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特許7290734アダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-05
(45)【発行日】2023-06-13
(54)【発明の名称】アダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20230606BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20230606BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230606BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12N15/11 Z
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2021546100
(86)(22)【出願日】2019-09-18
(86)【国際出願番号】 JP2019036512
(87)【国際公開番号】W WO2021053745
(87)【国際公開日】2021-03-25
【審査請求日】2022-03-09
(73)【特許権者】
【識別番号】501387839
【氏名又は名称】株式会社日立ハイテク
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】赤堀 玲奈
(72)【発明者】
【氏名】後藤 佑介
(72)【発明者】
【氏名】藤岡 満
(72)【発明者】
【氏名】柳 至
【審査官】木原 啓一郎
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０３５１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０９０１７９３７（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／００３５２６０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０５４５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２３０６１４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｍ
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノポアを有する薄膜を介して対向した第１の液槽と第２の液槽のうち、第１の液槽内に；解析対象の生体分子と、当該生体分子の少なくとも一方末端に対して直接的又は間接的に結合した一本鎖のヌクレオチドからなるアダプター分子であって、分子モータが結合しうる分子モータ結合部と、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部との組を複数有するアダプター分子とを含む生体分子－アダプター分子複合体と；アダプター分子における分子モータ結合部に結合しうる分子モータと；アダプター分子におけるプライマー結合部にハイブリダイズしうるプライマーと；を含む電解質溶液が充填され、第２の液槽内に電解質溶液が充填された状態で、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加して、第１の液槽側を負又はグランド電位とし第２の液槽を正電位とする電位勾配を形成する工程と、上記第２の液槽と上記第１の液槽との間を上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを介して移動する際に生ずる信号を測定する工程とを備え、
上記信号を測定する工程では、ナノポアに最も近い上記分子モータが、上記プライマー結合部にハイブリダイズしたプライマーから相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを通過する際に生ずる信号を測定し、その後、相補鎖を有する上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第１の液槽から上記第２の液槽に向かって移動させることで当該相補鎖を引き剥がし、再びナノポアに最も近い上記分子モータが相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ信号を測定することを繰り返すことを特徴とする、生体分子の分析方法。
【請求項2】
上記アダプター分子は、上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする請求項１記載の生体分子の分析方法。
【請求項3】
上記アダプター分子は、上記生体分子と直接的又は間接的に結合する端部とは反対側の端部に、上記生体分子の解析装置におけるナノポアの径より大径の脱落防止部を備えることを特徴とする請求項１記載の生体分子の分析方法。
【請求項4】
上記アダプター分子における上記生体分子と直接的又は間接的に結合する端部とは反対側の端部は、一本鎖核酸領域からなり、
上記脱落防止部は、上記一本鎖核酸領域に結合可能な分子又は上記一本鎖核酸領域内における相補領域で形成されるヘアピン構造であることを特徴とする請求項３記載の生体分子の分析方法。
【請求項5】
上記アダプター分子は、互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、末端が３’末端であって上記分子モータ結合部及び上記プライマー結合部の複数組を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする請求項１記載の生体分子の分析方法。
【請求項6】
上記アダプター分子は、互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域とを備え、
上記分子モータ結合部及び上記プライマー結合部の複数組は、これら一対の一本鎖核酸領域のうち３’末端を有する一本鎖核酸領域内にあることを特徴とする請求項１記載の生体分子の分析方法。
【請求項7】
上記アダプター分子は、上記一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域は、立体構造形成領域を有することを特徴とする請求項６記載の生体分子の分析方法。
【請求項8】
上記アダプター分子は、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対して相補的な塩基配列を有する立体構造形成抑制オリゴマーを備えることを特徴とする請求項７記載の生体分子の分析方法。
【請求項9】
上記立体構造形成抑制オリゴマーは、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対してハイブリダイズしており、立体構造形成抑制オリゴマーがハイブリダイズした部分より末端側が一本鎖であることを特徴とする請求項８記載の生体分子の分析方法。
【請求項10】
上記一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域は、分子モータとの結合力が上記生体分子よりも低い分子モータ離脱誘導部を有することを特徴とする請求項６記載の生体分子の分析方法。
【請求項11】
ナノポアを有する薄膜を介して対向した第１の液槽と第２の液槽のうち、第１の液槽内に；解析対象の生体分子と、当該生体分子の少なくとも一方末端に対して直接的又は間接的に結合したアダプター分子であって、分子モータとの結合力が上記生体分子よりも低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子とを含む生体分子－アダプター分子複合体と；当該生体分子－アダプター分子複合体における分子モータ結合部に結合しうる分子モータと；当該生体分子－アダプター分子複合体におけるプライマー結合部にハイブリダイズしうるプライマーと；を含む電解質溶液が充填され、第２の液槽内に電解質溶液が充填された状態で、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加して、第１の液槽側を負又はグランド電位とし第２の液槽を正電位とする電位勾配を形成する工程と、上記第２の液槽と上記第１の液槽との間を上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを介して移動する際に生ずる信号を測定する工程とを備え、
上記信号を測定する工程では、上記分子モータが、上記プライマー結合部にハイブリダイズしたプライマーから相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ、上記生体分子－アダプター分子複合体における分子モータ離脱誘導部で当該分子モータが乖離することを特徴とする、生体分子の分析方法。
【請求項12】
上記アダプター分子における上記分子モータ離脱誘導部は、ホスホジエステル結合を有しない炭素鎖又は脱塩基配列部であることを特徴とする請求項１１記載の生体分子の分析方法。
【請求項13】
上記アダプター分子は、上記分子モータ離脱誘導部よりも５’末端側に一本鎖のヌクレオチドからなる立体構造形成領域を更に有することを特徴とする請求項１１記載の生体分子の分析方法。
【請求項14】
上記アダプター分子は、互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、末端が５’末端であって上記分子モータ離脱誘導部を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする請求項１１記載の生体分子の分析方法。
【請求項15】
上記アダプター分子は、互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域とを備え、
上記分子モータ離脱誘導部は、これら一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域内にあることを特徴とする請求項１１記載の生体分子の分析方法。
【請求項16】
上記アダプター分子は、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対して相補的な塩基配列を有する立体構造形成抑制オリゴマーを備えることを特徴とする請求項１３記載の生体分子の分析方法。
【請求項17】
上記立体構造形成抑制オリゴマーは、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対してハイブリダイズしており、立体構造形成抑制オリゴマーがハイブリダイズした部分より末端側が一本鎖であることを特徴とする請求項１６記載の生体分子の分析方法。
【請求項18】
上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、上記生体分子の解析装置におけるナノポアの径より大径の脱落防止部を備えることを特徴とする請求項１５記載の生体分子の分析方法。
【請求項19】
上記脱落防止部は、上記一本鎖核酸領域に結合可能な分子又は上記一本鎖核酸領域内における相補領域で形成されるヘアピン構造であることを特徴とする請求項１８記載の生体分子の分析方法。
【請求項20】
上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、分子モータが結合しうる分子モータ結合部を備えることを特徴とする請求項１５記載の生体分子の分析方法。
【請求項21】
上記分子モータ結合部を備える一本鎖核酸領域は、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部を備えることを特徴とする請求項２０記載の生体分子の分析方法。
【請求項22】
上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする請求項２１記載の生体分子の分析方法。
【請求項23】
上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、分子モータが結合しうる分子モータ結合部と、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部との組を複数有することを特徴とする請求項１５記載の生体分子の分析方法。
【請求項24】
上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする請求項２３記載の生体分子の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸等の生体分子の分析に使用されるアダプター分子、当該アダプター分子を結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質や核酸分子などの生体分子は、それぞれアミノ酸やヌクレオチドといったモノマーが連結した構造を有する。これら生体分子のタンパク質については、エドマン法を自動化した装置（ペプチドシークエンサ又はプロテインシークエンサと呼称される）を用いてモノマー配列が決定される。核酸分子のモノマー配列（塩基配列）を決定する装置としては、サンガー法やマキサム・ギルバート法を適用した第１世代シーケンサ、パイロシークエンス法や、ブリッジＰＣＲ法と１塩基合成（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＢＳ）技術を組み合わせた方法を用いた第２世代シーケンサが知られている。
【0003】
一方、次世代ＤＮＡシーケンサの分野では、伸長反応や蛍光ラベルを行うことなく、ＤＮＡの塩基配列を電気的に直接計測する方法が注目されている。具体的には、試薬を用いることなくＤＮＡ鎖を直接計測し、塩基配列を決定する、いわゆるナノポアＤＮＡシーケング方式に関する研究開発が活発に進められている。
【0004】
このナノポアＤＮＡシーケンシング方式では、薄膜に形成された細孔（以下「ナノポア」という。）をＤＮＡ鎖が通過することで生じる封鎖電流を計測することにより、塩基配列を計測する。すなわち、ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いにより封鎖電流が変化するので、封鎖電流量を計測することで塩基種を順次同定することができる。この方式では、上述した各種シーケンサと異なり、ＤＮＡ鎖を鋳型とした酵素による増幅反応や蛍光体等の標識物を付加する必要もない。このため、ナノポアＤＮＡシーケンシング方式は、従来の各種シーケンサと比較して高スループットで、低ランニングコストであり、且つ長塩基のＤＮＡ解読が可能となる。
【0005】
このナノポアＤＮＡシーケンシング方式は、一般的に、電解質溶液が満たされている第１及び第２の液槽と、その第１及び第２の液槽を仕切り、ナノポアを有する薄膜と、第１及び第２の液槽に設けられる第１及び第２の電極とを備えた生体分子分析用デバイスにより実現される。生体分子分析用デバイスは、アレイデバイスとして構成することもできる。アレイデバイスは、薄膜によって仕切られる液室の組を複数個備えるデバイスをいう。例えば、第１の液槽を共通槽とし、第２の液槽を複数個の個別槽とすることができる。この場合、共通槽と個別槽の各々に電極を配置する。
【0006】
この構成において、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧が印加され、且つナノポアにはナノポア径に応じたイオン電流が流れる。また、ナノポアには、印加した電圧に応じた電位勾配が形成される。生体分子を第１の液槽に導入すると、拡散現象及びこの発生した電位勾配に応じて、生体分子がナノポアを介し第２の液槽へ送られる。イオン電流の大きさは一次近似としてナノポアの断面積に比例する。ＤＮＡがナノポアを通過すると、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この電流を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異や、塩基の種類を判別する。
【0007】
また、その他にも、ナノポアの内側面等にプローブ電極対を対向して設け、電極間に電圧をかけることにより、ナノポアを通過する際のＤＮＡとプローブ電極間のトンネル電流を測定し、トンネル電流の大きさから塩基の種類を判別する方式も知られている。
【0008】
ナノポアＤＮＡシーケンシング方式の課題の１つとして、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御が挙げられる。ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種の違いを封鎖電流量で計測するには、計測時の電流ノイズ及びＤＮＡ分子の揺らぎの時定数から、ＤＮＡのナノポア通過速度を１塩基辺り１００μｓ以上にする必要があると考えられている。しかし、ＤＮＡのナノポア通過速度は通常１塩基当たり１μｓ以下と速く、各塩基由来の封鎖電流を十分に計測することが困難である。
【0009】
搬送制御法の一つとして、ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖合成反応をする際や、ヘリカーゼが二本鎖ＤＮＡを解く際に鋳型となる一本鎖ＤＮＡを送り制御する力を利用する方法がある（例えば、非特許文献１参照）。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となるＤＮＡに結合して、鋳型ＤＮＡに相補結合したプライマーの端部から相補鎖合成反応を行う。第１の液槽において、ＤＮＡポリメラーゼがナノポア近傍で相補鎖合成反応を行うことで、ナノポアを介して鋳型ＤＮＡを第２の液槽に搬送する。このＤＮＡポリメラーゼやヘリカーゼを分子モータと呼ぶ。
【0010】
また、特許文献１に記載されるように、ナノポアを介して第１の液槽と第２の液槽の間を、解析対象の一本鎖ＤＮＡを往復運動させることで計測精度を向上させることができる。すなわち、解析対象の一本鎖ＤＮＡを第１の液槽と第２の液槽の間で往復運動させて、複数回計測することで単回測定において生じたエラーを補正することができる。このとき、特許文献１に記載されるように、解析対象の一本鎖ＤＮＡにおける一方端部に第一ストッパ分子（ナノポア径より大）を結合することで、当該一本鎖ＤＮＡの他方端部からナノポアを介して第２の液槽に一本鎖ＤＮＡを移動させ、第２の液槽内で一本鎖ＤＮＡの他方端部に対して第二ストッパ分子（ナノポア径より大）を結合させる。これにより、一本鎖ＤＮＡの一方端部が第１の液槽内に留まり、他方端部が第２の液槽内に留まることができ、往復運動に際して一本鎖ＤＮＡがナノポアから抜け落ちることが防止できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【文献】Ｇｅｒａｌｄ Ｍ Ｃｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，Ｎｏ．４，ｐ．３４４－３４８、２０１２
【特許文献】
【0012】
【文献】特許第５３７２５７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
上述のように、第１の液槽及び第２の液槽間に、ナノポアを介して生体分子を往復運動させることで、読み取り精度の向上が図られている。ところが、ナノポアを介した往復運動、すなわち生体分子の搬送制御は技術的に非常に困難であり、生体分子をより簡便かつ確実に往復運動させる技術が求められていた。
【0014】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ナノポアを介して解析対象の生体分子をより簡便かつ確実に往復運動させることができるアダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
【0016】
（１）解析対象の生体分子に対して直接的又は間接的に結合することができ、一本鎖のヌクレオチドからなる立体構造形成領域を有するアダプター分子。
【0017】
（２）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、上記立体構造形成領域を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする（１）記載のアダプター分子。
【0018】
（３）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域とを備え、上記立体構造形成領域は、これら一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域内にあることを特徴とする（１）記載のアダプター分子。
【0019】
（４）上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対して相補的な塩基配列を有する立体構造形成抑制オリゴマーを備えることを特徴とする（１）記載のアダプター分子。
【0020】
（５）上記立体構造形成抑制オリゴマーは、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対してハイブリダイズしており、立体構造形成抑制オリゴマーがハイブリダイズした部分より末端側が一本鎖であることを特徴とする（４）記載のアダプター分子。
【0021】
（６）上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、上記生体分子の解析装置におけるナノポアの径より大径の脱落防止部を備えることを特徴とする（３）記載のアダプター分子。
【0022】
（７）上記脱落防止部は、上記一本鎖核酸領域に結合可能な分子又は上記一本鎖核酸領域内における相補領域で形成されるヘアピン構造であることを特徴とする（６）記載のアダプター分子。
【0023】
（８）上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、分子モータが結合しうる分子モータ結合部を備えることを特徴とする（３）記載のアダプター分子。
【0024】
（９）上記分子モータ結合部を備える一本鎖核酸領域は、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部を備えることを特徴とする（８）記載のアダプター分子。
【0025】
（１０）上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする（９）記載のアダプター分子。
【0026】
（１１）解析対象の生体分子に対して直接的又は間接的に結合することができ、一本鎖のヌクレオチドからなるアダプター分子であって、分子モータが結合しうる分子モータ結合部と、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部との組を複数有するアダプター分子。
【0027】
（１２）上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする（１１）記載のアダプター分子。
【0028】
（１３）上記生体分子と直接的又は間接的に結合する端部とは反対側の端部に、上記生体分子の解析装置におけるナノポアの径より大径の脱落防止部を備えることを特徴とする（１１）記載のアダプター分子。
【0029】
（１４）上記脱落防止部は、上記一本鎖核酸領域に結合可能な分子又は上記一本鎖核酸領域内における相補領域で形成されるヘアピン構造であることを特徴とする（１３）記載のアダプター分子。
【0030】
（１５）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、末端が３’末端であって上記分子モータ結合部及び上記プライマー結合部の複数組を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする（１１）記載のアダプター分子。
【0031】
（１６）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域とを備え、上記分子モータ結合部及び上記プライマー結合部の複数組は、これら一対の一本鎖核酸領域のうち３’末端を有する一本鎖核酸領域内にあることを特徴とする（１１）記載のアダプター分子。
【0032】
（１７）上記一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域は、立体構造形成領域を有することを特徴とする（１６）記載のアダプター分子。
【0033】
（１８）上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対して相補的な塩基配列を有する立体構造形成抑制オリゴマーを備えることを特徴とする（１７）記載のアダプター分子。
【0034】
（１９）上記立体構造形成抑制オリゴマーは、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対してハイブリダイズしており、立体構造形成抑制オリゴマーがハイブリダイズした部分より末端側が一本鎖であることを特徴とする（１８）記載のアダプター分子。
【0035】
（２０）上記一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域は、分子モータとの結合力が上記生体分子よりも低い分子モータ離脱誘導部を有することを特徴とする（１６）記載のアダプター分子。
【0036】
（２１）解析対象の生体分子に対して直接的又は間接的に結合することができ、分子モータとの結合力が上記生体分子よりも低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子。
【0037】
（２２）上記分子モータ離脱誘導部は、ホスホジエステル結合を有しない炭素鎖又は脱塩基配列部であることを特徴とする（２１）記載のアダプター分子。
【0038】
（２３）上記分子モータ離脱誘導部よりも５’末端側に一本鎖のヌクレオチドからなる立体構造形成領域を更に有することを特徴とする（２１）記載のアダプター分子。
【0039】
（２４）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、末端が５’末端であって上記分子モータ離脱誘導部を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする（２１）記載のアダプター分子。
当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結した、末端が５’末端であって上記分子モータ離脱誘導部を有する一本鎖核酸領域とを備えることを特徴とする（２１）記載のアダプター分子。
【0040】
（２５）互いに相補的な塩基配列からなり、上記解析対象の生体分子に直接的又は間接的に結合する一方端部を有する二本鎖核酸領域と、当該二本鎖核酸領域における上記一方端部と異なる他方端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域とを備え、上記分子モータ離脱誘導部は、これら一対の一本鎖核酸領域のうち５’末端を有する一本鎖核酸領域内にあることを特徴とする（２１）記載のアダプター分子。
【0041】
（２６）上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対して相補的な塩基配列を有する立体構造形成抑制オリゴマーを備えることを特徴とする（２３）記載のアダプター分子。
【0042】
（２７）上記立体構造形成抑制オリゴマーは、上記立体構造形成領域の少なくとも一部に対してハイブリダイズしており、立体構造形成抑制オリゴマーがハイブリダイズした部分より末端側が一本鎖であることを特徴とする（２６）記載のアダプター分子。
【0043】
（２８）上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、上記生体分子の解析装置におけるナノポアの径より大径の脱落防止部を備えることを特徴とする（２５）記載のアダプター分子。
【0044】
（２９）上記脱落防止部は、上記一本鎖核酸領域に結合可能な分子又は上記一本鎖核酸領域内における相補領域で形成されるヘアピン構造であることを特徴とする（２８）記載のアダプター分子。
【0045】
（３０）上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、分子モータが結合しうる分子モータ結合部を備えることを特徴とする（２５）記載のアダプター分子。
【0046】
（３１）上記分子モータ結合部を備える一本鎖核酸領域は、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部を備えることを特徴とする（３０）記載のアダプター分子。
【0047】
（３２）上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする（３１）記載のアダプター分子。
【0048】
（３３）上記一対の一本鎖核酸領域のうち、端部が３’末端である一本鎖核酸領域は、分子モータが結合しうる分子モータ結合部と、当該分子モータ結合部より３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部との組を複数有することを特徴とする（２５）記載のアダプター分子。
【0049】
（３４）上記分子モータ結合部と上記プライマー結合部との間に、上記分子モータが結合できないスペーサを有することを特徴とする（３３）記載のアダプター分子。
【0050】
（３５）解析対象の生体分子と、当該生体分子の少なくとも一方末端に対して直接的又は間接的に結合した（１）乃至（１０）いずれかに記載のアダプター分子とを含む生体分子－アダプター分子複合体。
【0051】
（３６）解析対象の生体分子と、当該生体分子の少なくとも一方末端に対して直接的又は間接的に結合した（１１）乃至（２０）いずれかに記載のアダプター分子とを含む生体分子－アダプター分子複合体。
【0052】
（３７）解析対象の生体分子と、当該生体分子の少なくとも一方末端に対して直接的又は間接的に結合した（２１）乃至（３４）いずれかに記載のアダプター分子とを含む生体分子－アダプター分子複合体。
【0053】
（３８）ナノポアを有する薄膜と、上記薄膜を介して対向した第１の液槽及び第２の液槽と、上記第１の液槽に上記（３５）、（３６）又は（３７）記載の生体分子－アダプター分子複合体を含む電解質溶液が充填されるとともに、上記第２の液槽に電解質溶液が充填された状態で第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加する電圧源と、上記第１の液槽と上記第２の液槽との間に所望の電位勾配を形成するよう上記電圧源を制御する制御装置とを備える生体分析装置。
【0054】
（３９）ナノポアを有する薄膜を介して対向した第１の液槽と第２の液槽のうち、第１の液槽内に上記（３５）記載の生体分子－アダプター分子複合体を含む電解質溶液が充填され、第２の液槽内に電解質溶液が充填された状態で、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加して、第１の液槽側を負又はグランド電位とし第２の液槽を正電位とする電位勾配を形成する工程と、上記第２の液槽内において上記アダプター分子の立体構造形成領域が立体構造を形成する工程と、上記第２の液槽と上記第１の液槽との間を上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを介して移動する際に生ずる信号を測定する工程とを備え、上記電位勾配を形成する工程では、生体分子－アダプター分子複合体における立体構造形成領域が上記ナノポアを介して上記第２の液槽内に導入され、電位勾配により上記生体分子－アダプター分子複合体が上記第１の液槽から上記第２の液槽に向かって移動することを特徴とする、生体分子の分析方法。
【0055】
（４０）ナノポアを有する薄膜を介して対向した第１の液槽と第２の液槽のうち、第１の液槽内に上記（３６）記載の生体分子－アダプター分子複合体と、アダプター分子における分子モータ結合部に結合しうる分子モータと、アダプター分子におけるプライマー結合部にハイブリダイズしうるプライマーとを含む電解質溶液が充填され、第２の液槽内に電解質溶液が充填された状態で、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加して、第１の液槽側を負又はグランド電位とし第２の液槽を正電位とする電位勾配を形成する工程と、上記第２の液槽と上記第１の液槽との間を上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを介して移動する際に生ずる信号を測定する工程とを備え、上記信号を測定する工程では、ナノポアに最も近い上記分子モータが、上記プライマー結合部にハイブリダイズしたプライマーから相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを通過する際に生ずる信号を測定し、その後、相補鎖を有する上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第１の液槽から上記第２の液槽に向かって移動させることで当該相補鎖を引き剥がし、再びナノポアに最も近い上記分子モータが相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ信号を測定することを繰り返すことを特徴とする、生体分子の分析方法。
【0056】
（４１）ナノポアを有する薄膜を介して対向した第１の液槽と第２の液槽のうち、第１の液槽内に上記（３７）記載の生体分子－アダプター分子複合体と、当該生体分子－アダプター分子複合体における分子モータ結合部に結合しうる分子モータと、当該生体分子－アダプター分子複合体におけるプライマー結合部にハイブリダイズしうるプライマーとを含む電解質溶液が充填され、第２の液槽内に電解質溶液が充填された状態で、第１の液槽と第２の液槽の間に電圧を印加して、第１の液槽側を負又はグランド電位とし第２の液槽を正電位とする電位勾配を形成する工程と、上記第２の液槽と上記第１の液槽との間を上記生体分子－アダプター分子複合体が上記ナノポアを介して移動する際に生ずる信号を測定する工程とを備え、上記信号を測定する工程では、上記分子モータが、上記プライマー結合部にハイブリダイズしたプライマーから相補鎖を合成することで、上記生体分子－アダプター分子複合体を上記第２の液槽から上記第１の液槽に向かって移動させ、上記生体分子－アダプター分子複合体における分子モータ離脱誘導部で当該分子モータが乖離することを特徴とする、生体分子の分析方法。
【発明の効果】
【0057】
本発明に係るアダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法によれば、特徴的なアダプター分子を使用することで、生体分子－アダプター分子をナノポア内に確実に往復運動させることができる。これにより、生体分子の正確な分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】本発明を適用したアダプター分子を利用する生体分子分析装置を概略的に示す構成図である。
【図2】本発明を適用したアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体の構成を示す構成図である。
【図6】本発明を適用したアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体を分子モータを用いて分析する工程を模式的に示す構成図である。
【図9】本発明を適用した他のアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体の構成を示す構成図である。
【図13】本発明を適用した更に他のアダプター分子の構成を示す構成図である。
【図16】本発明を適用した他のアダプター分子を利用する生体分子分析装置を概略的に示す構成図である。
【図17】本発明を適用した他のアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体の構成を示す構成図である。
【図22】本発明を適用した更に他のアダプター分子の構成を示す構成図である。
【図28】本発明を適用した更に他のアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体を分析する工程を模式的に示す構成図である。
【図35】本発明を適用した更に他のアダプター分子を利用する生体分子分析装置を概略的に示す構成図である。
【図36】本発明を適用した更に他のアダプター分子を含む生体分子－アダプター分子複合体の構成を示す構成図である。
【図40】本発明を適用した更に他のアダプター分子の構成を示す構成図である。
【図46】本発明を適用した更に他のアダプター分子の構成を示す構成図である。
【図50】本発明を適用した更に他のアダプター分子の構成を示す構成図である。
【図51】参考例１で測定した経過時間と封鎖電流との関係を示す特性図である。
【図52】テロメア構造を有しないアダプターと、テロメア構造を有するアダプターを計測した際のイオン電流変化を示す特性図である。
【図53】テロメア構造を有する一本鎖を計測溶液に融解させてナノポアの封鎖電流を計測した結果を示す特性図である。
【図54】テロメア構造を有するアダプター分子を生体分子にライゲーションし、他の末端にストレプトアビジンを有するサンプルを用いて封鎖電流を測定した結果を示す特性図である。
【図55】テロメア構造を有するアダプター分子を生体分子にライゲーションし、他の末端にストレプトアビジンを有する他のサンプルを用いて封鎖電流を測定した結果を示す特性図である。
【図56a】分子モータの存在下で分子モータ離脱誘導部を有する鋳型（ＳＡなし）を用いてナノポア通過信号を観察した結果を示す特性図である。
【図56b】分子モータの存在下で分子モータ離脱誘導部を有する鋳型（ＳＡ有り）を用いてナノポア通過信号を観察した結果を示す特性図である。
【図57】隣り合うプライマー結合部位の間隔を代えたアダプター分子について分子モータの存在下/非存在下で電気泳動を行った結果を示す写真である。
【図58】プライマー結合部及び分子モータ結合部を複数組有するアダプター分子を用いて、分子モータ存在下でナノポア通過信号を観察した結果を示す特性図であり、（ａ）は計測された封鎖信号の代表図であり、（ｂ）はDotplot解析の結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、本発明に係るアダプター分子、生体分子－アダプター分子複合体、生体分子の分析装置及び分析方法を、図面を参照して詳細に説明する。たたし、これら図面は、本発明の原理に則った具体的な実施形態を示すものであって、それらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【0060】
なお、以下、全ての実施形態において説明する生体分子分析装置は、いわゆる封鎖電流方式で生体分子の分析に用いられる、当該分野で公知の生体分子分析装置を適用することができる。従来公知の生体分子分析装置としては、例えば、米国特許第５７９５７８２号、“Scientific Reports 4, 5000, 2014, Akahori, et al.”、“Nanotechnology 25(27):275501, 2014, Yanagi et al.”、“Scientific Reports, 5, 14656, 2015, Goto et al.”、“Scientific Reports 5, 16640, 2015”等に開示されている装置を挙げることができる。
【0061】
［第１－１の実施形態］
図１に、アダプター分子と解析対象の生体分子とが直接的又は間接的に連結されてなる生体分子－アダプター分子複合体を分析する生体分子分析装置１００の一構成例を示す。図１に示した生体分子分析装置１００は、封鎖電流方式にてイオン電流を測定する生体分子分析用デバイスであり、ナノポア１０１が形成された基板１０２と、基板１０２を挟んで基板１０２と接するように配置され、その内部に電解質溶液１０３が満たされた一対の液槽１０４（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）と、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの各々に接する一対の電極１０５（第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂ）とを備える。測定時には、一対の電極１０５の間に電圧源１０７から所定の電圧が印加され、一対の電極１０５の間に電流が流れる。電極１０５の間に流れる電流の大きさは、電流計１０６により計測され、その計測値はコンピュータ１０８により分析される。
図１に、アダプター分子と解析対象の生体分子とが直接的又は間接的に連結されてなる生体分子－アダプター分子複合体を分析する生体分子分析装置１００の一構成例を示す。図１に示した生体分子分析装置１００は、封鎖電流方式にてイオン電流を測定する生体分子分析用デバイスであり、ナノポア１０１が形成された基板１０２と、基板１０２を挟んで基板１０２と接するように配置され、その内部に電解質溶液１０３が満たされた一対の液槽１０４（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）と、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの各々に接する一対の電極１０５（第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂ）とを備える。測定時には、一対の電極１０５の間に電圧源１０７から所定の電圧が印加され、一対の電極１０５の間に電流が流れる。電極１０５の間に流れる電流の大きさは、電流計１０６により計測され、その計測値はコンピュータ１０８により分析される。
【0062】
電解質溶液１０３には、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌが用いられる。電解質溶液１０３は、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂにおいて同じ組成であっても良いし、異なる組成であっても良い。なお、第１の液槽１０４Ａには、詳細を後述する生体分子－アダプター分子複合体等を含む電解質溶液１０３が充填されている。また、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ内の電解質溶液１０３には、生体分子の安定化のため、緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては、ＴｒｉｓやＥＤＴＡやＰＢＳなどが用いられる。第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂは、例えばＡｇ、ＡｇＣｌ、Ｐｔといった導電性を有する材料から作製することができる。
【0063】
第１の液槽１０４Ａ内に充填された電解質溶液１０３には、解析対象の生体分子１０９に対して第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１が結合してなる生体分子－アダプター分子複合体１１２が含まれる。第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１は、解析対象の生体分子１０９の端部に連結することができる、ヌクレオチドや疑似ヌクレオチド、ペプチド核酸等がから構成される核酸分子である。第１のアダプター分子１１０は、解析対象の生体分子１０９の一方端部に連結され、第２の液槽１０４Ｂ内において立体構造を形成する。第２のアダプター分子１１１は、生体分子１０９と連結される端部とは反対側の端部に脱落防止部１１３を備えている。
【0064】
ここで、第１のアダプター分子１１０が第２の液槽１０４Ｂ内で形成する立体構造とは、特に限定されないが、ナノポア１０１の直径より大きな外形を有する立体構造を意味する。立体構造の具体例としては、特に限定されないが、ヘアピン構造、グアニン四重鎖（Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ若しくはＧ４、Ｇカルテット）構造（例えばテロメア構造）、ＤＮＡナノボール構造、ＤＮＡオリガミ構造等を挙げることができる。また、当該立体構造は、一分子内でハイブリダイゼーションや、キレート構造を形成してできる構造でもよい。さらに、詳細を後述するが、当該立体構造にはナノポア１０１近傍において計測電圧が印加されるため、立体構造を維持する耐圧が計測電圧以上とすることが好ましい。ただし、立体構造を維持する耐圧が計測電圧未満であっても、タンパク質等を結合させることで耐圧を強化することも可能である。
【0065】
図１に示したような一本鎖ＤＮＡからなる生体分子－アダプター分子複合体１１２は、解析対象の二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性した後、それぞれ一本鎖の第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１を連結することで調製することができる。或いは、図２（Ａ）に示すように、解析対象の二本鎖ＤＮＡの一方端部に第１のアダプター分子１１０を連結するとともに他方端部に第２のアダプター分子１１１を連結し、その後、二本鎖ＤＮＡを変性することで一本鎖ＤＮＡからなる生体分子－アダプター分子複合体１１２を調製しても良い（図２（Ｃ））。このとき、第１のアダプター分子１１０は、上述した立体構造を形成する立体構造形成領域１１４を分子中に有している。すなわち、立体構造形成領域１１４は、上述したような、ヘアピン構造、グアニン四重鎖構造、ＤＮＡナノボール構造或いはＤＮＡオリガミ構造といった立体構造を形成するのに必要な塩基配列を含む領域である。
【0066】
また、図２（Ｃ）に示すように、立体構造形成領域１１４は、第２の液槽１０４Ｂ内に導入され立体構造を形成するまでの間に立体構造を形成することを防止するための立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有することが好ましい。立体構造形成抑制オリゴマー１１５は、立体構造形成領域１１４の少なくとも一部にハイブリダイズすることで、立体構造形成領域１１４が立体構造を形成することを防止できる。立体構造形成抑制オリゴマー１１５は、立体構造形成領域１１４全体に対してハイブリダイズできるヌクレオチド鎖でも良いし、立体構造形成領域１１４の一部であって立体構造の形成を防止するに足る部分にハイブリダイズできるヌクレオチド鎖であってもよい。例えば立体構造形成領域１１４がＧ四重鎖構造である場合、四重鎖を構成するグアニン残基に対してハイブリダイズできるヌクレオチド鎖を立体構造形成抑制オリゴマー１１５とすることができる。立体構造形成抑制オリゴマー１１５の塩基長としては、１０数個～表個程度とすることができ、１５～６０塩基長とすることがより好ましい。
【0067】
また、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１は、図２（Ｂ）に示すように、少なくとも、解析対象の二本鎖ＤＮＡと連結する端部にそれぞれ二本鎖領域１１６及び１１７を備える構成であっても良い。なお、図示しないが、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１は、全体を二本鎖としてもよい。これらいずれの場合でも、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１を解析対象の二本鎖ＤＮＡに連結した後、一本鎖に変性することで、一本鎖ＤＮＡからなる生体分子－アダプター分子複合体１１２を調製することができる（図２（Ｃ））。
【0068】
図２（Ｂ）には示していないが、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１における二本鎖領域１１６及び１１７は、生体分子１０９と連結する端部が３’突出末端（例えば、ｄＴ突出末端）とすることが好ましい。当該端部を３’ｄＴ突出末端とすることで、アダプター分子１１０と生体分子１０９とを連結する際に、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１のヘテロダイマーやホモダイマーの形成を防止することができる。
【0069】
さらにまた、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１において、二本鎖領域１１６及び１１７の長さ及び塩基配列は、特に限定されず、任意の長さ及び任意の塩基配列とすることができる。例えば、二本鎖領域１１６及び１１７の長さとしては、５～１００塩基長とすることができ、１０～８０塩基長とすることができ、１５～６０塩基長とすることができ、２０～４０塩基長とすることができる。
【0070】
また、図示しないが、第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と生体分子１０９とは間接的に連結しても良い。間接的に連結するとは、所定の塩基長の核酸断片を介して第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と生体分子１０９とを連結すること、生体分子１０９の種類に応じて導入される官能基を介して第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と生体分子１０９とを連結することを含む意味である。
【0071】
なお、解析対象の生体分子１０９が二本鎖ＤＮＡ断片である場合、二本鎖ＤＮＡ断片の一方の鎖を基準とし、基準とした鎖における５’末端に第１のアダプター分子１１０を結合し、当該鎖における３’末端に第２のアダプター分子１１１を結合する。ただし、これは逆でもよく、当該鎖における３’末端に第１のアダプター分子１１０を結合し、当該鎖における５’末端に第２のアダプター分子１１１を結合してもよい。
【0072】
ここで、第２のアダプター分子１１１における脱落防止部１１３とは、第１の液槽１０４Ａに存在する一本鎖の生体分子－アダプター分子複合体１１２がナノポア１０１を介して第２の液槽１０４Ｂに抜け落ちるのを防止する機能を有する構成を意味する。したがって、脱落防止部１１３として使用可能な分子としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジンやＤｉｇｏｘｉｇｅｉｎ（ＤＩＧ）に対する抗ＤＩＧ抗体とビーズとの複合体等を使用することができる。
【0073】
また、脱落防止部１１３は、ナノポア１０１の大きさ（直径）よりも十分大きいものとすることが好ましい。例えば、ナノポア１０１の径に対する脱落防止部１１３の大きさとしては、生体分子１０９の進行を止めることができる大きさであればよいが、例えば１．２～５０倍程度とすることが望ましい。より詳細には、生体分子１０９として一本鎖ＤＮＡを測定する場合、その直径が大凡１．５ｎｍであるため、ナノポア１０１の直径として１．５ｎｍ～２．５ｎｍ程度とすれば、ストレプトアビジン（径は大凡５ｎｍ）を脱落防止部１１３として使用することができる。なお、ストレプトアビジンを末端に結合させる際には、当該末端にビオチンを結合させておく。末端のビオチン化は市販のキットを使用することができる。また、ストレプトアビジンとしては、特に限定されないが、例えば、ビオチンとの結合部位を１箇所となるように変異を導入した変異型ストレプトアビジンでもよい。
【0074】
基板１０２は、基材１２０と、基材１２０の一主面に形成された薄膜１２１とから構成されている。ナノポア１０１は、薄膜１２１に形成されている。また、基板２０３は、図示しないが、絶縁層を有してもよい。基材１２０は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料を含む）から形成することができる。基材１２０を構成する電気的絶縁体材料の例としては、シリコン（ケイ素）、ケイ素化合物、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。ケイ素化合物としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、炭化ケイ素等、酸窒化ケイ素が挙げられる。特に、基材１２０は、これらの任意の材料から作製することができるが、例えばケイ素又はケイ素化合物であってよい。なお、ナノポア１０１は、中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオポア）であってもよい。
【0075】
基板１０２のサイズ及び厚さは、ナノポア１０１を設けることができるものであれば特に限定されるものではない。基板１０２は、当技術分野で公知の方法により作製することが可能で、あるいは市販品として入手することも可能である。例えば、基板１０２は、フォトリソグラフィ又は電子線リソグラフィ、及びエッチング、レーザブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、化学蒸着（ＣＶＤ）、誘電破壊、電子線若しくは収束イオンビーム等の技術を用いて作製することができる。なお、基板１０２は、表面への標的外の分子の吸着を避けるために、コーティングしてもよい。
【0076】
基板１０２は、少なくとも１つのナノポア１０１を有する。ナノポア１０１は、具体的には薄膜１２１に設けられるが、場合により、薄膜１２１及び基材１２０に設けてもよい。ここで、「ナノポア」及び「ポア」とは、ナノメートル（ｎｍ）サイズ（すなわち、１ｎｍ以上、１μｍ未満の直径を有する貫通孔であり、基板１０２を貫通して第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとを連通する孔である。
【0077】
基板１０２は、ナノポア１０１を設けるための薄膜１２１を有することが好ましい。すなわち、ナノサイズの孔を形成するのに適した材料及び厚さの薄膜１２１を基板１２０上に形成することによって、ナノポア１０１を簡便かつ効率的に基板１０２に設けることができる。ナノポア１０１形成の容易性から、薄膜１２１の材料は、例えば酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、金属酸化物、金属ケイ酸塩、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、グラフェン等が好ましい。薄膜１２１の厚さは、１Å（オングストローム）～２００ｎｍ、好ましくは１Å～１００ｎｍ、より好ましくは１Å～５０ｎｍ、例として約５ｎｍである。また、薄膜１２１（及び場合によっては基板１０２全体）は、実質的に透明であってもよい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ５０％以上、好ましくは８０％以上透過できることを意味する。また薄膜は、単層であっても複層であってもよい。
【0078】
なお、薄膜１２１上には、絶縁層を設けることも好ましい。絶縁層の厚みは好ましくは５ｎｍ～５０ｎｍである。絶縁層には任意の絶縁体材料を使用できるが、例えばケイ素又はケイ素化合物（窒化ケイ素、酸化ケイ素等）を使用することが好ましい。
【0079】
ナノポア１０１のサイズは、分析対象の生体高分子の種類によって適切なサイズを選択することができる。ナノポアは、均一な直径を有していてもよいが、部位により異なる直径を有してもよい。基板１０２の薄膜１２１に設けるナノポアは、最小直径部、すなわちナノポア１０１の有する最も小さい直径が、直径１００ｎｍ以下、例えば０．９ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは０．９ｎｍ～５０ｎｍ、例えば０．９ｎｍ～１０ｎｍであり、具体的には１ｎｍ以上５ｎｍ以下、３ｎｍ以上５ｎｍ以下等であることが好ましい。なお、ナノポア１０１は、基材１２０に形成された１μｍ以上の直径を有するポアと連結していてもよい。
【0080】
また、解析対象の生体分子が一本鎖の核酸（ＤＮＡ）である場合には、一本鎖ＤＮＡの直径が大凡１．４ｎｍであることから、ナノポア１０１の直径としては１．４ｎｍ～１０ｎｍ程度であることが好ましく、１．４ｎｍ～２．５ｎｍ程度であることがより好ましく、具体的にはおおよそ約１．６ｎｍとすることができる。解析対象の生体分子が二本鎖の核酸（ＤＮＡ）である場合には、二本鎖ＤＮＡの直径が大凡２．６ｎｍであることから、ナノポア１０１の直径としては３ｎｍ～１０ｎｍ程度であることが好ましく、３ｎｍ～５ｎｍ程度であることがより好ましい。さらに、ナノポア１０１の直径は、解析対象の生体高分子（例えばタンパク質、ポリペプチド、糖鎖等）の外径寸法に応じて、適宜設定することができる。
【0081】
ナノポア１０１の深さ（長さ）は、薄膜１２１又は基板１０２全体の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１０１の深さは、解析対象の生体分子を構成するモノマー単位の長さと揃えることが好ましい。例えば、解析対象の生体分子として核酸を選択する場合には、ナノポア１０１の深さは、塩基１個程度の大きさ、例えば約０．３ｎｍ程度とすることが好ましい。一方で、ナノポアの深さは、生体分子を構成するモノマー単位の２倍以上、３倍以上、５倍以上の大きさとすることができる。例えば、生体分子が核酸から構成されている場合には、ナノポアの深さは、塩基３個以上の大きさ、例えば約１ｎｍ以上であっても解析できる。これにより、ナノポアのロバスト性を維持しつつ、高精度な解析が可能となる。また、ナノポアの形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【0082】
さらに、ナノポア１０１は、基板１０２に少なくとも１つ設けることができ、複数のナノポア１０１を設ける場合に、規則的に配列してもよいしランダムに配置しても良い。ナノポア１０１は、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の電子ビームを照射することにより、ナノリソグラフィー技術又はイオンビームリソグラフィ技術等を使用することにより形成することができる。
【0083】
なお、図１に例示した装置は、一対の液槽１０４Ａと１０４Ｂとの間に１つのナノポア１０１を有しているが、これはあくまでも一例であり、一対の液槽１０４Ａと１０４Ｂとの間に複数のナノポア１０１を有する構成とすることもできる。また、他の例としては、基板１０２に複数個のナノポア１０１を形成し、複数個のナノポア１０１の各々の領域を隔壁で分離して構成されるアレイデバイスとすることも可能である。当該アレイデバイスにおいては、第１の液槽１０４Ａを共通槽とし、第２の液槽１０４Ｂを複数個の個別槽とすることができる。この場合、共通槽と個別槽のそれぞれに電極を配置することができる。
【0084】
ナノポアを有する薄膜を複数枚備えるアレイ型の装置構成の場合には、ナノポアを有する薄膜を規則的に配列することが好ましい。複数の薄膜を配置する間隔は、使用する電極、電気測定系の能力に応じて、０．１μｍ～１０μｍ、好ましくは０．５μｍ～４μｍとすることができる。
【0085】
なお、薄膜中にナノポアを形成する方法は、特に限定されるものではなく、例えば透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などを用いることができる。例えば“Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)”に記載されている方法を使用することができる。
【0086】
一方、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂとしては、特に限定されず、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム等の白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル等；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）、タングステン、タンタル等から作製することができる。
【0087】
以上のように構成された生体分子分析装置では、第１の液槽１０４Ａ内に生体分子－アダプター分子複合体１１２を含む電解質溶液１０３が充填された状態で、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位又はグランド電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成すると、図３に示すように、第１のアダプター１１０の末端（５’末端）がナノポア１０１方向に移動する（図３中矢印Ａの方向）。そして、図４に示すように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体１１２はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する（図４中矢印Ａの方向）。この図３の状態から図４の状態へと推移する際、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズしていた立体構造形成抑制オリゴマー１１５がナノポア１０１を通過することができずに引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。その結果、第２の液槽１０４Ｂ内に導入された立体構造形成領域１１４が立体構造（図４の例ではＧ四重鎖構造）を形成する。
【0088】
また、生体分子分析装置は、第１のアダプター１１０に立体構造を形成した生体分子－アダプター分子複合体１１２を、ナノポア１０１を介して第１の液槽１０４Ａから第２の液槽１０４Ｂへ移動させるが、電圧勾配を逆にすることで、図５に示したように、同生体分子－アダプター分子複合体１１２を、ナノポア１０１を介して第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａへ移動させることができる（図５中矢印Ｂの方向）。すなわち、図４に示したように、第１の液槽１０４Ａを負電位又はグランド電位とし、第２の液槽１０４Ｂを正電位として形成された電圧勾配によって図中矢印［Ａ］で示す方向に生体分子－アダプター分子複合体１１２を移動させることができる。逆に、図５に示したように、第２の液槽１０４Ｂを負電位又はグランド電位とし、第１の液槽１０４Ａを正電位として形成された電圧勾配によって図中矢印［Ｂ］で示す方向に生体分子－アダプター分子複合体１１２を移動させることができる。このように、生体分子分析装置は、第１のアダプター１１０に立体構造を形成した生体分子－アダプター分子複合体１１２を第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間で往復運動させることができる。このとき、第１のアダプター１１０に立体構造が形成されているため、図５中矢印Ｂの方向に生体分子－アダプター分子複合体１１２が移動したときに、当該立体構造により生体分子－アダプター分子複合体１１２がナノポア１０１から脱落することを防止できる。
【0089】
なお、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの間に形成する電圧勾配とは、負に帯電した核酸分子を移動させるため、いずれか一方を正電位とすれば良く、他方は負電位又はグランド電位とすれば良い。以下の説明において、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂのいずれか一方を正電位とし、他方を負電位とすると記載する場合、負電位とする側はグランド電位としても良いことは勿論である。
【0090】
また、図１の生体分子分析装置は、測定部１０６にて一対の電極１０５Ａ及び１０５Ｂの間に流れるイオン電流（封鎖信号）を測定し、コンピュータ１０８が測定されたイオン電流（封鎖信号）の値に基づいて生体分子－アダプター分子複合体１１２の配列情報を取得ことができる。なお、図１には示していないが、ナノポア１０１内に電極を設けることでトンネル電流を取得してトンネル電流に基づいて配列情報を取得すること、又はトランジスタ特性変化を検出することでも生体分子１０９の配列情報を得ることが可能である。
【0091】
ここで、より詳細に塩基配列情報の決定方法を説明する。塩基にはＡＴＧＣの４種類があるが、これらの塩基がナノポア１０１を通過するとその種類ごとに固有のイオン電流（封鎖電流）の値が観測される。そこで、予め、既知の配列を用いてナノポア１０１通過時のイオン電流を計測しておき、当該既知の配列に対応した電流値をコンピュータ１０８におけるメモリに記憶させておく。そして、解析対象の生体－アダプター分子複合体１１１を構成する塩基が順次、ナノポア１０１を通過する際に測定された電流値を、メモリに格納した既知の配列に対応した電流値と比較することで、解析対象の生体－アダプター分子複合体１１１を構成する塩基の種類を順次決定することができる。ここで、予めイオン電流を計測しておく既知の配列とは、ナノポア１０１の深さ（長さ）に相当する塩基数（例えば、２塩基の配列、３塩基の配列、又は５塩基の配列）とすることができる。
【0092】
また、生体分子１０９の塩基配列決定方法としては、生体分子１０９に蛍光体を標識し、ナノポア１０１近傍で励起させ、その発光蛍光を検出しても良い。さらに、参考文献１（ＮＡＮＯ ＬＥＴＴＥＲＳ（２００５），Ｖｏｌ．５，ｐｐ．４２１－４２４）に記載されている、ハイブリダイゼーションベースでの生体分子１０９の塩基配列を決定する方法を適用することもできる。
【0093】
上述した塩基配列情報の決定方法によって、図４に示した状態から図５に示した状態となるように、生体分子－アダプター分子複合体１１２を、ナノポア１０１を介して第１の液槽１０４Ａから第２の液槽１０４Ｂへ移動させる際に生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。また、生体分子－アダプター分子複合体１１２を、ナノポア１０１を介して第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間を往復運動する際に生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。
【0094】
なお、生体分子－アダプター分子複合体１１１を往復運動させる際、図４の矢印［Ａ］方向に移動するときのみ生体分子１０９の塩基配列情報を取得しても良いし、図５の矢印［Ｂ］方向に移動するときのみ生体分子１０９の塩基配列情報を取得しても良いし、図４の矢印［Ａ］方向及び図５の矢印［Ｂ］方向の両方で生体分子１０９の塩基配列情報を取得しても良い。図４の矢印［Ａ］方向に移動するときは、生体分子１０９の５’末端から３’末端に向かって塩基配列情報を決定し、図５の矢印［Ｂ］方向に移動するときは、生体分子１０９の３’末端から５’末端に向かって塩基配列情報を決定することとなる。いずれの場合でも、生体分子１０９について複数セットの塩基配列情報を取得することができ、塩基配列情報の正確性を向上させることができる。言い換えると、生体分子－アダプター分子複合体１１１を往復運動させることで、生体分子１０９の塩基配列を複数回読み取ることができ、読み取り精度を向上させることができる。
【0095】
また、上述した往復運動における印加電圧の切替えは、例えば、一定時間で自動的に切り替える方法を挙げることができる。この場合、コンピュータ１０８に電圧切替えのタイミングをプログラムしておき、当該プログラムに従って電圧源１０７を制御することで、当該タイミングで印加電圧を切替え、上述したような往復運動を行うことができる。
【0096】
或いは、上述した往復運動に際して読み取った塩基配列情報を用いて印加電圧の切替えを行うこともできる。例えば、第１のアダプター分子１１０に特徴的な配列や、塩基（ＡＧＣＴ）とは異なる封鎖電流を生じさせる領域を組み入れ、この特徴的な配列や当該領域の信号を読み取った段階で電圧を切り替える方法が挙げられる。塩基とは異なる封鎖電流を生じさせる領域とは、例えば、ペプチド核酸や人工核酸等の疑似核酸を含む領域を挙げることができる。上記特徴的な配列や、塩基とは異なる封鎖電流を生じさせる領域の信号を読み取ることで、生体分子１０９について塩基配列の読取りが終わり、ナノポア１０１に生体分子－アダプター分子複合体１１２の端部が近接していることを認識できる。よって、このタイミングで印加電圧を切替えることで、生体分子－アダプター分子複合体１１２の端部がナノポア１０１に接する前に、生体分子－アダプター分子複合体１１２を反対方向に移動させることができる。特に、第２の液槽１０４Ｂ内において、生体分子－アダプター分子複合体１１２の末端近傍に立体構造が形成されているため、生体分子－アダプター分子複合体１１２が図５の矢印Ｂ方向に移動する際にナノポア１０１から脱落することを確実に防止できる。これにより、上述した往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列を複数回読み取ることができ、読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0097】
以上のように、第１のアダプター分子１１０を使用することで、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に形成した電圧勾配によって、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間を生体分子－アダプター分子複合体１１２を確実に往復運動させることができる。なお、上述の例では、生体分子１０９として二本鎖核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）を例示したが、生体分子１０９としてはタンパク質（ペプチド鎖）や糖鎖であっても同様の原理によって分析対象とすることができる。
【0098】
なお、以上の説明では、図３～５に示したように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に形成した電圧勾配を制御することによって、生体分子－アダプター分子複合体１１２を往復運動させたが、生体分子－アダプター分子複合体１１２の移動制御はこの方式に限定されるものではない。いわゆる分子モータを用いることで生体分子－アダプター分子複合体１１２を第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間で移動させることができる。ここで、分子モータとは、生体分子－アダプター分子複合体１１２上を移動することができるタンパク質分子を意味する。このような機能を有する分子モータとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム及びヘリカーゼを挙げることができる。特に、本実施の形態では、分子モータとして、一本鎖ＤＮＡを鋳型として相補鎖を５’末端から３’末端方向に合成するＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【0099】
具体的には、図６に示すように、生体分子－アダプター分子複合体１１２を含む第１の液槽１０４Ａ内に分子モータ１３０及びプライマー１３１を存在させると、第２のアダプター分子１１１にプライマー１３１がハイブリダイズするとともに分子モータ１３０がその下流に結合する。言い換えると、プライマー１３１は、第２のアダプター分子１１１にハイブリダイズするように設計する。ここで、プライマー１３１は、特に限定されないが、例えば５～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは１８～２５塩基長の一本鎖ヌクレオチドとすることができる。
【0100】
次に、図７に示すように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に形成した電圧勾配によって、生体分子－アダプター分子複合体１１２が矢印Ａの方向に移動し、分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。ここで分子モータ１３０の寸法Ｄｍはナノポア１０１の直径Ｄｎよりも大きいため（Ｄｍ＞Ｄｎ）、分子モータ１３０がナノポア１０１の入口（第１の液槽１０４Ａ側）に到達すると、ナノポア１０１を通過して出口側（第２の液槽１０４Ｂ側）に進むことはできず、ナノポア１０１の入口に止まる。
【0101】
そして、図８に示すように、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、生体分子－アダプター分子複合体１１２が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、生体分子－アダプター分子複合体１１２が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、生体分子－アダプター分子複合体１１２は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向（図８中矢印Ｂの方向）に搬送される。このとき、上述したように、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体１１２の塩基配列情報を取得することができる。
【0102】
このように分子モータ１３０を用いて生体分子－アダプター分子複合体１１２の搬送を制御することで、ナノポア通過速度を１塩基辺り１００μｓ以上にすることができ、各塩基由来の封鎖電流を十分に計測することが可能となる。
【0103】
このように、図６～８に示すように、分子モータ１３０を利用して生体分子－アダプター分子複合体１１２の搬送を制御する方法においても、生体分子－アダプター分子複合体１１２の端部近傍に立体構造が形成されているため、生体分子－アダプター分子複合体１１２が図８の矢印Ｂ方向に移動する際にナノポア１０１から脱落することを確実に防止できる。
【0104】
［第１－２の実施形態］
本実施の形態では、図１等に示した第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と異なる、図９に示すようなアダプター分子２００を説明する。なお、図９に例示的に示すアダプター分子２００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図１等に示した第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施の形態では、図１等に示した第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と異なる、図９に示すようなアダプター分子２００を説明する。なお、図９に例示的に示すアダプター分子２００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図１等に示した第１のアダプター分子１１０及び第２のアダプター分子１１１と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0105】
図９に示したアダプター分子２００は、生体分子１０９に直接的に結合する二本鎖核酸領域２０１と、二本鎖核酸領域２０１における生体分子１０９と結合した端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂとを備える。なお、一本鎖核酸領域２０２Ａは３’末端に結合した脱落防止部１１３を有し、一本鎖核酸領域２０２Ｂは５’末端を有する。また、図９に示したアダプター分子２００は、一本鎖核酸領域２０２Ｂに立体構造形成領域１１４を有している。さらに、図９に示したアダプター分子２００は、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズした立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有することが好ましい。図９に示した例では、脱落防止部１１３が３’末端を有する一本鎖核酸領域２０２Ａの端部に配置され、一本鎖核酸領域２０２Ｂに立体構造形成領域１１４が配置されている。しかし、脱落防止部１１３は、一本鎖核酸領域２０２Ａの端部ではなく、５’末端を有する一本鎖核酸領域２０２Ｂの端部に配置され、一本鎖核酸領域２０２Ａに立体構造形成領域１１４を配置してもよい。
【0106】
なお、第１の液槽１０４Ａ内に充填された電解質溶液１０３に生体分子１０９、アダプター分子２００及びＤＮＡリガーゼを添加することで、第１の液槽１０４Ａ内に充填された電解質溶液１０３内で生体分子－アダプター分子複合体２０３を形成することができる。
【0107】
また、図示しないが、アダプター分子２００と生体分子１０９とは間接的に連結しても良い。間接的に連結するとは、所定の塩基長の核酸断片を介してアダプター分子２００と生体分子１０９とを連結すること、生体分子１０９の種類に応じて導入される官能基を介してアダプター分子２００と生体分子１０９とを連結することを含む意味である。
【0108】
さらに、アダプター分子２００は、二本鎖核酸領域２０１における生体分子１０９と連結する端部が３’突出末端（例えば、ｄＴ突出末端）とすることが好ましい。当該端部を３’ｄＴ突出末端とすることで、アダプター分子２００と生体分子１０９とを連結する際にアダプター分子２００のダイマー形成を防止することができる。
【0109】
さらにまた、アダプター分子２００において、二本鎖核酸領域２０１の長さ及び塩基配列は、特に限定されず、任意の長さ及び任意の塩基配列とすることができる。例えば、二本鎖核酸領域２０１の長さとしては、５～１００塩基長とすることができ、１０～８０塩基長とすることができ、１５～６０塩基長とすることができ、２０～４０塩基長とすることができる。
【0110】
さらにまた、アダプター分子２００において、一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂの長さ及び塩基配列は特に限定されず、任意の長さ及び任意の塩基配列とすることができる。なお、一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂは、互いに同じ長さであっても良いし、異なる長さであっても良い。一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂは、互いに共通する塩基配列を有していても良いし、互いに非相補的であれば全く異なる塩基配列を有していても良い。非相補的であるとは、一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂの塩基配列全体において相補的な配列の割合が３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下、最も好ましくは３％以下であることを意味する。
【0111】
一本鎖核酸領域２０２Ａ及び２０２Ｂの長さとしては、例えば、１０～２００塩基長とすることができ、２０～１５０塩基長とすることができ、３０～１００塩基長とすることができ、５０～８０塩基長とすることができる。また、立体構造形成領域１１４を有する一本鎖核酸領域２０２Ｂは、立体構造形成領域１１４よりも５’末端側の塩基配列（例えば２０塩基長）を９０％以上がチミンからなる塩基配列、好ましくは１００％チミンからなる塩基配列とすることができる。立体構造形成領域１１４よりも５’末端側の塩基配列におけるチミンの割合をこの範囲とすることで、高次構造の形成を防止できナノポア１０１に導入しやすい形状とすることができる。
【0112】
以上のように構成された、図９に示したアダプター分子２００を有する生体分子－アダプター分子複合体２０３は、図１に示した生体分子分析装置により分析することができる。先ず、図１０に示すように、第１の液槽１０４Ａ内に、生体分子－アダプター分子複合体２０３を含む電解質溶液１０３が充填された状態で、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成すると、脱落防止部１１３を有しない一本鎖核酸領域２０２Ｂの端部がナノポア１０１内に臨む。そして、さらに電圧勾配により、図１１に示すように、生体分子－アダプター分子複合体２０３はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。この図１０の状態から図１１の状態へと推移する際、生体分子－アダプター分子複合体２０３における二本鎖の核酸（アダプター分子２００における二本鎖核酸領域２０１と生体分子１０９、立体構造形成領域１１４と立体構造形成抑制オリゴマー１１５）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。
【0113】
このように、アダプター分子２００を使用することによって、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子２０２を使用することによって二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。そして、立体構造形成領域１１４を有する一本鎖核酸領域２０２Ｂが第２の液槽１０４Ｂに導入されると、立体構造形成領域１１４において立体構造が形成される。
【0114】
また、生体分子分析装置は、図１１に示したように、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体２０３を、ナノポア１０１を介して第１の液槽１０４Ａから第２の液槽１０４Ｂへ移動させるが、電圧勾配を逆にすることで、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体２０３を、ナノポア１０１を介して第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａへ移動させることができる。すなわち、図１２Ａに示したように、第１の液槽１０４Ａを負電位とし、第２の液槽１０４Ｂを正電位として形成された電圧勾配によって図中矢印［Ａ］で示す方向に生体分子－アダプター分子複合体２０３を移動させることができる。逆に、図１２Ｂに示したように、第２の液槽１０４Ｂを負電位とし、第１の液槽１０４Ａを正電位として形成された電圧勾配によって図中矢印［Ｂ］で示す方向に生体分子－アダプター分子複合体２０３を移動させることができる。このように、生体分子分析装置は、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電圧勾配を制御することで、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体２０３を第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間で往復運動させることができる。
【0115】
特に、第２の液槽１０４Ｂ内において、生体分子－アダプター分子複合体２０３の末端近傍に立体構造が形成されているため、生体分子－アダプター分子複合体２０３が図１２Ｂの矢印Ｂ方向に移動する際にナノポア１０１から脱落することを確実に防止できる。これにより、上述した往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列を複数回読み取ることができ、読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0116】
［第１－３の実施形態］
本実施の形態では、図１及び図９等に示した第１のアダプター分子１１０、第２のアダプター分子１１１及びアダプター分子２００と異なる、図１３に示すようなアダプター分子３００を説明する。なお、図１３に例示的に示すアダプター分子３００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図１及び図９等に示した第１のアダプター分子１１０、第２のアダプター分子１１１及びアダプター分子２００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施の形態では、図１及び図９等に示した第１のアダプター分子１１０、第２のアダプター分子１１１及びアダプター分子２００と異なる、図１３に示すようなアダプター分子３００を説明する。なお、図１３に例示的に示すアダプター分子３００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図１及び図９等に示した第１のアダプター分子１１０、第２のアダプター分子１１１及びアダプター分子２００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0117】
図１３に示すアダプター分子３００は、生体分子１０９に結合する二本鎖核酸領域２０１と、二本鎖核酸領域２０１における生体分子１０９と結合する端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域３０１Ａ及び３０１Ｂと、一本鎖核酸領域３０１Ａの末端に配された脱落防止部１１３とを備える。なお、一本鎖核酸領域３０１Ａは３’末端を有し、一本鎖核酸領域３０１Ｂは５’末端を有する。また、図１３に示したアダプター分子３００は、一本鎖核酸領域３０１Ｂに立体構造形成領域１１４を有している。さらに、図１３に示したアダプター分子３００は、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズした立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有することが好ましい。
【0118】
図１３に示すアダプター分子３００における一本鎖核酸領域３０１Ａは、分子モータが結合しうる分子モータ結合部３０２を有している。また、図１３に示すアダプター分子３００における一本鎖核酸領域３０１Ａは、分子モータ結合部３０２の３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部３０３を有している。プライマー結合部３０３は、使用するプライマーの塩基配列と相補的な配列を有していればよく、具体的な塩基配列に限定されない。ここで、プライマーとは、特に限定されないが、例えば５～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは１８～２５塩基長の一本鎖ヌクレオチドとすることができる。したがって、プライマー結合部３０３は、１０～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは１８～２５塩基長の領域であってプライマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる領域とすることができる。
【0119】
さらに、図１３に示すアダプター分子３００における一本鎖核酸領域３０１Ａは、分子モータ結合部３０２とプライマー結合部３０３との間にスペーサ３０４を有している。ここでスペーサ３０４とは、分子モータが結合できない領域、すなわちＡＧＣＴからなる塩基を含まない領域を意味する。スペーサ３０４としては、特に限定されないが、塩基を含まない、直鎖状連結体とすることができる。特にスペーサ３０４の長さは、少なくとも２塩基に相当する長さ、すなわち約０．６×２ｎｍ以上とすることが好ましい。換言すると、スペーサ３０４により、分子モータ結合部３０２とプライマー結合部３０３との間を２塩基以上（約０．６×２ｎｍ以上）離間させることができる。スペーサ３０４を構成する材料としては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＣ３ Ｓｐｃｅｒ、ＰＣ ｓｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８及びｄＳｐａｃｅｒ等のＤＮＡ鎖中に配置できる材料を挙げることができる。その他にも、スペーサ３０４としては直鎖状炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸及び直鎖状糖鎖等を使用することができる。
【0120】
さらにまた、図１３に示すアダプター分子３００は、二本鎖核酸領域２０１における所定の領域を標識配列（図示せず）とすることができる。標識配列とは、バーコード配列やインデックス配列とも呼称され、アダプター分子３００に固有の塩基配列を意味する。例えば、標識配列のみが相違する複数のアダプター分子３００を用意しておくことで、標識配列に基づいて使用したアダプター分子３００の種類を特定することができる。
【0121】
【0122】
先ず、生体分子１０９の両端部にそれぞれアダプター分子３００を結合した生体分子－アダプター分子複合体３０５を準備する。第１の液槽１０４Ａ内に、当該生体分子－アダプター分子複合体３０５、分子モータ１３０、プライマー１３１及び立体構造形成抑制オリゴマー１１５を含む電解質溶液を充填する。これにより、図１４Ａに示すように、アダプター分子３００における分子モータ結合部３０２に分子モータ１３０が結合し、プライマー結合部３０３にプライマー１３１がハイブリダイズし、一本鎖核酸領域３０１Ｂの立体構造形成領域１１４に立体構造形成抑制オリゴマー１１５がハイブリダイズする。
【0123】
次に、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、一本鎖核酸領域３０１Ｂがナノポア１０１方向に移動し、立体構造形成抑制オリゴマー１１５がハイブリダイズしていない５’末端領域がナノポア１０１内に導入される。そして、図１４Ｂに示すように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体３０５はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。このとき、生体分子－アダプター分子複合体３０５における二本鎖の核酸（アダプター分子３００における二本鎖核酸領域２０１と生体分子１０９、立体構造形成抑制オリゴマー１１５と立体構造形成領域１１４）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。
【0124】
このように、アダプター分子３００を使用した場合でも、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子３００を使用した場合でも二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。なお、図１４Ａ及びＢに示した状態では、プライマー１３１と分子モータ１３０とがスペーサ３０４の長さ離間しているため、プライマー１３１の３’末端を起点とした、分子モータ１３０による相補鎖合成反応は開始されない。そして、立体構造形成領域１１４を有する一本鎖核酸領域３０１Ｂが第２の液槽１０４Ｂに導入されると、立体構造形成領域１１４において立体構造が形成される。
【0125】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図１５Ａに示すように、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５がナノポア１０１を通過し、その後、分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５は負電荷を帯びているため、さらに下流方向に進み、スペーサ３０４を中心に形状変化を起こす。すると、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端と接触し、結合する（図１５Ｂ）。これにより、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。なお、図１５Ａ～Ｈにおいて白抜きの矢印は負極から正極に向かう電位勾配を意味している。
【0126】
そして、図１５Ｃに示すように、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向（図１５Ｃ中矢印Ｍの方向）に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体３０５の塩基配列情報を取得することができる。
【0127】
そして、図１５Ｄに示すように、生体分子－アダプター分子複合体３０５の一本鎖核酸領域３０１Ｂに形成された立体構造がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止する。分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止した段階で、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とする。その結果、図１５Ｅに示すように、生体分子－アダプター分子複合体３０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する（図１５Ｅ中矢印Ｍの方向）。このとき、分子モータ１３０によって合成された生体分子－アダプター分子複合体３０５の相補鎖３０６が生体分子－アダプター分子複合体３０５から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）とともに、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体３０５から乖離する。
【0128】
なお、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とするタイミングは、一定時間で自動的に切り替える方法や、読み取った塩基配列情報を用いて切り替える方法とすることもできる。あるいは、立体構造がナノポア１０１に近接すると封鎖電流の減少が計測できるため、封鎖電流の減少を検知した段階で第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位としてもよい。これらいずれの方法でも、一本鎖核酸領域３０１Ｂに立体構造を形成させることで、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５全体がナノポア１０１を通過することを防止することができる。
【0129】
そして、次に、図１５Ｆに示すように、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂに印加する電圧を反転し、第１の液槽１０４Ａを正電位とし第２の液槽１０４Ｂを負電位とする電位勾配を形成する。これにより、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体３０５を、ナノポア１０１を介して第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａ方向へ移動させることができる。
【0130】
その後、図１５Ｇに示すように、第１の液槽１０４Ａに充填された電解質溶液１０３に分子モータ１３０及びプライマー１３１を添加し、プライマー結合部３０３にプライマー１３１をハイブリダイズさせ、分子モータ結合部３０２に分子モータ１３０を結合させる。その後、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂに印加する電圧を再び反転し、第１の液槽１０４Ａを負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、プライマー１３１がハイブリダイズし、分子モータ１３０が結合した生体分子－アダプター分子複合体３０５を、第２の液槽１０４Ｂ方向へ移動させる。そして、図１５Ｂに示したように、スペーサ３０４を中心とした形状変化が生じ、分子モータ１３０にプライマー１３１の３’末端と接触する状態を形成する。すなわち、図１５Ａ～Ｇを繰り返すことによって、分子モータ１３０による搬送動作毎にシーケンシングすることができる。
【0131】
なお、参考文献（Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；５（１１）：７９８－８０６）によれば、分子モータ１３０を用いた計測（ナノポア１０１の直径１．４ｎｍ）では、少なくとも８０ｍＶ以上の電圧をかけながら計測することが示唆されている。この場合、参考文献（Ｎａｔｕｒｅ ｐｈｙｓｉｃｓ，５，３４７－３５１，２００９．）によれば、大凡２４ｐＮの力がかかること示唆されている。したがって、本実施形態において、脱落防止部１１３は、８０ｍＶの電圧で測定する場合には２４ｐＮ以上の結合力で一本鎖核酸領域３０１Ａに結合することが好ましい。
【0132】
特に、第２の液槽１０４Ｂ内において、生体分子－アダプター分子複合体３０５の末端近傍に立体構造が形成されているため、生体分子－アダプター分子複合体３０５が第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａの方向に移動する際にナノポア１０１から脱落することを確実に防止できる。これにより、上述した往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列を複数回読み取ることができ、読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0133】
［第２－１の実施形態］
本実施形態では、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子と異なり、複数のプライマー結合部位および当該プライマー結合部位に対応する分子モータ結合部を有するアダプター分子について説明する。本実施形態で説明するアダプター分子等において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施形態では、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子と異なり、複数のプライマー結合部位および当該プライマー結合部位に対応する分子モータ結合部を有するアダプター分子について説明する。本実施形態で説明するアダプター分子等において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0134】
図１６は、本実施形態に係るアダプター分子４００を有する生体分子－アダプター分子複合体４０１を分析する生体分子分析装置１００を示している。生体分子分析装置１００は、生体分子－アダプター分子複合体４０１を分析する装置であって、封鎖電流方式にてイオン電流を測定する生体分子分析用デバイスである。生体分子分析装置１００は、ナノポア１０１が形成された基板１０２と、基板１０２を挟んで基板１０２と接するように配置され、その内部に電解質溶液１０３が満たされた一対の液槽１０４（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）と、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの各々に接する一対の電極１０５（第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂ）とを備える。測定時には、一対の電極１０５の間に電圧源１０７から所定の電圧が印加され、一対の電極１０５の間に電流が流れる。電極１０５の間に流れる電流の大きさは、電流計１０６により計測され、その計測値はコンピュータ１０８により分析される。
【0135】
本実施形態に示すアダプター分子４００は、図１７（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、分子モータ１３０が結合しうる分子モータ結合部４０２と、当該分子モータ結合部４０２より３’末端側にプライマー１３１がハイブリダイズしうるプライマー結合部４０３との組を複数有している。なお、アダプター分子４００としては、図１７（Ａ）に示すように、一本鎖ＤＮＡからなるものでも良いし、図１７（Ｂ）に示すように、解析対象の生体分子１０９が二本鎖ＤＮＡである場合、当該生体分子１０９と連結する端部を二本鎖ＤＮＡとしても良い。また、アダプター分子４００は、一方端部（例えば３’末端）に脱落防止部１１３を備えることが好ましい。
【0136】
ここで、分子モータ結合部４０２とプライマー結合部位４０３との組合せの数は、複数（２以上）であれば特に限定されないが、例えば２～１０組とすることができ、２～５組とすることがより好ましい。これら分子モータ結合部４０２とプライマー結合部位４０３との組合せの数は、生体分子１０９の塩基配列を読み取る回数に対応する。このため、生体分子１０９の塩基配列を読み取る回数を予め決定しておき、この回数に対応するように、分子モータ結合部４０２とプライマー結合部位４０３との組合せの数を設定することもできる。
【0137】
以上のように構成されたアダプター分子４００を用いた生体分子１０９の分析方法を、図１８～２１を用いて説明する。
【0138】
先ず、生体分子１０９の一方端部にアダプター分子４００を結合した生体分子－アダプター分子複合体４０１を準備する。第１の液槽１０４Ａ内に、当該生体分子－アダプター分子複合体４０１、分子モータ１３０及びプライマー１３１を含む電解質溶液を充填する。これにより、アダプター分子４００における複数の分子モータ結合部４０２にそれぞれ分子モータ１３０が結合し、複数のプライマー結合部４０３にそれぞれプライマー１３１がハイブリダイズする。
【0139】
次に、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、図１８に示すように、生体分子－アダプター分子複合体４０１におけるアダプター分子４００が結合していない端部がナノポア１０１方向に移動し、ナノポア１０１内に導入される。そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体４０１はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。図示しないが、第２の液槽１０４Ｂの電解質溶液１０３に脱落防止部１１３を添加することで、第２の液槽１０４Ｂに移動した生体分子－アダプター分子複合体４０１の端部に脱落防止部１１３を付加することができる。
【0140】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図１９に示すように、生体分子－アダプター分子複合体４０１がナノポア１０１を通過し、その後、生体分子１０９に最も近い位置にある分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0141】
そして、図２０に示すように、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、生体分子－アダプター分子複合体４０１が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、生体分子－アダプター分子複合体４０１が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、生体分子－アダプター分子複合体４０１は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向（図２０中矢印Ｂの方向）に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体４０１の塩基配列情報を取得することができる。
【0142】
そして、図２０に示すように、生体分子－アダプター分子複合体４０１における第２の液槽１０４Ｂに位置する端部に結合した脱落防止部１１３がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止する。分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止した段階で、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とする。その結果、図２１に示すように、生体分子－アダプター分子複合体４０１が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する（図２１中矢印Ａの方向）。このとき、分子モータ１３０によって合成された生体分子－アダプター分子複合体４０１の相補鎖４０４が生体分子－アダプター分子複合体４０１から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）とともに、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体４０１から乖離する。
【0143】
なお、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とするタイミングは、一定時間で自動的に切り替える方法や、読み取った塩基配列情報を用いて切り替える方法とすることもできる。あるいは、脱落防止部１１３がナノポア１０１に近接すると封鎖電流の減少が計測できるため、封鎖電流の減少を検知した段階で第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位としてもよい。これらいずれの方法でも、脱落防止部１１３により生体分子－アダプター分子複合体４０１全体がナノポア１０１を通過し、脱落することを防止できる。
【0144】
そして、相補鎖４０４及び分子モータ１３０が引き剥がされた後、図２１に示すように、生体分子１０９に最も近い位置にある次の分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端から相補鎖合成反応を開始する。すなわち、図２０に示したように、次の分子モータ１３０によって生体分子－アダプター分子複合体４０１が電位勾配に逆らって再び第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体４０１の塩基配列情報を再び取得することができる。
【0145】
以上のようにアダプター分子４００に結合した分子モータ１３０及びプライマー１３１の組の数に応じて複数回、塩基配列情報を取得することができる。このアダプター分子４００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に印加した電圧を反転させる制御や、一回の測定後に再び分子モータ１３０及びプライマー１３１を結合させる工程を行うことなく、上述した一連の処理によって生体分子１０９の塩基配列情報を複数回取得することができる。すなわち、このアダプター分子４００を使用した場合には、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0146】
［第２－２の実施形態］
本実施形態では、図１６等に示したアダプター分子４００とは異なる、図２２に示すアダプター分子５００について説明する。アダプター分子５００において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子やアダプター分子４００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施形態では、図１６等に示したアダプター分子４００とは異なる、図２２に示すアダプター分子５００について説明する。アダプター分子５００において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子やアダプター分子４００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0147】
図２２に示したアダプター分子５００は、生体分子１０９に直接的に結合する二本鎖核酸領域５０１と、二本鎖核酸領域５０１における生体分子１０９と結合する端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域５０２Ａ及び５０２Ｂとを備える。また、図２２に示したアダプター分子５００は、一本鎖核酸領域５０２Ａに複数組の分子モータ結合部５０３及びプライマー結合部５０４を有している。一本鎖核酸領域５０２Ｂは５’末端を有し、一本鎖核酸領域５０２Ａは３’末端を有している。なお、一本鎖核酸領域５０２Ａの末端には脱落防止部１１３を備えることが好ましい。
【0148】
また、一本鎖核酸領域５０２Ｂの長さ及び塩基配列は、特に限定されず、任意の長さ及び任意の塩基配列とすることができる。なお、一本鎖核酸領域５０２Ａ及び５０２Ｂは、互いに同じ長さであっても良いし、異なる長さであっても良い。ここで、一本鎖核酸領域５０２Ａ及び５０２Ｂが互いに非相補的であるとは、一本鎖核酸領域５０２Ａ及び５０２Ｂの塩基配列全体において相補的な配列の割合が３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、更に好ましくは５％以下、最も好ましくは３％以下であることを意味する。
【0149】
一本鎖核酸領域５０２Ｂの長さとしては、例えば、１０～２００塩基長とすることができ、２０～１５０塩基長とすることができ、３０～１００塩基長とすることができ、５０～８０塩基長とすることができる。一例としては、特に、５’末端を有する一本鎖核酸領域５０２Ｂは、９０％以上がチミンからなる塩基配列、好ましくは１００％チミンからなる塩基配列とすることができる。５’末端を有する一本鎖核酸領域５０２Ｂにおけるチミンの割合をこの範囲とすることで、高次構造の形成を防止できナノポア１０１に導入しやすい形状を維持することができる。
【0150】
なお、第１の液槽１０４Ａ内に充填された電解質溶液１０３に生体分子１０９、アダプター分子５００及びＤＮＡリガーゼを添加することで、図２３に示すように、第１の液槽１０４Ａ内に充填された電解質溶液１０３内で生体分子－アダプター分子複合体５０５を形成してもよい。
【0151】
また、図示しないが、アダプター分子５００と生体分子１０９とは間接的に連結しても良い。間接的に連結するとは、所定の塩基長の核酸断片を介してアダプター分子５００と生体分子１０９とを連結すること、生体分子１０９の種類に応じて導入される官能基を介してアダプター分子５００と生体分子１０９とを連結することを含む意味である。
【0152】
さらに、アダプター分子５００は、二本鎖核酸領域５０１における生体分子１０９と連結する端部が３’突出末端（例えば、ｄＴ突出末端）とすることが好ましい。当該端部を３’ｄＡ突出末端とすることで、アダプター分子５００と生体分子１０９とを連結する際にアダプター分子５００のダイマー形成を防止することができる。
【0153】
さらにまた、アダプター分子５００において、二本鎖核酸領域５０１の長さ及び塩基配列は、特に限定されず、任意の長さ及び任意の塩基配列とすることができる。例えば、二本鎖核酸領域５０１の長さとしては、５～１００塩基長とすることができ、１０～８０塩基長とすることができ、１５～６０塩基長とすることができ、２０～４０塩基長とすることができる。
【0154】
以上のように構成された、図２２に示したアダプター分子５００を有する生体分子－アダプター分子複合体５０５は、図１６に示した生体分子分析装置により分析することができる。先ず、図示しないが、第１の液槽１０４Ａ内に、生体分子－アダプター分子複合体５０５、分子モータ１３０及びプライマー１３１を含む電解質溶液１０３が充填される。これにより、図２３に示すように、第１の液槽１０４Ａ内において生体分子－アダプター分子複合体５０５に、複数組の分子モータ１３０及びプライマー１３１が結合する。この状態で、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成すると、一本鎖核酸領域５０２Ｂの端部（一本鎖の核酸）がナノポア１０１内に臨む。そして、さらに電圧勾配により、図２４に示すように、生体分子－アダプター分子複合体５０５はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。この図２３の状態から図２４の状態へと推移する際、生体分子－アダプター分子複合体５０５における二本鎖の核酸（アダプター分子５００における二本鎖核酸領域５０１と生体分子１０９）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。
【0155】
このように、アダプター分子５００を使用することによって、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子５００を使用することによって二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。そして、図２４に示したように、第２の液槽１０４Ｂの電解質溶液１０３に脱落防止部１１３を添加することで、第２の液槽１０４Ｂに移動した生体分子－アダプター分子複合体５０５の端部に脱落防止部１１３を付加することができる。
【0156】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図２４に示すように、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体５０５がナノポア１０１を通過し、その後、生体分子１０９に最も近い位置にある分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0157】
そして、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体５０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、生体分子－アダプター分子複合体５０５が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、生体分子－アダプター分子複合体５０５は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体５０５の塩基配列情報を取得することができる。
【0158】
そして、図２５に示すように、生体分子－アダプター分子複合体５０５における第２の液槽１０４Ｂに位置する端部に結合した脱落防止部１１３がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止する。分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止した段階で、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とする。その結果、図２６に示すように、生体分子－アダプター分子複合体５０が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する。このとき、分子モータ１３０によって合成された生体分子－アダプター分子複合体５０５の相補鎖５０６が生体分子－アダプター分子複合体５０５から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）とともに、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体５０５から乖離する。
【0159】
なお、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とするタイミングは、一定時間で自動的に切り替える方法や、読み取った塩基配列情報を用いて切り替える方法とすることもできる。あるいは、脱落防止部１１３がナノポア１０１に近接すると封鎖電流の減少が計測できるため、封鎖電流の減少を検知した段階で第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位としてもよい。これらいずれの方法でも、脱落防止部１１３により生体分子－アダプター分子複合体５０５全体がナノポア１０１を通過し、脱落することを防止できる。
【0160】
そして、相補鎖５０６及び分子モータ１３０が引き剥がされた後、図２６に示すように、生体分子１０９に最も近い位置にある次の分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。すなわち、図２７に示したように、次の分子モータ１３０によって生体分子－アダプター分子複合体５０５が電位勾配に逆らって再び第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体５０５の塩基配列情報を再び取得することができる。
【0161】
以上のようにアダプター分子５００に結合した分子モータ１３０及びプライマー１３１の組の数に応じて、生体分子１０９の塩基配列情報を複数回取得することができる。このアダプター分子５００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に印加した電圧を反転させる制御や、一回の測定後に再び分子モータ１３０及びプライマー１３１を結合させる工程を行うことなく、上述した一連の処理によって複数回、生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。すなわち、このアダプター分子５００を使用した場合には、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0162】
［第２－３の実施形態］
本実施形態では、図１６等に示したアダプター分子４００、図２２等に示したアダプター分子５００とは異なるアダプター分子について説明する。本項において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子やアダプター分子４００又は５００と同じ構成については同じ符号を付すことで、その詳細な説明を省略する。
本実施形態では、図１６等に示したアダプター分子４００、図２２等に示したアダプター分子５００とは異なるアダプター分子について説明する。本項において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子やアダプター分子４００又は５００と同じ構成については同じ符号を付すことで、その詳細な説明を省略する。
【0163】
図２８に示すようにアダプター分子６００は、生体分子１０９に結合する二本鎖核酸領域６０１と、二本鎖核酸領域６０１における生体分子１０９と結合する端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域６０１Ａ及び６０１Ｂとを備える。一本鎖核酸領域６０１Ａは３’末端を有し、一本鎖核酸領域６０１Ｂは５’末端を有する。なお、一本鎖核酸領域６０１Ａの３‘末端は脱落防止部１１３とを備えることが好ましい。また、図２８に示したアダプター分子６００は、一本鎖核酸領域６０１Ｂに立体構造形成領域１１４を有している。さらに、図２８に示したアダプター分子６００は、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズした立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有することが好ましい。
【0164】
図２８に示すアダプター分子６００における一本鎖核酸領域６０１Ａは、分子モータ１３０が結合しうる複数の分子モータ結合部６０２を有している。また、図２８に示すアダプター分子６００における一本鎖核酸領域６０１Ａは、分子モータ結合部６０２の３’末端側にプライマー１３１がハイブリダイズしうる複数のプライマー結合部６０３を有している。すなわち、図２８に示したアダプター分子６００は、一本鎖核酸領域６０１Ａに複数組の分子モータ結合部６０２及びプライマー結合部５０３を有している。
【0165】
さらに、図２８に示すアダプター分子６００における一本鎖核酸領域６０１Ａは、複数組の分子モータ結合部６０２とプライマー結合部６０３との間のそれぞれにスペーサ６０４を有している。ここでスペーサ６０４とは、分子モータ１３０が結合できない領域、すなわちＡＧＣＴからなる塩基を含まない領域を意味する。スペーサ６０４としては、特に限定されないが、塩基を含まない、直鎖状連結体とすることができる。特にスペーサ６０４の長さは、少なくとも２塩基に相当する長さ、すなわち約０．６×２ｎｍ以上とすることが好ましい。換言すると、スペーサ６０４により、分子モータ結合部６０２とプライマー結合部６０３との間を２塩基以上（約０．６×２ｎｍ以上）離間させることができる。スペーサ６０４を構成する材料としては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＣ３ Ｓｐｃｅｒ、ＰＣ ｓｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８及びｄＳｐａｃｅｒ等のＤＮＡ鎖中に配置できる材料を挙げることができる。その他にも、スペーサ６０４としては直鎖状炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸及び直鎖状糖鎖等を使用することができる。
【0166】
さらにまた、図２８に示すアダプター分子６００は、二本鎖核酸領域６０１における所定の領域を標識配列（図示せず）とすることができる。標識配列とは、バーコード配列やインデックス配列とも呼称され、アダプター分子６００に固有の塩基配列を意味する。例えば、標識配列のみが相違する複数のアダプター分子６００を用意しておくことで、標識配列に基づいて使用したアダプター分子６００の種類を特定することができる。
【0167】
なお、図２８に示したアダプター分子６００は、生体分子１０９と連結した生体分子－アダプター分子複合体６０５を形成しており、分子モータ１３０及びプライマー１３１が結合した状態を示している。図２８に示した状態で、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、図２９に示すように、一本鎖核酸領域６０１Ｂがナノポア１０１方向に移動し、立体構造形成抑制オリゴマー１１５がハイブリダイズしていない５’末端領域がナノポア１０１内に導入される。そして、図３０に示すように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体６０５はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。このとき、生体分子－アダプター分子複合体６０５における二本鎖の核酸（アダプター分子６００における二本鎖核酸領域６０１と生体分子１０９、立体構造形成抑制オリゴマー１１５と立体構造形成領域１１４）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。
【0168】
このように、アダプター分子６００を使用した場合でも、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子６００を使用した場合でも二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。なお、図３０に示した状態では、プライマー１３１と分子モータ１３０とがスペーサ６０４の長さ離間しているため、プライマー１３１の３’末端からの分子モータ１３０による相補鎖合成反応は開始されない。そして、立体構造形成領域１１４を有する一本鎖核酸領域６０１Ｂが第２の液槽１０４Ｂに導入されると、立体構造形成領域１１４において立体構造が形成される。
【0169】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図３０に示すように、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体６０５がナノポア１０１を通過し、その後、分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体６０５は負電荷を帯びているため、さらに下流方向に進み、スペーサ６０４を中心に形状変化を起こす。すると、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端と接触し、結合する（図３１）。これにより、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0170】
そして、図３２に示すように、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体６０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体６０５が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、生体分子－アダプター分子複合体６０５は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向（図３２中矢印Ｂの方向）に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体６０５の塩基配列情報を取得することができる。
【0171】
そして、図３２に示すように、生体分子－アダプター分子複合体６０５の一本鎖核酸領域６０１Ｂに形成された立体構造がナノポア１０１に到達すると、分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止する。分子モータ１３０による搬送動作及びシーケンシングが停止した段階で、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とする。その結果、図３３に示すように、生体分子－アダプター分子複合体６０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する（図３３中矢印Ａの方向）。このとき、分子モータ１３０によって合成された生体分子－アダプター分子複合体６０５の相補鎖６０６が生体分子－アダプター分子複合体６０５から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）とともに、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体６０５から乖離する。
【0172】
なお、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位とするタイミングは、一定時間で自動的に切り替える方法や、読み取った塩基配列情報を用いて切り替える方法とすることもできる。あるいは、立体構造がナノポア１０１に近接すると封鎖電流の減少が計測できるため、封鎖電流の減少を検知した段階で第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位としてもよい。これらいずれの方法でも、一本鎖核酸領域６０１Ｂに立体構造を形成させることで、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体６０５全体がナノポア１０１を通過することを防止することができる。
【0173】
そして、図３３に示すように、生体分子１０９に最も近い位置にある次の分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、負電荷を帯びた生体分子－アダプター分子複合体６０５は、さらに下流方向に進み、スペーサ６０４を中心に形状変化を起こす。すると、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端と接触し、結合する（図３１参照）。これにより、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端から再び相補鎖合成反応を開始する。すなわち、図３４に示したように、次の分子モータ１３０によって生体分子－アダプター分子複合体６０５が電位勾配に逆らって再び第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体６０５の塩基配列情報を再び取得することができる。
【0174】
以上のようにアダプター分子６００に結合した分子モータ１３０及びプライマー１３１の組の数に応じて、生体分子１０９の塩基配列情報を複数回取得することができる。このアダプター分子６００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に印加した電圧を反転させる制御や、一回の測定後に再び分子モータ１３０及びプライマー１３１を結合させる工程を行うことなく、上述した一連の処理によって複数回、生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。すなわち、このアダプター分子６００を使用した場合には、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0175】
特に、このアダプター分子６００を使用した場合には、第２の液槽１０４Ｂ内において、生体分子－アダプター分子複合体６０５の末端近傍に立体構造が形成されているため、生体分子－アダプター分子複合体６０５が第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａの方向に移動する際にナノポア１０１から脱落することを確実に防止できる。これにより、上述した往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列の読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0176】
［第３－１の実施形態］
本実施形態では、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子及び第２－１～３の実施形態で示したアダプター分子と異なり、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子ついて説明する。本実施形態で説明するアダプター分子等において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子及び第２－１～３の実施形態で示したアダプター分子と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施形態では、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子及び第２－１～３の実施形態で示したアダプター分子と異なり、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子ついて説明する。本実施形態で説明するアダプター分子等において、第１－１～３の実施形態で示したアダプター分子及び第２－１～３の実施形態で示したアダプター分子と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0177】
図３５は、本実施形態に係るアダプター分子７００を有する生体分子－アダプター分子複合体７０１を分析する生体分子分析装置１００を示している。生体分子分析装置１００は、生体分子－アダプター分子複合体７０１を分析する装置であって、封鎖電流方式にてイオン電流を測定する生体分子分析用デバイスである。生体分子分析装置１００は、ナノポア１０１が形成された基板１０２と、基板１０２を挟んで基板１０２と接するように配置され、その内部に電解質溶液１０３が満たされた一対の液槽１０４（第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂ）と、第１の液槽１０４Ａ及び第２の液槽１０４Ｂの各々に接する一対の電極１０５（第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂ）とを備える。測定時には、一対の電極１０５の間に電圧源１０７から所定の電圧が印加され、一対の電極１０５の間に電流が流れる。電極１０５の間に流れる電流の大きさは、電流計１０６により計測され、その計測値はコンピュータ１０８により分析される。
【0178】
アダプター分子７００は、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、分子中に分子モータ離脱誘導部７０２を有している。分子モータ離脱誘導部７０２は、生体分子１０９と分子モータ１３０との結合力と比較して、分子モータ１３０との結合力が低いという特徴の領域である。分子モータ離脱誘導部７０２としては、特に限定されないが、ホスホジエステル結合を有しない炭素鎖又は脱塩基配列からなる領域とすることができる。ここでＤＮＡポリメラーゼ等の分子モータ１３０は、ヌクレオチドがホスホジエステル結合で結合した核酸に結合する。よって、分子モータ離脱誘導部７０２としては、核酸と異なる構造、すなわち一例として、モノマーがホスホジエステル結合で連結した構造を除く鎖状構造とすることができる。分子モータ離脱誘導部７０２としては、塩基を有しない構造とすることがより好ましい。一例として分子モータ離脱誘導部７０２は、iSpC3系の脱塩基から構成することができる。この場合、分子モータ結合（例えばポリメラーゼ）の大きさ以下でリン酸基が配置されるため、平均的な分子モータの物理寸法以上長さでリン酸基不在領域を持つことが好ましい。例として、iSp9やiSp18を使用することができる。また、分子モータ離脱誘導部７０２は、これらのうち複数種類が規則的又はランダムに連結したものでもよい。さらに、分子モータ離脱誘導部７０２は、上述したような脱塩基から構成されるものに限定されず、任意の長さの炭素鎖、任意の長さのポリエチレングリコール（PEG）でもよい。また、分子モータ離脱誘導部７０２は、ポリメラーゼによる伸長反応を抑制及び離脱可能とするのであれば、リン酸基を有する修飾塩基であってもよい。このような例としては、Nitroindoleを挙げることができる。Nitroindoleを分子モータ離脱誘導部７０２に使用することで、ポリメラーゼの伸長反応を止めることができる。
【0179】
なお、アダプター分子７００としては、図３６（Ａ）に示すように、一本鎖ＤＮＡからなるものでも良いし、図３６（Ｂ）に示すように、解析対象の生体分子１０９が二本鎖ＤＮＡである場合、当該生体分子１０９と連結する端部を二本鎖ＤＮＡとしても良い。
【0180】
アダプター分子７００は、解析対象の生体分子１０９の一方端部に連結される。生体分子１０９の他方端部には、分子モータ１３０が結合される分子モータ結合部７０３と、プライマー１３１がハイブリダイズできるプライマー結合部７０４を備えるアダプター分子７０５（以下、分子モータ結合用アダプター分子７０５と称す）が連結される。分子モータ結合用アダプター分子７０５は、生体分子１０９と連結する端部とは反対側の端部（例えば３’末端）に脱落防止部１１３を備えることが好ましい。
【0181】
図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示す例では、生体分子１０９の５’末端にアダプター分子７００を連結し、生体分子１０９の３’末端に分子モータ結合用アダプター分子７０５を連結する構成とした。図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示した何れのアダプター分子７００及び分子モータ結合用アダプター分子７０５を使用しても良く、二本鎖領域を一本鎖とすることで、図３６（Ｃ）に示すように、一本鎖の生体分子－アダプター分子複合体７０１を作製することができる。
【0182】
以上のように構成されたアダプター分子７００を用いた生体分子１０９の分析方法を、図３７～３９を用いて説明する。
【0183】
先ず、生体分子１０９の一方端部にアダプター分子７００を結合し、他方端部に分子モータ結合用アダプター分子７０５を結合した生体分子－アダプター分子複合体７０１を準備する。第１の液槽１０４Ａ内に、当該生体分子－アダプター分子複合体７０１、分子モータ１３０及びプライマー１３１を含む電解質溶液を充填する。これにより、分子モータ結合用アダプター分子７０５における分子モータ結合部７０３に分子モータ１３０が結合し、プライマー結合部７０４にプライマー１３１がハイブリダイズする。
【0184】
次に、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、生体分子－アダプター分子複合体７０１におけるアダプター分子７００の端部がナノポア１０１方向に移動し、ナノポア１０１内に導入される。そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体７０１はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。図示しないが、第２の液槽１０４Ｂの電解質溶液１０３に脱落防止部１１３を添加することで、第２の液槽１０４Ｂに移動した生体分子－アダプター分子複合体４０１の端部に脱落防止部１１３を付加することができる。
【0185】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図３７に示すように、生体分子－アダプター分子複合体７０１がナノポア１０１を通過し、その後、分子モータ結合部７０３に結合した分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0186】
そして、図３８に示すように、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、生体分子－アダプター分子複合体７０１が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、生体分子－アダプター分子複合体７０１が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、生体分子－アダプター分子複合体７０１は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向（図３８中矢印Ｂの方向）に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体７０１の塩基配列情報を取得することができる。
【0187】
そして、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体７０１を第１の液槽１０４Ａ方向に搬送し続け、図３９に示すように、分子モータ１３０が分子モータ離脱誘導部７０２の位置に来ると、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体７０１から乖離する。分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体７０１から乖離すると、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、相補鎖７０６を有する生体分子－アダプター分子複合体７０１が第２の液槽１０４Ｂ方向に移動し、相補鎖７０６が生体分子－アダプター分子複合体７０１から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｐｅｄ）。
【0188】
以上のように、アダプター分子７００を使用することで、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体７０１から容易に乖離するため、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位として分子モータ１３０を強制的に乖離するとともに合成された相補鎖を引き剥がすといった処理が不要となる。さらに、アダプター分子７００を使用することで、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体７０１から容易に乖離して、その後、生体分子－アダプター分子複合体７０１が第２の液槽１０４Ｂ方向に移動するため、アダプター分子７００の端部に脱落防止部１１３を有してなくとも、生体分子－アダプター分子複合体７０１の脱落を防止することができる。
【0189】
また、図示しないが、合成された相補鎖７０６を引き剥がした後、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間を逆の電位勾配とする（第１の液槽１０４Ａを正電位、第２の液槽１０４Ｂを負電位）ことにより、生体分子－アダプター分子複合体７０１を第１の液槽１０４Ａ方向に移動させ、再び、分子モータ結合用アダプター分子７０５の所定の位置に分子モータ１３０及びプライマー１３１を結合させることができる。その後、図３７～３９に示した工程に従って再び、生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。
【0190】
以上のようにアダプター分子７００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電圧勾配を制御して分子モータ１３０を乖離し、相補鎖７０６を引き剥がす処理が不要となり、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0191】
［第３－２の実施形態］
本実施の形態では、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び分子モータ結合用アダプター分子７０５と異なる、図４０に示すようなアダプター分子８００を説明する。なお、図４０に例示的に示すアダプター分子８００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び分子モータ結合用アダプター分子７０５と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施の形態では、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び分子モータ結合用アダプター分子７０５と異なる、図４０に示すようなアダプター分子８００を説明する。なお、図４０に例示的に示すアダプター分子８００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び分子モータ結合用アダプター分子７０５と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0192】
図４０に示したアダプター分子８００は、生体分子１０９に直接的に結合する二本鎖核酸領域８０１と、二本鎖核酸領域８０１における生体分子１０９と結合した端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域８０２Ａ及び８０２Ｂとを備える。なお、一本鎖核酸領域８０２Ａは３’末端に結合した脱落防止部１１３を有し、一本鎖核酸領域８０２Ｂは５’末端を有する。また、図４０に示したアダプター分子８００は、一本鎖核酸領域８０２Ｂに立体構造形成領域１１４を有している。さらに、図４０に示したアダプター分子８００は、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズした立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有することが好ましい。さらにまた、アダプター分子８００は、一本鎖核酸領域８０１Ｂにおいて、立体構造形成領域１１４よりも二本鎖核酸領域８０１に近い位置に分子モータ離脱誘導部７０２を有している。
【0193】
図４０に示すアダプター分子８００における一本鎖核酸領域８０１Ａは、分子モータが結合しうる分子モータ結合部８０３を有している。また、図４０に示すアダプター分子８００における一本鎖核酸領域８０１Ａは、分子モータ結合部８０３の３’末端側にプライマーがハイブリダイズしうるプライマー結合部８０４を有している。プライマー結合部８０４は、使用するプライマーの塩基配列と相補的な配列を有していればよく、具体的な塩基配列に限定されない。ここで、プライマーとは、特に限定されないが、例えば１０～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは１８～２５塩基長の一本鎖ヌクレオチドとすることができる。したがって、プライマー結合部３０３は、１０～４０塩基長、好ましくは１５～３５塩基長、より好ましくは１８～２５塩基長の領域であってプライマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる領域とすることができる。
【0194】
さらに、図４０に示すアダプター分子８００における一本鎖核酸領域８０２Ａは、分子モータ結合部８０３とプライマー結合部８０４との間にスペーサ８０５を有している。ここでスペーサ８０５とは、分子モータが結合できない領域、すなわちＡＧＣＴからなる塩基を含まない領域を意味する。スペーサ８０５としては、特に限定されないが、塩基を含まない、直鎖状連結体とすることができる。特にスペーサ８０５の長さは、少なくとも２塩基に相当する長さ、すなわち約０．６×２ｎｍ以上とすることが好ましい。換言すると、スペーサ８０５により、分子モータ結合部８０３とプライマー結合部８０４との間を２塩基以上（約０．６×２ｎｍ以上）離間させることができる。スペーサ８０５を構成する材料としては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＣ３ Ｓｐｃｅｒ、ＰＣ ｓｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８及びｄＳｐａｃｅｒ等のＤＮＡ鎖中に配置できる材料を挙げることができる。その他にも、スペーサ８０５としては直鎖状炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸及び直鎖状糖鎖等を使用することができる。
【0195】
さらにまた、図４０に示すアダプター分子８００は、二本鎖核酸領域８０１における所定の領域を標識配列（図示せず）とすることができる。標識配列とは、バーコード配列やインデックス配列とも呼称され、アダプター分子８００に固有の塩基配列を意味する。例えば、標識配列のみが相違する複数のアダプター分子８００を用意しておくことで、標識配列に基づいて使用したアダプター分子８００の種類を特定することができる。
【0196】
以上のように構成されたアダプター分子８００を用いた生体分子１０９の分析方法を、図４１～４５を用いて説明する。
【0197】
先ず、生体分子１０９の両端部にそれぞれアダプター分子８００を結合した生体分子－アダプター分子複合体８０６を準備する。第１の液槽１０４Ａ内に、当該生体分子－アダプター分子複合体８０６、分子モータ１３０、プライマー１３１及び立体構造形成抑制オリゴマー１１５を含む電解質溶液を充填する。これにより、図４１に示すように、アダプター分子８００における分子モータ結合部８０３に分子モータ１３０が結合し、プライマー結合部８０４にプライマー１３１がハイブリダイズし、一本鎖核酸領域８０２Ｂの立体構造形成領域１１４に立体構造形成抑制オリゴマー１１５がハイブリダイズする。
【0198】
次に、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、一本鎖核酸領域８０２Ｂの先端がナノポア１０１方向に移動し、立体構造形成抑制オリゴマー１１５がハイブリダイズしていない５’末端領域がナノポア１０１内に導入される。そして、図４２に示すように、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電位勾配により、生体分子－アダプター分子複合体８０６はナノポア１０１を介して（通って）第２の液槽１０４Ｂへ移動する。このとき、生体分子－アダプター分子複合体８０６における二本鎖の核酸（アダプター分子８００における二本鎖核酸領域８０１と生体分子１０９、立体構造形成抑制オリゴマー１１５と立体構造形成領域１１４）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。
【0199】
このように、アダプター分子８００を使用した場合でも、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子８００を使用した場合でも二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。なお、図４１及び４２に示した状態では、プライマー１３１と分子モータ１３０とがスペーサ８０５の長さ離間しているため、プライマー１３１の３’末端を起点とした分子モータ１３０による相補鎖合成反応は開始されない。そして、立体構造形成領域１１４を有する一本鎖核酸領域８０２Ｂが第２の液槽１０４Ｂに導入されると、立体構造形成領域１１４において立体構造が形成される。
【0200】
そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、図４２に示すように、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０６がナノポア１０１を通過し、その後、分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０６は負電荷を帯びているため、さらに下流方向に進み、スペーサ８０５を中心に形状変化を起こす。すると、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端と接触し、結合する（図４３）。これにより、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0201】
そして、図４４に示すように、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０５が電位勾配によって第２の液槽１０４Ｂ側に移動する力よりも、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０５が分子モータ１３０によって引き上げられる力が強いため、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０５は電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体８０６の塩基配列情報を取得することができる。
【0202】
そして、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体８０６を第１の液槽１０４Ａ方向に搬送し続け、図４５に示すように、一本鎖核酸領域８０２Ｂに形成された立体構造がナノポア１０１に到達するとともに分子モータ１３０が分子モータ離脱誘導部７０２の位置に来ると、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体８０６から乖離する。そして、図示しないが、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体８０６から乖離すると、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、相補鎖８０７を有する生体分子－アダプター分子複合体８０６が第２の液槽１０４Ｂ方向に移動し、相補鎖８０７が生体分子－アダプター分子複合体８０５から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｐｅｄ）。
【0203】
アダプター分子８００を使用した場合も、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体８０６から容易に乖離するため、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位として分子モータ１３０を強制的に乖離するとともに合成された相補鎖８０７を引き剥がすといった処理が不要となる。さらに、アダプター分子８００を使用した場合、生体分子－アダプター分子複合体８０６における第２の液槽１０４Ｂ内の端部近傍に立体構造が形成されるため、生体分子－アダプター分子複合体８０６のナノポア１０１からの脱落をより確実に防止することができる。
【0204】
また、図示しないが、合成された相補鎖８０７を引き剥がした後、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂに印加する電圧を反転し、第１の液槽１０４Ａを正電位とし第２の液槽１０４Ｂを負電位とする電位勾配を形成する。これにより、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体８０６を、ナノポア１０１を介して第２の液槽１０４Ｂから第１の液槽１０４Ａ方向へ移動させることができる。その後、第１の液槽１０４Ａに充填された電解質溶液１０３に分子モータ１３０及びプライマー１３１を添加し、プライマー結合部８０４にプライマー１３１をハイブリダイズさせ、分子モータ結合部８０３に分子モータ１３０を結合させる。その後、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂに印加する電圧を再び反転し、第１の液槽１０４Ａを負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、プライマー１３１がハイブリダイズし、分子モータ１３０が結合した生体分子－アダプター分子複合体８０６を、第２の液槽１０４Ｂ方向へ移動させる。そして、図４３に示したように、スペーサ８０５を中心とした形状変化が生じ、分子モータ１３０にプライマー１３１の３’末端と接触する状態を形成する。すなわち、図４１～４５を繰り返すことによって、分子モータ１３０による搬送動作毎にシーケンシングすることができる。
【0205】
以上のようにアダプター分子８００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間の電圧勾配を制御して分子モータ１３０を乖離し、相補鎖８０７を引き剥がす処理が不要となり、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0206】
［第３－３の実施形態］
本実施の形態では、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び図４０に示したアダプター分子８００と異なる、図４６に示すようなアダプター分子９００を説明する。なお、図４６に例示的に示すアダプター分子９００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び図４０に示したアダプター分子８００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
本実施の形態では、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び図４０に示したアダプター分子８００と異なる、図４６に示すようなアダプター分子９００を説明する。なお、図４６に例示的に示すアダプター分子９００及びこれを用いた生体分子解析装置において、図３６（Ａ）及び（Ｂ）に示したアダプター分子７００及び図４０に示したアダプター分子８００と同じ構成については同じ符号を付すことで、本項においては詳細な説明を省略する。
【0207】
図４６に示すアダプター分子９００は、生体分子１０９に結合する二本鎖核酸領域９０１と、二本鎖核酸領域９０１における生体分子１０９と結合する端部と異なる端部と連結し、互いに非相補的な塩基配列からなる一対の一本鎖核酸領域９０１Ａ及び９０１Ｂを備える。一本鎖核酸領域９０１Ａは３’末端を有し、一本鎖核酸領域９０１Ｂは５’末端を有する。なお、図示しないが、一本鎖核酸領域９０１Ａの末端には脱落防止部（図４０等における脱落防止部１１３）を備えることも可能である。なお、図４６に示したアダプター分子９００において、一本鎖核酸領域９０１Ｂは、分子モータ離脱誘導部７０２を有している。
【0208】
図４６に示すアダプター分子９００における一本鎖核酸領域９０１Ａは、分子モータ１３０が結合しうる複数の分子モータ結合部９０２を有している。また、図４６に示すアダプター分子９００における一本鎖核酸領域９０１Ａは、分子モータ結合部９０２の３’末端側にプライマー１３１がハイブリダイズしうる複数のプライマー結合部９０３を有している。すなわち、図４６に示したアダプター分子９００は、一本鎖核酸領域９０１Ａに複数組の分子モータ結合部９０２及びプライマー結合部９０３を有している。
【0209】
さらに、図４６に示すアダプター分子９００における一本鎖核酸領域９０１Ａは、複数組の分子モータ結合部９０２とプライマー結合部９０３との間のそれぞれにスペーサ９０４を有している。ここでスペーサ９０４とは、分子モータ１３０が結合できない領域、すなわちＡＧＣＴからなる塩基を含まない領域を意味する。スペーサ９０４としては、特に限定されないが、塩基を含まない、直鎖状連結体とすることができる。特にスペーサ９０４の長さは、少なくとも２塩基に相当する長さ、すなわち約０．６×２ｎｍ以上とすることが好ましい。換言すると、スペーサ９０４により、分子モータ結合部９０２とプライマー結合部９０３との間を２塩基以上（約０．６×２ｎｍ以上）離間させることができる。スペーサ９０４を構成する材料としては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＣ３ Ｓｐｃｅｒ、ＰＣ ｓｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８及びｄＳｐａｃｅｒ等のＤＮＡ鎖中に配置できる材料を挙げることができる。その他にも、スペーサ９０４としては直鎖状炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸及び直鎖状糖鎖等を使用することができる。
【0210】
さらにまた、図４６に示すアダプター分子９００は、二本鎖核酸領域９０１における所定の領域を標識配列（図示せず）とすることができる。標識配列とは、バーコード配列やインデックス配列とも呼称され、アダプター分子９００に固有の塩基配列を意味する。例えば、標識配列のみが相違する複数のアダプター分子９００を用意しておくことで、標識配列に基づいて使用したアダプター分子９００の種類を特定することができる。
【0211】
以上のように構成されたアダプター分子９００を用いた生体分子１０９の分析方法を、図４７～４９を用いて説明する。
【0212】
先ず、図４６に示したアダプター分子９００を生体分子１０９の両端部にそれぞれ結合した生体分子－アダプター分子複合体９０５を準備する。生体分子－アダプター分子複合体９０５を分子プローブ１３０及びプライマー１３１とともに第１の液槽１０Ａに充填する。この状態で、第１の電極１０５Ａ及び第２の電極１０５Ｂの間に電圧を印加して、第１の液槽１０４Ａ側を負電位とし第２の液槽１０４Ｂを正電位とする電位勾配を形成する。これにより、図４７に示すように、一本鎖核酸領域９０１Ｂがナノポア１０１方向に移動し、二本鎖の核酸（アダプター分子９００における二本鎖核酸領域９０１と生体分子１０９）が引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｅｄ）。また、図４７に示すように、生体分子－アダプター分子複合体９０５における生体分子１０９に最も近い位置にある分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。この状態で、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端を起点として、５’末端から３’末端の方向に相補鎖合成反応を開始する。
【0213】
このように、アダプター分子９００を使用した場合でも、二本鎖の核酸である生体分子１０９に対して煩雑な変性処理（例えば熱処理）を行うことなく、ナノポア１０１を通過しうる一本鎖の核酸とすることができる。すなわち、アダプター分子９００を使用した場合でも二本鎖の核酸を容易に引き剥がすことができる。
【0214】
そして、分子モータ１３０による相補鎖合成反応が進行すると、一本鎖となった生体分子－アダプター分子複合体９０５が電位勾配に逆らって第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体９０５の塩基配列情報を取得することができる。
【0215】
そして、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体９０５を第１の液槽１０４Ａ方向に搬送し続け、図４８に示すように、分子モータ１３０が一本鎖核酸領域９０１Ｂに形成された分子モータ離脱誘導部７０２の位置に来ると、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体９０５から乖離する。そして、図示しないが、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体９０５から乖離すると、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、相補鎖９０６を有する生体分子－アダプター分子複合体９０５が第２の液槽１０４Ｂ方向に移動し、相補鎖９０６が生体分子－アダプター分子複合体９０５から引き剥がされる（Ｕｎｚｉｐｐｅｄ）。
【0216】
アダプター分子９００を使用した場合も、分子モータ離脱誘導部７０２によって、分子モータ１３０が生体分子－アダプター分子複合体９０５から容易に乖離するため、第２の液槽１０４Ｂ内をより強い正電位として分子モータ１３０を強制的に乖離するとともに合成された相補鎖９０６を引き剥がすといった処理が不要となる。
【0217】
そして、生体分子１０９に最も近い位置にある次の分子モータ１３０がナノポア１０１に到達する。そして、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂの間の電位勾配により、負電荷を帯びた生体分子－アダプター分子複合体９０５は、さらに下流方向に進み、図４９に示すように、スペーサ９０４を中心に形状変化を起こし、分子モータ１３０がプライマー１３１の３’末端と接触し、結合する。これにより、分子モータ１３０は、プライマー１３１の３’末端から再び相補鎖合成反応を開始する。すなわち、次の分子モータ１３０によって生体分子－アダプター分子複合体９０５が電位勾配に逆らって再び第１の液槽１０４Ａ方向に搬送される。このとき、ナノポア１０１を通過する生体分子－アダプター分子複合体９０５の塩基配列情報を再び取得することができる。
【0218】
以上のようにアダプター分子９００に結合した分子モータ１３０及びプライマー１３１の組の数に応じて、生体分子１０９の塩基配列情報を複数回取得することができる。このアダプター分子９００を使用した場合には、第１の液槽１０４Ａと第２の液槽１０４Ｂとの間に印加した電圧を反転させる制御や、一回の測定後に再び分子モータ１３０及びプライマー１３１を結合させる工程を行うことなく、上述した一連の処理によって複数回、生体分子１０９の塩基配列情報を取得することができる。すなわち、このアダプター分子９００を使用した場合には、非常に簡便な操作による往復運動に伴って、生体分子１０９の塩基配列に対する読み取り精度を確実に向上させることができる。
【0219】
ところで、以上で説明したアダプター分子９００は、図５０に示すように、一本鎖核酸領域９０１Ｂに立体構造形成領域１１４と、立体構造形成領域１１４にハイブリダイズした立体構造形成抑制オリゴマー１１５とを有していてもよい。立体構造形成領域１１４は、一本鎖核酸領域９０１Ｂにおいて、分子モータ離脱誘導部７０２よりも末端側に位置している。立体構造形成領域１１４及び立体構造形成抑制オリゴマー１１５を有するアダプター分子９００を使用した場合、図４７～４９に示した状態において、第２の液槽１０４Ｂ内で立体構造形成領域１１４が立体構造を形成する。生体分子－アダプター分子複合体９０５における第２の液槽１０４Ｂ内の端部近傍に立体構造が形成されると、生体分子－アダプター分子複合体９０５のナノポア１０１からの脱落をより確実に防止することができる。
【実施例】
【0220】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔参考例〕
特開2010-230614公報に開示されたように、解析対象のＤＮＡ鎖の両末端をストレプトアビジン（ＳＡ）のようなナノポア径よりも大きな分子を結合させて、電圧制御を行うことによる手段をとることが可能な場合もある。しかし、本方式の場合、第２の液槽１０４Ｂ（ｔｒａｎｓチャンバとも称す）側のＳＡは、ＤＮＡ鎖をナノポア通過させた後に結合させる必要がある。ナノポアを通過した一分子のＤＮＡ鎖に対して第２の液槽１０４Ｂ側に溶解したＳＡ一分子と結合させるには、結合まで十分な時間待機するか、十分な濃度のＳＡを溶解する必要がある。
〔参考例〕
特開2010-230614公報に開示されたように、解析対象のＤＮＡ鎖の両末端をストレプトアビジン（ＳＡ）のようなナノポア径よりも大きな分子を結合させて、電圧制御を行うことによる手段をとることが可能な場合もある。しかし、本方式の場合、第２の液槽１０４Ｂ（ｔｒａｎｓチャンバとも称す）側のＳＡは、ＤＮＡ鎖をナノポア通過させた後に結合させる必要がある。ナノポアを通過した一分子のＤＮＡ鎖に対して第２の液槽１０４Ｂ側に溶解したＳＡ一分子と結合させるには、結合まで十分な時間待機するか、十分な濃度のＳＡを溶解する必要がある。
【0221】
本参考例では、第２の液槽１０４Ｂ内でＤＮＡ鎖に対してＳＡを結合させる実験を行った結果を示す。第２の液槽１０４Ｂの塩濃度は１ＭのＫＣｌ及び３ＭのＫＣｌで実施した。生体分子として一本鎖ＤＮＡ８０ｍｅｒの両末端にビオチン修飾されたものを用いた。予め片方のビオチンにのみＳＡが結合可能とする濃度比で一本鎖ＤＮＡとＳＡを反応させ、ナノポアを通過させた。
【0222】
生体分子１０９が存在しない状態で計測される電流値を基準（ポア電流）とし、電流値の減少の有無からナノポアへのＤＮＡのトラップや、通過、離脱を判断した。図５１の上段は第２の液槽１０４Ｂ側に計測溶液のみを入れる場合の結果を示す。ＳＡ結合ｓｓＤＮＡをチャンバに導入し、計測開始直後、ＤＮＡ由来のイオン電流の減少（封鎖電流）が確認された。その封鎖電流は解消されることなくナノポアを閉塞し続けた。これはＤＮＡの末端に結合したＳＡがナノポア径以上の直径を有するために通過することができずナノポアにトラップされていることを示す。ここで、電圧を反転すると、ポア径由来の電流値に回復する。第２の液槽１０４Ｂに存在するＤＮＡの末端は一本鎖のままであるため、電気泳動により第１の液槽１０４Ａ側に抜けたと考えられる。
【0223】
ここで、第２の液槽１０４Ｂに終濃度９μＭとなるようにＳＡを溶解した。ＤＮＡは同様にＳＡが一個結合した濃度で反応させ、ナノポア計測に用いた。ＤＮＡを第１の液槽１０４Ａに導入すると、同様にポアの閉塞現象が確認される。ここで閉塞直後に電圧反転をすると、第２の液槽１０４ＢにＳＡを導入していなかったときと同様にポア電流に回復する現象が見られた。一方で、閉塞確認後１０分待機してから電圧を反転すると、計測されたイオン電流はポア電流に戻らず閉塞し続けることが確認された（図５１下段）。
【0224】
ＳＡ付ＤＮＡ由来の閉塞が確認されてから、電圧反転するまでの時間を変えていったところ、少なくとも１０分の待機時間が必要であり、また１０分以上待機しても必ずしも結合できるわけでもなかった。すなわち、第２の液槽１０４Ｂ内においてＤＮＡ鎖の末端にＳＡを結合させるための時間が長く、測定の効率化を阻害する要因であることがわかった。また、ＤＮＡ鎖の末端に対するＳＡの結合が完了したか否かを判断する基準も曖昧であることが判明した。
【0225】
〔実施例１〕
本実施例では、図１３に示したアダプター分子３００を実際に設計し、立体構造形成領域１１４による立体構造の有効性を評価した。
本実施例では、図１３に示したアダプター分子３００を実際に設計し、立体構造形成領域１１４による立体構造の有効性を評価した。
【0226】
具体的には、生体分子１０９及びプライマー１３１として表１に示した配列のＤＮＡを設計した。「Ｚ」で示される位置にはｉＳｐＣ３をスペーサ３０４として配置した。また、脱落防止部１１３としてはストレプトアビジンを使用した。加えて、立体構造形成領域１１４の配列は表１に示したテロメア配列を用いた。二本鎖領域２０１及びそれに続く一本鎖核酸領域３０１Ａ及び３０１Ｂを表のように設計した。
【0227】
【表1】
【0228】
ここではＳＡが結合することにより、ナノポアが閉塞されることは上記〔参考例〕で示した実験により確認されたため、テロメア構造によりナノポア１０１が閉塞することを確認した。図５２は、立体構造形成領域１１４のテロメア構造を有しないアダプターと、テロメア構造を有するアダプターを計測した際のイオン電流変化を示す。図５２（ａ）に、テロメア構造がない場合、図５２（ｂ）にテロメア構造がある場合に取得された信号を示す。テロメア構造がない時には、通過信号、すなわち自発的に封鎖信号がベース電流に回復する様子が観察された。一方、テロメア構造を有するサンプルを用いた際には、封鎖信号確認後、自発的にベース電流に戻ることがなかった。また、その後、電圧を反転することにベース電流に戻ることが確認された。
【0229】
図５３に、一本鎖であり、テロメア構造を有するものを計測溶液に融解させてナノポア計測した結果を示す。結果、０．１Ｖでは閉塞しつづける信号が確認された。図５２（ｂ）で確認されたナノポアの閉塞はアダプター分子内に形成されたテロメア構造由来であることが言える。一方で、計測電圧を上昇していくと、通過信号となる様子も確認された。これはテロメア構造の耐圧が０．２Ｖ付近にあることを示している。
【0230】
以上の結果をもとに、ＳＡ及びテロメア構造を脱落防止部１１３とした生体分子のナノポアへのトラップが可能であることを確認する実験には０．１Ｖ印加電圧を用いることとした。
【0231】
図５４には、立体構造形成領域１１４としてテロメア構造を有するアダプター分子を生体分子にライゲーションしたサンプルを用いて生体分子がナノポアにトラップ可能か確認した結果を示す。一本鎖核酸領域３０１Ａの末端にはＳＡが結合できるように、上記ライゲーションの後にＳＡを混在させて３７度でインキュベーションした。サンプル導入から約２５秒後に、イオン電流が減少したままベース電流に回復しなくなる現象が確認された。３０秒待機した後に、印加電圧を反転したが、電流値がベース電流に戻らなかった。更に約５秒後、印加電圧を戻すが、ベース電流に戻ることなく電圧反転前の電流値が取得された。これらの動作を３度繰り返すが、ベース電流に戻ることはなかった。
【0232】
図５５にも同様の異なるポア及び異なるサンプルで実施した実験例を掲載する。同様に導入したサンプルが閉塞する前に電圧反転を行っても、ベース電流が確認されるのみであるが（＜３０秒）、一旦閉塞が確認されると、ベース電流にもどることなく、閉塞電流が維持される。
【0233】
以上のことから以下のことが推察される。図５４上段の模式図で示したように、一本鎖核酸領域３０１Ａに結合したＳＡと、一本鎖核酸領域３０１Ｂがナノポア１０１を通過したことにより形成された立体構造の間で一本鎖ＤＮＡ（生体分子１０９）がナノポアに留まり続けたことを示していると考えられる。以上のことから、第一の制御鎖に結合した脱落防止部１１３と、立体構造形成領域１１４で形成された立体構造の間で、迅速に往復運動を可能とする構成が実現できたと結論付けられた。
【0234】
〔実施例２〕
本実施例では、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子を設計し、当該分子モータ離脱誘導部により分子モータの乖離が可能か検討した。
本実施例では、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子を設計し、当該分子モータ離脱誘導部により分子モータの乖離が可能か検討した。
【0235】
具体的には、表２に示すように、プライマー１３１として「Primer Oligo 23 nt」を設計し、３種類の分子モータ離脱誘導部を有するアダプター分子を設計した。
【0236】
【表2】
【0237】
表２に記載のプライマー１３１及びアダプター分子を用いて、分子モータ存在下でナノポア通過信号を観察した結果を図５６ａ及びｂに示した。また、本実施例では、代表的に鋳型としてiSp18x4_T20_Deb18を用いた。アダプター分子にはXで示す位置に分子モータ離脱誘導部が存在する。分子モータ離脱誘導部を有しない鋳型を用いてナノポア通過信号を観察した際と同様、プライマーのunzip信号と考えられる封鎖時間が1ms以下の早い通過信号及びポリメラーゼによる搬送由来の信号と考えられる封鎖時間が1～100msの通過信号が確認された。ここで、ｄＮＴＰ非存在下で確認される信号、すなわちポリメラーゼが鋳型に結合したままナノポアでトラップされるような信号、換言すればナノポアがポリメラーゼで閉塞されその状態が維持される信号は確認されなかった。図５６ａで用いた一本鎖にＳＡをにつけた結合させた分子を用いて、同様の計測を行ったところ、閉塞が維持される信号が確認された（図５６ｂ）。
【0238】
これらの結果から、以下のことが推察される。図５６ａの結果は、模式図で示したように、プライマーから伸長反応を開始した分子モータが、分子モータ脱離誘導鎖に到達したところで一本鎖から離脱し、合成鎖の引き剥がしが開始され、鋳型がナノポアを通過する状態と考えられる。図５６ｂの結果は、鋳型の末端にＳＡが結合しているため、図５６ａの結果から想定された鋳型がナノポアを通過する際にＳＡにトラップされて通過が実現しなかったものと考えられる。なお、閉塞確認後、電圧を反転すると、ベース電流に戻ることが確認されていることからも、ＳＡによって一本鎖がトラップされている状態が実現されていると考えられる。
【0239】
以上のことから、分子モータ離脱誘導部を配設することで鋳型から積極的に分子モータの搬送を止め、鋳型である一本鎖ＤＮＡとの結合を解除することが可能であることが示された。
【0240】
〔実施例３〕
本実施例では、図１７に示したアダプター分子４００のように、プライマー結合部位及び分子モータ結合部の組を複数有する場合、隣り合うプライマー結合部位の好ましい間隔を検討した。
本実施例では、図１７に示したアダプター分子４００のように、プライマー結合部位及び分子モータ結合部の組を複数有する場合、隣り合うプライマー結合部位の好ましい間隔を検討した。
【0241】
具体的には、プライマー結合部位とその下流にスペーサ（脱塩基からなる領域）とを有する構成において、隣り合うプライマー結合部位の間隔を１５塩基長、２５塩基長、３５塩基長又は７５塩基長としてアダプター分子を設計した。設計したアダプター分子及び分子モータ（ポリメラーゼ）を含むバッファ溶液を調製し、分子モータをアダプター分子に結合させた後に電気泳動を行った。
【0242】
その結果を図５７に示した。図５７中、「polymerase：＋」「「polymerase：－」は、分子モータとしてのポリメラーゼをバッファ溶液中に存在した状態での実験であるか（＋）、又はそうでないのか（－）を示している。いずれの条件でもポリメラーゼをアダプター分子に結合させると、アニールのみの時に現れていたバンド位置とは異なる位置に新たなバンドが表れる。図５７に示すように、本実施例で設計したアダプター分子については全て、ポリメラーゼ存在下で新たなバンドが観察できた。このことから、隣り合うプライマー結合部位の間隔を１５塩基長、２５塩基長、３５塩基長又は７５塩基長としても、分子モータであるポリメラーゼが結合できることが明らかとなった。
【0243】
〔実施例４〕
本実施例では、図４６に示したアダプター分子９００のように、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有し、プライマー結合部、分子モータ結合部、プライマー結合部と分子モータ結合部の間にスペーサを有する組合せを複数有するアダプター分子を設計し、対象分子の繰り返し搬送制御が可能か確認した。
本実施例では、図４６に示したアダプター分子９００のように、生体分子と分子モータとの結合力と比較して、分子モータとの結合力が低い分子モータ離脱誘導部を有し、プライマー結合部、分子モータ結合部、プライマー結合部と分子モータ結合部の間にスペーサを有する組合せを複数有するアダプター分子を設計し、対象分子の繰り返し搬送制御が可能か確認した。
【0244】
具体的には、表３に示すように、プライマー１３１として「Primer Oligo 23 nt」を設計し、アダプター分子として、「Primer Oligo 23 nt」が３箇所結合するように「Tandem primer template」を設計した（配列番号１０）。解析対象分子の長さは69merとした。また、隣り合うプライマー結合部位の間隔は１５ｍｅｒとした。
【0245】
【表3】
【0246】
表３に記載のプライマー１３１及びアダプター分子を用いて、分子モータ存在下でナノポア通過信号を観察した結果を図５８に示した。図５８（ａ）は計測された封鎖信号の代表図である。電流値が特に高くなっている部分は、ナノポアの抵抗が最も低くなっていることを示しており、「Tandem primer template」の中のiSpC3の部分を示していると考えられる。
【0247】
ここで、取得された波形の中に、同一領域を読み取った波形が反映されていることを調べるため、Dotplot解析を行った。Dotplotでは、各レベルに当てられた電流値で形成された波形の、例えば10レベルずつの波形の区切りを動的伸縮法による解析を行い、その結果、類似度が高くなるほどハイスコアを出力するようにしている（図５８（ｂ））。図５８（ｂ）では、対角線は同一箇所の類似度を表しているため完全一致のスコアを出力している。一方で、例えば、80～100レベルと120～140レベルは、異なる場所間であるがよく一致していることを示している。
【0248】
取得された波形に対してレベル抽出を行い、前述の手法を用いて、30レベルずつの波形区切りで互いに類似度の高い場所の探索を行った。レベル抽出は、任意時間ウインドウにおける電流値の平均を代表電流値として定義した。取得されたDotplotは図５８（ｂ）のようになった。図５８（ｂ）が示しているのは、総レベル数200に対して、0～60レベル、60～120レベル、120～200レベルが類似していることを大まかに示している。また、二巡目のレベル80～110と、110～140も類似していることが示される。
【0249】
今回設計した配列が目的のとおりに繰り返して解析されたとすると、読み取り対象領域が３回繰り返えされることになる。加えて、３回目の繰返しのところでプライマー部分を２回読むことになるため、類似波形として出力された二本目の線がずれることになる。実際に、図５８（ｂ）に示したように、今回のDotplot解析ではそのことが反映された出力となっている。この結果から設計通り３回の繰り返し解析が実現されたことを示している。
【0250】
以上のことから、プライマー結合部を複数用意し、かつ分子モータ離脱誘導部を配置することで、ポリメラーゼによる搬送とポリメラーゼの脱離とunzipとの繰り返しを、電圧の制御をすることなく、プライマーが結合した数だけ自動的に繰り返えすことができ、対象分子の高精度な解析が可能となることが示された。
【0251】
〔参考例２〕
本参考例２では、本発明が適用されるナノポアを半導体微細加工技術により作製する手順を説明する。まず、厚さ７２５μｍの８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４をそれぞれ膜厚１２ｎｍ／２５０ｎｍ／１００ｎｍでその順に成膜する。また、Ｓｉウエハの裏面に、Ｓｉ３Ｎ４を１１２ｎｍ成膜する。
本参考例２では、本発明が適用されるナノポアを半導体微細加工技術により作製する手順を説明する。まず、厚さ７２５μｍの８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４をそれぞれ膜厚１２ｎｍ／２５０ｎｍ／１００ｎｍでその順に成膜する。また、Ｓｉウエハの裏面に、Ｓｉ３Ｎ４を１１２ｎｍ成膜する。
【0252】
次に、Ｓｉウエハ表面最上部のＳｉ３Ｎ４を５００ｎｍ四方で反応性イオンエッチングにより除去する。同様に、Ｓｉウエハ裏面のＳｉ３Ｎ４を１０３８μｍ四方で反応性イオンエッチングにより除去する。裏面については更に、エッチングにより露出したＳｉ基板をＴＭＡＨ（Tetramethylammonium hydroxide）により更にエッチングする。Ｓｉエッチングの間は、表面側のＳｉＯのエッチングを防ぐため、ウエハ表面を保護膜（ProTEKTMB3primer and ProTEKTMB3, Brewer Science, Inc.）で覆うのが好ましい。中間層のＳｉＯはポリシリコンであってもよい。
【0253】
次に、当該保護膜を取り除いた後、５００ｎｍ四方で露出しているＳｉＯ層をＢＨＦ溶液（ＨＦ／ＮＨ４Ｆ＝１／６０、８分間）で取り除く。これにより、膜厚１２ｎｍの薄膜Ｓｉ３Ｎ４が露出した仕切り体が得られる。ポリシリコンが犠牲層に選択された場合はＫＯＨによるエッチングにより薄膜が露出される。この段階では、薄膜にナノポアは設けられていない。
【0254】
ナノポアの形成は、例えば以下の手順で行うことができる。仕切り体を生体分子分析用デバイス等にセットする前に、Ar/O2 plasma(SAMCO Inc., Japan)により、１０Ｗ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Ｓｉ３Ｎ４薄膜を親水化する。次に、生体分子分析用デバイスに仕切り体をセットする。その後、薄膜を挟む上下の液槽を、１ＭのＫＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５溶液で満たし、各液槽のそれぞれに電極を導入する。
【0255】
電圧の印加は、ナノポアの形成時だけでなく、ナノポアが形成された後にナノポアを介して流れるイオン電流の計測時にも行われる。ここでは、下側に位置する液槽をｃｉｓ槽と呼び、上側に位置する液槽をｔｒａｎｓ槽と呼ぶ。また、ｃｉｓ槽側の電極に印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓ槽側の電極に電圧Ｖｔｒａｎｓを印加する。電圧Ｖｔｒａｎｓは、パルス発生器（例えば41501B SMU AND Pulse Generator Expander, Agilent Technologies, Inc.）により発生する。
【0256】
パルス印加後の電流値は、電流計（例えば4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER, Agilent Technologies, Inc.）で読み取ることができる。パルス電圧の印加前に形成されたナノポアの直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポアの直径を大きくしつつ、目的とする直径を得ることができる。
【0257】
ナノポアの直径は、イオン電流値から見積もった。条件選択の基準は表４の通りである。
【0258】
【表4】
【0259】
【数1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56a】
【図56b】
【図57】
【図58】
【配列表】