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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-20
(45)【発行日】2023-07-28
(54)【発明の名称】カンキツ品種の識別方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230721BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20230721BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230721BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6827 Z
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020128757
(22)【出願日】2020-07-30
(65)【公開番号】P2022025729
(43)【公開日】2022-02-10
【審査請求日】2022-06-13
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100189094
【弁理士】
【氏名又は名称】田邉 陽一
(72)【発明者】
【氏名】島田 武彦
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 朋子
(72)【発明者】
【氏名】藤井 浩
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】Takahiro Noda et al.,，Euphytica，2020年06月29日，Vol. 216, No. 115，DOI: 10.1007/s10681-020-02654-2
【文献】Qiuying Fang et al.,，Plant Molecular Biology Reporter，2018年09月03日，Vol. 36，pp. 653-662，10.1007/s11105-018-1111-1
【文献】Frederique Ollitrault et al.,，American Journal of Botany，2012年，pp. e268-e273，DOI: 10.3732/ajb.1100569
【文献】Yoshihiro Kawahara et al.,，Breeding Science，2020年03月05日，Vol. 70，pp. 200-211，DOI: 10.1270/jsbbs.19097
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
識別対象であるカンキツ植物のインデルマーカーを利用してカンキツ品種を識別する方法であって、下記（１）、（２）、及び（３）に記載の工程を含むことを特徴とする、カンキツ品種「あすみ」を識別するためのカンキツ品種の識別方法：（１）前記識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９に関してＣｐ０４１９欠失型配列を検出する工程、
（２）前記識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４に関してＩＮＤ２１４欠失型配列を検出する工程、
（３）前記（１）及び（２）に記載の工程においてＣｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、前記識別対象であるカンキツ植物の品種が「あすみ」であると判定する工程、
；
前記（１）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＣｐ０４１９に関して、
（１ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン内に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、第２１１７番目の塩基「Ｇ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基を示し、第２２８７番目の塩基「Ｔ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基を示し、第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（１ｂ）前記識別対象であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＣｐ０４１９挿入型配列を示し、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＣｐ０４１９欠失型配列を示す、
；
前記（２）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＩＮＤ２１４に関して、
（２ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、第２５０３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基を示し、第２７１３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基を示し、第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（２ｂ）前記識別対象であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４挿入型配列を示し、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列を示す、
；
前記（１）に記載の工程が、前記識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡに対して、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行うことを含む工程であり、
前記（２）に記載の工程が、前記識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡに対して、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行うことを含む工程であり、
前記（１）に記載の工程のＰＣＲ反応及び前記（２）に記載の工程のＰＣＲ反応が、同一のＰＣＲ反応液にて同時に行われるＰＣＲ反応である、
；
前記Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むＰＣＲプライマーセットが、
Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマー（配列番号６で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、又は、プライマー構成塩基の３’端側の塩基配列が配列番号６で示す塩基配列と一致する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー）、及び、
Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー（配列番号５で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、又は、プライマー構成塩基の３’端側の塩基配列が配列番号５で示す塩基配列と一致する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー）、
からなるＰＣＲプライマーセットである、
；
前記ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むＰＣＲプライマーセットが、
ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマー（配列番号１１で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、又は、プライマー構成塩基の３’端側の塩基配列が配列番号１１で示す塩基配列と一致する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー）、及び、
ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー（配列番号１２で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー、又は、プライマー構成塩基の３’端側の塩基配列が配列番号１２で示す塩基配列と一致する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー）、
からなるＰＣＲプライマーセットである。
【請求項2】
前記（１）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出する工程のＰＣＲ反応、及び、前記（２）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出する工程のＰＣＲ反応が、前記識別対象であるカンキツ植物の植物体、前記植物体の加工品、又は前記植物体若しくは加工品から抽出されたＤＮＡ、を対象試料としたＰＣＲ反応である、請求項１に記載のカンキツ品種「あすみ」を識別するためのカンキツ品種の識別方法。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のカンキツ品種「あすみ」を識別するためのカンキツ品種の識別方法を使用することを含む、カンキツ品種「あすみ」の植物体を栽培する方法、カンキツ品種「あすみ」の果実を生産する方法、又は、カンキツ品種「あすみ」の果実の加工品を生産する方法。
【請求項4】
請求項１に記載のカンキツ品種「あすみ」を識別するためのカンキツ品種の識別方法で用いるためのカンキツ品種識別キットであって、
；
当該キットが、
請求項１に記載のＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマー、請求項１に記載のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマー、請求項１に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマー、及び、請求項１に記載のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー、を含む溶液、
を構成物品として含む、マルチプレックスＰＣＲ反応を行うためのキットである、
；
カンキツ品種「あすみ」を識別するためのカンキツ品種識別キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カンキツ品種「あすみ」を他のカンキツ品種から精度良く迅速に識別可能な技術であり且つ検査現場でも広く導入可能な技術に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、カンキツの「あすみ」、ブドウの「シャインマスカット」など農研機構で育成した優良な新品種が海外へ流出し、無断で栽培される事例が顕在化している。今後、これらの生産物による権利侵害の発生が懸念されることから、権利侵害が想定される諸国において品種登録出願が行われると伴に、権利侵害を立証するためのＤＮＡ品種識別技術の開発が進められている。「あすみ」の育成者権の侵害を監視するためには、税関等の水際において輸入を阻止することが重要である。このため、既存の品種識別技術に加え、税関等の検査現場において簡易かつ迅速に品種識別が可能な技術開発が求められている。
【0003】
農研機構果樹茶部門は、国内で流通するカンキツの種苗を対象としたＣＡＰＳマーカーによる品種識別技術を開発した。当該技術に関して、当部門ではＩＳＯ（国際標準化機構）基準に準拠したカンキツ品種のＤＮＡ品種識別技術マニュアルを作成している（非特許文献１）。ここで、ＣＡＰＳマーカー分析技術は、特定のゲノム領域を対象にしたＰＣＲ増幅断片を特定の制限酵素で切断し、品種間に存在する塩基置換や欠失・挿入といったゲノムＤＮＡの多型によって生じる制限酵素断片のサイズの差異を利用する技術である。当該技術を利用した分析には高額機器が不要であり、検査現場への普及性は高い。
しかしながら、果実や加工品を対象とした品種識別では、糖、酸、ポリフェノールなどの夾雑物の混入、加工時の熱処理や化学処理などにより高品質のＤＮＡサンプルが得にくい。そのため、制限酵素を利用した多型検出のためには比較的長いＰＣＲ増幅断片を利用するＣＡＰＳ分析法は、夾雑物によりＰＣＲや制限酵素処理における酵素阻害やＰＣＲ増幅効率の低下などにより、分析結果が不安定になる課題がある。
しかしながら、果実や加工品を対象とした品種識別では、糖、酸、ポリフェノールなどの夾雑物の混入、加工時の熱処理や化学処理などにより高品質のＤＮＡサンプルが得にくい。そのため、制限酵素を利用した多型検出のためには比較的長いＰＣＲ増幅断片を利用するＣＡＰＳ分析法は、夾雑物によりＰＣＲや制限酵素処理における酵素阻害やＰＣＲ増幅効率の低下などにより、分析結果が不安定になる課題がある。
【0004】
また、同部門では、ＣＡＰＳ法の他に、果実や加工品を対象としたＳＮＰマーカーによる品種識別技術を開発した（非特許文献２）。当該ＳＮＰ分析法は、１００ｂｐ程度の特定のゲノム領域を対象にしたＰＣＲ増幅断片中の１塩基多型を蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブで検出する技術であり、高精度に多型が検出でき、分析に要する時間が極めて短いという利点がある。
この点、ＳＮＰ分析法は、ＣＡＰＳ法での分析精度の課題を克服した技術と認められるところ、一方、ＳＮＰマーカーの検出に利用する特殊な修飾プローブ合成や試薬等のランニングコストが高額であるという課題が認められる。また、当該ＳＮＰ法を簡便に行うためには、リアルタイムＰＣＲ装置の導入が必要となる。
この点、ＳＮＰ分析法は、ＣＡＰＳ法での分析精度の課題を克服した技術と認められるところ、一方、ＳＮＰマーカーの検出に利用する特殊な修飾プローブ合成や試薬等のランニングコストが高額であるという課題が認められる。また、当該ＳＮＰ法を簡便に行うためには、リアルタイムＰＣＲ装置の導入が必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】ＣＡＰＳマーカーによるカンキツ２２品種のＤＮＡ品種識別技術、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、２０１９年３月２９日 初版
【文献】Breeding Science, (2020) https://doi.org/10.1270/jsbbs.19142; T. Endo et al.; TaqMan-MGB SNP genotyping assay to identify 48 citrus cultivars distributed in the Japanese market
【文献】Tree Genetics & Genomes, (2014) 10, 1001-1013; T. Shimada et al.; Construction of a citrus framework genetic map anchored by 708 gene-based markers
【文献】Plant Molecular Biology Reporter, (2018) https://doi.org/10.1007/s11105-018-1111-1; Q. Fang et al.; Development of Species-Specific InDel Markers in Citrus
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、上記従来技術の事情に鑑みてなされたものでありその課題とする処は、カンキツ品種「あすみ」を他のカンキツ品種から精度良く迅速に識別可能な技術であり、且つ、検査現場等でも広く導入可能な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記従来技術の状況において、本発明者らはカンキツ植物のゲノムＤＮＡに存在する１８４種類のインデルマーカーに着目して検討を行ったところ、品種「あすみ」にてアレル多型を示す２種類のインデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４を見出した。
そこで、本発明者らは、日本国内の９８％以上のカンキツ果実の流通量をカバーする４８品種を含めて、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型を調査したところ、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型が「ヘテロ型」（相同染色体に挿入型配列と欠失型配列を有するヘテロ型）を示したカンキツ品種は、品種「あすみ」のみであることを見出した。ここで、当該調査結果は、日本国内の流通量の観点でＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別の精度を充足する調査結果と認められた。即ち、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座に関して、挿入型配列と欠失型配列をヘテロで有するアレル型を見出すことによって、品種「あすみ」の識別が可能となることが示された。
更に本発明者らは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのいずれからも欠失型配列が検出された場合、識別対象のカンキツ品種が品種「あすみ」であると判定できることを見出した。即ち、品種「あすみ」の識別は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座から「インデルマーカーの欠失型配列のみ」を検出することによって、当該識別が可能であることが示された。
そこで、本発明者らは、日本国内の９８％以上のカンキツ果実の流通量をカバーする４８品種を含めて、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型を調査したところ、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型が「ヘテロ型」（相同染色体に挿入型配列と欠失型配列を有するヘテロ型）を示したカンキツ品種は、品種「あすみ」のみであることを見出した。ここで、当該調査結果は、日本国内の流通量の観点でＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別の精度を充足する調査結果と認められた。即ち、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座に関して、挿入型配列と欠失型配列をヘテロで有するアレル型を見出すことによって、品種「あすみ」の識別が可能となることが示された。
更に本発明者らは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのいずれからも欠失型配列が検出された場合、識別対象のカンキツ品種が品種「あすみ」であると判定できることを見出した。即ち、品種「あすみ」の識別は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座から「インデルマーカーの欠失型配列のみ」を検出することによって、当該識別が可能であることが示された。
【0008】
本発明者らは上記知見に基づいて本発明を完成するに至った。本発明は具体的には以下に記載の発明に関する。
［項１］
下記（１）、（２）、及び（３）に記載の工程を含む、カンキツ品種の識別方法：
（１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、
（２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、
（３）前記（１）及び（２）に記載の工程においてＣｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程、
；
前記（１）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＣｐ０４１９に関して、
（１ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン内に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、第２１１７番目の塩基「Ｇ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基を示し、第２２８７番目の塩基「Ｔ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基を示し、第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（１ｂ）対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＣｐ０４１９挿入型配列を示し、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＣｐ０４１９欠失型配列を示す、
；
前記（２）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＩＮＤ２１４に関して、
（２ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、第２５０３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基を示し、第２７１３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基を示し、第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（２ｂ）対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４挿入型配列を示し、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列を示す。
［項２］
前記（１）に記載の工程が、Ｃｐ０４１９の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程であり、
前記（２）に記載の工程が、ＩＮＤ２１４の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程であり、
前記（３）に記載の工程が、Ｃｐ０４１９に関する上記ヘテロ型多型及びＩＮＤ２１４に関する上記ヘテロ型多型の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程である、
項１に記載のカンキツ品種の識別方法。
［項３］
前記（１）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出する工程、及び、前記（２）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出する工程が、
カンキツ植物の植物体、前記植物体の加工品、又は前記植物体若しくは加工品から抽出されたＤＮＡ、を対象試料としたＰＣＲ反応を含む工程である、項１又は２に記載のカンキツ品種の識別方法。
［項４］
前記（１）に記載の工程と前記（２）に記載の工程が、同一のＰＣＲ反応液を用いて同時に行われる工程である、項１～３のいずれかに記載のカンキツ品種の識別方法。
［項５］
項１～４のいずれかに記載のカンキツ品種の識別方法を使用することを含む、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の植物体を栽培する方法、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の果実を生産する方法、又は、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の果実の加工品を生産する方法。
［項１］
下記（１）、（２）、及び（３）に記載の工程を含む、カンキツ品種の識別方法：
（１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、
（２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、
（３）前記（１）及び（２）に記載の工程においてＣｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程、
；
前記（１）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＣｐ０４１９に関して、
（１ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン内に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、第２１１７番目の塩基「Ｇ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基を示し、第２２８７番目の塩基「Ｔ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基を示し、第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（１ｂ）対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＣｐ０４１９挿入型配列を示し、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＣｐ０４１９欠失型配列を示す、
；
前記（２）に記載のカンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＩＮＤ２１４に関して、
（２ａ）カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、第２５０３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基を示し、第２７１３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基を示し、第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、
（２ｂ）対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４挿入型配列を示し、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列を示す。
［項２］
前記（１）に記載の工程が、Ｃｐ０４１９の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程であり、
前記（２）に記載の工程が、ＩＮＤ２１４の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程であり、
前記（３）に記載の工程が、Ｃｐ０４１９に関する上記ヘテロ型多型及びＩＮＤ２１４に関する上記ヘテロ型多型の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程である、
項１に記載のカンキツ品種の識別方法。
［項３］
前記（１）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出する工程、及び、前記（２）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出する工程が、
カンキツ植物の植物体、前記植物体の加工品、又は前記植物体若しくは加工品から抽出されたＤＮＡ、を対象試料としたＰＣＲ反応を含む工程である、項１又は２に記載のカンキツ品種の識別方法。
［項４］
前記（１）に記載の工程と前記（２）に記載の工程が、同一のＰＣＲ反応液を用いて同時に行われる工程である、項１～３のいずれかに記載のカンキツ品種の識別方法。
［項５］
項１～４のいずれかに記載のカンキツ品種の識別方法を使用することを含む、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の植物体を栽培する方法、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の果実を生産する方法、又は、
品種「あすみ」、若しくは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、の果実の加工品を生産する方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、カンキツ品種「あすみ」を他のカンキツ品種から精度良く迅速に識別可能な技術であり、且つ、検査現場等でも広く導入可能な技術を提供することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】カンキツ品種「あすみ」の果実の外観、縦断面、及び横断面を撮影した写真像図である。写真右下のｂａｒは５ｃｍを示す。
【図2】カンキツ植物の染色体上において、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の遺伝子座の位置を模式的に示した図である。
【図3】インデルマーカーＣｐ０４１９の遺伝子座及びその周辺領域に関する情報を示した模式図である。
【図4】インデルマーカーＩＮＤ２１４の遺伝子座及びその周辺領域に関する情報を示した模式図である。
【図5】実験例２において、アレル多型を検出するためにインデルマーカー遺伝子座を挟む位置にてプライマー設計を行ったことを示す説明図である。
【図6】実験例２のアレル多型の検出による品種識別試験に関して、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動像及び検出結果を示した図である。図６ＡはＣｐ０４１９に関する多型分析の結果を示し、図６ＢはＩＮＤ２１４に関する多型分析の結果を示す。図中の「●」は品種「あすみ」の試料を示す。また、「＋」は多型バンドが検出された試料を示す。
【図7】実験例３において、インデルマーカー欠失型配列の検出を行うためにインデルマーカー遺伝子座を含むプライマー設計を行ったことを示す説明図である。
【図8】実験例３のインデルマーカー欠失型配列の検出による品種識別試験に関して、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動像及び検出結果を示した図である。図８ＡはＣｐ０４１９に関する欠失型配列の検出結果を示し、図８ＢはＩＮＤ２１４に関する欠失型配列の検出結果を示す。図中の「●」は品種「あすみ」の試料を示す。また、「＋」は欠失型配列の増幅バンドが検出されたことを示す。
【図9】実験例４のマルチプレックスＰＣＲ法による品種識別試験に関して、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動像及び検出結果を示した図である。図中の「●」は品種「あすみ」の試料を示す。また、「＋」は欠失型配列の増幅バンドが検出されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明に係る技術的範囲は、下記した構成を全て含む態様に限定されるものではない。また、本発明に係る技術的範囲は、下記に記載した構成以外の他の構成を含む態様を除外するものではない。
【0012】
［用語の説明］
本明細書中、「塩基配列の変異」は、塩基配列を構成する塩基の置換、欠失、及び／又は挿入による変異を意味する用語として用いる。
本明細書中、「品種」という用語は、「種（species）」の下位分類を指し、集団として他の品種（又は系統）と区別可能な外形的及び／又は生理的な特性（表現型）を有し、同一世代の特性が十分に類似した均一性が有し、世代を超えて前記特性が維持される安定性を備える集団を指す用語として用いている。
本明細書中、ある塩基から（より）上流又は下流に＊＊番目の塩基という表現は、その塩基の上流側又は下流側に１つ隣の塩基を第１番目の塩基として数えて上流又は下流に＊＊番目の塩基を意味する。
本明細書中、ある塩基配列の３’端の塩基から（より）上流に＊＊番目の塩基とは、その３’端の塩基の１つ上流側の塩基を１番目の塩基として数えて上流に＊＊番目の塩基を意味する。
本明細書中、「塩基配列の変異」は、塩基配列を構成する塩基の置換、欠失、及び／又は挿入による変異を意味する用語として用いる。
本明細書中、「品種」という用語は、「種（species）」の下位分類を指し、集団として他の品種（又は系統）と区別可能な外形的及び／又は生理的な特性（表現型）を有し、同一世代の特性が十分に類似した均一性が有し、世代を超えて前記特性が維持される安定性を備える集団を指す用語として用いている。
本明細書中、ある塩基から（より）上流又は下流に＊＊番目の塩基という表現は、その塩基の上流側又は下流側に１つ隣の塩基を第１番目の塩基として数えて上流又は下流に＊＊番目の塩基を意味する。
本明細書中、ある塩基配列の３’端の塩基から（より）上流に＊＊番目の塩基とは、その３’端の塩基の１つ上流側の塩基を１番目の塩基として数えて上流に＊＊番目の塩基を意味する。
【0013】
１．カンキツ品種の識別方法
本発明は、カンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を他のカンキツ品種から精度良く迅速に識別可能な技術であり、且つ、検査現場等でも広く導入可能な技術に関する。
本発明は、カンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を他のカンキツ品種から精度良く迅速に識別可能な技術であり、且つ、検査現場等でも広く導入可能な技術に関する。
【0014】
［識別対象］
本発明に係るカンキツ品種の識別技術は、カンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を他のカンキツ品種の植物から識別する技術に関する。
本発明に係るカンキツ品種の識別技術は、カンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を他のカンキツ品種の植物から識別する技術に関する。
【0015】
本発明に係る技術の適用対象である「カンキツ植物」とは、カンキツ属に属する植物を指す。カンキツ属に属する植物は、その果実が果皮の内側に果肉が詰まった小袋が放射状に並んだ構造にて構成され、食用・食材として供される重要な農産物資源となる場合が多い。また、カンキツ属の植物体は、常緑性の低木（樹木）であり落葉はせず、温暖地域での栽培に適した性質を有し、日本の温暖地域での栽培にも適する。
ここで、本明細書中、「カンキツ属（Citrus、別名ミカン属）」とは、ミカン科ミカン連に属する分類群を指す。カンキツ属（genus Citrus）に属する各植物は、分類上は‘種（species）’とされる場合もあるが、変異発生した単一樹から栄養生殖によって栽培種として分布拡大した例が多く、実質的な遺伝子的な差異は、品種（系統）レベル程度の遺伝的差異しかない場合が多い。近年の遺伝子型を比較した研究では、カンキツ属の原種は、わずか４種程度で、それ以外のほとんど種は、雑種であるという説が有力である。この点、カンキツ属は、比較的種間雑種や接ぎ木が容易な分類群であり、遺伝的背景（植物種としての基本的特性）がお互いに近い種で構成されている分類群と認められる。
カンキツ属（Citrus）に属する植物としては、近年の遺伝子型を比較した研究では、これらカンキツ属のほとんどの種は遺伝的に近縁であり、雑種形成により誕生したという説が有力であり、特に真正柑橘亜属とされる種どうしは極めて近縁であると認められる。
これらの観点から、本明細書中のカンキツ属に属する各植物（カンキツ植物）としては、それぞれの区別が可能な分類単位を「品種」として捉えて扱う。また、本発明では、変種や他の集団から区別可能な系統等の各種集団に関しても、カンキツ属に属する集団であれば、同義に捉えて（即ち、品種と同レベルの分類集団と捉えて）、識別対象とすることが可能である。
ここで、本明細書中、「カンキツ属（Citrus、別名ミカン属）」とは、ミカン科ミカン連に属する分類群を指す。カンキツ属（genus Citrus）に属する各植物は、分類上は‘種（species）’とされる場合もあるが、変異発生した単一樹から栄養生殖によって栽培種として分布拡大した例が多く、実質的な遺伝子的な差異は、品種（系統）レベル程度の遺伝的差異しかない場合が多い。近年の遺伝子型を比較した研究では、カンキツ属の原種は、わずか４種程度で、それ以外のほとんど種は、雑種であるという説が有力である。この点、カンキツ属は、比較的種間雑種や接ぎ木が容易な分類群であり、遺伝的背景（植物種としての基本的特性）がお互いに近い種で構成されている分類群と認められる。
カンキツ属（Citrus）に属する植物としては、近年の遺伝子型を比較した研究では、これらカンキツ属のほとんどの種は遺伝的に近縁であり、雑種形成により誕生したという説が有力であり、特に真正柑橘亜属とされる種どうしは極めて近縁であると認められる。
これらの観点から、本明細書中のカンキツ属に属する各植物（カンキツ植物）としては、それぞれの区別が可能な分類単位を「品種」として捉えて扱う。また、本発明では、変種や他の集団から区別可能な系統等の各種集団に関しても、カンキツ属に属する集団であれば、同義に捉えて（即ち、品種と同レベルの分類集団と捉えて）、識別対象とすることが可能である。
【0016】
本発明のカンキツ品種の識別技術において、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出して他のカンキツ品種から識別可能な品種は、品種「あすみ」である。ここで、品種「あすみ」は、本出願人により作出された新規のカンキツ育成品種であり、品種登録番号：第２３７２３号として品種登録されている。
品種「あすみ」の平均的な品種特性としては、次の特性を挙げることができる。樹勢は中程度で土壌及び気象条件に対する適応範囲は広く、様々なカンキツ産地での栽培が可能である。地上部ではトゲの発生が多く、ソウカ病に強く、カイヨウ病に弱い。隔年結果性は中程度、成熟期が１月下旬～２月上旬で、果実重が平均１５０ｇ程度である。
果実の果肉部分の糖度が１５％程度、酸度が１．１％程度、芳香を有し、食味が非常に高い。β－クリプトキサンチンを１．６６ｍｇ／果肉１００ｇ程度と多く含有する。外果皮の剥皮性は中程度であるが、果実あたりの種子が平均１．５粒と少なく、じょうのう膜が柔らかく比較的食べやすい。
品種「あすみ」の平均的な品種特性としては、次の特性を挙げることができる。樹勢は中程度で土壌及び気象条件に対する適応範囲は広く、様々なカンキツ産地での栽培が可能である。地上部ではトゲの発生が多く、ソウカ病に強く、カイヨウ病に弱い。隔年結果性は中程度、成熟期が１月下旬～２月上旬で、果実重が平均１５０ｇ程度である。
果実の果肉部分の糖度が１５％程度、酸度が１．１％程度、芳香を有し、食味が非常に高い。β－クリプトキサンチンを１．６６ｍｇ／果肉１００ｇ程度と多く含有する。外果皮の剥皮性は中程度であるが、果実あたりの種子が平均１．５粒と少なく、じょうのう膜が柔らかく比較的食べやすい。
【0017】
また、本発明のカンキツ品種の識別技術では、その識別原理の観点から、品種「あすみ」の後代品種のうちＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示すカンキツ品種に関しても、本技術を利用して他のカンキツ品種から識別することが可能となる。
ここで、品種「あすみ」の後代品種としては、品種「あすみ」に由来する品種や品種「あすみ」を基に作出された品種を挙げることができる。当該後代品種としては、例えば、交配、突然変異、遺伝子導入、ゲノム編集等によって作出された後代品種を挙げることができる。また、当該後代品種としては、本出願後に品種として登録された作出品種も含まれる。また、当該後代品種には、品種「あすみ」の後代系統、品種「あすみ」に由来する作出系統、品種「あすみ」に由来する変異系統、等の各集団も含まれる。
また、品種「あすみ」と同じアレル型とは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座に関して、ヘテロ型（挿入型配列／欠失型配列）のアレル多型を指す。なお、当該
アレル型が品種「あすみ」に由来するものであれば、これらの遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列に変異が発生した場合でも、本発明の品種識別技術の適用が可能である。
ここで、品種「あすみ」の後代品種としては、品種「あすみ」に由来する品種や品種「あすみ」を基に作出された品種を挙げることができる。当該後代品種としては、例えば、交配、突然変異、遺伝子導入、ゲノム編集等によって作出された後代品種を挙げることができる。また、当該後代品種としては、本出願後に品種として登録された作出品種も含まれる。また、当該後代品種には、品種「あすみ」の後代系統、品種「あすみ」に由来する作出系統、品種「あすみ」に由来する変異系統、等の各集団も含まれる。
また、品種「あすみ」と同じアレル型とは、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座に関して、ヘテロ型（挿入型配列／欠失型配列）のアレル多型を指す。なお、当該
アレル型が品種「あすみ」に由来するものであれば、これらの遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列に変異が発生した場合でも、本発明の品種識別技術の適用が可能である。
【0018】
本発明の識別技術において、品種「あすみ」との区別が可能な「他のカンキツ品種」としては、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方又はいずれかが欠失型配列とはならないカンキツ品種を挙げることができる。他のカンキツ品種に属するカンキツ植物では、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型が、品種「あすみ」とは異なるアレル型を示す。
ここで、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、例えば、下記の実験例にて示されたクレメンティン、ウンシュウミカン、グレープフルーツ、スイートオレンジ、レモン、不知火、イヨ（伊予柑）、ナツミカン、ハッサク、ポンカン、璃の香、みはや、あすき、麗紅、津之輝、西南のひかり、津之望、はるひ、清見、せとか、はるみ、はれひめ、甘平、紅まどんな、等を挙げることができる。これら２４種類のカンキツ品種は品種「あすみ」と合わせると（計２５種類）、日本国内ではほとんど流通していないクレメンティンを考慮したとしても、日本国内のカンキツ果実流通量の９４％以上を占める。この点、ＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別技術では、流通量９０％以上を識別可能な技術を基準としているところ、当該技術が同国際基準を充足する技術であることを示す。
また、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、例えば、下記の実験例にて示されたユズ、河内晩柑、ヒュウガナツ、スダチ、シークワサー、カラマンダリン（カラ）、タンカン、セミノール、カボス、天草、黄金柑、紀州ミカン、スイートスプリング、三宝柑、アンコール、たまみ、西之香、佐賀マンダリン、マーコット、南香、あまか、カンキツ中間母本農６号、カブス、等を、当該他のカンキツ品種として挙げることができる。
上記したクレメンティン及び品種「あすみ」等の２５種類に加えて、これら２３種類の品種を合わせると（計４８種類）、日本国内のカンキツ果実流通量の９８％以上を占める。この点は、本発明の識別技術が非常に高い精度で品種「あすみ」の識別を可能とする品種識別技術であることを示している。
更に、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、下記実験例の結果及びその系統関係を考慮して、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方又はいずれかが欠失型配列とはならないカンキツ品種を、他のカンキツ品種として挙げることが可能となる。例えば、ブンタン等に関しても、本発明の識別技術の原理的な観点から、品種「あすみ」との区別が可能な他のカンキツ品種と認めることができる。
ここで、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、例えば、下記の実験例にて示されたクレメンティン、ウンシュウミカン、グレープフルーツ、スイートオレンジ、レモン、不知火、イヨ（伊予柑）、ナツミカン、ハッサク、ポンカン、璃の香、みはや、あすき、麗紅、津之輝、西南のひかり、津之望、はるひ、清見、せとか、はるみ、はれひめ、甘平、紅まどんな、等を挙げることができる。これら２４種類のカンキツ品種は品種「あすみ」と合わせると（計２５種類）、日本国内ではほとんど流通していないクレメンティンを考慮したとしても、日本国内のカンキツ果実流通量の９４％以上を占める。この点、ＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別技術では、流通量９０％以上を識別可能な技術を基準としているところ、当該技術が同国際基準を充足する技術であることを示す。
また、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、例えば、下記の実験例にて示されたユズ、河内晩柑、ヒュウガナツ、スダチ、シークワサー、カラマンダリン（カラ）、タンカン、セミノール、カボス、天草、黄金柑、紀州ミカン、スイートスプリング、三宝柑、アンコール、たまみ、西之香、佐賀マンダリン、マーコット、南香、あまか、カンキツ中間母本農６号、カブス、等を、当該他のカンキツ品種として挙げることができる。
上記したクレメンティン及び品種「あすみ」等の２５種類に加えて、これら２３種類の品種を合わせると（計４８種類）、日本国内のカンキツ果実流通量の９８％以上を占める。この点は、本発明の識別技術が非常に高い精度で品種「あすみ」の識別を可能とする品種識別技術であることを示している。
更に、本発明の識別技術を用いて品種「あすみ」との区別が可能な当該他のカンキツ品種としては、下記実験例の結果及びその系統関係を考慮して、インデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方又はいずれかが欠失型配列とはならないカンキツ品種を、他のカンキツ品種として挙げることが可能となる。例えば、ブンタン等に関しても、本発明の識別技術の原理的な観点から、品種「あすみ」との区別が可能な他のカンキツ品種と認めることができる。
【0019】
［インデルマーカー欠失型配列の検出工程］
本発明に係るカンキツ識別技術は、（工程１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、及び、（工程２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、を含む、カンキツ品種の識別方法に関する。
本発明に係るカンキツ識別技術は、（工程１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、及び、（工程２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、を含む、カンキツ品種の識別方法に関する。
【0020】
ここで、カンキツ植物ゲノムＤＮＡからインデルマーカー欠失型配列の検出は、既存の核酸検出技術を利用することによって行うことが可能である。例えば、ＰＣＲ法を利用した技術、ハイブリダイゼーション法を利用した技術、等を利用することができる。また、プローブとプライマーを併用したリアルタイムＰＣＲ法、野生型と欠失型の２種類のプローブを併用したドットブロット法、等の多型検出技術を利用することも可能である。
本発明に係る欠失型配列検出工程としては、その容易性及び迅速性の点から、欠失型配列を特異的に増幅可能なプライマーセットを用いた通常のＰＣＲ法を利用した技術によって行うことが好適である。ＰＣＲ法に用いる反応試薬や反応条件等の手法は、プライマー特異的なＰＣＲ増幅断片が得られる反応試薬や反応条件等の手法であれば特に制限はなく、公知の手法にて行うことが可能である。
ＰＣＲ増幅断片の検出手段としては、常法又は新規の手法によって行うことが可能である。一例としては、エチジウムブロマイド、蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位体等を利用してＰＣＲ増幅断片の検出を行うことが可能であるが、特にこれらに制限はない。
本発明に係る欠失型配列検出工程としては、その容易性及び迅速性の点から、欠失型配列を特異的に増幅可能なプライマーセットを用いた通常のＰＣＲ法を利用した技術によって行うことが好適である。ＰＣＲ法に用いる反応試薬や反応条件等の手法は、プライマー特異的なＰＣＲ増幅断片が得られる反応試薬や反応条件等の手法であれば特に制限はなく、公知の手法にて行うことが可能である。
ＰＣＲ増幅断片の検出手段としては、常法又は新規の手法によって行うことが可能である。一例としては、エチジウムブロマイド、蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位体等を利用してＰＣＲ増幅断片の検出を行うことが可能であるが、特にこれらに制限はない。
【0021】
試料
本発明に係る識別技術は、識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカー欠失型配列を検出する工程を含む。
当該検出工程における欠失型配列の検出は、カンキツ植物の植物体自体やそのゲノムＤＮＡを含む試料を用いて行うことが可能である。詳しくは、当該検出工程では、カンキツ植物の植物体、前記植物体の加工品、又は前記植物体若しくは加工品から抽出されたＤＮＡ、等を用いて検出を行うことが可能である。
当該検出工程において欠失型配列の検出に用いるカンキツ植物の植物体としては、カンキツ植物の植物体に含まれる全て又はいずれかの部位や組織、全て又はいずれかの生育段階に属する植物体、等を試料として用いることができる。より具体的には、成長芽、側芽、生育枝、枝、葉、葉柄、トゲ、茎、花蕾、花、果実、種子、根、などを挙げることができる。また、果実を構成する外果皮、内果皮、果肉、種子等を挙げることができる。当該試料として好適には、ポリフェノール類等の夾雑物が少なくＤＮＡ抽出又はＰＣＲ増幅等のし易い、葉や芽等の組織や器官を用いることが好適である。また、識別したい果実から各構成組織を採取して、当該検出工程の試料として用いることも勿論可能である。
また、当該検出工程では、上記のカンキツ植物の加工品を試料として用いることも可能である。当該加工品としては、様々な加工処理や加工段階のものが含まれるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が可能な程度の加工処理や加工段階のものを用いることが好適である。一例としては、植物体の搾汁物、植物体の抽出物、搾汁残渣、抽出残渣、植物体そのものの加工物（植物体の切断物、粉砕物、ペースト状物、ピューレ状物、乾燥物、粉末物、冷凍処理物、各種化学的処理等）等を挙げることができる。特にこれらの加工品の具体的な例示としては、果実を利用してこれらの加工態様を示す果実加工品を用いることが好適である。当該果実加工品としては、例えば、果肉を含むストレートジュース、果肉をシロップ漬けにした缶詰、ドライフルーツ、等の果実加工品を好適に挙げることができる。
本発明に係る識別技術は、識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカー欠失型配列を検出する工程を含む。
当該検出工程における欠失型配列の検出は、カンキツ植物の植物体自体やそのゲノムＤＮＡを含む試料を用いて行うことが可能である。詳しくは、当該検出工程では、カンキツ植物の植物体、前記植物体の加工品、又は前記植物体若しくは加工品から抽出されたＤＮＡ、等を用いて検出を行うことが可能である。
当該検出工程において欠失型配列の検出に用いるカンキツ植物の植物体としては、カンキツ植物の植物体に含まれる全て又はいずれかの部位や組織、全て又はいずれかの生育段階に属する植物体、等を試料として用いることができる。より具体的には、成長芽、側芽、生育枝、枝、葉、葉柄、トゲ、茎、花蕾、花、果実、種子、根、などを挙げることができる。また、果実を構成する外果皮、内果皮、果肉、種子等を挙げることができる。当該試料として好適には、ポリフェノール類等の夾雑物が少なくＤＮＡ抽出又はＰＣＲ増幅等のし易い、葉や芽等の組織や器官を用いることが好適である。また、識別したい果実から各構成組織を採取して、当該検出工程の試料として用いることも勿論可能である。
また、当該検出工程では、上記のカンキツ植物の加工品を試料として用いることも可能である。当該加工品としては、様々な加工処理や加工段階のものが含まれるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が可能な程度の加工処理や加工段階のものを用いることが好適である。一例としては、植物体の搾汁物、植物体の抽出物、搾汁残渣、抽出残渣、植物体そのものの加工物（植物体の切断物、粉砕物、ペースト状物、ピューレ状物、乾燥物、粉末物、冷凍処理物、各種化学的処理等）等を挙げることができる。特にこれらの加工品の具体的な例示としては、果実を利用してこれらの加工態様を示す果実加工品を用いることが好適である。当該果実加工品としては、例えば、果肉を含むストレートジュース、果肉をシロップ漬けにした缶詰、ドライフルーツ、等の果実加工品を好適に挙げることができる。
【0022】
Ｃｐ０４１９遺伝子座
当該インデルマーカー欠失型配列の検出工程では、（工程１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、を含む。
ここで、インデルマーカーＣｐ０４１９は、カンキツゲノムの第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロンに存在するインデルマーカーである（図２、図３）。クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を示す配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子を示す第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、第１５９０番目の塩基から第２８２５番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、当該第１イントロンは、配列番号１に示される塩基配列における第２０００番目の塩基から第２３４６番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、当該遺伝子の５’ＵＴＲは、配列番号１に示される塩基配列における第１５０１番目の塩基から第１５８９番目の塩基までの塩基配列に該当する。
Ｃｐ０４１９遺伝子座に挿入配列を有する挿入型配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）では、当該第１イントロン中に存在するＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に、約１７０ｂｐの挿入配列が存在する。クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を示す配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基である第２１１７番目の塩基「Ｇ」とＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基である第２２８７番目の塩基「Ｔ」の間に、１６９ｂｐの挿入配列が存在する。
当該インデルマーカー欠失型配列の検出工程では、（工程１）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＣｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程、を含む。
ここで、インデルマーカーＣｐ０４１９は、カンキツゲノムの第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロンに存在するインデルマーカーである（図２、図３）。クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を示す配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子を示す第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、第１５９０番目の塩基から第２８２５番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、当該第１イントロンは、配列番号１に示される塩基配列における第２０００番目の塩基から第２３４６番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、当該遺伝子の５’ＵＴＲは、配列番号１に示される塩基配列における第１５０１番目の塩基から第１５８９番目の塩基までの塩基配列に該当する。
Ｃｐ０４１９遺伝子座に挿入配列を有する挿入型配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）では、当該第１イントロン中に存在するＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に、約１７０ｂｐの挿入配列が存在する。クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を示す配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基である第２１１７番目の塩基「Ｇ」とＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基である第２２８７番目の塩基「Ｔ」の間に、１６９ｂｐの挿入配列が存在する。
【0023】
クレメンティンは、当該挿入配列が存在するタイプの配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）と当該挿入配列が存在しないタイプの配列（Ｃｐ０４１９欠失型配列）とを、相同染色体にヘテロで有するアレル型を示す。ここで、Ｃｐ０４１９欠失型配列では、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挟まれた領域（上記した約１７０ｂｐの挿入配列）が欠失した塩基配列（「ＧＴ」の２塩基）となる（図３）。また、品種「あすみ」も、クレメンティンと同様に、Ｃｐ０４１９挿入型配列とＣｐ０４１９欠失型配列とを相同染色体にヘテロで有するアレル型を示す。品種「あすみ」から単離されたＣｐ０４１９欠失型配列を含む塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列として示すことができる。品種「あすみ」のＣｐ０４１９欠失型配列を示す配列番号２に記載の塩基配列で示した場合、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」は第３５５番目の塩基に該当し、最下流塩基「Ｔ」は第３５６番目の塩基に該当する。
【0024】
即ち、本発明では、カンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＣｐ０４１９に関して、次の定義をすることができる：
カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン内に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、第２１１７番目の塩基「Ｇ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基を示し、第２２８７番目の塩基「Ｔ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基を示し、第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、；
対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＣｐ０４１９挿入型配列を示し、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＣｐ０４１９欠失型配列を示す。
カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第５染色体上のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン内に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む配列番号１に記載の塩基配列で示した場合、第２１１７番目の塩基「Ｇ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基を示し、第２２８７番目の塩基「Ｔ」がＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基を示し、第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、；
対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＣｐ０４１９挿入型配列を示し、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＣｐ０４１９欠失型配列を示す。
【0025】
ここで、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座とは、対象試料であるカンキツ植物ゲノムにおいて、クレメンティンゲノムのＣｐ０４１９とオーソログ関係にある遺伝子座（共通祖先において同一起源の遺伝子座）を指す。また、上記に対応する挿入配列とは、対象試料であるカンキツ植物ゲノムにおいて、クレメンティンゲノムの挿入配列とのオーソログ関係にある挿入配列（共通祖先において同一起源の挿入配列）を指す。当該挿入配列に関しては、タンパク質機能とは関係ない進化速度が速い領域であるが、配列同一性が非常に高い場合（例えば、クレメンティンゲノムの挿入配列である配列番号１の第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの塩基配列に対して配列同一性９０％以上、好ましくは９５％以上の場合）には、お互いに対応する同一起源の配列に該当すると判断できる。
また、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の末端塩基及びその周辺領域を構成する塩基配列に関しても、上記と同様に認識することが可能である。例えば、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基より上流に１０００番目、好ましくは５６０番目、の塩基（上流１ｋｂｐ以内には上流調節領域が多く存在する）からＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基までの塩基配列及びＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基から最終エクソンの最後の塩基までの塩基配列に対して、配列同一性８５％以上、９０％以上、又は９５％以上を示す場合、お互いに対応する配列に該当すると判断できる。
また、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の末端塩基及びその周辺領域を構成する塩基配列に関しても、上記と同様に認識することが可能である。例えば、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基より上流に１０００番目、好ましくは５６０番目、の塩基（上流１ｋｂｐ以内には上流調節領域が多く存在する）からＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基までの塩基配列及びＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基から最終エクソンの最後の塩基までの塩基配列に対して、配列同一性８５％以上、９０％以上、又は９５％以上を示す場合、お互いに対応する配列に該当すると判断できる。
【0026】
Ｃｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセット
当該検出工程におけるＣｐ０４１９欠失型配列の検出は、Ｃｐ０４１９欠失型配列のＰＣＲ増幅が可能なように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法によって好適に行うことが可能である。
当該検出工程におけるＣｐ０４１９欠失型配列の検出は、Ｃｐ０４１９欠失型配列のＰＣＲ増幅が可能なように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法によって好適に行うことが可能である。
【0027】
（遺伝子座を挟むプライマーセット）
当該検出工程においてＣｐ０４１９欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に１対のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット（１対のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーのプラマーセット）を設計し、Ｃｐ０４１９欠失型配列のＰＣＲ増幅断片の増幅の有無による検出が可能となるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する態様を挙げることができる（図５参照）。
当該１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片が増幅する。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅する。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＣｐ０４１９遺伝子座にはＣｐ０４１９欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
当該検出工程においてＣｐ０４１９欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に１対のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット（１対のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーのプラマーセット）を設計し、Ｃｐ０４１９欠失型配列のＰＣＲ増幅断片の増幅の有無による検出が可能となるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する態様を挙げることができる（図５参照）。
当該１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片が増幅する。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅する。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＣｐ０４１９遺伝子座にはＣｐ０４１９欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
【0028】
「１対のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマー」（フォワードプライマー及びリバースプライマー）にて構成されるプライマーセットとしては、具体的には、下記のＣｐ０４１９遺伝子座を含むＤＮＡ断片を増幅可能な次の１対のオリゴヌクレオチドプライマー（ｐ１）及び（ｐ２）を用いることが可能である：
（ｐ１）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｇ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ２）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、上記（ｐ１）に記載のプライマーとＣｐ０４１９遺伝子座を挟む向き及び位置にてプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１）及び（ｐ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、その全てのカンキツ品種に対してＣｐ０４１９挿入型配列又はＣｐ０４１９欠失型配列の増幅が可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
（ｐ１）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｇ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ２）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、上記（ｐ１）に記載のプライマーとＣｐ０４１９遺伝子座を挟む向き及び位置にてプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１）及び（ｐ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、その全てのカンキツ品種に対してＣｐ０４１９挿入型配列又はＣｐ０４１９欠失型配列の増幅が可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
【0029】
（欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）
また、当該検出工程においてＣｐ０４１９欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、Ｃｐ０４１９欠失型配列が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断されていたＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基と最下流塩基を繋いだ塩基配列からなるＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを設計する態様を挙げることができる（図７参照）。
当該Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーとこれとプライマー対を形成するＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合にはＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じずにＰＣＲ増幅断片は検出されない。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅断片が検出される。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、Ｃｐ０４１９欠失型配列と一致する塩基長のＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＣｐ０４１９遺伝子座には、Ｃｐ０４１９欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
また、当該検出工程においてＣｐ０４１９欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、Ｃｐ０４１９欠失型配列が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断されていたＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基と最下流塩基を繋いだ塩基配列からなるＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを設計する態様を挙げることができる（図７参照）。
当該Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーとこれとプライマー対を形成するＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合にはＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じずにＰＣＲ増幅断片は検出されない。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅断片が検出される。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、Ｃｐ０４１９欠失型配列と一致する塩基長のＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＣｐ０４１９遺伝子座には、Ｃｐ０４１９欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
【0030】
「Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマー」とこれと対になる「Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー」としては、具体的には、Ｃｐ０４１９欠失型配列のみを特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（ｐ１１）及びこれとプライマー対を形成するＣｐ０４１９検出用共通領域プライマー（ｐ１２）を用いることが可能である：
（ｐ１１）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基（Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）を含んで構成される塩基配列であり、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に前記Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は、カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基（Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）の相補２塩基を含んで構成される塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、前記Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基の相補２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ１２）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、又は、カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｇ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、であって、上記（ｐ１１）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１１）及び（ｐ１２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、クレメンティン並びに試料５、９、１２、１６、２１、２３、３２、及び４２として示されたカンキツ品種に対してＣｐ０４１９欠失型配列の増幅が可能であって、且つ、その他の試料として示されたカンキツ品種に対してはＰＣＲ増幅が生じない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
（ｐ１１）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基（Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）を含んで構成される塩基配列であり、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に前記Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は、カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基（Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）の相補２塩基を含んで構成される塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、前記Ｃｐ０４１９遺伝子座である２塩基の相補２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ１２）カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、又は、カンキツ植物ゲノムのＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｇ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、であって、上記（ｐ１１）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１１）及び（ｐ１２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、クレメンティン並びに試料５、９、１２、１６、２１、２３、３２、及び４２として示されたカンキツ品種に対してＣｐ０４１９欠失型配列の増幅が可能であって、且つ、その他の試料として示されたカンキツ品種に対してはＰＣＲ増幅が生じない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
【0031】
（プライマー設計事項）
上記したオリゴヌクレオチドプライマーの設計条件としては、（ｐ１）と（ｐ２）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１）がフォワードプライマーの場合は（ｐ２）はリバースプライマーとなり、（ｐ１）がリバースプライマーの場合は（ｐ２）がフォワードプライマーとなる。同様に、（ｐ１１）と（ｐ１２）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１１）がフォワードプライマーの場合は（ｐ１２）はリバースプライマーとなり、（ｐ１１）がリバースプライマーの場合は（ｐ１２）がフォワードプライマーとなる。
上記したオリゴヌクレオチドプライマーの設計条件としては、（ｐ１）と（ｐ２）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１）がフォワードプライマーの場合は（ｐ２）はリバースプライマーとなり、（ｐ１）がリバースプライマーの場合は（ｐ２）がフォワードプライマーとなる。同様に、（ｐ１１）と（ｐ１２）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１１）がフォワードプライマーの場合は（ｐ１２）はリバースプライマーとなり、（ｐ１１）がリバースプライマーの場合は（ｐ１２）がフォワードプライマーとなる。
【0032】
また、プライマーの設計条件としては、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列、又はその相補配列に含まれる塩基配列を、連続して少なくとも１６塩基含むプライマーであることが好適である。好適な塩基長（塩基：ｍｅｒ）としては、当該塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列を、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上、を含むプライマーであることが好適である。また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長の上限としては、プライマーとして機能する範囲を逸脱しない範囲であれば特に制限はないが、例えば上記塩基配列の塩基長が、５０塩基以下又は４０塩基以下のものを挙げることができる。
また、配列特異的性を上げて、非特異的ＰＣＲ増幅を下げるためには、プライマー対を形成するプライマーとのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等を近似した値に合わせた上で、塩基長の長い適切なプライマーを設計することが好適である。
また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの５’端は、ベクター挿入等に利用するための制限酵素サイトや各種ベクター導入用の修飾塩基配列を付加したものであっても良く、また、蛍光物質や標識物質等を結合した形態のものであっても良い。また、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端の塩基は、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列と完全一致する塩基配列であることが好適である。
また、配列特異的性を上げて、非特異的ＰＣＲ増幅を下げるためには、プライマー対を形成するプライマーとのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等を近似した値に合わせた上で、塩基長の長い適切なプライマーを設計することが好適である。
また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの５’端は、ベクター挿入等に利用するための制限酵素サイトや各種ベクター導入用の修飾塩基配列を付加したものであっても良く、また、蛍光物質や標識物質等を結合した形態のものであっても良い。また、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端の塩基は、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列と完全一致する塩基配列であることが好適である。
【0033】
上記に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを設計可能な領域としては、増幅産物の塩基長がＰＣＲ増幅に適した領域であることが好適である。具体的には、ＰＣＲ増幅断片の塩基長（塩基対：ｂｐ）が、ＰＣＲ増幅の容易性の観点から２ｋｂｐ以下となる位置に、上記した１対のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーのプライマーセット（遺伝子座を挟むプライマーセット）、又は、上記Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーとＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーのプライマーセット（欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）を設計することが好適である。
より好ましくは、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が、２ｋｂ以下、１．５ｋｂｐ以下、１．２ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以下、又は８００ｂｐ以下となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。ＰＣＲ増幅断片長の下限としては、例えば、非特異的増幅との区別の観点から、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、又は２００ｂｐ以上となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。実施形態としては、例えば１００～１０００ｂｐ、２００～８００ｂｐ、２４６～７６８ｂｐ、又は３７１～７６８ｂｐの範囲が挙げられる。
より好ましくは、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が、２ｋｂ以下、１．５ｋｂｐ以下、１．２ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以下、又は８００ｂｐ以下となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。ＰＣＲ増幅断片長の下限としては、例えば、非特異的増幅との区別の観点から、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、又は２００ｂｐ以上となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。実施形態としては、例えば１００～１０００ｂｐ、２００～８００ｂｐ、２４６～７６８ｂｐ、又は３７１～７６８ｂｐの範囲が挙げられる。
【0034】
ＰＣＲの技術的な点を考慮すると、（ｐ１）、（ｐ２）、及び（ｐ１２）に記載のＣｐ０４１９検出用共通領域プライマーを設計可能な領域（図５、図７参照）としては、ＰＣＲ増幅の容易性の観点から、具体的には、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｇ」までの塩基配列で示される領域、又は、最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。好ましくは当該上流又は下流に１０００番目、９００番目、８００番目、又は７５０番目の塩基までの領域を好適に挙げることができる。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」又は標準品種クレメンティン等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」又は標準品種クレメンティン等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
【0035】
（ｐ１１）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーとしては、Ｃｐ０４１９欠失型配列に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基又はその相補２塩基が存在する欠失型配列を特異的に検出するプライマーとして機能するため、プライマーを構成する塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、当該２塩基又はその相補２塩基を含む塩基配列を有するプライマーであることが好適である（図７参照）。好ましくは、当該２塩基又はその相補２塩基を、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に９番目、より好ましくは８番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に含む塩基配列、を有するプライマーであることが好適である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
【0036】
上記（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ１１）、及び（ｐ１２）に記載のプライマーとしては、上記した各種プライマー設計条件に関して、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる塩基配列を含むプライマーを、本発明のカンキツ識別技術に用いることが可能な上記プライマーとして採用できる。また、上記のＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対して、１又は数個の変異を有する塩基配列を含むプライマーであっても、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる塩基配列を含むプライマーであれば、上記プライマーとして使用することが可能である。
当該プライマーを構成する塩基配列に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対する変異数としては、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる範囲であれば特に制限はないが、例えば、３塩基以下、２塩基以下、又は１塩基以下を挙げることができる。特に好ましくは、変異数が２塩基以下のものを好適に挙げることができる。
当該変異配列を含むプライマーの態様としては、好ましくは、プライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列が、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列と一致するプライマーを挙げることができる。当該態様では、それより５’側の塩基に変異を有する塩基配列であっても、３’側での配列特異的な結合能が担保されるため、上記の欠失型配列の検出機能が担保されたプライマーとして用いることが可能となる。好ましくは、当該プライマーにおいてＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列に一致する領域としては、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に１２番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、又は２０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。
また、当該変異配列を含むプライマー態様としては、上記Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列に対する変異箇所を除いて、プライマー構成塩基配列の全体で１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上が、上記Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列と一致する塩基配列を含むプライマーであることが好適である。
当該プライマーを構成する塩基配列に関して、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対する変異数としては、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる範囲であれば特に制限はないが、例えば、３塩基以下、２塩基以下、又は１塩基以下を挙げることができる。特に好ましくは、変異数が２塩基以下のものを好適に挙げることができる。
当該変異配列を含むプライマーの態様としては、好ましくは、プライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列が、Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列と一致するプライマーを挙げることができる。当該態様では、それより５’側の塩基に変異を有する塩基配列であっても、３’側での配列特異的な結合能が担保されるため、上記の欠失型配列の検出機能が担保されたプライマーとして用いることが可能となる。好ましくは、当該プライマーにおいてＣｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列に一致する領域としては、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に１２番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、又は２０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。
また、当該変異配列を含むプライマー態様としては、上記Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列に対する変異箇所を除いて、プライマー構成塩基配列の全体で１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上が、上記Ｃｐ０４１９遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列と一致する塩基配列を含むプライマーであることが好適である。
【0037】
下記実験例に基づく好適な態様としては、（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ１１）、及び／又は（ｐ１２）に記載のプライマーに関して、品種「あすみ」の塩基配列、若しくは、品種「あすみ」の塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上が品種「あすみ」の塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーを好適に挙げることができる。そして、当該プライマーとしては、下記実験例で示した４８種類のカンキツ品種のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合において、その全てのカンキツ品種に対して、下記実験例で示されたＣｐ０４１９挿入型配列及びＣｐ０４１９欠失型配列のＰＣＲ増幅様式と同様のＰＣＲ増幅様式を示す塩基配列を含むプライマーを、本発明のカンキツ識別技術に用いることが可能なプライマーとして好適に採用することができる。
なお、ここでの「実験例の（中略）ＰＣＲ増幅様式と同様」という表現は、下記実験例の４８種類のカンキツ品種に対するＰＣＲ増幅の有無による検出様式が同じかどうかを指し、プライマー設計位置等の相違による増幅断片の塩基長の相違は許容される内容として記載されている。
また、同様に、（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ１１）、及び／又は（ｐ１２）に記載のプライマーに関して、クレメンティンの塩基配列、若しくは、クレメンティンの塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上がクレメンティンの塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーに関しても、上記と同様の条件にてプライマーを設計することが可能である。
なお、ここでの「実験例の（中略）ＰＣＲ増幅様式と同様」という表現は、下記実験例の４８種類のカンキツ品種に対するＰＣＲ増幅の有無による検出様式が同じかどうかを指し、プライマー設計位置等の相違による増幅断片の塩基長の相違は許容される内容として記載されている。
また、同様に、（ｐ１）、（ｐ２）、（ｐ１１）、及び／又は（ｐ１２）に記載のプライマーに関して、クレメンティンの塩基配列、若しくは、クレメンティンの塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上がクレメンティンの塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーに関しても、上記と同様の条件にてプライマーを設計することが可能である。
【0038】
ＩＮＤ２１４遺伝子座
当該インデルマーカー欠失型配列の検出工程では、（工程２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、を含む。
ここで、インデルマーカーＩＮＤ２１４は、カンキツゲノムの第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーである（図２、図４）。クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を示す配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子を示す第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、第３１８６番目の塩基から第１１６５８番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、５’ＵＴＲは、配列番号７に示される塩基配列における第３００１番目の塩基から第３１８５番目の塩基までの塩基配列に該当し、第３００１番目の塩基より上流側の領域（第１番目の塩基から第３０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域）は、当該遺伝子の上流領域に該当する。ここで、配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基は、当該遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基から上流に２８８番目の塩基に該当し、ＩＮＤ２１４遺伝子座は当該遺伝子の上流調節領域が存在する領域にあるインデルマーカーと認められる。
ＩＮＤ２１４遺伝子座に挿入配列を有する挿入型配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）では、当該遺伝子の上流領域中に存在するＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に、約２１０ｂｐの挿入配列が存在する。クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を示す配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基である第２５０３番目の塩基「Ｔ」とＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基である第２７１３番目の塩基「Ｔ」の間に、２０９ｂｐの挿入配列が存在する。
当該インデルマーカー欠失型配列の検出工程では、（工程２）識別対象であるカンキツ植物のゲノムＤＮＡから、インデルマーカーＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程、を含む。
ここで、インデルマーカーＩＮＤ２１４は、カンキツゲノムの第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーである（図２、図４）。クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を示す配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子を示す第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、第３１８６番目の塩基から第１１６５８番目の塩基までの塩基配列で示される領域に該当する。また、５’ＵＴＲは、配列番号７に示される塩基配列における第３００１番目の塩基から第３１８５番目の塩基までの塩基配列に該当し、第３００１番目の塩基より上流側の領域（第１番目の塩基から第３０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域）は、当該遺伝子の上流領域に該当する。ここで、配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基は、当該遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基から上流に２８８番目の塩基に該当し、ＩＮＤ２１４遺伝子座は当該遺伝子の上流調節領域が存在する領域にあるインデルマーカーと認められる。
ＩＮＤ２１４遺伝子座に挿入配列を有する挿入型配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）では、当該遺伝子の上流領域中に存在するＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に、約２１０ｂｐの挿入配列が存在する。クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を示す配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基である第２５０３番目の塩基「Ｔ」とＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基である第２７１３番目の塩基「Ｔ」の間に、２０９ｂｐの挿入配列が存在する。
【0039】
クレメンティンは、当該挿入配列が存在するタイプの配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）を、相同染色体にホモで有するアレル型を示す。一方、品種「あすみ」では、当該挿入配列が存在するタイプの配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）と当該挿入配列が存在しないタイプの配列（ＩＮＤ２１４欠失型配列）とを、相同染色体にヘテロで有するアレル型を示す。ここで、ＩＮＤ２１４欠失型配列では、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挟まれた領域（上記した約２１０ｂｐの挿入配列）が欠失したタイプの塩基配列（「ＴＴ」の２塩基）となる（図４）。品種「あすみ」から単離されたＩＮＤ２１４欠失型配列を含む塩基配列は、配列番号８に記載の塩基配列として示すことができる。品種「あすみ」のＩＮＤ２１４欠失型配列を示す配列番号８に記載の塩基配列で示した場合、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」は第５８番目の塩基に該当し、最下流塩基「Ｔ」は第５９番目の塩基に該当する。
【0040】
即ち、本発明では、カンキツ植物ゲノムのインデルマーカーＩＮＤ２１４に関して、次の定義をすることができる：
カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、第２５０３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基を示し、第２７１３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基を示し、第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、；
対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４挿入型配列を示し、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列を示す。
カンキツ標準品種であるクレメンティンのゲノムで示した場合、第１染色体上のＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域に存在するインデルマーカーの遺伝子座であって、当該クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む配列番号７に記載の塩基配列で示した場合、第２５０３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基を示し、第２７１３番目の塩基「Ｔ」がＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基を示し、第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列が挿入配列を示し、；
対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に上記に対応する挿入配列が存在する塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４挿入型配列を示し、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挿入配列が存在しない塩基配列の場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列を示す。
【0041】
ここで、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座とは、対象試料であるカンキツ植物ゲノムにおいて、クレメンティンゲノムのＩＮＤ２１４とオーソログ関係にある遺伝子座（共通祖先において同一起源の遺伝子座）を指す。また、上記に対応する挿入配列とは、対象試料であるカンキツ植物ゲノムにおいて、クレメンティンゲノムの挿入配列とのオーソログ関係にある挿入配列（共通祖先において同一起源の挿入配列）を指す。当該挿入配列に関しては、タンパク質機能とは関係ない進化速度が速い領域であるが、配列同一性が非常に高い場合（例えば、クレメンティンゲノムの挿入配列である配列番号７の第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの塩基配列に対して配列同一性９０％以上、好ましくは９５％以上の場合）には、お互いに対応する同一起源の配列に該当すると判断できる。
また、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の末端塩基及びその周辺領域を構成する塩基配列に関しても、上記と同様に認識することが可能である。例えば、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基より上流に１０００番目、好ましくは５６０番目、の塩基（上流１ｋｂｐ以内には上流調節領域が多く存在する）からＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基までの塩基配列及びＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基から最終エクソンの最後の塩基までの塩基配列に対して、配列同一性８５％以上、９０％以上、又は９５％以上を示す場合、お互いに対応する配列に該当すると判断できる。
また、対象試料であるカンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の末端塩基及びその周辺領域を構成する塩基配列に関しても、上記と同様に認識することが可能である。例えば、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基より上流に１０００番目、好ましくは５６０番目、の塩基（上流１ｋｂｐ以内には上流調節領域が多く存在する）からＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基までの塩基配列及びＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基から最終エクソンの最後の塩基までの塩基配列に対して、配列同一性８５％以上、９０％以上、又は９５％以上を示す場合、お互いに対応する配列に該当すると判断できる。
【0042】
ＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセット
当該検出工程におけるＩＮＤ２１４欠失型配列の検出は、ＩＮＤ２１４欠失型配列のＰＣＲ増幅が可能なように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法によって好適に行うことが可能である。
当該検出工程におけるＩＮＤ２１４欠失型配列の検出は、ＩＮＤ２１４欠失型配列のＰＣＲ増幅が可能なように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法によって好適に行うことが可能である。
【0043】
（遺伝子座を挟むプライマーセット）
当該検出工程においてＩＮＤ２１４欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に１対のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット（１対のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーのプラマーセット）を設計し、ＩＮＤ２１４欠失型配列のＰＣＲ増幅断片の増幅の有無による検出が可能となるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する態様を挙げることができる（図５参照）。
当該１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片が増幅する。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅する。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＩＮＤ２１４遺伝子座にはＩＮＤ２１４欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
当該検出工程においてＩＮＤ２１４欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に１対のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット（１対のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーのプラマーセット）を設計し、ＩＮＤ２１４欠失型配列のＰＣＲ増幅断片の増幅の有無による検出が可能となるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する態様を挙げることができる（図５参照）。
当該１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片が増幅する。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅する。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＩＮＤ２１４遺伝子座にはＩＮＤ２１４欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
【0044】
「１対のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー」（フォワードプライマー及びリバースプライマー）にて構成されるプライマーセットとしては、具体的には、下記のＩＮＤ２１４遺伝子座を含むＤＮＡ断片を増幅可能な次の１対のオリゴヌクレオチドプライマー（ｐ３）及び（ｐ４）を用いることが可能である：
（ｐ３）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｔ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ４）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、上記（ｐ３）に記載のプライマーとＩＮＤ２１４遺伝子座を挟む向き及び位置にてプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ３）及び（ｐ４）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、その全てのカンキツ品種に対してＩＮＤ２１４挿入型配列又はＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅が可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
（ｐ３）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｔ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ４）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、上記（ｐ３）に記載のプライマーとＩＮＤ２１４遺伝子座を挟む向き及び位置にてプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ３）及び（ｐ４）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、その全てのカンキツ品種に対してＩＮＤ２１４挿入型配列又はＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅が可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
【0045】
（欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）
また、当該検出工程においてＩＮＤ２１４欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、ＩＮＤ２１４欠失型配列が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断されていたＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基と最下流塩基を繋いだ塩基配列からなるＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを設計する態様を挙げることができる（図７参照）。
当該ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーとこれとプライマー対を形成するＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じずにＰＣＲ増幅断片は検出されない。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅断片が検出される。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、ＩＮＤ２１４欠失型配列と一致する塩基長のＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＩＮＤ２１４遺伝子座には、ＩＮＤ２１４欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
また、当該検出工程においてＩＮＤ２１４欠失型配列の検出が可能なオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば、ＩＮＤ２１４欠失型配列が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断されていたＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基と最下流塩基を繋いだ塩基配列からなるＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを設計する態様を挙げることができる（図７参照）。
当該ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーとこれとプライマー対を形成するＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合にはＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じずにＰＣＲ増幅断片は検出されない。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅断片が検出される。
従って、当該プライマーセットを用いて検出工程を行って、ＩＮＤ２１４欠失型配列と一致する塩基長のＤＮＡ断片が増幅した場合、対象試料のゲノムＤＮＡのＩＮＤ２１４遺伝子座には、ＩＮＤ２１４欠失型配列が存在すると判断することが可能となる。
【0046】
「ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマー」とこれと対になる「ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー」としては、具体的には、ＩＮＤ２１４欠失型配列のみを特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（ｐ１３）及びこれとプライマー対を形成するＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー（ｐ１４）を用いることが可能である：
（ｐ１３）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基（ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）を含んで構成される塩基配列であり、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に前記ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は、カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基（ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）の相補２塩基を含んで構成される塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、前記ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基の相補２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ１４）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、又は、カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｔ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、であって、上記（ｐ１３）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１３）及び（ｐ１４）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、試料２、３、６、７、８、１２、１３、１８、２６、３５、３８、及び４７として示されたカンキツ品種に対してＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅が可能であって、且つ、クレメンティン並びにその他の試料番号にて示されたカンキツ品種に対してはＰＣＲ増幅が生じない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
（ｐ１３）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基（ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）を含んで構成される塩基配列であり、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に前記ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、又は、カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４の挿入配列が存在しない欠失型配列の塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列が当該ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基（ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基）の相補２塩基を含んで構成される塩基配列であって、当該１６塩基以上の塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、前記ＩＮＤ２１４遺伝子座である２塩基の相補２塩基を含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｐ１４）カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列の相補配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、又は、カンキツ植物ゲノムのＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｔ」までの塩基配列に含まれる１６塩基以上の塩基配列、であって、上記（ｐ１３）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
ここで、上記（ｐ１３）及び（ｐ１４）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、そのプライマー機能を発揮するための塩基配列として、これらのオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセットとして用いて表１、表２、表５、及び表６に記載されたカンキツ品種（計４８種類）のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った場合に、試料２、３、６、７、８、１２、１３、１８、２６、３５、３８、及び４７として示されたカンキツ品種に対してＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅が可能であって、且つ、クレメンティン並びにその他の試料番号にて示されたカンキツ品種に対してはＰＣＲ増幅が生じない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーである態様を、好適に挙げることができる。
【0047】
（プライマー設計事項）
上記したオリゴヌクレオチドプライマーの設計条件としては、（ｐ３）と（ｐ４）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ３）がフォワードプライマーの場合は（ｐ４）はリバースプライマーとなり、（ｐ３）がリバースプライマーの場合は（ｐ４）がフォワードプライマーとなる。同様に、（ｐ１３）と（ｐ１４）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１３）がフォワードプライマーの場合は（ｐ１４）はリバースプライマーとなり、（ｐ１３）がリバースプライマーの場合は（ｐ１４）がフォワードプライマーとなる。
上記したオリゴヌクレオチドプライマーの設計条件としては、（ｐ３）と（ｐ４）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ３）がフォワードプライマーの場合は（ｐ４）はリバースプライマーとなり、（ｐ３）がリバースプライマーの場合は（ｐ４）がフォワードプライマーとなる。同様に、（ｐ１３）と（ｐ１４）はプライマー対を形成する同じプライマーセットのプライマーどうしであるため、（ｐ１３）がフォワードプライマーの場合は（ｐ１４）はリバースプライマーとなり、（ｐ１３）がリバースプライマーの場合は（ｐ１４）がフォワードプライマーとなる。
【0048】
また、プライマーの設計条件としては、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列、又はその相補配列に含まれる塩基配列を、連続して少なくとも１６塩基含むプライマーであることが好適である。好適な塩基長（塩基：ｍｅｒ）としては、当該塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列を、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上、を含むプライマーであることが好適である。また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長の上限としては、プライマーとして機能する範囲を逸脱しない範囲であれば特に制限はないが、例えば上記塩基配列の塩基長が５０塩基以下又は４０塩基以下のものを挙げることができる。
また、配列特異的性を上げて、非特異的ＰＣＲ増幅を下げるためには、プライマー対を形成するプライマーとのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等を近似した値に合わせた上で、塩基長の長い適切なプライマーを設計することが好適である。
また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの５’端は、ベクター挿入等に利用するための制限酵素サイトや各種ベクター導入用の修飾塩基配列を付加したものであっても良く、また、蛍光物質や標識物質等を結合した形態のものであっても良い。また、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端の塩基は、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列と完全一致する塩基配列であることが好適である。
また、配列特異的性を上げて、非特異的ＰＣＲ増幅を下げるためには、プライマー対を形成するプライマーとのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等を近似した値に合わせた上で、塩基長の長い適切なプライマーを設計することが好適である。
また、当該オリゴヌクレオチドプライマーの５’端は、ベクター挿入等に利用するための制限酵素サイトや各種ベクター導入用の修飾塩基配列を付加したものであっても良く、また、蛍光物質や標識物質等を結合した形態のものであっても良い。また、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端の塩基は、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列と完全一致する塩基配列であることが好適である。
【0049】
上記に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを設計可能な領域としては、増幅産物の塩基長がＰＣＲ増幅に適した領域であることが好適である。具体的には、ＰＣＲ増幅断片の塩基長（塩基対：ｂｐ）が、ＰＣＲ増幅の容易性の観点から２ｋｂｐ以下となる位置に、上記した１対のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーのプライマーセット（遺伝子座を挟むプライマーセット）、又は、上記ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーとＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーのプライマーセット（欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）を設計することが好適である。
より好ましくは、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が、２ｋｂ以下、１．５ｋｂｐ以下、１．２ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以下、又は８００ｂｐ以下となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。ＰＣＲ増幅断片長の下限としては、例えば、非特異的増幅との区別の観点から、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、又は２００ｂｐ以上となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。実施形態としては、例えば１００～１０００ｂｐ、２００～８００ｂｐ、２４６～７６８ｂｐ、又は２４６～５０５ｂｐの範囲が挙げられる。
より好ましくは、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が、２ｋｂ以下、１．５ｋｂｐ以下、１．２ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以下、又は８００ｂｐ以下となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。ＰＣＲ増幅断片長の下限としては、例えば、非特異的増幅との区別の観点から、ＰＣＲ増幅断片の塩基長が５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、又は２００ｂｐ以上となる位置にプライマーセットを設計することが好適である。実施形態としては、例えば１００～１０００ｂｐ、２００～８００ｂｐ、２４６～７６８ｂｐ、又は２４６～５０５ｂｐの範囲が挙げられる。
【0050】
ＰＣＲの技術的な点を考慮すると、（ｐ３）、（ｐ４）、及び（ｐ１４）に記載のＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマーを設計可能な領域（図５、図７参照）としては、ＰＣＲ増幅の容易性の観点から、具体的には、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」より上流に１０００番目の塩基から当該最上流塩基「Ｔ」までの塩基配列で示される領域、又は、最下流塩基「Ｔ」からその下流に１０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。好ましくは当該上流又は下流に１０００番目、９００番目、８００番目、７５０番目、又は５００番目の塩基までの領域を好適に挙げることができる。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」又は標準品種クレメンティン等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」又は標準品種クレメンティン等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
【0051】
（ｐ１３）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーとしては、ＩＮＤ２１４欠失型配列に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」からなる２塩基又はその相補２塩基が存在する欠失型配列を特異的に検出するプライマーとして機能するため、プライマーを構成する塩基配列の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に、当該２塩基又はその相補２塩基を含む塩基配列を有するプライマーであることが好適である（図７参照）。好ましくは、当該２塩基又はその相補２塩基を、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に９番目、より好ましくは８番目の塩基から当該３’端の塩基までの間に含む塩基配列、を有するプライマーであることが好適である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
また、当該プライマー設計の実施形態として、一例としては、品種「あすみ」等におけるこれらの対応領域をプライマー設計領域とすることが可能である。
【0052】
上記（ｐ３）、（ｐ４）、（ｐ１３）、及び（ｐ１４）に記載のプライマーとしては、上記した各種プライマー設計条件に関して、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる塩基配列を含むプライマーを、本発明のカンキツ識別技術に用いることが可能な上記プライマーとして採用できる。また、上記のＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対して、１塩基以上の変異を有する塩基配列を含むプライマーであっても、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる塩基配列を含むプライマーであれば、上記プライマーとして使用することが可能である。
当該プライマーを構成する塩基配列に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対する変異数としては、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる範囲であれば特に制限はないが、好ましくは、３塩基以下、２塩基以下、又は１塩基以下を挙げることができる。特に好ましくは、変異数が２塩基以下のものを好適に挙げることができる。
ここで、当該変異配列を含むプライマーの態様としては、例えば、プライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列が、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列と一致するプライマーを好適に挙げることができる。当該態様では、それより５’側の塩基に変異を有する塩基配列であっても、３’側での配列特異的な結合能が担保されるため、上記の欠失型配列の検出機能が担保されたプライマーとして用いることが可能となる。好ましくは、当該プライマーにおいてＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列に一致する領域としては、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に１２番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、又は２０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。
また、当該変異配列を含むプライマー態様としては、上記ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列に対する変異箇所を除いて、プライマー構成塩基配列の全体で１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上が、上記ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列と一致する塩基配列を含むプライマーであることが好適である。
当該プライマーを構成する塩基配列に関して、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列に対する変異数としては、対象試料ゲノムＤＮＡ上におけるＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の増幅が可能となる範囲であれば特に制限はないが、好ましくは、３塩基以下、２塩基以下、又は１塩基以下を挙げることができる。特に好ましくは、変異数が２塩基以下のものを好適に挙げることができる。
ここで、当該変異配列を含むプライマーの態様としては、例えば、プライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列が、ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列と一致するプライマーを好適に挙げることができる。当該態様では、それより５’側の塩基に変異を有する塩基配列であっても、３’側での配列特異的な結合能が担保されるため、上記の欠失型配列の検出機能が担保されたプライマーとして用いることが可能となる。好ましくは、当該プライマーにおいてＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域の塩基配列又はその相補配列上の塩基配列に一致する領域としては、プライマー構成塩基配列の３’端の塩基より上流に１２番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、又は２０番目の塩基から当該３’端の塩基までの間の塩基配列で示される領域、を好適に挙げることができる。
また、当該変異配列を含むプライマー態様としては、上記ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又はその相補配列に対する変異箇所を除いて、プライマー構成塩基配列の全体で１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、又は２０塩基以上が、上記ＩＮＤ２１４遺伝子座及びその周辺領域を構成する塩基配列又は相補配列と一致する塩基配列を含むプライマーであることが好適である。
【0053】
下記実験例に基づく好適な態様としては、（ｐ３）、（ｐ４）、（ｐ１３）、及び／又は（ｐ１４）に記載のプライマーに関して、品種「あすみ」の塩基配列、若しくは、品種「あすみ」の塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上が品種「あすみ」の塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーを好適に挙げることができる。そして、当該プライマーとしては、下記実験例で示した４８種類のカンキツ品種のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合において、その全てのカンキツ品種に対して、下記実験例で示されたＩＮＤ２１４挿入型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列のＰＣＲ増幅様式と同様のＰＣＲ増幅様式を示す塩基配列を含むプライマーを、本発明のカンキツ識別技術に用いることが可能なプライマーとして好適に採用することができる。
なお、ここでの「実験例の（中略）ＰＣＲ増幅様式と同様」という表現は、下記実験例の４８種類のカンキツ品種に対するＰＣＲ増幅の有無による検出様式が同じかどうかを指し、プライマー設計位置等の相違による増幅断片の塩基長の相違は許容される内容として記載されている。
また、同様に、（ｐ３）、（ｐ４）、（ｐ１３）、及び／又は（ｐ１４）に記載のプライマーとしては、クレメンティンの塩基配列、若しくは、クレメンティンの塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上がクレメンティンの塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーに関しても、上記と同様の条件にてプライマーを設計することが可能である。
なお、ここでの「実験例の（中略）ＰＣＲ増幅様式と同様」という表現は、下記実験例の４８種類のカンキツ品種に対するＰＣＲ増幅の有無による検出様式が同じかどうかを指し、プライマー設計位置等の相違による増幅断片の塩基長の相違は許容される内容として記載されている。
また、同様に、（ｐ３）、（ｐ４）、（ｐ１３）、及び／又は（ｐ１４）に記載のプライマーとしては、クレメンティンの塩基配列、若しくは、クレメンティンの塩基配列に対して変異が２塩基以下であってプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含む全体で１６塩基以上がクレメンティンの塩基配列と一致する塩基配列、又は、これらの相補配列に該当する塩基配列、を含むプライマーに関しても、上記と同様の条件にてプライマーを設計することが可能である。
【0054】
インデルマーカー欠失型配列検出工程の態様
本発明に係る識別対象である品種「あすみ」は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型が「ヘテロ型」（相同染色体に挿入型配列と欠失型配列を有するヘテロ型）を示すカンキツ品種であるところ、本発明者は、当該品種「あすみ」の識別はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座から「インデルマーカーの欠失型配列のみ」を検出することによって可能となることが見出した。この点、本発明のカンキツ識別技術では、当該欠失型配列検出工程を必須工程として採用することが可能となる。
当該欠失型配列検出工程をＰＣＲ法にて行う場合、上記したインデルマーカーの遺伝子座を挟むプライマーセット又は欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットを用いて当該工程を行うことが可能となる。特には、増幅断片として「欠失型配列のみ」の検出が可能となる欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットを用いて、当該工程を行うことが好適である。
本発明に係る識別対象である品種「あすみ」は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型が「ヘテロ型」（相同染色体に挿入型配列と欠失型配列を有するヘテロ型）を示すカンキツ品種であるところ、本発明者は、当該品種「あすみ」の識別はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方の遺伝子座から「インデルマーカーの欠失型配列のみ」を検出することによって可能となることが見出した。この点、本発明のカンキツ識別技術では、当該欠失型配列検出工程を必須工程として採用することが可能となる。
当該欠失型配列検出工程をＰＣＲ法にて行う場合、上記したインデルマーカーの遺伝子座を挟むプライマーセット又は欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットを用いて当該工程を行うことが可能となる。特には、増幅断片として「欠失型配列のみ」の検出が可能となる欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットを用いて、当該工程を行うことが好適である。
【0055】
また、本発明に係るカンキツ品種識別技術では、インデルマーカー欠失型配列検出工程をインデルマーカーのアレル多型検出工程として行うことも可能である。
即ち、本発明に係るカンキツ品種識別技術では、（工程１）Ｃｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程を、Ｃｐ０４１９の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程として行うことが可能となる。また、本発明に係るカンキツ品種識別技術では、（工程２）ＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程を、ＩＮＤ２１４の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程として行うことが可能となる。
当該欠失型配列検出工程をアレル多型検出工程としてＰＣＲ法で行う場合、上記したインデルマーカーの遺伝子座を挟むプライマーセットを用いて、当該工程を行うことが可能となる。
即ち、本発明に係るカンキツ品種識別技術では、（工程１）Ｃｐ０４１９の欠失型配列を検出する工程を、Ｃｐ０４１９の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程として行うことが可能となる。また、本発明に係るカンキツ品種識別技術では、（工程２）ＩＮＤ２１４の欠失型配列を検出する工程を、ＩＮＤ２１４の挿入型配列と欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を検出することを含む工程として行うことが可能となる。
当該欠失型配列検出工程をアレル多型検出工程としてＰＣＲ法で行う場合、上記したインデルマーカーの遺伝子座を挟むプライマーセットを用いて、当該工程を行うことが可能となる。
【0056】
本発明に係るカンキツ識別技術では、（工程１）と（工程２）の順番には特に制限はなく、（工程１）を行った後に（工程２）を行う態様、（工程２）を行った後に（工程１）を行う態様が可能である。また、上記の（工程１）及び（工程２）を別々に行う態様に加えて、（工程１）と（工程２）を同時に行う態様も可能である。
また、（工程１）と（工程２）の検出工程を、同一の試料溶液を用いて行う態様も可能である。例えば、ＰＣＲ法を利用して行う場合、（工程１）と（工程２）を同一のＰＣＲ反応液を用いて行う態様が可能である。当該態様としては、上記したＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセットとＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセットを同一溶液中に含むＰＣＲ反応液を調製し、１回のＰＣＲ反応にてＣｐ０４１９欠失型配列の増幅とＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅を同時に行う態様（マルチプレックス法）を挙げることができる。
また、（工程１）と（工程２）の検出工程を、同一の試料溶液を用いて行う態様も可能である。例えば、ＰＣＲ法を利用して行う場合、（工程１）と（工程２）を同一のＰＣＲ反応液を用いて行う態様が可能である。当該態様としては、上記したＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセットとＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセットを同一溶液中に含むＰＣＲ反応液を調製し、１回のＰＣＲ反応にてＣｐ０４１９欠失型配列の増幅とＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅を同時に行う態様（マルチプレックス法）を挙げることができる。
【0057】
当該欠失型配列検出工程をマルチプレックスＰＣＲ法で行う場合、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット、及び、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット、の４種類のプライマーを含んだ状態のＰＣＲ反応液を調製して、当該工程を行うことが好適である。
また、当該マルチプレックス法にてＰＣＲ反応を行う場合、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットでのＰＣＲ増幅断片の塩基長と、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットでのＰＣＲ増幅断片の塩基長とが、電気泳動でお互いに識別可能な塩基長で且つ近似した長さの塩基長となるようにプライマー設計をすることが好適である。また、これら４種類のプライマーのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等が近似した値になるようにプライマー設計することが好適である。
当該態様を採用した場合、マルチプレックス法による１検体のＰＣＲ反応液を電気泳動するのみで、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅の有無を１度に判断することが可能となる。
また、当該マルチプレックス法にてＰＣＲ反応を行う場合、Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットでのＰＣＲ増幅断片の塩基長と、ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセットでのＰＣＲ増幅断片の塩基長とが、電気泳動でお互いに識別可能な塩基長で且つ近似した長さの塩基長となるようにプライマー設計をすることが好適である。また、これら４種類のプライマーのＴｍ値（アニーリング温度）やＧＣ含量等が近似した値になるようにプライマー設計することが好適である。
当該態様を採用した場合、マルチプレックス法による１検体のＰＣＲ反応液を電気泳動するのみで、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列の増幅の有無を１度に判断することが可能となる。
【0058】
［判定工程］
本発明に係るカンキツ識別技術は、前記のインデルマーカー欠失型配列検出工程を行った後、その検出結果から識別対象のカンキツ植物が品種「あすみ」又はその後代品種であるかを判定する工程を含む。
本発明のカンキツ識別技術では、上記した（工程１）及び（工程２）に記載のインデルマーカー欠失型配列検出工程を行った後、その欠失型配列の検出結果に基づいて（工程３）に係る判定工程を行う。
本発明に係るカンキツ識別技術は、前記のインデルマーカー欠失型配列検出工程を行った後、その検出結果から識別対象のカンキツ植物が品種「あすみ」又はその後代品種であるかを判定する工程を含む。
本発明のカンキツ識別技術では、上記した（工程１）及び（工程２）に記載のインデルマーカー欠失型配列検出工程を行った後、その欠失型配列の検出結果に基づいて（工程３）に係る判定工程を行う。
【0059】
ここで、インデルマーカーであるＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して、カンキツ属に属する多くのカンキツ品種では、これらの遺伝子座に挿入配列を有する挿入型配列をホモ型で有するアレル型（挿入型配列／挿入型配列）を示す。一方、後述する実験例の結果が示すように、一部のカンキツ品種では、これらの遺伝子座のいずれか１つに関して、挿入配列が欠失した欠失型配列を相同染色体の１本に有するヘテロ型のアレル型（挿入型配列／欠失型配列）を示すカンキツ品種が数種存在する。
それに対して、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のアレル型がヘテロ型（挿入型配列／欠失型配列）を示すカンキツ品種は品種「あすみ」のみと認められ、少なくとも本出願時における主要な他のカンキツ品種では、同様のアレル多型を示す品種は発見されていない。
それに対して、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のアレル型がヘテロ型（挿入型配列／欠失型配列）を示すカンキツ品種は品種「あすみ」のみと認められ、少なくとも本出願時における主要な他のカンキツ品種では、同様のアレル多型を示す品種は発見されていない。
【0060】
この点、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の欠失型配列は、ヘテロ型のアレル多型を示すカンキツ品種のゲノムＤＮＡにしか存在しない配列である。そのため、本発明のカンキツ識別技術では、Ｃｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」又はその後代品種であると判定することが可能となる。
即ち、本発明に係るカンキツ識別技術は、（工程３）：前記（工程１）及び（工程２）において、Ｃｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程を含む、カンキツ品種の識別方法に関する。
即ち、本発明に係るカンキツ識別技術は、（工程３）：前記（工程１）及び（工程２）において、Ｃｐ０４１９欠失型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である、又は、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程を含む、カンキツ品種の識別方法に関する。
【0061】
また、本発明に係るカンキツ識別技術では、前記（工程１）及び／又は（工程２）をインデルマーカーのアレル多型検出工程として行った場合、（工程３）の判定工程を、上記ヘテロ型のアレル多型（挿入型配列／欠失型配列）が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」又はその後代品種であると判定することも可能となる。
即ち、本発明に係るカンキツ識別技術では、（工程３）の判定工程を、Ｃｐ０４１９に関する上記ヘテロ型多型及びＩＮＤ２１４に関する上記ヘテロ型多型の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程として行うことも可能となる。
即ち、本発明に係るカンキツ識別技術では、（工程３）の判定工程を、Ｃｐ０４１９に関する上記ヘテロ型多型及びＩＮＤ２１４に関する上記ヘテロ型多型の両方が検出された場合に、対象試料であるカンキツ植物の品種が品種「あすみ」である又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種である、と判定する工程として行うことも可能となる。
【0062】
［その他の工程等］
本発明に係るカンキツ識別技術では、上記（工程１）、（工程２）、及び（工程３）以外の他の工程を含む態様とすることも可能である。例えば、（工程１）及び（工程２）の前に他の工程を含む態様とすることが可能であり、（工程３）の後に他の工程を含む態様とすることが可能である。また、（工程１）、（工程２）、及び（工程３）の間に他の工程を含む態様とすることも可能である。
他の工程としては、公知及び／又は新規の技術的事項を含む工程を含み特に制限はないが、例えば、対象植物の植物体の外形的又は生理的な表現型（例えば、地上部の形態、生育特性、果実の形態や品質、代謝物質や分泌物質の特性、等）に基づく対象試料植物の選別工程、他のＤＮＡ識別技術（ＳＮＰ、ＳＳＲ、ＣＡＰＳ、ＲＦＬＰ等の解析）に基づく品種識別工程、等を併せて行う態様も可能である。
本発明に係るカンキツ識別技術では、上記（工程１）、（工程２）、及び（工程３）以外の他の工程を含む態様とすることも可能である。例えば、（工程１）及び（工程２）の前に他の工程を含む態様とすることが可能であり、（工程３）の後に他の工程を含む態様とすることが可能である。また、（工程１）、（工程２）、及び（工程３）の間に他の工程を含む態様とすることも可能である。
他の工程としては、公知及び／又は新規の技術的事項を含む工程を含み特に制限はないが、例えば、対象植物の植物体の外形的又は生理的な表現型（例えば、地上部の形態、生育特性、果実の形態や品質、代謝物質や分泌物質の特性、等）に基づく対象試料植物の選別工程、他のＤＮＡ識別技術（ＳＮＰ、ＳＳＲ、ＣＡＰＳ、ＲＦＬＰ等の解析）に基づく品種識別工程、等を併せて行う態様も可能である。
【0063】
２．カンキツ品種識別技術に関する発明及び応用発明
本出願に関する発明としては、上記段落１．に記載されたカンキツ品種の識別技術に関する発明、当該識別技術を用いるための技術的特徴に関する発明、並びに、当該識別技術を利用した発明、等に関する発明が含まれる。
本出願に関する発明としては、上記段落１．に記載されたカンキツ品種の識別技術に関する発明、当該識別技術を用いるための技術的特徴に関する発明、並びに、当該識別技術を利用した発明、等に関する発明が含まれる。
【0064】
［各種方法に関する発明］
本発明に関するカンキツ識別技術としては、カンキツ品種の識別方法に関する発明が含まれる。詳しくは、本発明には、品種「あすみ」又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種を他のカンキツ品種から識別する方法に関する発明が含まれる。
また、本発明に係るカンキツ識別技術を利用した発明としては、上記したカンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を識別する方法を使用することを含む、各種方法に関する発明が含まれる。例えば、品種「あすみ」又はその後代品種の植物体を栽培する方法、品種「あすみ」又はその後代品種の果実を生産する方法、又は、品種「あすみ」又はその後代品種の果実の加工品を生産する方法、等に関する発明が含まれる。
当該植物体の栽培方法、果実の生産方法、果実の加工品の生産方法としては、本発明に係るカンキツ品種識別方法を用いること以外は、常法や公知の手法にて行うことが可能である。また、これらの各種方法の発明に関しては、各種工程、条件、手法、手段等に関しては、上記段落の記載を参照又は引用することが可能である。また、本発明の特徴部分以外の各種工程、条件、手法、手段等に関しては、常法や公知の手法等を採用することが可能である。
また、カンキツ果実の加工品の生産方法において、生産物に該当するカンキツ果実加工品としては、上記段落の加工品に関する記載を参照又は引用することも可能であるが、例えば、果肉を含むストレートジュース、果肉をシロップ漬けにした缶詰、ドライフルーツ、等の果実加工品を挙げることができる。
本発明に関するカンキツ識別技術としては、カンキツ品種の識別方法に関する発明が含まれる。詳しくは、本発明には、品種「あすみ」又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種を他のカンキツ品種から識別する方法に関する発明が含まれる。
また、本発明に係るカンキツ識別技術を利用した発明としては、上記したカンキツ品種「あすみ」又はその後代品種を識別する方法を使用することを含む、各種方法に関する発明が含まれる。例えば、品種「あすみ」又はその後代品種の植物体を栽培する方法、品種「あすみ」又はその後代品種の果実を生産する方法、又は、品種「あすみ」又はその後代品種の果実の加工品を生産する方法、等に関する発明が含まれる。
当該植物体の栽培方法、果実の生産方法、果実の加工品の生産方法としては、本発明に係るカンキツ品種識別方法を用いること以外は、常法や公知の手法にて行うことが可能である。また、これらの各種方法の発明に関しては、各種工程、条件、手法、手段等に関しては、上記段落の記載を参照又は引用することが可能である。また、本発明の特徴部分以外の各種工程、条件、手法、手段等に関しては、常法や公知の手法等を採用することが可能である。
また、カンキツ果実の加工品の生産方法において、生産物に該当するカンキツ果実加工品としては、上記段落の加工品に関する記載を参照又は引用することも可能であるが、例えば、果肉を含むストレートジュース、果肉をシロップ漬けにした缶詰、ドライフルーツ、等の果実加工品を挙げることができる。
【0065】
［カンキツ品種識別キットに関する発明］
本発明としては、上記したカンキツ識別技術を用いるための技術的特徴に関する発明として、品種「あすみ」又はその後代品種を識別するためのカンキツ品種識別キットに関する発明が含まれる。
即ち、本発明は下記のカンキツ品種識別キットに関する発明を含まれる：
下記（Ａ）に記載のプライマーセット及び下記（Ｂ）に記載のプライマーセットを含む、カンキツ品種「あすみ」又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、を識別するためのカンキツ品種識別キット：
（Ａ）下記（ａ－１）又は（ａ－２）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出可能なプライマーセット：
（ａ－１）前記（ｐ１）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ２）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、
（ａ－２）前記（ｐ１１）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ１２）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、；
（Ｂ）下記（ｂ－１）又は（ｂ－２）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出可能なプライマーセット：
（ｂ－１）前記（ｐ３）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ４）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、
（ｂ－２）前記（ｐ１３）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ１４）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット。
本発明としては、上記したカンキツ識別技術を用いるための技術的特徴に関する発明として、品種「あすみ」又はその後代品種を識別するためのカンキツ品種識別キットに関する発明が含まれる。
即ち、本発明は下記のカンキツ品種識別キットに関する発明を含まれる：
下記（Ａ）に記載のプライマーセット及び下記（Ｂ）に記載のプライマーセットを含む、カンキツ品種「あすみ」又はＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種「あすみ」の後代品種、を識別するためのカンキツ品種識別キット：
（Ａ）下記（ａ－１）又は（ａ－２）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出可能なプライマーセット：
（ａ－１）前記（ｐ１）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ２）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、
（ａ－２）前記（ｐ１１）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ１２）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、；
（Ｂ）下記（ｂ－１）又は（ｂ－２）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出可能なプライマーセット：
（ｂ－１）前記（ｐ３）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ４）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット、
（ｂ－２）前記（ｐ１３）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、及び、前記（ｐ１４）に示されるオリゴヌクレオチドプライマー、からなるプライマーセット。
【0066】
当該カンキツ品種識別キットは、上記した品種「あすみ」又はその後代品種を識別するためのプライマーセットとして、（Ａ）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセット、並びに、（Ｂ）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセット、の両方のプライマーセット（計４種類のプライマー）を含むカンキツ品種識別キットに関する。
ここで、（Ａ）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ１）及び（ｐ２）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（Ｃｐ０４１９遺伝子座を挟む位置に設計されたプライマーセット）、又は、（ｐ１１）及び（ｐ１２）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）、のいずれかを含めることが可能である。
また、（Ｂ）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ３）及び（ｐ４）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（ＩＮＤ２１４遺伝子座を挟む位置に設計されたプライマーセット）、又は、（ｐ１３）及び（ｐ１４）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）、のいずれかを含めることが可能である。
ここで、（Ａ）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ１）及び（ｐ２）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（Ｃｐ０４１９遺伝子座を挟む位置に設計されたプライマーセット）、又は、（ｐ１１）及び（ｐ１２）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）、のいずれかを含めることが可能である。
また、（Ｂ）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ３）及び（ｐ４）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（ＩＮＤ２１４遺伝子座を挟む位置に設計されたプライマーセット）、又は、（ｐ１３）及び（ｐ１４）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）、のいずれかを含めることが可能である。
【0067】
本発明に係るカンキツ品種識別キットの好適態様としては（Ａ）に記載のＣｐ０４１９欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ１１）及び（ｐ１２）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）を含め、（Ｂ）に記載のＩＮＤ２１４欠失型配列を検出するためのプライマーセットとしては、（ｐ１３）及び（ｐ１４）の２種類のプライマーからなるプライマーセット（ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを含むプライマーセット）を含めた態様とすることが好適である。
当該態様では、インデルマーカーの「欠失型配列のみ」を増幅可能なプライマーセットを含んで構成されるキットであるため、マルチプレックス法等に好適に用いることが可能となる。
当該態様では、インデルマーカーの「欠失型配列のみ」を増幅可能なプライマーセットを含んで構成されるキットであるため、マルチプレックス法等に好適に用いることが可能となる。
【0068】
また、本発明に係るカンキツ品種識別キットとしては、上記プライマーセット以外に各種構成物品を含むキットの態様とすることが可能である。例えば、各種試薬、酵素、ｒｂｃＬ遺伝子増幅用プライマーセット等の陽性コントロールとなるプライマーセット、等を含むキットの態様とすることも可能である。
【実施例】
【0069】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【0070】
［実験手法］
以下の実験例において行われた試験及び解析等に関して、特に明示のない箇所に関しては、下記の手法や条件にて試験及び解析等を行った。
以下の実験例において行われた試験及び解析等に関して、特に明示のない箇所に関しては、下記の手法や条件にて試験及び解析等を行った。
【0071】
（１）「ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ反応」
カンキツ植物の果実から外果皮を切り出し、乳鉢内で液体窒素を用いて試料を凍結させ、乳棒にて試料の粉砕を行った。得られた粉末化した試料について、ＤＮＡ抽出キットであるＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、トータルＤＮＡの抽出を行った。当該手法にて得られたトータルＤＮＡには、ゲノムＤＮＡと葉緑体ＤＮＡが含まれる。
カンキツ植物の果実から外果皮を切り出し、乳鉢内で液体窒素を用いて試料を凍結させ、乳棒にて試料の粉砕を行った。得られた粉末化した試料について、ＤＮＡ抽出キットであるＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、トータルＤＮＡの抽出を行った。当該手法にて得られたトータルＤＮＡには、ゲノムＤＮＡと葉緑体ＤＮＡが含まれる。
【0072】
上記抽出したトータルＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Toyobo社）及び下記に記載のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ反応によるＤＮＡ断片の増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用サーマルサイクラー（ProFlex PCR System、Thermo Fisher Scientific社）及び９６穴プレート又は８連チューブを用いて、下記の条件にて行った。
なお、以下の品種識別試験に関する実験例で用いられたＣｐ０４１９遺伝子座又はＩＮＤ２１４遺伝子座を増幅するためのプライマーは、品種「あすみ」の欠失型配列の塩基配列を基に設計されたプライマーである。これらのうちの最短プライマーは１７塩基であった。また、これらのプライマーの一部には、他のカンキツ品種（標準品種クレメンティン）の塩基配列に対して最大２塩基の相違（プライマー構成塩基２０塩基のうち、３’端の塩基から上流に１１番目の塩基と１２番目の塩基での相違）が認められたが、クレメンティン配列との一致率の最も低いプライマーであってもプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含めて全体で１８塩基の塩基配列は一致するものであった。
これらのプライマーがクレメンティンを含む本実験例２～５で用いた計４８種類の全てのカンキツ品種のＣｐ０４１９遺伝子座又はＩＮＤ２１４遺伝子座を含む領域を増幅可能なプライマーであることは、以下の実験例にて確認された（表１～６、図６、図８、図９、図１０）。
なお、以下の品種識別試験に関する実験例で用いられたＣｐ０４１９遺伝子座又はＩＮＤ２１４遺伝子座を増幅するためのプライマーは、品種「あすみ」の欠失型配列の塩基配列を基に設計されたプライマーである。これらのうちの最短プライマーは１７塩基であった。また、これらのプライマーの一部には、他のカンキツ品種（標準品種クレメンティン）の塩基配列に対して最大２塩基の相違（プライマー構成塩基２０塩基のうち、３’端の塩基から上流に１１番目の塩基と１２番目の塩基での相違）が認められたが、クレメンティン配列との一致率の最も低いプライマーであってもプライマー構成塩基の３’端の塩基より上流に１０番目の塩基から当該３’端の塩基までの塩基配列を含めて全体で１８塩基の塩基配列は一致するものであった。
これらのプライマーがクレメンティンを含む本実験例２～５で用いた計４８種類の全てのカンキツ品種のＣｐ０４１９遺伝子座又はＩＮＤ２１４遺伝子座を含む領域を増幅可能なプライマーであることは、以下の実験例にて確認された（表１～６、図６、図８、図９、図１０）。
【0073】
（ＰＣＲ反応液）
2×KOD One PCR Master Mix Blue ５μＬ
プライマー溶液（各４ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
試料ＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ） １μＬ
滅菌超純水 ３μＬ
（計 １０μＬ）
2×KOD One PCR Master Mix Blue ５μＬ
プライマー溶液（各４ｐｍｏｌ／μＬ） １μＬ
試料ＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ） １μＬ
滅菌超純水 ３μＬ
（計 １０μＬ）
【0074】
（ＰＣＲ条件）
９８℃ １秒
３２サイクル×（９８℃１０秒 →５６℃５秒 →６８℃２秒）
６８℃ ３０秒
４℃ サンプル回収まで
９８℃ １秒
３２サイクル×（９８℃１０秒 →５６℃５秒 →６８℃２秒）
６８℃ ３０秒
４℃ サンプル回収まで
【0075】
上記ＰＣＲ反応後の反応液にloading dye（青色素）を加えて２％アガロースゲルにアプライし、１×ＴＡＥバッファー中で電気泳動を行った。サイズマーカーである１００ｂｐラダーも同時に電気泳動した。
電気泳動後のゲルをＥｔＢｒ溶液中にて２０分間染色し、紫外線照射を行ってサイズに応じて分離されたＤＮＡ増幅断片をバンドとして検出した。
電気泳動後のゲルをＥｔＢｒ溶液中にて２０分間染色し、紫外線照射を行ってサイズに応じて分離されたＤＮＡ増幅断片をバンドとして検出した。
【0076】
［実験例１］『品種「あすみ」を識別可能なインデルマーカーの選抜』
カンキツ属植物のインデルマーカーに関して、品種「あすみ」に特有なアレル型を示すインデルマーカーの探索を行った。本例で検討に用いたインデルマーカーは、カンキツ属植物において遺伝子座自体は公知のインデルマーカーであるところ（非特許文献３、４）、カンキツ属植物の各品種が有するゲノムＤＮＡが有するアレル型は知られていない。
カンキツ属植物のインデルマーカーに関して、品種「あすみ」に特有なアレル型を示すインデルマーカーの探索を行った。本例で検討に用いたインデルマーカーは、カンキツ属植物において遺伝子座自体は公知のインデルマーカーであるところ（非特許文献３、４）、カンキツ属植物の各品種が有するゲノムＤＮＡが有するアレル型は知られていない。
【0077】
（１）「品種「あすみ」を識別可能なインデルマーカー多型の探索」
カンキツ属植物においてインデルマーカー１８５種類に関して、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置でＰＣＲプライマーを設定し、品種「あすみ」から抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行って、それぞれのプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ増幅断片の塩基長を電気泳動により検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。
カンキツ属植物においてインデルマーカー１８５種類に関して、インデルマーカーの遺伝子座を挟む位置でＰＣＲプライマーを設定し、品種「あすみ」から抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行って、それぞれのプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ増幅断片の塩基長を電気泳動により検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。
【0078】
その結果、上記調査した１８５種類のインデルマーカーのうち、Ｃｐ０４１９に関するプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行ったところ、塩基長の異なる２種類のＰＣＲ増幅断片が得られることが示された。同様に、ＩＮＤ２１４に関するプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った場合も、塩基長の異なる２種類のＰＣＲ増幅断片が得られることが示された。
当該結果から、品種「あすみ」では、Ｃｐ０４１９のインデルマーカーの遺伝子座に関して、当該遺伝子座に挿入配列を有する配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）と挿入配列を有さない配列（Ｃｐ０４１９欠失型配列）を相同染色体にヘテロで有するカンキツ品種であることが示された。同様に、品種「あすみ」は、ＩＮＤ２１４のインデルマーカーの遺伝子座に関しても、当該遺伝子座に挿入配列を有する配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）と挿入配列を有さない配列（ＩＮＤ２１４欠失型配列）をヘテロで有するカンキツ品種であることが示された。
当該結果から、品種「あすみ」では、Ｃｐ０４１９のインデルマーカーの遺伝子座に関して、当該遺伝子座に挿入配列を有する配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）と挿入配列を有さない配列（Ｃｐ０４１９欠失型配列）を相同染色体にヘテロで有するカンキツ品種であることが示された。同様に、品種「あすみ」は、ＩＮＤ２１４のインデルマーカーの遺伝子座に関しても、当該遺伝子座に挿入配列を有する配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）と挿入配列を有さない配列（ＩＮＤ２１４欠失型配列）をヘテロで有するカンキツ品種であることが示された。
【0079】
（２）「Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の塩基配列情報」
カンキツ植物のインデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して、これらの塩基配列に関する情報を以下に示す。
カンキツ植物のインデルマーカーＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関して、これらの塩基配列に関する情報を以下に示す。
【0080】
（Ｃｐ０４１９）
インデルマーカーＣｐ０４１９は、ゲノム情報が解読されているカンキツの標準種の１つであるクレメンティンゲノムの第５染色体上（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子（配列番号１に示す塩基配列内に存在する遺伝子）の第１イントロンに存在するインデルマーカーである（図２、図３）。
ここで、クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列として示すことができる。クレメンティンのエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子に関して、第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、配列番号１に示される塩基配列において、第１５９０番目から第２８２５番目の塩基にて示される塩基配列に該当する領域である。また、当該第１イントロンは、配列番号１に示される塩基配列における第２０００番目から第２３４６番目の塩基にて示される塩基配列で示される領域である。また、５’ＵＴＲは、配列番号１に示される塩基配列における第１５０１番目の塩基から第１５８９番目の塩基までの塩基配列に該当する。
クレメンティンの当該Ｃｐ０４１９挿入型配列では、配列番号１に示されるＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基である第２１１７番目の塩基「Ｇ」とＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基である第２２８７番目の塩基「Ｔ」の間に、１６９ｂｐの挿入配列（配列番号１の第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの領域）が存在する。
インデルマーカーＣｐ０４１９は、ゲノム情報が解読されているカンキツの標準種の１つであるクレメンティンゲノムの第５染色体上（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）、エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子（配列番号１に示す塩基配列内に存在する遺伝子）の第１イントロンに存在するインデルマーカーである（図２、図３）。
ここで、クレメンティンのＣｐ０４１９挿入型配列を含む塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列として示すことができる。クレメンティンのエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子に関して、第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、配列番号１に示される塩基配列において、第１５９０番目から第２８２５番目の塩基にて示される塩基配列に該当する領域である。また、当該第１イントロンは、配列番号１に示される塩基配列における第２０００番目から第２３４６番目の塩基にて示される塩基配列で示される領域である。また、５’ＵＴＲは、配列番号１に示される塩基配列における第１５０１番目の塩基から第１５８９番目の塩基までの塩基配列に該当する。
クレメンティンの当該Ｃｐ０４１９挿入型配列では、配列番号１に示されるＣｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基である第２１１７番目の塩基「Ｇ」とＣｐ０４１９遺伝子座の最下流塩基である第２２８７番目の塩基「Ｔ」の間に、１６９ｂｐの挿入配列（配列番号１の第２１１８番目の塩基から第２２８６番目の塩基までの領域）が存在する。
【0081】
クレメンティンは、当該挿入配列が存在するタイプの配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）と当該挿入配列が存在しないタイプの配列（Ｃｐ０４１９欠失型配列）とを、相同染色体にヘテロで有するアレル型を示す。ここで、Ｃｐ０４１９欠失型のエンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロンでは、Ｃｐ０４１９遺伝子座の最上流塩基「Ｇ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挟まれた領域（上記の挿入配列）が欠失した塩基配列となる（図３）。
本例の選抜試験の結果では、品種「あすみ」は、クレメンティンと同様にＣｐ０４１９挿入型配列とＣｐ０４１９欠失型配列とを相同染色体にヘテロで有するアレル型を示した。品種「あすみ」から単離されたＣｐ０４１９欠失型配列を含む塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列として示すことができる。
本例の選抜試験の結果では、品種「あすみ」は、クレメンティンと同様にＣｐ０４１９挿入型配列とＣｐ０４１９欠失型配列とを相同染色体にヘテロで有するアレル型を示した。品種「あすみ」から単離されたＣｐ０４１９欠失型配列を含む塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列として示すことができる。
【0082】
（ＩＮＤ２１４）
インデルマーカーＩＮＤ２１４は、ゲノム情報が解読されているカンキツの標準種の１つであるクレメンティンゲノムの第１染色体上（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子（配列番号７に示す塩基配列内に存在する遺伝子）の上流領域に存在するインデルマーカーである（図２、図４）。
ここで、クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む塩基配列は、配列番号７に記載の塩基配列として示すことができる。クレメンティンのＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子に関して、第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、配列番号７に示される塩基配列において、第３１８６番目から第１１６５８番目の塩基にて示される塩基配列に該当する領域である。また、５’ＵＴＲは、配列番号７に示される塩基配列における第３００１番目の塩基から第３１８５番目の塩基までの塩基配列に該当し、第３００１番目の塩基より上流側の領域（第１番目の塩基から第３０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域）は、当該遺伝子の上流領域に該当する。ＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基は、当該遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基から上流に２８８番目の塩基に該当するため、ＩＮＤ２１４遺伝子座は当該遺伝子の上流調節領域にあるインデルマーカーと認められる。
クレメンティンの当該ＩＮＤ２１４挿入型配列では、配列番号７に示されるＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基である第２５０３番目の塩基「Ｔ」とＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基である第２７１３番目の塩基「Ｔ」の間に、２０９ｂｐの挿入配列（配列番号７の第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの領域）が存在する。クレメンティンは、当該挿入配列が存在するタイプの配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）を相同染色体にホモで有するアレル型を示す。
インデルマーカーＩＮＤ２１４は、ゲノム情報が解読されているカンキツの標準種の１つであるクレメンティンゲノムの第１染色体上（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）、ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子（配列番号７に示す塩基配列内に存在する遺伝子）の上流領域に存在するインデルマーカーである（図２、図４）。
ここで、クレメンティンのＩＮＤ２１４挿入型配列を含む塩基配列は、配列番号７に記載の塩基配列として示すことができる。クレメンティンのＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子に関して、第１エクソンの最上流塩基から最終エクソンの最下流塩基までの塩基配列で示される領域は、配列番号７に示される塩基配列において、第３１８６番目から第１１６５８番目の塩基にて示される塩基配列に該当する領域である。また、５’ＵＴＲは、配列番号７に示される塩基配列における第３００１番目の塩基から第３１８５番目の塩基までの塩基配列に該当し、第３００１番目の塩基より上流側の領域（第１番目の塩基から第３０００番目の塩基までの塩基配列で示される領域）は、当該遺伝子の上流領域に該当する。ＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基は、当該遺伝子の５’ＵＴＲの最上流塩基から上流に２８８番目の塩基に該当するため、ＩＮＤ２１４遺伝子座は当該遺伝子の上流調節領域にあるインデルマーカーと認められる。
クレメンティンの当該ＩＮＤ２１４挿入型配列では、配列番号７に示されるＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基である第２５０３番目の塩基「Ｔ」とＩＮＤ２１４遺伝子座の最下流塩基である第２７１３番目の塩基「Ｔ」の間に、２０９ｂｐの挿入配列（配列番号７の第２５０４番目の塩基から第２７１２番目の塩基までの領域）が存在する。クレメンティンは、当該挿入配列が存在するタイプの配列（Ｃｐ０４１９挿入型配列）を相同染色体にホモで有するアレル型を示す。
【0083】
本例での選抜試験の結果では、品種「あすみ」は、クレメンティンとは異なり当該挿入配列が存在するタイプの配列（ＩＮＤ２１４挿入型配列）と当該挿入配列が存在しないタイプの配列（ＩＮＤ２１４欠失型配列）とを、相同染色体にヘテロで有するアレル型を示した。ここで、ＩＮＤ２１４欠失型でのＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域では、ＩＮＤ２１４遺伝子座の最上流塩基「Ｔ」と最下流塩基「Ｔ」の間に挟まれた領域（上記の挿入配列）が欠失した塩基配列となる（図４）。品種「あすみ」から単離されたＩＮＤ２１４欠失型配列を含む塩基配列は、配列番号８に記載の塩基配列として示すことができる。
【0084】
［実験例２］『カンキツ品種識別試験』
上記試験により選抜した２種類のインデルマーカーに関するアレル多型分析を行うことで、主要なカンキツ品種から品種「あすみ」の識別が可能かを検討した。
上記試験により選抜した２種類のインデルマーカーに関するアレル多型分析を行うことで、主要なカンキツ品種から品種「あすみ」の識別が可能かを検討した。
【0085】
（１）「Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関するアレル多型分析」
品種「あすみ」を含むカンキツ品種２４種類（試料１～２４）からトータルＤＮＡを抽出し、Ｃｐ０４１９の遺伝子座を挟む位置で設計したオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセット（配列番号３、４）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。同様に、ＩＮＤ２１４の遺伝子座を挟む位置で設計したオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセット（配列番号９、１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。
本例におけるＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のプライマー設計位置としては、図５に示すようにインデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に設計した（図３～５）。
品種「あすみ」を含むカンキツ品種２４種類（試料１～２４）からトータルＤＮＡを抽出し、Ｃｐ０４１９の遺伝子座を挟む位置で設計したオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセット（配列番号３、４）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。同様に、ＩＮＤ２１４の遺伝子座を挟む位置で設計したオリゴヌクレオチドプライマーのプライマーセット（配列番号９、１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。
本例におけるＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のプライマー設計位置としては、図５に示すようにインデルマーカーの遺伝子座を挟む位置に設計した（図３～５）。
【0086】
詳しくは、本例におけるＣｐ０４１９の増幅プライマーセットのうちの上流側プライマーは、配列番号３で示す塩基配列からなる２１塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー１）である。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号２の第１番目の塩基から第２１番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号４で示す塩基配列からなる１７塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー２）である。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号２の第５８３番目の塩基から第５９９番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。
ここで、当該プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当する７６８ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片（短鎖ＤＮＡ断片に相当する５９９ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。
当該プライマーセットを用いてクレメンティンから抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行ったところ、長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドと短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンドが増幅することが確認された。
ここで、当該プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当する７６８ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片（短鎖ＤＮＡ断片に相当する５９９ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。
当該プライマーセットを用いてクレメンティンから抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行ったところ、長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドと短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンドが増幅することが確認された。
【0087】
同様に、ＩＮＤ２１４の増幅プライマーセットのうちの上流側プライマーは、配列番号９で示す塩基配列からなる２２塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー１）である。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＩＮＤ２１４を含むゲノム領域を示す配列番号８の第１番目の塩基から第２２番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号１０で示す塩基配列からなる２０塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー２）である。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＩＮＤ２１４を含むゲノム領域を示す配列番号８の第２７７番目の塩基から第２９６番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。
ここで、当該プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当する５０５ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片（短鎖ＤＮＡ断片に相当する２９６ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。
当該プライマーセットを用いてクレメンティンから抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行ったところ、長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンドのみが増幅し、短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの増幅は確認されなかった。
ここで、当該プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅を行った場合、インデルマーカー挿入型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列を含む長鎖ＤＮＡ断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当する５０５ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。一方、インデルマーカー欠失型配列がゲノムに存在する場合、挿入配列に相当する長さが欠失した短鎖ＤＮＡ断片（短鎖ＤＮＡ断片に相当する２９６ｂｐ又はこれと同程度の塩基長のバンド）が増幅することが予想される。
当該プライマーセットを用いてクレメンティンから抽出したトータルＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行ったところ、長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンドのみが増幅し、短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの増幅は確認されなかった。
【0088】
Ｃｐ０４１９に関するＰＣＲ増幅の結果を図６Ａに、ＩＮＤ２１４に関するＰＣＲ増幅の結果を図６Ｂに示した。
その結果、Ｃｐ０４１９の解析結果に関して、調査した２４種類のカンキツ品種のうちの１８種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９挿入型配列のＰＣＲ増幅断片のみ（長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの１８種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９挿入型配列を相同染色体にホモで有するアレル型であることが示された。
一方、品種「あすみ」（試料１２）を含む６種類のカンキツ品種に関しては、Ｃｐ０４１９挿入型配列及びＣｐ０４１９欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの６種類のカンキツ品種に関しては、Ｃｐ０４１９挿入型配列及びＣｐ０４１９欠失型配列を相同染色体にヘテロで有するアレル型であることが示された。
その結果、Ｃｐ０４１９の解析結果に関して、調査した２４種類のカンキツ品種のうちの１８種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９挿入型配列のＰＣＲ増幅断片のみ（長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの１８種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９挿入型配列を相同染色体にホモで有するアレル型であることが示された。
一方、品種「あすみ」（試料１２）を含む６種類のカンキツ品種に関しては、Ｃｐ０４１９挿入型配列及びＣｐ０４１９欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの６種類のカンキツ品種に関しては、Ｃｐ０４１９挿入型配列及びＣｐ０４１９欠失型配列を相同染色体にヘテロで有するアレル型であることが示された。
【0089】
同様に、ＩＮＤ２１４の解析結果に関して、調査した２４種類のカンキツ品種のうちの１６種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４挿入型配列のＰＣＲ増幅断片のみ（長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの１６種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４挿入型配列を相同染色体にホモで有するアレル型であることが示された。
一方、品種「あすみ」（試料１２）を含む８種類のカンキツ品種に関しては、ＩＮＤ２１４挿入型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの８種類のカンキツ品種に関しては、ＩＮＤ２１４挿入型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列を相同染色体にヘテロで有するアレル型であることが示された。
一方、品種「あすみ」（試料１２）を含む８種類のカンキツ品種に関しては、ＩＮＤ２１４挿入型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅断片（長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンド）が増幅することが示された。即ち、これらの８種類のカンキツ品種に関しては、ＩＮＤ２１４挿入型配列及びＩＮＤ２１４欠失型配列を相同染色体にヘテロで有するアレル型であることが示された。
【0090】
（２）「品種「あすみ」の識別」
上記のＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関する多型解析の結果を精査したところ、調査した２４種類のカンキツ品種（試料１～２４）及び標準品種であるクレメンティンのうち、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型がヘテロ型を示したカンキツ品種は、品種「あすみ」（試料１２）のみであることが示された（表１、表２、図６Ａ、図６Ｂ）。また、調査した他のカンキツ品種からは、品種「あすみ」と同様のアレル多型を示す品種は発見されなかった。
ここで、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種（試料１～２４）及びクレメンティンの計２５種類のカンキツ品種は、本願出願時において日本国内に流通するカンキツ果実流通量の９４％を占めるカンキツ品種である。この点、ＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別技術では、流通量９０％以上を識別可能な技術を基準としているところ、本例の調査結果は、当該技術が同国際基準を充足する技術であることを示す結果であると認められた。
上記のＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関する多型解析の結果を精査したところ、調査した２４種類のカンキツ品種（試料１～２４）及び標準品種であるクレメンティンのうち、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型がヘテロ型を示したカンキツ品種は、品種「あすみ」（試料１２）のみであることが示された（表１、表２、図６Ａ、図６Ｂ）。また、調査した他のカンキツ品種からは、品種「あすみ」と同様のアレル多型を示す品種は発見されなかった。
ここで、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種（試料１～２４）及びクレメンティンの計２５種類のカンキツ品種は、本願出願時において日本国内に流通するカンキツ果実流通量の９４％を占めるカンキツ品種である。この点、ＩＳＯ１３４９５国際基準に定められる品種識別技術では、流通量９０％以上を識別可能な技術を基準としているところ、本例の調査結果は、当該技術が同国際基準を充足する技術であることを示す結果であると認められた。
【0091】
以上の結果及び知見から、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関する多型解析を行って両方のインデルマーカーのアレル型が「ヘテロ型」である場合、ＩＳＯ１３４９５国際基準を充足する精度にて、識別対象のカンキツ品種が品種「あすみ」に該当すると判断できることが示された。
【0092】
【表1】
【0093】
【表2】
【0094】
［実験例３］『インデルマーカー欠失型配列の検出を利用した品種識別技術』
上記２種類のインデルマーカーに関して、インデルマーカーの欠失型配列のみを増幅可能なプライマーセットを設計して品種「あすみ」の識別試験を行った。
上記２種類のインデルマーカーに関して、インデルマーカーの欠失型配列のみを増幅可能なプライマーセットを設計して品種「あすみ」の識別試験を行った。
【0095】
（１）「Ｃｐ０４１９欠失型配列の検出」
Ｃｐ０４１９の遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９欠失型が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断された共通配列を繋いだ塩基配列からなるＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを設計した（図３、図７）。
当該Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーは、配列番号６で示す塩基配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９欠失型配列を含むゲノム領域を示す配列番号２の第３４８番目の塩基から第３７３番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。当該プライマーを構成する塩基のうち、３’端の塩基から上流に７番目と８番目の２塩基は、Ｃｐ０４１９欠失型配列の遺伝子座を示す２塩基の相補２塩基に該当する。
また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号５で示す塩基配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー３）である。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号２の第３番目の塩基から第２８番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。
Ｃｐ０４１９の遺伝子座に関して、Ｃｐ０４１９欠失型が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断された共通配列を繋いだ塩基配列からなるＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーを設計した（図３、図７）。
当該Ｃｐ０４１９欠失型配列特異的プライマーは、配列番号６で示す塩基配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９欠失型配列を含むゲノム領域を示す配列番号２の第３４８番目の塩基から第３７３番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。当該プライマーを構成する塩基のうち、３’端の塩基から上流に７番目と８番目の２塩基は、Ｃｐ０４１９欠失型配列の遺伝子座を示す２塩基の相補２塩基に該当する。
また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号５で示す塩基配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｐ０４１９検出用共通領域プライマー３）である。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号２の第３番目の塩基から第２８番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。
【0096】
実験例２にて調製したカンキツ品種２４種類のトータルＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図８Ａに示した。
その結果、実験例２にてＣｐ０４１９挿入型とＣｐ０４１９欠失型のヘテロ型を示した品種「あすみ」を含む８種類のカンキツ品種から、ＰＣＲ増幅を示すＤＮＡ断片がシングルバンドとして検出されることが確認された（図８Ａ）。品種「あすみ」で確認された当該ＰＣＲ増幅バンドの断片長は３７１ｂｐであることから、上記設計したプライマーセットで予想されるＣｐ０４１９欠失型配列の塩基長に相当するＤＮＡ断片であることが確認された。
一方、実験例２にてＣｐ０４１９挿入型のホモ型を示した１６種類のカンキツ品種からは、ＰＣＲ増幅断片を示すバンドは何も検出されなかった。また、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種のいずれにおいても、Ｃｐ０４１９挿入型に対応するＰＣＲ増幅断片は検出されなかった。
その結果、実験例２にてＣｐ０４１９挿入型とＣｐ０４１９欠失型のヘテロ型を示した品種「あすみ」を含む８種類のカンキツ品種から、ＰＣＲ増幅を示すＤＮＡ断片がシングルバンドとして検出されることが確認された（図８Ａ）。品種「あすみ」で確認された当該ＰＣＲ増幅バンドの断片長は３７１ｂｐであることから、上記設計したプライマーセットで予想されるＣｐ０４１９欠失型配列の塩基長に相当するＤＮＡ断片であることが確認された。
一方、実験例２にてＣｐ０４１９挿入型のホモ型を示した１６種類のカンキツ品種からは、ＰＣＲ増幅断片を示すバンドは何も検出されなかった。また、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種のいずれにおいても、Ｃｐ０４１９挿入型に対応するＰＣＲ増幅断片は検出されなかった。
【0097】
（２）「ＩＮＤ２１４欠失型配列の検出」
ＩＮＤ２１４の遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４欠失型が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断された共通配列を繋いだ塩基配列からなるＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを設計した（図４、図７）。
当該ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーは、配列番号１１で示す塩基配列からなる１８塩基のオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＩＮＤ２１４欠失型配列を含むゲノム領域を示す配列番号８の第４９番目の塩基から第６６番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。当該プライマーを構成する塩基のうち、３’端の塩基から上流に７番目と８番目の２塩基は、ＩＮＤ２１４欠失型配列の遺伝子座を示す２塩基に該当する。
また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号１２で示す塩基配列からなる２７塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー３）である。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号８の第２６８番目の塩基から第２９４番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。
ＩＮＤ２１４の遺伝子座に関して、ＩＮＤ２１４欠失型が存在する場合にのみＰＣＲ増幅が生じるように、挿入配列に分断された共通配列を繋いだ塩基配列からなるＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーを設計した（図４、図７）。
当該ＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマーは、配列番号１１で示す塩基配列からなる１８塩基のオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーはフォワードプライマーであり、品種「あすみ」のＩＮＤ２１４欠失型配列を含むゲノム領域を示す配列番号８の第４９番目の塩基から第６６番目の塩基までの塩基配列に相当するプライマーである。当該プライマーを構成する塩基のうち、３’端の塩基から上流に７番目と８番目の２塩基は、ＩＮＤ２１４欠失型配列の遺伝子座を示す２塩基に該当する。
また、当該プライマーとプライマー対を形成する下流側プライマーは、配列番号１２で示す塩基配列からなる２７塩基のオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー３）である。当該プライマーはリバースプライマーであり、品種「あすみ」のＣｐ０４１９を含むゲノム領域を示す配列番号８の第２６８番目の塩基から第２９４番目の塩基までの塩基配列の相補配列に相当するプライマーである。
【0098】
実験例２にて調製したカンキツ品種２４種類のトータルＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図８Ｂに示した。
その結果、実験例２にてＩＮＤ２１４挿入型とＩＮＤ２１４欠失型のヘテロ型を示した品種「あすみ」を含む８種類のカンキツ品種から、ＰＣＲ増幅を示すＤＮＡ断片がシングルバンドとして検出されることが確認された（図８Ｂ）。品種「あすみ」で確認された当該ＰＣＲ増幅バンドの断片長は２４６ｂｐであることから、上記設計したプライマーセットで予想されるＩＮＤ２１４欠失型配列の塩基長に相当するＤＮＡ断片であることが確認された。
一方、実験例２にてＩＮＤ２１４挿入型のホモ型を示した１６種類のカンキツ品種からは、ＰＣＲ増幅断片を示すバンドは何も検出されなかった。また、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種のいずれにおいても、ＩＮＤ２１４挿入型に対応するＰＣＲ増幅断片は検出されなかった。
その結果、実験例２にてＩＮＤ２１４挿入型とＩＮＤ２１４欠失型のヘテロ型を示した品種「あすみ」を含む８種類のカンキツ品種から、ＰＣＲ増幅を示すＤＮＡ断片がシングルバンドとして検出されることが確認された（図８Ｂ）。品種「あすみ」で確認された当該ＰＣＲ増幅バンドの断片長は２４６ｂｐであることから、上記設計したプライマーセットで予想されるＩＮＤ２１４欠失型配列の塩基長に相当するＤＮＡ断片であることが確認された。
一方、実験例２にてＩＮＤ２１４挿入型のホモ型を示した１６種類のカンキツ品種からは、ＰＣＲ増幅断片を示すバンドは何も検出されなかった。また、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種のいずれにおいても、ＩＮＤ２１４挿入型に対応するＰＣＲ増幅断片は検出されなかった。
【0099】
（３）「品種「あすみ」の識別」
Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のＰＣＲ増幅結果（図８Ａ、図８Ｂ）を精査したところ、調査した２４種類のカンキツ品種のうち、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅が検出されたものは、品種「あすみ」のみであることが示された。当該結果は、実験例２の多型解析の結果と一致する結果であった。
なお、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種からのトータルＤＮＡに対して、ポジティブコントロールとしてｒｂｃＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を行うためのプライマーセット（配列番号１３、１４）を用いてＰＣＲ反応を行ったところ、全ての試料からＤＮＡ増幅断片が検出され、ＤＮＡ試料としては問題ないことが確認された。
Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のＰＣＲ増幅結果（図８Ａ、図８Ｂ）を精査したところ、調査した２４種類のカンキツ品種のうち、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅が検出されたものは、品種「あすみ」のみであることが示された。当該結果は、実験例２の多型解析の結果と一致する結果であった。
なお、本例にて調査した２４種類のカンキツ品種からのトータルＤＮＡに対して、ポジティブコントロールとしてｒｂｃＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を行うためのプライマーセット（配列番号１３、１４）を用いてＰＣＲ反応を行ったところ、全ての試料からＤＮＡ増幅断片が検出され、ＤＮＡ試料としては問題ないことが確認された。
【0100】
以上の結果から、識別対象のカンキツ品種において、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのいずれからも欠失型配列が検出された場合、ＩＳＯ１３４９５国際基準を充足する精度にて、識別対象のカンキツ品種が品種「あすみ」であると判定できることが示された。即ち、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーから「インデルマーカーの欠失型配列」のみを検出することによって、品種「あすみ」の識別が可能であることが示された。
【0101】
【表3】
【0102】
【表4】
【0103】
［実験例４］『マルチプレックスＰＣＲ法による品種識別技術』
実験例３で設計したプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲ法による品種識別が可能かを検証した。
実験例３で設計したプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲ法による品種識別が可能かを検証した。
【0104】
実験例３にて設計したＣｐ０４１９欠失型配列特異的プライマー（配列番号６：リバースプライマー）及びＣｐ０４１９検出用共通領域プライマー３（配列番号５：フォワードプライマー）を各２ｐｍｏｌ／μＬ並びにＩＮＤ２１４欠失型配列特異的プライマー（配列番号１１：フォワードプライマー）及びＩＮＤ２１４検出用共通領域プライマー３（配列番号１２：リバースプライマー）を各４ｐｍｏｌ／μＬ含む１／１０倍希釈ＴＥ溶液を調製した。
当該プライマーミックス溶液を用いて、実験例２にて調製したカンキツ品種２４種類のトータルＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図９に示した。
当該プライマーミックス溶液を用いて、実験例２にて調製したカンキツ品種２４種類のトータルＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片を検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図９に示した。
【0105】
その結果、調査した２４種類のカンキツ品種のうち、品種「あすみ」からの試料（試料１２）でのみ、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列の両方のＰＣＲ増幅に該当する２本のＤＮＡ増幅バンドが検出された（図９）。当該結果は実験例３でのインデルマーカー欠失型配列の個別検出の結果と一致する結果であった。
当該結果から、Ｃｐ０４１９欠失型配列をシングルバンドとして検出可能なプライマーセット、及び、ＩＮＤ２１４欠失型配列をシングルバンドとして検出可能なプライマーセット、を含むマルチプレックスでのＰＣＲ反応を行うことによって、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列とを１回のＰＣＲ反応で同時に増幅して検出可能なことが示された。
以上の結果から、マルチプレックスＰＣＲ反応を行うことによって、品種「あすみ」の品種識別が更に容易に実行可能となることが示された。
当該結果から、Ｃｐ０４１９欠失型配列をシングルバンドとして検出可能なプライマーセット、及び、ＩＮＤ２１４欠失型配列をシングルバンドとして検出可能なプライマーセット、を含むマルチプレックスでのＰＣＲ反応を行うことによって、Ｃｐ０４１９欠失型配列とＩＮＤ２１４欠失型配列とを１回のＰＣＲ反応で同時に増幅して検出可能なことが示された。
以上の結果から、マルチプレックスＰＣＲ反応を行うことによって、品種「あすみ」の品種識別が更に容易に実行可能となることが示された。
【0106】
［実験例５］『他のカンキツ品種に関するＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４アレル型の確認』
上記実験例２にてアレル型が判明したカンキツ品種以外のカンキツ品種に関して、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型にて品種「あすみ」との識別が可能かを検証した。
上記実験例２にてアレル型が判明したカンキツ品種以外のカンキツ品種に関して、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型にて品種「あすみ」との識別が可能かを検証した。
【0107】
日本国内での流通が見られる品種を含む下記表に示した２３種類のカンキツ品種（試料２５～４７）に関して、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル多型分析を行った。
下記２３種類のカンキツ品種の植物体からトータルＤＮＡを抽出し、実験例２で用いたＣｐ０４１９の遺伝子座を挟む位置で設計したプライマーセット（配列番号３、４）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。同様に、ＩＮＤ２１４の遺伝子座を挟む位置で設計したプライマーセット（配列番号９、１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図１０に示した。
下記２３種類のカンキツ品種の植物体からトータルＤＮＡを抽出し、実験例２で用いたＣｐ０４１９の遺伝子座を挟む位置で設計したプライマーセット（配列番号３、４）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。同様に、ＩＮＤ２１４の遺伝子座を挟む位置で設計したプライマーセット（配列番号９、１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行って増幅されたＤＮＡ断片のサイズを検出した。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ反応、ＤＮＡ検出等の手法及び条件は、上記の記載に準じて行った。結果を図１０に示した。
【0108】
その結果、Ｃｐ０４１９の解析結果に関して、調査した２３種類のカンキツ品種のうちの２１種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９の長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンドが増幅し、挿入配列ホモ型のアレル型を示した。一方、２種類のカンキツ品種では、Ｃｐ０４１９の長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンドが増幅し、挿入型配列／欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を示した。
また、ＩＮＤ２１４の解析結果に関して、調査した２３種類のカンキツ品種のうちの１９種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４の長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンドが増幅し、挿入配列ホモ型のアレル型を示した。一方、４種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４の長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンドが増幅し、挿入型配列／欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を示した。
また、ＩＮＤ２１４の解析結果に関して、調査した２３種類のカンキツ品種のうちの１９種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４の長鎖ＤＮＡ断片に相当する１本バンドが増幅し、挿入配列ホモ型のアレル型を示した。一方、４種類のカンキツ品種では、ＩＮＤ２１４の長鎖ＤＮＡ断片に相当するバンド及び短鎖ＤＮＡ断片に相当するバンドの２本バンドが増幅し、挿入型配列／欠失型配列のヘテロ型のアレル多型を示した。
【0109】
上記のＣｐ０４１９及びＩＮＤ２１４に関する多型解析の結果を精査したところ、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４の両方のインデルマーカーのアレル型がヘテロ型を示したカンキツ品種は、本例で調査した２３種類のカンキツ品種（試料２５～４７）には存在しないことが示された。即ち、本例で調査した２３種類のカンキツ品種の中に、Ｃｐ０４１９及びＩＮＤ２１４のアレル型に関して、品種「あすみ」と同じアレル型を示す品種が存在しないことが示された。
ここで、上記実験例２にてアレル型が判明した２５種類のカンキツ品種（標準品種＋試料１～２４）に、本例にて調査した２３種類のカンキツ品種（試料２５～４７）を加えた計４８種類のカンキツ品種は、本願出願時において日本国内に流通するカンキツ果実流通量の９８％を占めるカンキツ品種である。この点、本例の調査結果は、当該技術が極めて高い精度で品種「あすみ」の識別が可能であることを裏付ける結果を示した。
ここで、上記実験例２にてアレル型が判明した２５種類のカンキツ品種（標準品種＋試料１～２４）に、本例にて調査した２３種類のカンキツ品種（試料２５～４７）を加えた計４８種類のカンキツ品種は、本願出願時において日本国内に流通するカンキツ果実流通量の９８％を占めるカンキツ品種である。この点、本例の調査結果は、当該技術が極めて高い精度で品種「あすみ」の識別が可能であることを裏付ける結果を示した。
【0110】
【表5】
【0111】
【表6】
【産業上の利用可能性】
【0112】
海外に流出したカンキツ品種「あすみ」の農作物や加工品が日本に向けて輸出された場合、税関における水際差し止めを請求するためには、侵害疑義品であるという証拠を提出する必要がある。本発明に基づくカンキツ品種「あすみ」の識別技術は、検査を行う公的機関や民間検査会社等での実施が想定される。
また、カンキツ栽培、種苗流通、果実流通、果実加工等を行う事業者においても、種子、苗木、果実、加工品等に対して、品種「あすみ」の識別を精度良く行うために利用されることが期待される。
また、カンキツ栽培、種苗流通、果実流通、果実加工等を行う事業者においても、種子、苗木、果実、加工品等に対して、品種「あすみ」の識別を精度良く行うために利用されることが期待される。
【符号の説明】
【0113】
１． インデルマーカー挿入型配列
１１． Ｃｐ０４１９挿入型配列及びその周辺領域
２１． ＩＮＤ２１４挿入型配列及びその周辺領域
１１． Ｃｐ０４１９挿入型配列及びその周辺領域
２１． ＩＮＤ２１４挿入型配列及びその周辺領域
【0114】
２． インデルマーカー欠失型配列
１２． Ｃｐ０４１９欠失型配列及びその周辺領域
２２． ＩＮＤ２１４欠失型配列及びその周辺領域
１２． Ｃｐ０４１９欠失型配列及びその周辺領域
２２． ＩＮＤ２１４欠失型配列及びその周辺領域
【0115】
４１． エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子
５１． エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン領域
５１． エンドプロテアーゼＣｌｐ遺伝子の第１イントロン領域
【0116】
４２． ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子
５２． ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域
５２． ＨＩＶ－１ Ｖｐｒ結合タンパク質遺伝子の上流領域
【0117】
３． インデルマーカー遺伝子座（挿入型の場合は挿入配列を含む領域）
３１． インデルマーカー遺伝子座の最上流塩基
３２． インデルマーカー遺伝子座の最下流塩基
３３． 挿入配列
３０１． Ｃｐ０４１９遺伝子座
３０２． ＩＮＤ２１４遺伝子座
３１． インデルマーカー遺伝子座の最上流塩基
３２． インデルマーカー遺伝子座の最下流塩基
３３． 挿入配列
３０１． Ｃｐ０４１９遺伝子座
３０２． ＩＮＤ２１４遺伝子座
【0118】
６１． インデルマーカー近傍の上流側共通配列
６２． インデルマーカー近傍の下流側共通配列
６２． インデルマーカー近傍の下流側共通配列
【0119】
７１． インデルマーカー検出用共通領域プライマー
７２． インデルマーカー検出用共通領域プライマー
７３． インデルマーカー欠失型配列特異的プライマー
７２． インデルマーカー検出用共通領域プライマー
７３． インデルマーカー欠失型配列特異的プライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】