特許 7307435 ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-04

(45)【発行日】2023-07-12

(54)【発明の名称】ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20230705BHJP

   C12N 1/10 20060101ALI20230705BHJP

   C12P 7/64 20220101ALI20230705BHJP

   C10L 1/02 20060101ALI20230705BHJP

【ＦＩ】

C12N1/12 A

C12N1/10

C12P7/64

C10L1/02

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2023509619

(86)(22)【出願日】2022-03-30

(86)【国際出願番号】 JP2022015844

(87)【国際公開番号】W WO2022220118

(87)【国際公開日】2022-10-20

【審査請求日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】P 2021067233

(32)【優先日】2021-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(73)【特許権者】

【識別番号】521155346

【氏名又は名称】株式会社ＭＯＺＵ－Ｅｎｅｒｇｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100121441

【弁理士】

【氏名又は名称】西村 竜平

(74)【代理人】

【識別番号】100154704

【弁理士】

【氏名又は名称】齊藤 真大

(74)【代理人】

【識別番号】100206151

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 惇志

(74)【代理人】

【識別番号】100218187

【弁理士】

【氏名又は名称】前田 治子

(74)【代理人】

【識別番号】100227673

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 光起

(72)【発明者】

【氏名】中野 長久

(72)【発明者】

【氏名】田部 記章

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／１６２５０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－１４８００５（ＪＰ，Ａ）

【文献】日本植物生理学会年会およびシンポジウム講演要旨集，1988年，28，p.131

【文献】化学と生物，2012年，Vol.50，p.789-791

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／１２

Ｃ１２Ｎ １／１０

Ｃ１２Ｐ ７／６４

Ｃ１０Ｌ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ユーグレナを準備する工程と、
前記ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する工程と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える工程と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられた前記ユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ工程と、を含み、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法。

【請求項2】

前記ワックスエステル発酵促進物質が、分子内の炭素原子数が１以上４以下である脂肪酸をさらに含有する、請求項１に記載されたワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法。

【請求項3】

前記ワックスエステル発酵促進物質における前記脂肪酸のモル比（脂肪酸のモル量／ワックスエステル発酵促進物質全体の合計モル量）が０．５以下である、請求項２に記載されたワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法。

【請求項4】

前記常温に保つ工程において窒素バブリングを行う、請求項１～３のいずれか一項に記載されたワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法。

【請求項5】

ユーグレナを準備する工程と、
前記ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する工程と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える工程と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられた前記ユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ工程と、
所定の時間にわたり常温に保たれた前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する工程と、を含み、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
ワックスエステルの製造方法。

【請求項6】

グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する、糖の存在下において好気的条件で培養されたユーグレナに酸性環境で与えるためのワックスエステル発酵促進剤。

【請求項7】

ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する手段と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える手段と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する手段と、を備え、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
ワックスエステル高含有ユーグレナの生産システム。

【請求項8】

ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する手段と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える手段と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する手段と、
回収された前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する手段と、を備え、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
ワックスエステルの製造システム。

【請求項9】

ユーグレナを準備する工程と、
前記ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する工程と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える工程と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられた前記ユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ工程と、
所定の時間にわたり常温に保たれた前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する工程と、
抽出された前記ワックスエステルを他の燃料用原料と混合させてバイオ燃料を調製する工程と、を含み、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
バイオ燃料の製造方法。

【請求項10】

ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する手段と、
培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える手段と、
前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する手段と、
回収された前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する手段と、
抽出された前記ワックスエステルを他の燃料用原料と混合させてバイオ燃料を調製する手段と、を備え、
前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり、
前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、
バイオ燃料の製造システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、準備したユーグレナと比べてワックスエステル（wax ester：以下「ＷＥ」ともいう。）含有量を高められたユーグレナ（以下「ワックスエステル高含有ユーグレナ」という意味で「ＷＥ高含有ユーグレナ」ともいう。）の生産方法および生産システム、並びに、ＷＥ又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵（以下「ＷＥ発酵」ともいう。）の促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオ燃料は、動物または植物などの生物資源を原料とする燃料である。バイオ燃料として利用され得る様々な成分のうち、分子内の炭素原子数が多くて燃焼時に生じる熱量が比較的に大きい成分として、ユーグレナに由来するＷＥが挙げられる（特許文献１と特許文献２とを参照）。一般的にＷＥは、炭素原子数１０以上の脂肪酸と炭素原子数８以上の脂肪族アルコールとのエステル、つまり分子内の炭素原子数が１８以上のエステルである。ユーグレナ（属名：Euglena、和名：ミドリムシ）は、鞭毛運動をする動物的性質と光合成をする植物的性質とを両立させた、ユニークな単細胞生物である。ユーグレナは、栄養条件に応じて細胞内の貯蔵物質を変化させることで、多様な栄養条件下で生育可能という特性を有する。この特性を活用するために、様々な研究開発が行われてきた。

【0003】

例えば特許文献２には、ユーグレナを好気的条件で２７℃から３５℃程度の液温で培養してから、低酸素処理しつつ１６℃程度で培養した後、培養されたユーグレナからＷＥを抽出するＷＥ製造方法が記載されている。好気的条件での培養により、ユーグレナ細胞内で、多糖類の一種であるパラミロン（β－１，３－グルカン）が生成し貯蔵される。その後、低酸素処理を伴う培養により、ユーグレナ細胞内で、パラミロンを分解してＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生合成する代謝が起こる。その代謝結果物として細胞内で、分子内の炭素原子数が２４以上かつ２６以下であるＷＥが産生され得る旨、特許文献２で説明されている。このように、嫌気的条件下においてユーグレナ細胞でパラミロンが酸素非依存的に代謝され、ＡＴＰ産生の副産物がＷＥの形態で細胞内に貯蔵される反応は、ワックスエステル発酵（ＷＥ発酵）ともいわれ、ユーグレナ細胞に独特な現象として知られている。特許文献２では、３－ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子の発現が抑制されたＫＡＴ１ノックダウンユーグレナを用いるのが好ましい旨も説明されている。

【0004】

特許文献１では、ユーグレナを好気的条件で糖を与えて培養してから、酸性環境でプロピオン酸を与えて一定時間放置した後、放置されたユーグレナからＷＥを回収する、バイオ燃料製造方法が記載されている。回収されるＷＥは、ミリスチン酸（炭素原子数１４）とミリスチルアルコール（炭素数原子数１４）とのエステル、つまりミリスチン酸ミリスチル（炭素原子数２８）を多く含むため、例えばジェット燃料の代替燃料として活用が期待される旨、特許文献１で説明されている。また、プロピオン酸は、ユーグレナ細胞で好気呼吸によるＡＴＰ生合成を阻害し、パラミロンを分解してＡＴＰ生合成せざるを得ない状態に誘導するため、細胞内でＷＥ発酵が促される旨も特許文献１で説明されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開第２０２０／１６２５０２号

【文献】特開２０１７－１４８００５号公報

【文献】特許第６３２９４４０号

【文献】特許第６０１９３０５号

【非特許文献】

【0006】

【文献】M. Cramer, 他１名, Arch. Mikrobiol., 1952, volume 17, pp.384-402

【文献】J. A. Schiff, 他２名, Methods Enzymol., 1971, volume 23, pp.143-162

【文献】L. E. Koren, 他１名, The Journal of Protozoology, 1967, volume 14, supplement, p.17

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

特許文献２に記載された製造方法と比べて、特許文献１に記載された製造方法には、次の利点があると考えられる。１つ目に、糖を与えるからユーグレナの培養に太陽光が必須でないため、天候や日照時間に左右されず、温度管理していれば年間を通じて培養可能な利点がある。２つ目に、低酸素処理と低温処理とが必須でないため、これら処理のための費用や手間を削減可能な利点がある。３つ目に、野生株のユーグレナでもＷＥ収率が高いため、用いるユーグレナが特定の変異株などに限定されずに済む利点がある。

【0008】

しかし、将来的にＷＥ製造の規模を拡大し事業化を図るにはさらに効率良くＷＥ発酵を促進可能な方法を発見できれば望ましい。更に可能であれば、従来の製造方法と比べて、省力化や製造コストが低減化された製造方法を開発できれば好ましい。特許文献１で用いられているプロピオン酸は、悪臭防止法施行規則で特定悪臭物質に指定されている。このため、更に可能であれば、例えばプロピオン酸を用いる場合でも、その使用量を幾らか少なくしても効率良くＷＥ発酵を促進可能なように、ＷＥ製造方法を改善できれば好ましい。

【0009】

そこで本発明の課題は、ユーグレナを用いる従来のワックスエステル製造方法と比べて、より効率良くワックスエステル発酵を促進可能に改善された、ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記した課題を解決するために、本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法は、ユーグレナを準備する工程と、前記ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する工程と、培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える工程と、前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられた前記ユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ工程と、を含み、前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法である。

【0011】

本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法では、前記ワックスエステル発酵促進物質が、グリオキシル酸（グリオキシ酸ともいう。）、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であり得る。

【0012】

前記ワックスエステル発酵促進物質として分子内の炭素原子数が１以上４以下の脂肪酸をさらに含有するものとしても良い。この場合には前記ワックスエステル発酵促進物質全体に対する前記脂肪酸の含有量がモル比（脂肪酸のモル量／ワックスエステル発酵促進物質全体の合計モル量）でを０．５以下となるようにすることが好ましい。

【0013】

本発明に係るワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法は、ユーグレナを準備する工程と、前記ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する工程と、培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える工程と、前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられた前記ユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ工程と、所定の時間にわたり常温に保たれた前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する工程と、を含み、前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法である。

【0014】

本発明に係るワックスエステル発酵促進剤は、分子内にケト基又はヒドロキシ基を有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する組成物であり、糖の存在下において好気的条件で培養されたユーグレナに酸性環境で与えられるための組成物である、ワックスエステル発酵促進剤である。

【0015】

本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産システムは、ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する手段と、培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える手段と、前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する手段と、を備え、前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、ワックスエステル高含有ユーグレナの生産システムである。

【0016】

本発明に係るワックスエステル又はバイオ燃料の製造システムは、ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する手段と、培養された前記ユーグレナに酸性環境でワックスエステル発酵促進物質を与える手段と、前記ワックスエステル発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する手段と、回収された前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する手段と、を備え、前記ワックスエステル発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物である、ワックスエステル又はバイオ燃料の製造システムである。

【発明の効果】

【0017】

本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法によれば、前記ワックスエステル発酵促進物質として、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、かつ分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を用いているために、ワックスエステルの収率を従来よりもさらに高めることができた。また、本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法によれば、プロピオン酸を使用する従来の方法と比べて、高価なプロピオン酸の使用量を低減することにより、ワックスエステル高含有ユーグレナの生産に係るコストを従来よりも低減可能である。

【0018】

さらに、本発明に係るワックスエステル又はバイオ燃料の製造方法によれば、従来の方法と比べて、培養期間を短縮することも可能であるため、培養コストを低減可能で、培養期間の短縮にも関わらずワックスエステル発酵を促進してワックスエステルの収率を高めることができる。このことは、本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産システムや、本発明に係るワックスエステル又はバイオ燃料の生産システムについても同様である。

【0019】

本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法などにおけるワックスエステル発酵促進物質は、ワックスエステルの収率を更に高めやすい観点から例えば、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物であるのが好ましい。本発明に係るワックスエステル発酵促進剤は、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する組成物であるため、効率良くワックスエステル発酵を促進可能である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法の一例を説明するフローチャート。

【図2】本発明に係るワックスエステル製造方法の一例を説明するフローチャート。

【図3】本発明に係るバイオ燃料組成物製造方法の一例を説明するフローチャート。

【図4】実験例１で糖の存在下において対数増殖期の中期まで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有する各群に関して、フェノール硫酸法で定量されたグルコース含有量（パラミロン含有量）の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。グラフ縦軸は、ユーグレナ細胞を含有する５０ｍＬの培地あたりにおける、グルコースに換算した糖含有量（μｇ／ｍＬ）を示し、このことは以下に説明する図６と図８とでも同様である。

【図5】実験例１で糖の存在下において対数増殖期の中期まで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有する各群に関して、分子内の炭素原子数が２８である化合物（Ｃ_２８）の含有量、つまりミリスチン酸ミリスチル含有量の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。グラフ縦軸は、ユーグレナ細胞を含有する５０ｍＬの培地においてユーグレナ細胞１．０×１０^６個あたりにおけるＣ_２８含有量（μｇ／１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ）を示し、このことは以下に説明する図７と図９でも同様である。**はウェルチのｔ検定（両側）においてｐ＜０．０１で有意差ありを意味し、このことは以下に説明する図７と図９とでも同様である。

【図6】実験例２で糖の存在下において対数増殖期の中期まで好気培養されたＳＭ－ＺＫ株を含有する各群に関して、フェノール硫酸法で定量されたグルコース含有量（パラミロン含有量）の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。

【図7】実験例２で糖の存在下において対数増殖期の中期まで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有する各群に関して、Ｃ_２８含有量の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。*はウェルチのｔ検定（両側）においてｐ＜０．０５で有意差ありを意味し、このことは以下に説明する図９でも同様である。

【図8】参考実験例で糖の存在下において定常期に達するまで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有する各群に関して、フェノール硫酸法で定量されたグルコース含有量（パラミロン含有量）の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。

【図9】参考実験例で糖の存在下において定常期に達するまで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有する各群に関して、Ｃ_２８含有量の測定結果を示すグラフ。ｎ＝３。平均値±標準偏差。

【発明を実施するための形態】

【0021】

＜ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法＞
本発明に係るワックスエステル高含有ユーグレナ（ＷＥ高含有ユーグレナ）の生産方法は、例えば図１に示すように、準備工程Ｓ１と、好気培養工程Ｓ２と、ワックスエステル発酵促進物質（ＷＥ発酵促進物質）混合工程Ｓ３と、ワックスエステル発酵（ＷＥ発酵）工程Ｓ４と、ユーグレナ回収工程Ｓ５とを含む。

【0022】

準備工程Ｓ１では、ユーグレナの生細胞を準備する。準備するユーグレナは、動物学の分類上でユーグレナ属（ミドリムシ属）に属する種、及びその変異種からなる群より選ばれた１種類以上の原生動物である。ここでの変異種には、例えば組換え、形質導入、又は形質転換などの遺伝的方法により得られた細胞株（変異株）も含まれる。準備するユーグレナとして例えば、Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis（以下「ユーグレナ・グラシリス」という。）、Euglena granulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglena piride、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena vermiformis、又はEuglena viridis等の種が挙げられる。準備するユーグレナは、野生株か又は変異株かを問わず、その細胞内でＷＥ発酵できれば良い。例えば、準備するユーグレナは、ユーグレナ・グラシリスＺ株（Euglena gracilis Z）を親株として、ストレプトマイシン処理により得られた葉緑体欠損変異株であるＳＭ－ＺＫ株でも、ＷＥ発酵可能であるため良い。

【0023】

準備工程Ｓ１では、池や沼などの淡水中に広く分布している野生のユーグレナを採取しても良いが、既に単離された任意のユーグレナ細胞株を入手するのが効率良い。準備するユーグレナは、適した培養条件が詳しく研究され知られており培養しやすい観点から、ユーグレナ・グラシリス、及びその変異株からなる群より選ばれた１種以上の原生動物であるのが好ましい。例えば、ユーグレナ・グラシリス、ユーグレナ・グラシリスＺ株、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス変種（Euglena gracilis var. bacillaris）、ユーグレナ・グラシリスＥＯＤ－１株（特許文献３参照、受託番号FERM BP-11530）、及びユーグレナ・グラシリスＫｉｓｈｕ株（特許文献４参照、受託番号 FERM P-22300）からなる群より選ばれた１種以上のユーグレナが好ましい。同様の観点から、準備するユーグレナとして更に好ましくは、ユーグレナ・グラシリスＺ株である。

【0024】

ユーグレナは例えば、池の水、又はプールに溜めた水道水などでも培養可能である。雑菌を避けて効率良く培養する観点では、準備工程Ｓ１で、ユーグレナを培養可能な培地も準備するのが好ましい。培地は、ユーグレナを播種して１５℃以上かつ３５℃以下の培地温度で好気的条件に保った場合に、播種したユーグレナを培養し生育可能であれば、特に限定されない。培地は、コンタミネーションに対処しやすい観点では例えば寒天斜面培地などの固体培地でも良いが、安価で調製が容易で撹拌しやすくユーグレナを高密度で培養しやすい観点では液体培地が好ましい。

【0025】

一般的にユーグレナ培養に適した液体培地は、ビタミンＢ_１２と、アンモニウム塩と、その他の無機塩類（リン、カリウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅、モリブテン、又はニッケルを分子内に有する化合物）とを含有し、必要に応じて更に他の栄養素、例えば糖やアミノ酸などを含有する。適した培養条件が詳しく研究され知られており培養しやすい観点では、従来からユーグレナ培養に用いられている公知の液体培地か、又はこれに類似する組成の液体培地を準備するのが更に好ましい。公知の液体培地として例えば以下に組成を示す、クレイマー・マイヤー培地（表１、非特許文献１参照）、ハットナー培地（表２、非特許文献２参照）、又はコーレン・ハットナー培地（以下「ＫＨ培地」という。表３、非特許文献３参照）等が挙げられる。配合を一部変更する場合、次の好気培養工程Ｓ２で培地に糖を添加する手間を省く観点から、公知の液体培地から糖の配合量を増した培地を準備するのが好ましい。

【0026】

【表1】

【0027】

【表2】

【0028】

【表3】

【0029】

本発明の目的に反しない限り、培地には、キレート剤、又はｐＨ調整剤などが含有されているのが好ましい。例えば、表３に記載されたＥＤＴＡ－Ｎａ_２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）はキレート剤として作用する。例えば、表１乃至表３に記載された配合で、リン酸塩やクエン酸はｐＨ調整剤として作用する。培地には、ペプチドを含有する組成物や、アンモニア水が配合されても良い。ペプチドを含有する組成物として例えば、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、又はコーンスティープリカー等が挙げられる。培地には、１種以上の遊離アミノ酸またはその塩が配合されても良い。次の好気培養工程Ｓ２で糖を添加する手間を省く観点では、準備する培地は糖を含有するのが好ましい。糖は、ユーグレナがその細胞内に取り込んで代謝可能な水溶性の糖であれば、特に限定されない。例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、又はデンプン等が挙げられる。二糖類やデンプンは、酵素により単糖類に分解され、栄養素としてユーグレナに利用される。糖は、次の好気培養工程Ｓ２でユーグレナにパラミロン産生を促す観点ではグルコースが好ましく、または、生産コストを安価に抑える観点ではデンプン、糖蜜、又は廃糖蜜などが好ましい。

【0030】

好気培養工程Ｓ２では、ユーグレナ細胞内でパラミロンを産生し貯蔵させるために、準備したユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する。培地に含有させる前記糖の濃度は好気培養工程の間、１質量％以上５質量％の範囲となるようにするのが好ましく、１．５質量％以上３質量％以下とすることがより好ましい。培地を好気的条件に保つ観点から、酸素を含む気体、例えば空気を培地に通気させつつ培養するのが好ましい。効率良く通気させる観点では、培地容量が５Ｌ以下の場合に振とう培養が良く、培地容量が５Ｌよりも大きい場合にバブリングを伴う通気培養が良い。培地及び糖は、先の準備工程Ｓ１の説明で例示した糖を用いれば良い。細胞数の増加やパラミロン生成を促す観点から、好気培養期間の途中で培地でのユーグレナの細胞密度に応じて、培地に追加で糖を加えるのが好ましい。十分量の糖を含有する培地を準備して用いる場合、この培地に糖を添加せず回分培養しても良い。ユーグレナ培養に適した各種の条件を維持可能な場合、例えば培地での溶存酸素濃度や各種の栄養成分の濃度などを一定範囲内に維持できる場合、連続培養しても良い。

【0031】

ユーグレナが光合成可能なように太陽光が照射される環境下で培養しても良いが、好気培養工程Ｓ２では糖の存在下で培養するため、暗黒下でもユーグレナを培養可能である。天候に左右されず培養可能とする観点では通気性を有する培養槽内でユーグレナを培養するのが好ましく、加えてコンタミネーションを避ける観点では通気培養可能な密閉空間が設けられた培養槽内で培養するのが更に好ましい。培地温度は、例えば１５℃以上かつ３５℃以下でも良いが、ユーグレナの細胞内で効率良くパラミロンの貯蔵を促す観点では２５℃以上かつ３０℃以下が好ましい。

【0032】

好気培養工程Ｓ２では、後にＷＥ発酵工程Ｓ４で効率良くＷＥ発酵を促進する観点により、ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する期間を、この条件での培養開始から、まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期または後期までの期間内に留めることが好ましい。一般的には、培地にユーグレナを播種した時点が培養開始の時点となる。対数増殖期は、ユーグレナ細胞の増殖曲線において、細胞数が対数的に増加する時期である。増殖曲線は、例えば、所定の培地にユーグレナ細胞を播種し、一定時間ごとに培地における細胞数または細胞密度を計測し、計測された細胞数または細胞密度をグラフにプロットして作成可能な曲線である。定常期は、対数増殖期を過ぎ、増殖する細胞数と死滅する細胞数とが概ね平衡に達し、細胞数の増加が見られなくなる時期である。播種するユーグレナ株の種類、培地の種類、糖の種類や量、培地温度、及び培地に照射される光量などの培養条件に応じて、定常期における細胞密度、つまり培地で到達し得る最大の細胞密度は異なる。

【0033】

当業者であれば、まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期または後期であることを、既知な任意の指標または方法で判断可能である。例えば、濁度または比増殖速度を指標として判断しても良い。例えば濁度を指標とする場合、ユーグレナ細胞を所定の培養条件で培養するときに、まだ播種されていない培地の濁度を０％とし、定常期に達した培地の濁度を１００％として、培地の相対濁度（％）を指標として判断するのが良い。この相対濁度を指標とする場合、対数増殖期の中期は培地の相対濁度が３５％より大きく７０％以下の期間であり、対数増殖期の後期は培地の相対濁度が７０％より大きく９５％以下の期間である。濁度は、培養液の濁り具合の測定値である。例えば、波長６６０ｎｍの単波長の光を培養液に入射し、透過光を分光光度計により測定する。入射光の強さをＩ_０、透過光の強さをＩ、透過層の厚みをＬ、吸光度をτとしたときに、数式「Ｉ＝Ｉ_０Ｅｘｐ（－τＬ）」により算出された吸光度τを培養液の濁度（ＯＤ）とする。

【0034】

好気培養工程Ｓ２では、後にＷＥ発酵工程Ｓ４で効率良くＷＥ発酵を促進する観点により、ユーグレナの好気培養工程を対数増殖期の中期又は後期で留めるためには、ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する期間を、この条件での培養開始から定常期に至るまでの期間の長さと比べて、０．５倍以上かつ０．８倍以下の期間の長さに留めるのが好ましい。例えば、ユーグレナ細胞の培養開始から定常期に至るまでに１２０時間を要する培養条件があれば、好気培養工程Ｓ２では、ユーグレナ細胞の培養期間を６０時間以上かつ９６時間以下の範囲内に留めるのが好ましい。

【0035】

ＷＥ発酵促進物質混合工程Ｓ３では、好気培養されて細胞内にパラミロンを貯蔵しているユーグレナに、酸性環境でＷＥ発酵促進物質を与える。酸性環境でＷＥ発酵促進物質を与えることにより、ユーグレナ細胞内でパラミロンが分解され、分子内の炭素原子数が２８である化合物（以下「Ｃ_２８」ともいう。）、つまりＷＥの産生が促される。酸性環境は、ＷＥ発酵を促す観点では、培地のｐＨが７．０未満であれば良く、好ましくは６．０以下、更に好ましくは３．５以下であり、ユーグレナの死滅を避ける観点では培地のｐＨが２．５以上であるのが好ましい。ＷＥ発酵促進物質混合工程Ｓ３では例えば、先の好気培養工程Ｓ２を済ませたユーグレナを含む培地に、ＷＥ発酵促進物質と、培地のｐＨを２．５以上かつ３．５以下に調製するためのｐＨ調製剤と、を混合するのが好ましい。

【0036】

本発明におけるＷＥ発酵促進物質は、分子内にケト基、アルデヒド基及びヒドロキシ基のうち少なくとも１つを有し、分子内の炭素原子数が２以上かつ４以下である一価カルボン酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物（Ａ）である。なお、前記化合物（Ａ）は、前記ケト基、アルデヒド基又は前記ヒドロキシ基とは、別にカルボキシル基を有するものである。この化合物（Ａ）としては、例えば、ヒドロキシカルボン酸又は分子内にアルデヒド基又はケト基を有する一価カルボン酸を挙げることができる。前記ヒドロキシカルボン酸として例えば、グリコール酸、乳酸、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸、又はγ－ヒドロキシ酪酸などの化合物が挙げられる。前記分子内にアルデヒド基又はケト基を有する一価カルボン酸として例えば、グリオキシル酸、ピルビン酸、３－オキソプロパン酸、α－ケト酪酸、又はアセト酢酸などの化合物が挙げられる。これらの中でも特に前記化合物（A）として、グリコール酸、グリオキシル酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を用いることが更に好ましい。このような低分子有機化合物は、細胞膜などを透過してユーグレナ細胞内に浸透しやすいと考えられる。ユーグレナ細胞では、細胞内に透過しやすい低分子有機化合物を過剰に供給された場合に、細胞内で好気呼吸を阻害（例えばフィードバック阻害）され、好気呼吸に代わりＡＴＰを獲得するためにＷＥ発酵が促進されやすいものと考えられる。

【0037】

ＷＥ発酵促進物質として、前述した化合物（Ａ）の他に、分子内の炭素原子数が１以上かつ４以下である脂肪酸（Ｂ）をさらに添加するものとしても良い。前記脂肪酸（Ｂ）としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸又はギ酸などの化合物が挙げられる。前記脂肪酸（Ｂ）が、炭素原子数が１以上かつ３以下である直鎖状の飽和炭化水素基を分子内に有する化合物を含有することが好ましい。ＷＥ発酵促進物質は、ここで例示した化合物（Ａ）の群のうち２種以上の化合物を併用するものとしても良いし、脂肪酸（Ｂ）の群から２種類以上の化合物を併用するものとしても良い。また、前記塩とは、本発明の目的に反しない限り、培地の水溶液中で電離可能な塩であれば特に限定されない。塩は、培地中で析出しにくい観点から、ナトリウム塩、又はカリウム塩であることが好ましい。

【0038】

前記化合物（Ａ）と前記脂肪酸（Ｂ）とを併用する場合のＷＥ発酵促進物質は、ＷＥ発酵を促進しやすい観点から、グリオキシル酸とグリコール酸との組み合わせ、グリオキシル酸とプロピオン酸との組み合わせ、または、グリコール酸とプロピオン酸との組み合わせであることが好ましい。グリオキシル酸とプロピオン酸との組み合わせである場合、または、グリコール酸とプロピオン酸との組み合わせである場合には、プロピオン酸のみを用いる場合と比べて、ＷＥ発酵を促しつつプロピオン酸の使用量を低減可能である観点からも好ましい。同様の観点から、ＷＥ発酵促進物質としてプロピオン酸を含む２種以上の化合物を用いる場合、プロピオン酸のＷＥ発酵促進物質に対するモル比（脂肪酸のモル量／ワックスエステル発酵促進物質全体の合計モル量）が、好ましくは０．５以下、更に好ましくは０．４以下である。

【0039】

あるいは、プロピオン酸に起因する臭いの問題を避ける観点から、促進物質混合工程Ｓ３では、培養された前記ユーグレナに酸性環境でＷＥ発酵促進物質を与えるが、プロピオン酸を実質的に与えないものとしても良い。「実質的に与えない」とは、与えないとされている成分が微量に培地中または細胞中に含有されていても、本発明の内容や本質においてＷＥ発酵に寄与しないと認められる程度の微量に過ぎなければ、許容されることを意味する。例えば、ユーグレナ細胞内において代謝の過程で微量のプロピオン酸が産生され得るが、ＷＥ発酵に寄与しない微量に過ぎないため、本発明では許容される。「実質的に与えない」とは、与えないとされている化合物の培地中における濃度が、例えば１００μｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ以下である。

【0040】

ＷＥ発酵促進物質混合工程Ｓ３では、ユーグレナ細胞内で効率良くＷＥ発酵を促す観点から、ユーグレナを含む培地におけるＷＥ発酵促進物質の含有量が、例えば０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、更に好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上になるように、培地に混合してＷＥ発酵促進物質をユーグレナに与えるのが望ましい。ユーグレナ細胞が死滅するのを避ける観点では、ユーグレナを含む培地におけるＷＥ発酵促進物質の含有量が、例えば１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは８．０ｍｍｏｌ／Ｌ未満、更に好ましくは６．０ｍｍｏｌ／Ｌ未満になるように、培地に混合してＷＥ発酵促進物質をユーグレナに与えるのが良い。含有量は、例えばＷＥ発酵促進物質としてグリオキシル酸とグリコール酸とを用いる場合のように、該当する化合物が２種以上ある場合、２種以上の化合物の含有量の合計値を意味する。ユーグレナを含む培地の組成が上記したモル濃度比になる様に、ＷＥ発酵促進物質と、ｐＨ調整剤とを培地に混合するのが好ましい。

【0041】

ＷＥ発酵工程Ｓ４では、細胞内でＷＥ発酵させるために、ＷＥ発酵促進物質を与えられたユーグレナを所定の時間にわたり常温に保つ。自然界では、水面で光合成をしてパラミロンを含蓄したユーグレナ細胞が、日差しの弱い冬期に水底に沈んでパラミロンを分解するＷＥ発酵をしつつ越冬する場合があるため、水底の温度（４℃程度）でも時間をかければＷＥ発酵が進行する。一方、３５℃を超える高温では、ユーグレナ細胞内で代謝が妨げられやすい。常温に保つために、ユーグレナを含有する培地の液温を調整しても良い。省コスト化を図る観点では、外気温が５℃以上かつ３５℃以下である季節や地域でＷＥ発酵工程Ｓ４を行うことで、培地温度を調整するコストを削減するのが好ましい。ＷＥ発酵を促す観点から「常温」は、例えば５℃以上かつ３５℃以下、好ましくは１５℃以上かつ３５℃以下、更に好ましくは２０℃以上かつ３０℃以下であるのが望ましい。

【0042】

個々のユーグレナ細胞で十分にＷＥ発酵させる観点では、ＷＥ発酵工程Ｓ４での「所定の時間」は、例えば６時間以上、好ましくは１２時間以上、更に好ましくは２４時間以上である。必要以上に長時間を要するのを避ける観点では、「所定の時間」は、例えば９６時間以内、好ましくは７２時間以内、更により好ましくは４８時間以内である。ＷＥ発酵促進物質を与えられたユーグレナは、ＷＥ発酵促進物質により細胞内で好気呼吸を妨げられてＷＥ発酵を行うため、低酸素条件に保たれてもＷＥを産生するが、好気的条件に保たれてもＷＥを産生する。低酸素条件に保つ処理の手間や費用を削減する観点では、ＷＥ発酵促進物質を与えられたユーグレナを所定の時間にわたり空気の存在下で常温に保つのが好ましい。
さらに言えば、このＷＥ発酵工程Ｓ４において、ユーグレナを含有する培地に、例えば通気培養のためのバブリング装置を用いて窒素をバブリングするものとしても良い。窒素のバブリングはＷＥ発酵工程の間ずっと行うようにしてもよいが、培地中に外部から酸素が入りこみにくい環境下においては、初めのうちの３時間等の所定時間のみ行うようにしてもよい。
窒素バブリングを行う代わりに、前記培地を収容する容器内を減圧して酸素量を抑えるなどによっても同様の効果が得られると推測できる。

【0043】

ユーグレナ回収工程Ｓ５では、ＷＥ発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収する。例えば、遠心分離機で培地を遠心分離し、沈殿物（沈殿したユーグレナ細胞）を回収すれば良い。回収したユーグレナは、先の準備工程Ｓ１で準備したユーグレナと比べてＷＥ含有量を明らかに高められており、つまりＷＥ高含有ユーグレナになっている。

【0044】

本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法によれば、ユーグレナを、糖の存在下において好気的条件で培養後、酸性環境でＷＥ発酵促進物質を与えて所定の時間にわたり常温に保つことにより、ユーグレナ細胞でＷＥ発酵を促す。ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養する期間を、培養開始からユーグレナの対数増殖期における中期または後期までに留めることにより、その後に所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナでは、意外にも、ＷＥの収率が高められている。このように、本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法によれば、従来のようにユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養するときに培養開始から定常期まで培養する工程を含む方法と比べて、培養期間が短縮されるため培養のコストを低減可能であり、培養期間の短縮にも関わらずＷＥ発酵を促進してＷＥの収率を高めることができる。

【0045】

ＷＥ発酵促進物質としてプロピオン酸のみをユーグレナに与える場合と比べて、グリオキシル酸またはグリコール酸を与える場合に更にＷＥ発酵が促進されるメカニズムは、不明である。グリオキシル酸とグリコール酸とが共にグリコール酸回路での中間生成物であることを考慮すると、これらの添加によってユーグレナ細胞内でより効率的に好気呼吸が阻害されてＷＥ発酵が促されている可能性が考えられる。

【0046】

＜ワックスエステルの製造方法＞
本発明に係るワックスエステル製造方法（ＷＥ製造方法）は、例えば図２に示すように、準備工程Ｓ１と、好気培養工程Ｓ２と、促進物質混合工程Ｓ３と、ＷＥ発酵工程Ｓ４と、ユーグレナ回収工程Ｓ５と、ワックスエステル抽出（ＷＥ抽出）工程Ｓ６と、を含む。工程Ｓ１乃至Ｓ５については、前述した本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法において、図１を用いて説明したとおりである。図２に示すＷＥ抽出工程Ｓ６では、回収されたユーグレナ、つまりＷＥ高含有ユーグレナから、ＷＥを抽出する。このための具体的な手法は、ＷＥを抽出可能であれば、本発明の目的に反しない限り特に限定されない。例えば、ＷＥ高含有ユーグレナの細胞を破砕し、遠心分離し、疎水性の上清（ユーグレナに由来するＷＥ層）を採取すれば良い。必要に応じて採取した上清を精製しても良く、例えば後述するＷＥ抽出方法を行っても良い。本発明に係るＷＥ製造方法によれば、その実施過程で本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法を実施するため、ユーグレナを用いる従来のＷＥ製造方法と比べて、培養期間が短縮されて培養コストを低減可能であり、培養期間の短縮にも関わらずＷＥ発酵を促進しＷＥの収率を高めることができる。ユーグレナに由来するＷＥは、バイオ燃料組成物の原料に限らず、例えば、化粧品原料、石鹸、家畜飼料原料、又は養魚飼料原料などとしても活用可能である。
また、ここではユーグレナからＷＥを抽出する方法を説明したが、ＷＥ高含有ユーグレナからＷＥを抽出せずに、培地から回収したＷＥ高含有ユーグレナの乾燥体をそのまま燃料として用いることも可能である。

【0047】

＜バイオ燃料組成物の製造方法＞
本発明に係るバイオ燃料組成物の製造方法は、例えば図３に示すように、準備工程Ｓ１と、好気培養工程Ｓ２と、促進物質混合工程Ｓ３と、ＷＥ発酵工程Ｓ４と、ユーグレナ回収工程Ｓ５と、ＷＥ抽出工程Ｓ６と、バイオ燃料調製工程Ｓ７と、を含む。工程Ｓ１乃至Ｓ５については図１を用いて前述したとおりであり、工程Ｓ６については図２を用いて説明したとおりである。バイオ燃料調製工程Ｓ７では、ユーグレナに由来するＷＥを用いて、バイオ燃料組成物を調製する。例えば、ＷＥを用いてバイオ燃料を製造するための公知の手法を実施すれば良い。本発明に係るバイオ燃料組成物の製造方法によれば、その実施過程で本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法を実施するため、ユーグレナを用いる従来のバイオ燃料製造方法と比べて、培養期間が短縮されて培養コストを低減可能であり、培養期間の短縮にも関わらずＷＥ発酵を促進しＷＥの収率を高めることができる。

【0048】

＜ワックスエステル発酵促進剤＞
本発明に係るワックスエステル発酵促進剤（ＷＥ発酵促進剤）は、プロピオン酸よりもＷＥ発酵を促進しやすい化合物である観点から、グリオキシル酸、グリコール酸、及びその塩からなる群より選ばれた１種以上の化合物を含有する組成物である。また、本発明に係るＷＥ発酵促進剤は、糖の存在下において好気的条件で培養されたユーグレナに酸性環境で与えられるための組成物である。ＷＥ発酵促進剤は、糖の存在下において定常期に達するまで好気的条件で培養されたユーグレナに酸性環境で与えられるための組成物でも良い。更にＷＥ発酵を促す観点から、ＷＥ発酵促進剤は、糖の存在下における好気的条件での培養を、まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期または後期までに留められたユーグレナに、酸性環境で与えられるための組成物であるのが好ましい。ＷＥ発酵促進剤は、液体製剤でも良いし、又は固形製剤でも良い。固形製剤である場合のＷＥ発酵促進剤は、液体培地中で溶解しやすいように、タブレット状、錠剤、顆粒、懸濁液、シロップ、又は乾燥粉末などの形態を採り得る。ＷＥ発酵促進剤は、ＷＥ発酵促進物質と共に、必要に応じて例えば、賦形剤、抗酸化剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、又は着色剤などの公知の添加剤を含有しても良い。ＷＥ発酵促進剤は、例えば、本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産方法、本発明に係るＷＥ製造方法、または、本発明に係るバイオ燃料組成物の製造方法においてＷＥ発酵促進物質混合工程Ｓ３（図１乃至図３）で活用可能である。

【0049】

＜ワックスエステル高含有ユーグレナの生産システム＞
本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産システムは、培養手段と、ＷＥ発酵促進物質供給手段と、回収手段とを備える。培養手段は、ユーグレナを糖の存在下において好気的条件で培養するための手段である。培養手段として例えば、図１を用いて説明した準備工程Ｓ１と好気培養工程Ｓ２とを実施可能なように、ユーグレナを培養するための培養槽と、ユーグレナ培養に適した培地との組み合わせが挙げられる。培養手段として必要に応じて更に、培地に混合するのが良い糖などの栄養素や、通気培養のためのバブリング装置を有する組合せが好ましい。好気培養の期間は、培養開始からユーグレナの対数増殖期における中期または後期までに留められる。ＷＥ発酵促進物質供給手段は、糖の存在下で好気的条件培養されて細胞内にパラミロンを含蓄したユーグレナに、酸性環境で、前述したＷＥ発酵促進物質を与えるための手段である。回収手段は、ＷＥ発酵促進物質を与えられてから所定の時間にわたり常温に保たれたユーグレナを回収するための手段である。

【0050】

＜ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造システム＞
本発明に係るＷＥ製造システムは、前述した本発明に係るＷＥ高含有ユーグレナの生産システムに加えて更に、回収したユーグレナからＷＥを抽出するための抽出手段を備える。抽出手段として例えば、遠心分離機と、細胞破砕装置との組み合わせが挙げられる。ＷＥを精製する場合、抽出手段として更に、ＷＥ抽出に適した溶媒を含む組合せが好ましい。ＷＥ抽出に適した溶媒として、例えばアセトンが挙げられる。本発明に係るバイオ燃料組成物の製造システムは、本発明に係るＷＥ製造装置に加えて更に、ユーグレナに由来するＷＥを他の燃料用原料と混合させてバイオ燃料組成物を調製するための手段を備える。

【0051】

本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で当業者の知識に基づいて種々なる改良、修正、又は変形を加えた態様でも実施できる。本発明は、同一の作用又は効果を生じる範囲内で、いずれかの発明特定事項を他の技術に置換した形態で実施しても良い。次に実施例などを示して本発明を具体的に説明するが、本発明は次の実施例に制限されるものではない。

【実施例】

【0052】

＜パラミロン定量方法＞
後述する実験例１と実験例２と参考実験例とでは、以下に説明する方法により、ユーグレナ細胞からパラミロンを抽出し定量した。ユーグレナ細胞を含有する液体培地（例えばＫＨ培地）を遠心分離し、沈殿物（沈殿したユーグレナ細胞）を採取し、沈殿物に１００質量％のアセトンを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌するか又は超音波破砕機で処理して、懸濁液を調製した。この懸濁液を、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、上清を除去し、沈殿物に１００質量％のアセトンを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌するか又は超音波破砕機で処理して懸濁液を調製する操作を、沈殿物が白色になるまで繰り返した。上清を除去して得られる白色の沈殿物に、１．０ｍＬの１．０質量％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を加え、ボルテックスミキサーで撹拌し懸濁させ、５分間にわたり沸騰水浴させ、氷上に静置して十分に冷やした。この氷冷されたＳＤＳ溶液を、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、上清を除去し、沈殿物を超純水で洗浄し、再び遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して上清を除去し、沈殿物に１．０ｍＬかつ１．０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、沈殿物を目視できなくなるまで一晩にわたり振とうすることにより、パラミロン定量用懸濁液を得た。

【0053】

懸濁液でのパラミロン含有量を、以下に説明するフェノール硫酸法により測定した。パラミロン定量用懸濁液を希釈して０．２ｍＬ採取して試験管内に注ぎ、ボルテックスミキサーで撹拌し、０．２ｍＬの５質量％フェノール溶液を混合し、エッペンドルフ社製のMultipette（登録商標）M4で１．０ｍＬの濃硫酸を勢いよく加え、ボルテックスミキサーでよく撹拌し混合させた混合液を調製した。この混合液を、３０分間にわたり３０℃に保温後、２００μＬずつ９６ウェルマイクロプレートに分注し、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍでの吸光度を測定した。フェノール硫酸法での検量線については、１０ｍｇ／ｍＬのグルコース水溶液を超純水で希釈して、各々、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、３１．２５μｇ／ｍＬ、及び１５．６２５μｇ／ｍＬのグルコース水溶液を調製し、各々のグルコール水溶液をパラミロン定量用懸濁液と同様に処理し、波長４９０ｎｍでの吸光度を測定して検量線を作成した。

【0054】

＜ワックスエステル定量方法＞
後述する実験例１と実験例２と参考実験例では、以下に説明する方法により、ユーグレナ細胞からＷＥを抽出し定量した。ユーグレナ細胞を含有する液体培地（例えばＫＨ培地）を遠心分離し、沈殿物（沈殿したユーグレナ細胞）を採取し、クロロホルム：メタノール：超純水（例えばＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水）＝１０：２０：８となる体積比で混合した溶液を添加し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌するか又は超音波破砕機で１５分間処理し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３分）して上清を採取する操作を行った。この操作を３回繰り返して得られる上清は、高濃度のＷＥを含有する白色の脂質溶液になった。例えば１．８ｍＬの脂質溶液に対して１．０ｍＬのクロロホルムと１．０ｍＬの超純水とを添加し、ボルテックスミキサーで３０秒かけて撹拌し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃、３分）し、上層である水とメタノールとの混合層を除去し、下層であるクロロホルム層を採取した。採取したクロロホルム層を真空乾燥機で乾固させ、乾固物を５００μＬのヘキサンに溶解させ、希釈して分析用試料液を調製し、以下のようにガスクロマトグラフ質量分析計（以下「ＧＣ－ＭＳ」という。）を用い、分子内の炭素原子数が２８である化合物（Ｃ_２８）、つまりＷＥの一種であるミリスチン酸ミリスチルを定量した。

【0055】

ＧＣ－ＭＳとして、株式会社島津製作所製のGCMS-QP2010 Ultraを用いた。分離用カラムとして、アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent J&W GCカラム-DB-5ms（カラム長３０ｃｍ、内径０．２５ｍｍ、膜孔０．２５μｍ）を用いた。１．０μＬの分析用試料液を分離用カラムに注入し、キャリアガスとしてヘリウムを流量１．１６ｍＬ／分で分離用カラムに注入した。分析用試料液に含有される成分の分離にあたり、最初の１分間はカラム温度を１００℃に設定し、次にカラム温度を２８０℃まで１０℃／分で昇温させ、その後にカラム温度を１０分間にわたり２８０℃に保った。インターフェイスとイオン源とを２５０℃に設定した。ミリスチン酸ミリスチルは７０ｅＶでイオン化され、ＳＩＭモードでｍ／ｚ＝２２９．２とｍ／ｚ＝５７．１とで検出され定量された。標準試料溶液として、シグマアルドリッチ社製のミリスチン酸ミリスチルの含有量が、３．０μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、又は０．１μｇ／ｍＬとなるようにヘキサンに溶解させた溶液を用いた。

【0056】

＜実験例１＞
ユーグレナとして、大阪府立大学の食品代謝栄養学研究室から分譲された、実験用のユーグレナ・グラシリスＺ株を準備した。このユーグレナを培養するために、フラスコ内でＫＨ培地（前述した表３参照）を調製した。フラスコの口部に綿栓を詰め、オートクレーブにより２気圧、１２１℃で１５分間かけて加圧滅菌した。滅菌した培地をクリーンベンチ内に置き、培地が冷えてから、雑菌が混入しないように、培地に１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ以上かつ３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ以下程度のユーグレナ細胞が播種されるように、細胞の懸濁液を少量添加した。細胞の懸濁液を添加した時点を、培養開始とした。培養開始から、２８℃以上かつ３０℃以下に保たれた培養室内で、細胞を播種された培地を暗黒下で振とう機により８０ｒｐｍ程度で振とうし続けることにより、ユーグレナを２質量％の糖の存在下において好気的条件で培養した。なお、この条件で培養する場合、ユーグレナ細胞が定常期に達するには、６日間以上（１４４時間以上）の培養期間を要する。実験例１では、この条件での好気培養を培養開始から９６時間（４日間）経過時に終えた。つまり、実験例１では、好気培養期間を、まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期までに留めた。

【0057】

好気培養期間の終了後、直ちに培地を攪拌して少量を採取し、血球計算盤上に滴下し、液滴上にカバーガラスを貼り付けた。顕微鏡で観察し、血球計算盤上で縦１．０ｍｍ×横１．０ｍｍの区画内にあるユーグレナ細胞数を数えた。Ｎ_Ｎを「１．０ｍｍ^２あたりにある細胞数の平均値」とし、計算式「Ｎ_Ｃ＝Ｎ_Ｎ×１０^４」により、培地１．０ｍＬあたりの細胞数Ｎ_Ｃを算出した。この計算式における「１０^４」は、１．０ｍｍ^２に対する容量の変換値である。実験例１で好気培養を終えた時点のＫＨ培地において、ユーグレナ細胞数は５．３７×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。また、多数のフラスコを準備し、まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期まで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有するＫＨ培地を、好気培養期間の終了後に直ちに、各々のフラスコに５０ｍＬずつ分注した。分注された各々のフラスコにおけるユーグレナを、次に説明する、０時間群Ａ、窒素処理群Ａ、プロピオン酸群Ａ、グリコール酸群Ａ、グリオキシル酸群Ａ、グリコール酸＆プロピオン酸群Ａ、および、グリオキシル酸＆プロピオン酸群Ａのうちいずれか１種類の群に分類した。

【0058】

０時間群Ａでは、好気培養を終えると直ちに、前述した定量方法でユーグレナ細胞のパラミロン含有量とＷＥ含有量とを定量した。窒素処理群Ａでは、室温２８℃以上かつ３０℃以下に保たれた培養室内で、培地にＷＥ発酵促進物質を添加することなく、培地に窒素ガスを供給してバブリングさせながら２４時間にわたり静置後、同様にしてユーグレナ細胞のパラミロン含有量とＷＥ含有量とを定量した。プロピオン酸群Ａでは、培地でのプロピオン酸濃度が４．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにプロピオン酸を添加して培地を弱酸性にし、綿栓を介して通気させつつ前記培養室内で２４時間にわたり静置後、同様にしてユーグレナ細胞のパラミロン含有量とＷＥ含有量とを定量した。グリコール酸群Ａでは、培地でのグリコール酸濃度が４．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように培地にプロピオン酸を添加した他は、プロピオン酸群Ａと同様にした。グリオキシル酸群Ａでは、培地でのグリオキシル酸濃度が４．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように培地にグリオキシル酸を添加した他は、プロピオン酸群Ａと同様にした。グリコール酸＆プロピオン酸群Ａでは、培地でグリコール酸濃度が２．０ｍｍｏｌ／Ｌとなりプロピオン酸濃度が２．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、グリコール酸とプロピオン酸とを培地に添加した他は、プロピオン酸群Ａと同様にした。グリオキシル酸＆プロピオン酸群Ａでは、培地でグリオキシル酸濃度が２．０ｍｍｏｌ／Ｌとなりプロピオン酸濃度が２．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、グリオキシル酸とプロピオン酸とを培地に添加した他は、プロピオン酸群Ａと同様にした。パラミロン含有量の定量結果を図４と次の表４とに示し、Ｃ_２８含有量の定量結果を図５と次の表４とに示す。

【0059】

【表4】

【0060】

図４と表４とで示すように、プロピオン酸群Ａでは、０時間群Ａと比べてパラミロン含有量の減少は示されなかった。一方、プロピオン酸群Ａと比べて、窒素処理群Ａ，グリコール酸群Ａ、及びグリオキシル酸群Ａの各々では、パラミロン含有量が明らかに少なかった。窒素処理群Ａ、グリコール酸群Ａ、及びグリオキシル酸群Ａの各々と比べて、それぞれ、グリコール酸＆プロピオン酸群Ａと、グリオキシル酸＆プロピオン酸群Ａとでは、パラミロン含有量が明らかに少なかった。図５と表４とで示すように、０時間群Ａと比べて、他の群ではＣ_２８含有量が多かった。また、プロピオン酸群Aと比べて、窒素処理群Ａ、グリコール酸群Ａ、グリオキシル酸群A、グリコール酸＆プロピオン酸群Ａ、および、グリオキシル酸＆プロピオン酸群Aの各々では、Ｃ_２８含有量が多かった。

【0061】

図４と図５と表４とに示した実験結果から、グリコール酸とグリオキシル酸との各々は、特許文献１で好適とされたプロピオン酸よりも、細胞内に含蓄されたパラミロンを代謝してミリスチン酸ミリスチルを産生するＷＥ発酵を効率良く促進しやすい化合物であることが示唆された。また、ＷＥ発酵促進物質として、グリコール酸とプロピオン酸とが合計で４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように併用する場合や、グリオキシル酸とプロピオン酸とが合計で４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように併用する場合には、４ｍｍｏｌ／Ｌのプロピオン酸のみを用いる場合と比べて、プロピオン酸の使用量を削減しつつもＷＥ発酵を効率良く促進可能であることが示唆された。

【0062】

＜実験例２＞
ユーグレナ・グラシリスＺ株を用いた実験例１と比べて、実験例２ではユーグレナとして、大阪府立大学の食品代謝栄養学研究室から分譲されたＳＭ－ＺＫ株を用いるように変更したことを除けば、その他は実験例１と同条件で実験を行った。実験例２で好気培養を終えた時点のＫＨ培地において、ユーグレナ細胞数は７．０５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。まだ定常期に至っていない対数増殖期の中期まで好気培養されたＳＭ－ＺＫ株を含有するＫＨ培地を、好気培養期間の終了後に直ちに、各々のフラスコに５０ｍＬずつ分注した。前述した実験例１では０時間群Ａ、窒素処理群Ａ、プロピオン酸群Ａ、グリコール酸群Ａ、グリオキシル酸群Ａ、グリコール酸＆プロピオン酸群Ａ、および、グリオキシル酸＆プロピオン酸群Ａの各々を調製したが、この順で実験例２では同様の操作により、０時間群Ｂ、窒素処理群Ｂ、プロピオン酸群Ｂ、グリコール酸群Ｂ、グリオキシル酸群Ｂ、グリコール酸＆プロピオン酸群Ｂ、および、グリオキシル酸＆プロピオン酸群Ｂの各々を調製した。実験例２で調製した各群について、パラミロン含有量の定量結果を図６と次の表５とに示し、Ｃ_２８含有量を図７と次の表５とに示す。

【0063】

【表5】

【0064】

図６と図７と表５とに示すように、ＳＭ－ＺＫ株を用いた実験例２では、ユーグレナ・グラシリスＺ株を用いた実験例１と同様の実験結果が示された。このため、ユーグレナ・グラシリスＺ株やＳＭ－ＺＫ株に限らず、グリコール酸とグリオキシル酸との各々は、プロピオン酸よりもＷＥ発酵を効率良く促進しやすい化合物であろうと考えられる。

【0065】

＜実験例３＞
好気培養期間をまだ定常期に至っていない対数増殖期の中期までに留めた実験例１と比べて、実験例３では、定常期に達するまで好気培養を行うように変更したことを除けば、その他は実験例１と同条件で実験を行った。つまり、実験例３では、ユーグレナ・グラシリスＺ株を、ＫＨ培地（糖の存在下）において好気的条件で培養開始から１６８時間（７日間）経過時まで培養した。実験例３で好気培養を終えた時点のＫＨ培地において、ユーグレナ細胞数は２．０４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。このため、実験例３では、定常期に達するまで好気培養したことにより、実験例１と比べてユーグレナ細胞数が約３．８倍となった。定常期に達するまで好気培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株を含有するＫＨ培地を、好気培養期間の終了後に直ちに、各々のフラスコに５０ｍＬずつ分注した。前述した実験例１では０時間群Ａ、窒素処理群Ａ、プロピオン酸群Ａ、グリコール酸群Ａ、及びグリオキシル酸群Ａの各々を調製したが、この順で実験例３では同様の操作により、０時間群Ｃ、窒素処理群Ｃ、プロピオン酸群Ｃ、グリコール酸群Ｃ、及びグリオキシル酸群Ｃの各々を調製した。実験例３で調製した各群について、パラミロン含有量の定量結果を図８と次の表６とに示し、Ｃ_２８含有量の定量結果を図９と次の表６とに示す。

【0066】

【表6】

【0067】

図９と表６とに示すように、定常期に達するまでＫＨ培地（糖の存在下）において好気的条件で培養されたユーグレナ・グラシリスＺ株でも、グリコール酸とグリオキシル酸との各々は、プロピオン酸よりもＷＥ発酵を効率良く促進しやすい化合物であることが示唆された。表６（実験例３）と前述した表４（実験例１）とを比べると明らかなように、または、図８（実験例３）と図４（実験例１）とを比べると明らかなように、好気培養を対数増殖期の中期までに留めた実験例１での各群と比べて、好気培養を定常期に達するまで行った実験例３の各群では、フェノール硫酸法で定量したグルコース含有量（パラミロン含有量）が１００倍前後多かった。このため、図８（参考実験例）と図４（実験例１）とでは、グラフ縦軸で数値の桁数が異なっている。このように、好気培養を対数増殖期の中期までに留める場合と比べて、好気培養を定常期に達するまで継続すると、個々のユーグレナ細胞内にパラミロンが多く含蓄されることが確認された。

【0068】

それにも関わらず、意外にも、表６（実験例３）と前述した表４（実験例１）とを比べると明らかなように、または図９（実験例３）と図５（実験例１）とを比べると明らかなように、好気培養を対数増殖期の中期までに留めた実験例１での各群と比べて、好気培養を定常期に達するまで行った実験例３の各群では、Ｃ_２８含有量（ミリスチン酸ミリスチル含有量）が０．１倍前後であった。換言すれば、好気培養を定常期に達するまで行った実験例３の各群と、好気培養を対数増殖期の中期までに留めた実験例１との比較から、好気培養の期間を対数増殖期の中期までに留めた場合であっても、ユーグレナの体内におけるＣ_２８含有量（ミリスチン酸ミリスチル含有量）は十分に高くなっていることが分かる。この結果から、グリコール酸とグリオキシル酸を与えた場合には、好気培養期間を短くした場合であってもＷＥを十分に高含有したユーグレナが得られることが分かった。

【0069】

従来どおりに定常期まで好気培養を行う場合と比べて、ユーグレナ１個体あたりのＷＥ含有量が大きくなるメカニズムは、本願出願時に不明であるものの、次のように推察される。ユーグレナは、栄養条件に応じて細胞内の貯蔵物質を変化させることで、多様な栄養条件下で生育可能という特性を有する。この特性は、ユーグレナ細胞が晒されている環境に応じてその時々で生成可能な栄養素を細胞内に含蓄することによって、飢餓環境下でのユーグレナの生存力を保障する特性として、進化の過程で突然変異と自然選択（自然淘汰）との繰返しによりユーグレナ細胞に備わったものと考えられる。また、対数増殖期の途中にあるユーグレナ細胞では、細胞が盛んに分裂または増殖していることからすれば、細胞数の増加や細胞の生存に資する代謝経路は実質的に抑制されておらず、ユーグレナ細胞が本来に備えているＷＥ発酵能が十分に発揮されやすいのであろうと考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0070】

本発明によれば、従来よりも効率良くワックスエステル（ＷＥ）発酵を促進可能に改善された、ＷＥ高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ＷＥ又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ＷＥ発酵促進剤を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】