサイトメーターを用いた外胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
播種後２、４、又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Biolegend社製、clone 10C2）及び蛍光標識した抗Ｐａｘ６抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone O18-1330）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の蛍光強度と抗Ｐａｘ６抗体の蛍光強度を解析した。ＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６は、外胚葉の分化マーカーである。
播種後２、４、又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Biolegend社製、clone 10C2）及び蛍光標識した抗Ｐａｘ６抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone O18-1330）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の蛍光強度と抗Ｐａｘ６抗体の蛍光強度を解析した。ＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６は、外胚葉の分化マーカーである。
【0039】
フローサイトメーターにより、各細胞を、ＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６の発現量で分画した結果を図３に示す。Ｎｅｓｔｉｎ陽性でありかつＰａｘ６陽性である細胞が、外胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｎｅｓｔｉｎ陽性Ｐａｘ６陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、β－ＮＭＮ存在下で培養した細胞のほうが、Ｎｅｓｔｉｎ陽性Ｐａｘ６陽性細胞の比率が高かった。すなわち、β－ＮＭＮ添加により、外胚葉分化における分化効率が向上したことが確認された。
【0040】
これらの結果から、β－ＮＭＮは、外胚葉への分化誘導時に細胞の増殖性と分化効率の両方を向上させて、ｉＰＳ細胞から外胚葉細胞への分化を促進することがわかった。
【0041】
［実施例３］
ｉＰＳ細胞の中胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
ｉＰＳ細胞の中胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
【0042】
＜培養＞
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を１×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加したｉＰＳ細胞用培養培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の中胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように添加した培地で培地交換を行った。播種後１日目の培地交換時のみ、前記中胚葉分化誘導用培養培地にβ－ＮＭＮと共にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地に交換した。
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を１×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加したｉＰＳ細胞用培養培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の中胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように添加した培地で培地交換を行った。播種後１日目の培地交換時のみ、前記中胚葉分化誘導用培養培地にβ－ＮＭＮと共にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地に交換した。
【0043】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図４に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する中胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、中胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図４に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する中胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、中胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
【0044】
＜フローサイトメーターを用いた中胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体（Merck社製、clone 3E4.2）及び蛍光標識した抗ＣＤ５６抗体（Biolegend社製、clone HCD56）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体の蛍光強度と抗ＣＤ５６抗体の蛍光強度を解析した。ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６は、中胚葉の分化マーカーである。
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体（Merck社製、clone 3E4.2）及び蛍光標識した抗ＣＤ５６抗体（Biolegend社製、clone HCD56）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体の蛍光強度と抗ＣＤ５６抗体の蛍光強度を解析した。ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６は、中胚葉の分化マーカーである。
【0045】
フローサイトメーターにより、各細胞を、ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６の発現量で分画した結果を図５に示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ陽性でありかつＣＤ５６陽性である細胞が、中胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ陽性ＣＤ５６陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、β－ＮＭＮ存在下で培養した細胞とβ－ＮＭＮ非存在下で培養した細胞のＢｒａｃｈｙｕｒｙ陽性ＣＤ５６陽性細胞の比率に明確な差異はなかった。特に、β－ＮＭＮを１ｍＭ添加した細胞では、β－ＮＭＮ無添加で培養した場合よりも明らかにＢｒａｃｈｙｕｒｙ陽性ＣＤ５６陽性細胞の比率が低下していた。すなわち、β－ＮＭＮ添加は、中胚葉分化における分化効率にあまり影響しないことが確認された。
【0046】
これらの結果から、β－ＮＭＮは、中胚葉への分化誘導時に細胞の増殖性を向上させるが、ｉＰＳ細胞から中胚葉細胞への分化には明確な差異はなかった。
【0047】
［実施例４］
ｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２５３Ｇ１株を用いた。
ｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導時におけるβ－ＮＭＮの効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２５３Ｇ１株を用いた。
【0048】
＜培養＞
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を３×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加したｉＰＳ細胞用培養培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の内胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように添加した培地で培地交換を行った。播種後１日目の培地交換時のみ、前記内胚葉分化誘導用培養培地にβ－ＮＭＮと共にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地に交換した。
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を３×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加したｉＰＳ細胞用培養培地で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の内胚葉分化誘導用培養培地に、β－ＮＭＮを終濃度０、０．１、０．２５、又は１ｍＭとなるように添加した培地で培地交換を行った。播種後１日目の培地交換時のみ、前記内胚葉分化誘導用培養培地にβ－ＮＭＮと共にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地に交換した。
【0049】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図６に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する内胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、内胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図６に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有する内胚葉分化誘導用培養培地で培養した細胞のほうが、β－ＮＭＮを添加していない培地で培養した細胞よりも細胞数が多かった。この結果から、β－ＮＭＮによって、内胚葉への分化誘導時の細胞増殖性が向上することがわかった。
【0050】
＜フローサイトメーターを用いた内胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｓｏｘ１７抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone P7-969）及び蛍光標識した抗ＣＸＣＲ４抗体（Biolegend社製、clone 12G5）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｓｏｘ１７抗体の蛍光強度と抗ＣＸＣＲ４抗体の蛍光強度を解析した。Ｓｏｘ１７とＣＸＣＲ４は、内胚葉の分化マーカーである。
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｓｏｘ１７抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone P7-969）及び蛍光標識した抗ＣＸＣＲ４抗体（Biolegend社製、clone 12G5）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｓｏｘ１７抗体の蛍光強度と抗ＣＸＣＲ４抗体の蛍光強度を解析した。Ｓｏｘ１７とＣＸＣＲ４は、内胚葉の分化マーカーである。
【0051】
フローサイトメーターにより、各細胞を、Ｓｏｘ１７とＣＸＣＲ４の発現量で分画した結果を図７に示す。Ｓｏｘ１７陽性でありかつＣＸＣＲ４陽性である細胞が、内胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｓｏｘ１７陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、β－ＮＭＮ存在下で培養した細胞とβ－ＮＭＮ非存在下で培養した細胞のＳｏｘ１７陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率に明確な差異はなかった。すなわち、β－ＮＭＮ添加は、内胚葉分化における分化効率にあまり影響しないことが確認された。
【0052】
これらの結果から、β－ＮＭＮは、内胚葉への分化誘導時に細胞の増殖性を向上させるが、ｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化には明確な差異はなかった。
【0053】
［実施例５］
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２５３Ｇ１株を用いた。
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２５３Ｇ１株を用いた。
【0054】
＜培養＞
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた培養用ディッシュに播種したｉＰＳ細胞を、ｉＰＳ細胞用培養培地にβ－ＮＭＮを終濃度０、０．２５、若しくは１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地で、１日培養した。播種後１日目から毎日、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた培養用ディッシュに播種したｉＰＳ細胞を、ｉＰＳ細胞用培養培地にβ－ＮＭＮを終濃度０、０．２５、若しくは１ｍＭとなるように、Ｒｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように、それぞれ添加した培地にＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地で、１日培養した。播種後１日目から毎日、播種時の培養培地からＲｏｃｋ阻害剤を除いた培地で培地交換を行った。７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
【0055】
回収したｉＰＳ細胞を、マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を３×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、培養用ディッシュ中で培養していた時の培養培地からβ－ＮＭＮを除き、さらにＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地中で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の内胚葉分化誘導用培養培地で培地交換を行った。
【0056】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図８に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に内胚葉分化誘導がなされた細胞と、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に内胚葉分化誘導がなされた細胞とは、細胞数において明確な差異はなかった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加は、その後の内胚葉分化時の細胞増殖にあまり影響しないことが分かった。
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図８に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に内胚葉分化誘導がなされた細胞と、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に内胚葉分化誘導がなされた細胞とは、細胞数において明確な差異はなかった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加は、その後の内胚葉分化時の細胞増殖にあまり影響しないことが分かった。
【0057】
＜フローサイトメーターを用いた内胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｓｏｘ１７抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone P7-969）及び蛍光標識した抗ＦｏｘＡ２抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone N17-280）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｓｏｘ１７抗体の蛍光強度と抗ＦｏｘＡ２抗体の蛍光強度を解析した。Ｓｏｘ１７とＦｏｘＡ２は、内胚葉の分化マーカーである。
播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、パラホルムアルデヒドで固定した後、サポニン含有ＰＢＳで膜透過処理を行った。次いで、蛍光標識した抗Ｓｏｘ１７抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone P7-969）及び蛍光標識した抗ＦｏｘＡ２抗体（ベクトンディッキンソン社製、clone N17-280）を用いて、細胞を染色した。染色された細胞を洗浄した後、フローサイトメーター「FACScaliber」（ベクトンディッキンソン社製）により、各細胞の抗Ｓｏｘ１７抗体の蛍光強度と抗ＦｏｘＡ２抗体の蛍光強度を解析した。Ｓｏｘ１７とＦｏｘＡ２は、内胚葉の分化マーカーである。
【0058】
フローサイトメーターにより、各細胞を、Ｓｏｘ１７の発現量で分画した結果を図９に示す。Ｓｏｘ１７陽性である細胞が、内胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｓｏｘ１７陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、未分化培養時にβ－ＮＭＮ存在下で培養したｉＰＳ細胞のほうが、β－ＮＭＮ非存在下で培養したｉＰＳ細胞よりも、Ｓｏｘ１７陽性細胞の比率が高かった。すなわち、未分化培養時にβ－ＮＭＮ存在下で培養することにより、内胚葉分化における分化効率が向上したことが確認された。
【0059】
これらの結果から、ｉＰＳ細胞を予めβ－ＮＭＮ存在下で培養した後に内胚葉分化誘導を行うことにより、内胚葉への分化効率が向上し、ｉＰＳ細胞から内胚葉細胞への分化が促進されることがわかった。
【0060】
［実施例６］
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の中胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の中胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
【0061】
＜培養＞
ｉＰＳ細胞を、実施例５と同様にして培養用ディッシュ中で培養し、７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
回収したｉＰＳ細胞を、マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を１×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、培養用ディッシュ中で培養していた時の培養培地からβ－ＮＭＮを除き、さらにＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地中で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の中胚葉分化誘導用培養培地で培地交換を行った。
ｉＰＳ細胞を、実施例５と同様にして培養用ディッシュ中で培養し、７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
回収したｉＰＳ細胞を、マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を１×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、培養用ディッシュ中で培養していた時の培養培地からβ－ＮＭＮを除き、さらにＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地中で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の中胚葉分化誘導用培養培地で培地交換を行った。
【0062】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図１０に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に中胚葉分化誘導がなされた細胞のほうが、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に中胚葉分化誘導がなされた細胞よりも、細胞数が多かった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加によって、その後の中胚葉分化時の細胞増殖が向上することが分かった。
播種後７日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の播種後７日目の細胞数を図１０に示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に中胚葉分化誘導がなされた細胞のほうが、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に中胚葉分化誘導がなされた細胞よりも、細胞数が多かった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加によって、その後の中胚葉分化時の細胞増殖が向上することが分かった。
【0063】
＜フローサイトメーターを用いた中胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
実施例３と同様にして、播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、蛍光標識した抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体及び蛍光標識した抗ＣＤ５６抗体で染色し、フローサイトメーターにより、各細胞の抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体の蛍光強度と抗ＣＤ５６抗体の蛍光強度を解析した。
実施例３と同様にして、播種後５又は７日目にサンプリングした細胞を、蛍光標識した抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体及び蛍光標識した抗ＣＤ５６抗体で染色し、フローサイトメーターにより、各細胞の抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体の蛍光強度と抗ＣＤ５６抗体の蛍光強度を解析した。
【0064】
フローサイトメーターにより、各細胞を、ＢｒａｃｈｙｕｒｙとＣＤ５６の発現量で分画した結果を図１１に示す。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ陽性でありかつＣＤ５６陽性である細胞が、中胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ陽性ＣＤ５６陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、中胚葉分化誘前にβ－ＮＭＮ存在下で培養した細胞とβ－ＮＭＮ非存在下で培養した細胞の、分化誘導後のＢｒａｃｈｙｕｒｙ陽性ＣＤ５６陽性細胞の比率に明確な差異はなかった。すなわち、未分化培養時のβ－ＮＭＮは、その後の中胚葉分化誘導における分化効率にあまり影響しないことが確認された。
【0065】
これらの結果から、ｉＰＳ細胞を予めβ－ＮＭＮ存在下で培養した後に中胚葉分化誘導を行うことにより、中胚葉分化誘導時の細胞増殖性が向上したが、ｉＰＳ細胞から中胚葉細胞への分化には明確な差異が確認されなかった。
【0066】
［実施例７］
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の外胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、ｉＰＳ細胞の外胚葉分化誘導に対する効果を調べた。ｉＰＳ細胞としては、２０１Ｂ７株を用いた。
【0067】
＜培養＞
ｉＰＳ細胞を、実施例５と同様にして培養用ディッシュ中で培養し、７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
回収したｉＰＳ細胞を、マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を３×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、培養用ディッシュ中で培養していた時の培養培地からβ－ＮＭＮを除き、さらにＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地中で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の外胚葉分化誘導用培養培地で培地交換を行った。
ｉＰＳ細胞を、実施例５と同様にして培養用ディッシュ中で培養し、７０～８０％コンフルエンシーに達した時点で、培養用ディッシュからｉＰＳ細胞を剥離して回収した。
回収したｉＰＳ細胞を、マトリゲル（コーニング社製）で製造元プロトコルに従いコーティングされた２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を３×１０５細胞／ウェルになるよう播種した。この２４ウェルプレートの細胞を、培養用ディッシュ中で培養していた時の培養培地からβ－ＮＭＮを除き、さらにＲｏｃｋ阻害剤を終濃度１０μＭになるように添加した培地中で１日培養した。播種後１日目から毎日、「STEMdiff Trilineage Differentiation kit」（STEMCELL technology社製）の外胚葉分化誘導用培養培地で培地交換を行った。
【0068】
＜細胞数の経時的変化＞
播種後７又は９日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の細胞数の経時的変化を図１２（Ａ）に、播種後９日目の細胞数を図１２（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に外胚葉分化誘導がなされた細胞のほうが、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に外胚葉分化誘導がなされた細胞よりも、細胞数が多かった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加によって、その後の外胚葉分化時の細胞増殖が向上することが分かった。
播種後７又は９日目の細胞をサンプリングし、細胞数をカウントした。各細胞の細胞数の経時的変化を図１２（Ａ）に、播種後９日目の細胞数を図１２（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、β－ＮＭＮを含有するｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に外胚葉分化誘導がなされた細胞のほうが、β－ＮＭＮを含有していないｉＰＳ細胞用培養培地で培養した後に外胚葉分化誘導がなされた細胞よりも、細胞数が多かった。すなわち、未分化培養時におけるβ－ＮＭＮ添加によって、その後の外胚葉分化時の細胞増殖が向上することが分かった。
【0069】
＜フローサイトメーターを用いた外胚葉分化マーカー発現細胞の測定＞
実施例２と同様にして、播種後７又は９日目にサンプリングした細胞を、蛍光標識した抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体及び蛍光標識した抗Ｐａｘ６抗体で染色し、フローサイトメーターにより、各細胞の抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の蛍光強度と抗Ｐａｘ６抗体の蛍光強度を解析した。
実施例２と同様にして、播種後７又は９日目にサンプリングした細胞を、蛍光標識した抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体及び蛍光標識した抗Ｐａｘ６抗体で染色し、フローサイトメーターにより、各細胞の抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の蛍光強度と抗Ｐａｘ６抗体の蛍光強度を解析した。
【0070】
フローサイトメーターにより、各細胞を、ＮｅｓｔｉｎとＰａｘ６の発現量で分画した結果を図１３に示す。Ｎｅｓｔｉｎ陽性でありかつＰａｘ６陽性である細胞が、外胚葉に分化した細胞である。図中のパーセンテージは、Ｎｅｓｔｉｎ陽性Ｐａｘ６陽性細胞の細胞全量に対する比率（％）を示す。この結果、外胚葉分化誘前にβ－ＮＭＮ存在下で培養した細胞とβ－ＮＭＮ非存在下で培養した細胞の、分化誘導後のＮｅｓｔｉｎ陽性Ｐａｘ６陽性細胞の比率に明確な差異はなかった。すなわち、未分化培養時のβ－ＮＭＮは、その後の外胚葉分化誘導における分化効率にあまり影響しないことが確認された。
【0071】
これらの結果から、ｉＰＳ細胞を予めβ－ＮＭＮ存在下で培養した後に外胚葉分化誘導を行うことにより、外胚葉分化誘導時の細胞増殖性が向上したが、ｉＰＳ細胞から外胚葉細胞への分化には明確な差異は認められなかった。
【0072】
［実施例８］
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、間葉系幹細胞の骨分化誘導に対する効果を調べた。間葉系幹細胞としては、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Lonza社製、Cat# PT5006）を用いた。
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、間葉系幹細胞の骨分化誘導に対する効果を調べた。間葉系幹細胞としては、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Lonza社製、Cat# PT5006）を用いた。
【0073】
＜培養培地＞
増殖用培地としては、「MSCGM Bullet Kit」（Lonza社製、Cat# PT3001）に適宜をβ－ＭＮＭを添加した培地を用いた。
骨分化誘導用培地としては、α－ＭＥＭ培地に、ウシ胎児血清を終濃度１０容量％、デキサメタゾンを終濃度１０ｎＭ、βグリセロリン酸を終濃度１０ｍＭ、アスコルビン酸を終濃度５０μｇ／ｍＬ、ペニシリン－ストレプトマイシンを終濃度０．１％となるように添加した培地を用いた。
増殖用培地としては、「MSCGM Bullet Kit」（Lonza社製、Cat# PT3001）に適宜をβ－ＭＮＭを添加した培地を用いた。
骨分化誘導用培地としては、α－ＭＥＭ培地に、ウシ胎児血清を終濃度１０容量％、デキサメタゾンを終濃度１０ｎＭ、βグリセロリン酸を終濃度１０ｍＭ、アスコルビン酸を終濃度５０μｇ／ｍＬ、ペニシリン－ストレプトマイシンを終濃度０．１％となるように添加した培地を用いた。
【0074】
＜間葉系幹細胞の培養＞
間葉系幹細胞を、β－ＭＮＭ無添加の増殖用培地を用いて、培養用ディッシュに５×１０３細胞／ｃｍ２となるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で１日静置培養した。播種から１日経過後から２日おきに、β－ＭＮＭを終濃度０、０．１又は０．２５ｍＭとなるように添加した増殖用培地で培地交換を行った。
また、培養用ディッシュ内の細胞密度が８０～９０％コンフルエンシーになった時点で、継代を行った。継代は、まず、培養用ディッシュから上清を除き、ＰＢＳで洗浄した後、「１×Tryple Select」（Gibco社製）を添加し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で４分間静置した。静置後、ディッシュを軽くたたいて細胞を剥離させた後、増殖用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をシングル化した。次いで、このシングル化した細胞を、β－ＭＮＭを添加した増殖用培地に分散させ、培養用ディッシュに５×１０３細胞／ｃｍ２となるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で静置培養した。
４回継代培養を行った細胞を、以降の分化アッセイに使用した。
間葉系幹細胞を、β－ＭＮＭ無添加の増殖用培地を用いて、培養用ディッシュに５×１０３細胞／ｃｍ２となるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で１日静置培養した。播種から１日経過後から２日おきに、β－ＭＮＭを終濃度０、０．１又は０．２５ｍＭとなるように添加した増殖用培地で培地交換を行った。
また、培養用ディッシュ内の細胞密度が８０～９０％コンフルエンシーになった時点で、継代を行った。継代は、まず、培養用ディッシュから上清を除き、ＰＢＳで洗浄した後、「１×Tryple Select」（Gibco社製）を添加し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で４分間静置した。静置後、ディッシュを軽くたたいて細胞を剥離させた後、増殖用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をシングル化した。次いで、このシングル化した細胞を、β－ＭＮＭを添加した増殖用培地に分散させ、培養用ディッシュに５×１０３細胞／ｃｍ２となるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）で静置培養した。
４回継代培養を行った細胞を、以降の分化アッセイに使用した。
【0075】
＜分化誘導＞
β－ＭＮＭに馴化した細胞を、４８ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）でウェル内の細胞密度が８０～９０％コンフルエンシーになるまでβ－ＭＮＭを含有させた増殖用培地で培養し、その後骨分化誘導用培地へ交換した。培地交換は３～４日に１度行い、分化誘導開始から１４日目に、染色試験を行った。
β－ＭＮＭに馴化した細胞を、４８ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃、５体積％（ＣＯ２）でウェル内の細胞密度が８０～９０％コンフルエンシーになるまでβ－ＭＮＭを含有させた増殖用培地で培養し、その後骨分化誘導用培地へ交換した。培地交換は３～４日に１度行い、分化誘導開始から１４日目に、染色試験を行った。
【0076】
＜染色試験＞
分化誘導後の細胞について、アリザリンレッドＳを用いて沈着カルシウムの染色を行い、位相差顕微鏡にて染色状態を確認した。
分化誘導後の細胞について、アリザリンレッドＳを用いて沈着カルシウムの染色を行い、位相差顕微鏡にて染色状態を確認した。
【0077】
染色画像を図１４に示す。β－ＮＭＮ非添加（０ｍＭ）の細胞に比べ、０．１ｍＭ又は０．２５ｍＭのβ－ＮＭＮを添加した培地で培養した細胞は、カルシウム沈着が強くみられた。これらの結果から、β－ＮＭＮ存在下で増殖培養した細胞は骨への分化が促進されることが示唆された。
【0078】
［実施例９］
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、間葉系幹細胞の脂肪分化誘導に対する効果を調べた。間葉系幹細胞としては、実施例８と同様に、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Lonza社製、Cat# PT5006）を用いた。
分化誘導前にβ－ＮＭＮ存在下で培養することの、間葉系幹細胞の脂肪分化誘導に対する効果を調べた。間葉系幹細胞としては、実施例８と同様に、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Lonza社製、Cat# PT5006）を用いた。
【0079】
＜培養培地＞
増殖用培地としては、実施例８と同様に、「MSCGM Bullet Kit」（Lonza社製、Cat# PT3001）に適宜をβ－ＭＮＭを添加した培地を用いた。
脂肪分化誘導用培地としては、ＤＭＥＭ－Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に、ウシ胎児血清を終濃度１０容量％、ＩＢＭＸを終濃度０．５ｍＭ、デキサメタゾンを終濃度１μＭ、インドメタシンを終濃度２００μＭ、ペニシリン－ストレプトマイシンを終濃度０．１％となるように添加した培地を用いた。
増殖用培地としては、実施例８と同様に、「MSCGM Bullet Kit」（Lonza社製、Cat# PT3001）に適宜をβ－ＭＮＭを添加した培地を用いた。
脂肪分化誘導用培地としては、ＤＭＥＭ－Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ培地に、ウシ胎児血清を終濃度１０容量％、ＩＢＭＸを終濃度０．５ｍＭ、デキサメタゾンを終濃度１μＭ、インドメタシンを終濃度２００μＭ、ペニシリン－ストレプトマイシンを終濃度０．１％となるように添加した培地を用いた。
【0080】
＜間葉系幹細胞の培養＞
分化誘導前の間葉系幹細胞の培養は、実施例８と同様にして行った。
分化誘導前の間葉系幹細胞の培養は、実施例８と同様にして行った。
【0081】
＜分化誘導＞
分化誘導は、骨分化誘導用培地に代えて脂肪分化誘導用培地を用いた以外は、実施例８と同様にして行った。分化誘導開始から１４日目に、染色試験及び細胞のＲＮＡの回収を行った。
分化誘導は、骨分化誘導用培地に代えて脂肪分化誘導用培地を用いた以外は、実施例８と同様にして行った。分化誘導開始から１４日目に、染色試験及び細胞のＲＮＡの回収を行った。
【0082】
＜染色試験＞
分化誘導後の細胞について、オイルレッドＯを用いて細胞内脂肪滴の染色を行い、位相差顕微鏡にて染色状態を確認した。
分化誘導後の細胞について、オイルレッドＯを用いて細胞内脂肪滴の染色を行い、位相差顕微鏡にて染色状態を確認した。
【0083】
染色画像を図１５に示す。β－ＮＭＮ非添加（０ｍＭ）の細胞に比べ、０．１ｍＭ又は０．２５ｍＭのβ－ＮＭＮを添加した培地で培養した細胞は、多くの脂肪滴の蓄積がみられた。
【0084】
＜ｑＰＣＲ測定＞
分化誘導後の細胞から、「RNeasy Mini Plus Kit」（QIAGENE社製）を用いてＲＮＡを抽出し、これを鋳型として、「SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis Super Mix」（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表１に記載のプライマーと試薬「TB Green Fast qPCR Mix」（TaKaRa社製）を用いてｑＰＣＲを行い、ＰＰＡＲγ遺伝子、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子、及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。測定機器は、リアルタイムＰＣＲシステム「7500 Fast Real-Time PCR System」（Applied Biosystems社製）を使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子は内部標準として用いた。
分化誘導後の細胞から、「RNeasy Mini Plus Kit」（QIAGENE社製）を用いてＲＮＡを抽出し、これを鋳型として、「SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis Super Mix」（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、表１に記載のプライマーと試薬「TB Green Fast qPCR Mix」（TaKaRa社製）を用いてｑＰＣＲを行い、ＰＰＡＲγ遺伝子、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子、及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。測定機器は、リアルタイムＰＣＲシステム「7500 Fast Real-Time PCR System」（Applied Biosystems社製）を使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子は内部標準として用いた。
【0085】
【表1】
【0086】
脂肪へ分化誘導した細胞のｑＰＣＲの結果から、各遺伝子の相対発現量を求めた。β－ＮＭＮ非添加（０ｍＭ）の細胞の遺伝子発現量を１とした。図１６はＰＰＡＲγ遺伝子の相対発現量の測定結果を、図１７はＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の相対発現量の測定結果を、それぞれ示す。ＰＰＡＲγ及びＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎは、いずれも脂肪分化マーカーである。β－ＮＭＮ非添加（０ｍＭ）の細胞に比べ、０．１ｍＭ又は０．２５ｍＭのβ－ＮＭＮを添加した培地で培養した細胞は、両遺伝子の発現量の増加が確認された。
【0087】
オイルレッドＯ染色及びｑＰＣＲの結果から、β－ＮＭＮ存在下で増殖培養した細胞は、脂肪への分化が促進されることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】