特許 7318832 筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-24

(45)【発行日】2023-08-01

(54)【発明の名称】筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/135 20160101AFI20230725BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20230725BHJP

   A23L 33/195 20160101ALI20230725BHJP

   A61K 31/4015 20060101ALI20230725BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230725BHJP

   A61K 35/748 20150101ALI20230725BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20230725BHJP

【ＦＩ】

A23L33/135

A23L5/00 J

A23L5/00 K

A23L33/195

A61K31/4015

A61P21/00

A61K35/748

A61K38/02

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022576730

(86)(22)【出願日】2022-01-20

(86)【国際出願番号】 JP2022001881

(87)【国際公開番号】W WO2022158503

(87)【国際公開日】2022-07-28

【審査請求日】2023-03-07

(31)【優先権主張番号】P 2021009310

(32)【優先日】2021-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000002886

【氏名又は名称】ＤＩＣ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100149445

【弁理士】

【氏名又は名称】大野 孝幸

(74)【代理人】

【識別番号】100163290

【弁理士】

【氏名又は名称】岩本 明洋

(74)【代理人】

【識別番号】100214673

【弁理士】

【氏名又は名称】菅谷 英史

(74)【代理人】

【識別番号】100186646

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 雅裕

(72)【発明者】

【氏名】今井 康行

(72)【発明者】

【氏名】小関 友莉乃

【審査官】正 知晃

(56)【参考文献】

【文献】韓国登録特許第１０－２０７６４５９（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１４－０１０６５７２（ＫＲ，Ａ）

【文献】IN 201741006191 A (ITC LIMITED) 24.08.2018 (2018-08-24)

【文献】VOLTARELLI, F. A., et al.，Spirulina enhances the skeletal muscle protein in growing rats，Eur J Mutr，2008年，Vol.47, p.393-400

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物。

【請求項2】

前記有効成分がスピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種であって、
前記スピルリナ酵素分解物及び前記フィコシアニン酵素分解物における酵素がプロテアーゼである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物。

【請求項4】

前記有効成分がスピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種であって、
前記スピルリナ酵素分解物及び前記フィコシアニン酵素分解物における酵素がプロテアーゼである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

食品組成物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、機能性表示食品又は病者用食品である、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

医薬組成物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

サルコペニア又はロコモティブシンドロームの治療、予防又は改善に用いられる医薬組成物である、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、加齢に伴う筋力の低下及び筋肉量の減少をサルコペニア（sarcopenia、筋肉減弱症）とよび、患者の増加に伴って、その対処法が注目されている。サルコペニアは、骨格筋の筋肉量の減少を伴うものであるが、広義には骨格筋の筋力低下及び身体機能低下を伴うものも含むと考えられている。サルコペニアには加齢に伴って変化する身体活動の低下の他、栄養摂取量、ホルモン、炎症反応等の様々な要因が関与すると考えられている。サルコペニアに一度罹患してしまうと、易転倒・転落、骨折、体動制限そしてサルコペニアの進行という悪循環を呈し、寝たきり状態を誘発する。

【0003】

現在、サルコペニアの予防及び治療において、筋力トレーニングが有効であると考えられているが、関節や循環器などの合併症を持つ高齢者や、既に体動制限を余儀なくされたりしている高齢者に対して、強度の高い運動介入は困難である。そこで、強度の高い運動介入を伴わず、日常的に継続して経口摂取することができる、サルコペニアの予防及び治療のための食品及び／又は医薬品の開発が望まれている。サルコペニアの予防及び治療のための食品及び／又は医薬品として、必須アミノ酸、ホルモン剤、ＡＣＥ阻害剤等の研究がなされているが、サルコペニアに対して十分な効果を発揮する食品及び／又は医薬品は未だ少ない。

【0004】

ところで、近年の健康志向の高まりから、栄養バランスに優れ、一般的な食品より栄養価が高い食品として、スピルリナが注目されている。スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）は、豊富なタンパク質、糖類、各種ビタミン、ミネラル、植物性色素を含むシアノバクテリア種である。スピルリナは、多種類の栄養素をバランスよく摂取するための食品、サプリメントとしての利用の他に、スピルリナ自体や、スピルリナ由来の物質に多くの機能性があることが期待されており、スピルリナの利用法に関する研究が活発に行われている。

【0005】

例えば、スピルリナ由来のフィコシアニンに膵リパーゼ等のリパーゼの活性を阻害する作用があるとして、フィコシアニンを有効成分とするリパーゼ活性阻害剤が報告されている（特許文献１参照）。
また、スピルリナ由来のフィコシアニンが大豆蛋白質よりも高い血清脂質改善作用を有するとして、フィコシアニンを有効成分とする血清脂質低下剤が報告されている（特許文献２参照）。
さらに、スピルリナ（スピルリナ抽出物）を経口投与すると、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞の活性化が誘導されることが報告されている（非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００４－３５９６３８号公報

【文献】特開２００３－１３７８０５号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｈｉｒａｈａｓｈｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ： Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＮＫ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ．”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２（２００２）４２３－４３４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、スピルリナ自体やスピルリナ由来の物質に、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を示すことはこれまでに知られていなかった。

【0009】

本発明は、日常的に継続して経口摂取することができる、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、スピルリナ自体やスピルリナ由来の物質に、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、以下の態様を包含するものである。
［１］スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物。
［２］上記スピルリナ酵素分解物及び上記フィコシアニン酵素分解物における酵素がプロテアーゼである、［１］に記載の組成物。
［３］スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物。
［４］上記スピルリナ酵素分解物及び上記フィコシアニン酵素分解物における酵素がプロテアーゼである、［３］に記載の組成物。
［５］食品組成物である、［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、機能性表示食品又は病者用食品である、［５］に記載の組成物。
［７］医薬組成物である、［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［８］サルコペニア又はロコモティブシンドロームの治療、予防又は改善に用いられる医薬組成物である、［７］に記載の組成物。

【0012】

本発明によれば、日常的に継続して経口摂取することができる、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】試験１において、Ａ１群（Ｓｈａｍ群）に対する、腓腹筋における筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子発現量の割合を示す図である。

【図2】試験１において、Ａ１群（Ｓｈａｍ群）に対する、腓腹筋における筋萎縮に関与すると想定される遺伝子発現量の割合を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本実施形態に係る組成物について詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の一実施態様としての一例であり、これらの内容に特定されるものではない。

【0015】

本実施形態に係る組成物は、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物に関する。
また、本実施形態に係る組成物は、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物に関する。
以下、本実施形態に係る組成物の有効成分について説明した後、組成物の用途及び形態等について説明する。

【0016】

＜スピルリナ＞
スピルリナは、本実施形態に係る組成物における有効成分の一種であり、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を有する。
スピルリナは、藍藻類ネンジュモ目ユレモ科スピルリナ属に属する微細なラセン藻であり、豊富なタンパク質、糖類、各種ビタミン、ミネラル、植物性色素を含む。

【0017】

スピルリナとしては、例えば、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、スピルリナ・マキシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｘｉｍａ）、スピルリナ・ゲイトレリ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｇｅｉｔｌｅｒｉ）、スピルリナ・サイアミーゼ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｉａｍｅｓｅ）、スピルリナ・メイヤー（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｊｏｒ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｕｂｓａｌａｓａ）、スピルリナ・プリンセプス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）、スピルリナ・ラキシシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｌａｘｉｓｓｉｍａ）、スピルリナ・クルタ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｃｕｒｔａ）、スピルリナ・スピルリノイデス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐｉｒｕｌｉｎｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。これらの中でも、特に人工的に培養出来るため入手容易で好ましいスピルリナとして、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、スピルリナ・ゲイトレリ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｇｅｉｔｌｅｒｉ）、スピルリナ・サイアミーゼ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｉａｍｅｓｅ）等が挙げられる。なお、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）はアルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）とも称される。

【0018】

本実施形態に係る組成物に用いられるスピルリナは、液体培地中で培養した状態の藻体（湿藻体）をそのまま用いてもよいが、湿藻体のスピルリナを水やエタノール等の溶媒で抽出した抽出液、又はその抽出液を濃縮させたり乾燥させて得られる抽出物である、スピルリナエキスを用いるのが好ましい。

【0019】

＜＜スピルルリナエキス＞＞
スピルリナエキスを製造する際に用いる抽出液としては、本発明の効果が得られる範囲で特に限定されるものではないが、例えば、熱水を用いることができる。本実施形態では、藻体のスピルリナを熱水抽出することにより得られる抽出液、或いはその抽出液を濃縮させたり乾燥させて得られる抽出物が好ましく用いることができる。
スピルリナエキスを得る方法としては、特に制限されず、常法に従って得ることができるが、例えば、上記非特許文献１や特開平８－９９４０号公報等に記載の抽出液の製造方法等を挙げることができる。具体的には、下記に記載の製造方法を挙げることができる。

【0020】

＜＜スピルリナエキスの製造方法＞＞
スピルリナエキスは、スピルリナ藻体を１００℃を超える温度で熱水抽出し、当該抽出液のｐＨを特定の酸性条件下に調整し、その後、不溶性画分を除去することにより、スピルリナ抽出液を得ることで、製造することができる。
スピルリナエキスを液体状態で使用する場合には、上記のようにして得られたスピルリナ抽出液をそのまま使用することができる。また、上記スピルリナ抽出液を濃縮させたり乾燥させ粉末として使用することもできる。本実施形態に係る組成物に用いられるスピルリナエキスとしては、スピルリナ抽出液であっても、スピルリナ抽出液を濃縮或いは乾燥させて製造されたものであってもよい。

【0021】

スピルリナエキスを製造するためのスピルリナは、市販のものを用いてもよいし、自ら培養したものを用いてもよい。また、生の状態のスピルリナを使用してもよいし、生の状態のスピルリナを乾燥させたものでもよい。
スピルリナを培養する際の培養方法としては、藍藻の培養に用いられている通常の方法に従って行うことができる。例えば、屋外において塩基性条件下でスピルリナを培養し、増殖させることができる。
培養して得られたスピルリナ（以下、スピルリナ藻体ともいう）はそのまま用いることもできるし、培養したスピルリナをろ布やろ紙で回収し、水で洗浄後、水に懸濁し懸濁液としてもよい。更に、培養液や懸濁液を濃縮した湿藻体としてもよいし、その湿藻体を凍結乾燥やスプレー乾燥（噴霧乾燥）等により乾燥した乾燥藻体としてもよいし、その乾燥藻体を粉末化してもよい。
熱水抽出に用いるスピルリナ藻体は、湿藻体、凍結乾燥藻体、スプレー乾燥藻体、破砕藻体等いずれでもよい。例えば、破砕藻体を得るには、藻体を通常の方法、例えば工業的にはフレンチ・プレスの様な高圧押し出し法等による破砕処理が挙げられる。

【0022】

次に熱水抽出操作について説明する。例えば上記のように加工したスピルリナ藻体を、あらかじめ加圧容器内にて抽出溶媒中、例えば蒸留水中に懸濁させておく。懸濁濃度は特に制限されないが、抽出効率や回収時のコスト等を考慮すれば、溶媒に対して１～２０質量％が好ましい。抽出溶媒は水道水でもよいが、抽出液を食品素材として適用する点を考慮すると蒸留水が好ましい。抽出温度としては、通常１００℃を超える温度であり、１０５℃～１４０℃が好ましく、１１０～１３０℃がより好ましい。抽出の際の圧力としては１．０～２．５気圧が好ましい。また抽出時撹拌操作を行っても行わなくてもよいが、熱効率上撹拌操作は行う方が好ましい。抽出時間は長いほど抽出量は増大するが、効率を考えると通常抽出時間は０．５～４時間であるのが好ましい。

【0023】

次に、上記抽出操作後の藻体残渣懸濁液（ｐＨ＝６．８～７．０程度）から藻体残渣や熱変性による凝集タンパク質を除去する。除去する操作としては、例えば、当該懸濁液の遠心分離や濾過等の操作を行えばよく、この操作により上清を得る。ただし、上清には未だ多量のタンパク質が溶存しているため、溶存タンパク質をさらに除去するのが好ましい。溶存タンパク質をさらに除去するには、当該懸濁液に酸を加えて抽出液のｐＨをタンパク質の等電点以下の酸性条件とするのがよい。これにより、タンパク質を凝集させ、凝集したタンパク質を遠心分離や濾過等により分離してスピルリナエキスを得ることができる。或いは初めに藻体残渣等を除去することなく、抽出操作後の藻体残渣懸濁液のｐＨを上記のようにタンパク質の等電点以下に調整した後、藻体残渣や凝集タンパク質を同様に遠心分離や濾過等により分離してもよい。凝集されたタンパク質を除去することにより、高収量の多糖類を含むスピルリナエキスを得ることができる。

【0024】

タンパク質の等電点以下の酸性条件としては、ｐＨ４．５以下が好ましく、ｐＨ３．７５～４．２５がタンパク質の凝集、沈殿生成が最大となるためより好ましく、ｐＨ４．０がさらに好ましい。
ｐＨ調整の際に加える酸としては、硫酸や塩酸でもよいが、現実的な作業工程や食品素材として用いることを考慮すれば、無機酸よりもクエン酸やリンゴ酸等の有機酸を使用することが好ましい。

【0025】

＜フィコシアニン＞
フィコシアニンは、本実施形態に係る組成物における有効成分の一種であり、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を有する。
フィコシアニンは、色素タンパク質であり、発色団としてフィコシアノビリンを有する。フィコシアニンは、フィコシアノビリンとタンパクとが結合した構造を備えている。

【0026】

本実施形態に係る組成物に用いられるフィコシアニンとしては、例えば、藍藻類由来のフィコシアニン、紅藻類由来のフィコシアニン、クリプト藻由来のフィコシアニン等の藻類由来のフィコシアニン等が挙げられる。これらの中でも、大量に採取できることから藍藻類由来のフィコシアニンが好ましい。

【0027】

藍藻類としては、例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｈｅｒｅｌｌａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、シネコキスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリポスリクス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）属、スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）属、マスティゴクラディス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｕｓ）属、プルロカプサ（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）属等の藍藻類が挙げられる。これらの中でも、工業的規模で生産され、その安全性が確認されている、スピルリナ属及びアルスロスピラ属の藍藻類が好ましく、スピルリナ属の藍藻類がより好ましい。
また、フィコシアニン調製の原料としては、生の藍藻類を用いてもよく、乾燥処理した藍藻類を用いてもよい。藍藻類の乾燥品としては、生の藍藻類を常法に従い乾燥品としてもよく、市販の乾燥品を用いてもよい。

【0028】

フィコシアニンとしては、例えば、Ｃ－フィコシアニン、Ｒ－フィコシアニン、アロフィコシアニン等が挙げられる。品質、安全性、あるいは入手容易性等の観点からは、フィコシアニンとして、Ｃ－フィコシアニンを含有することが好ましい。従って、本実施形態に係る組成物の好ましい実施態様としては、Ｃ－フィコシアニンを有効成分として含有する組成物が挙げられる。さらに本実施形態に係る組成物の好ましい実施態様としては、Ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンとを含有する組成物が挙げられる。例えば、スピルリナ属の藍藻類から抽出することにより得られるＣ－フィコシアニンとアロフィコシアニンからなるフィコシアニンの混合物を組成物に含有させることができる。

【0029】

フィコシアニンは、例えば、藍藻類を水やリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液中に懸濁し、藍藻類中のフィコシアニンを抽出することにより得ることができる。
フィコシアニンを抽出する方法としては、特に制限は無く、常法に従って抽出することができる。
抽出方法の好ましい実施態様としては、例えば、特開２００６－２３０２７２号公報に記載の抽出方法等を挙げることができる。具体的には、下記抽出方法（ｉ）で記載する抽出方法が挙げられる。下記抽出方法（ｉ）により、高純度であざやかな色調のフィコシアニンを得ることができる。

【0030】

＜＜フィコシアニンの抽出方法（ｉ）＞＞
抽出方法（ｉ）は、
藍藻類中のフィコシアニンを水懸濁液中に抽出させた抽出液を得る第一工程と、
該抽出液中でカルシウム塩とリン酸塩とを反応させてリン酸カルシウムを生成させると共に該リン酸カルシウムにフィコシアニンの夾雑物を吸着させ吸着物を得る第二工程と、
該抽出液から藍藻類の残渣及び吸着物を除去する第三工程と、を有する。

【0031】

さらに上記抽出方法（ｉ）が下記抽出方法（ｉｉ）であると、より好ましい。
＜＜フィコシアニンの抽出方法（ｉｉ）＞＞
抽出方法（ｉｉ）は、
藍藻類中のフィコシアニンを水懸濁液中に抽出させた抽出液を得る第一工程と、
該抽出液中でカルシウム塩とリン酸塩とを反応させてリン酸カルシウムを生成させると共に該リン酸カルシウムにフィコシアニンの夾雑物を吸着させ吸着物を得る第二工程と、
該抽出液から藍藻類の残渣及び吸着物を除去する第三工程と、
第三工程より前に、抽出液にキレート剤を含有させる工程と、を有する。

【0032】

上記フィコシアニンの抽出方法（ｉ）又は（ｉｉ）を用いることにより、品質のよいフィコシアニンを藍藻類から抽出することができる。
特にスピルリナ属の藍藻類に対して、上記抽出方法（ｉ）又は（ｉｉ）を用いることにより、Ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンとの混合比が良好な品質のよいフィコシアニンを抽出することができる。
なお、上記抽出方法において、抽出条件を適宜選択することにより、Ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンとの混合比を所望の範囲とするよう調整するとよい。

【0033】

フィコシアニンの種類は、すべてＣ－フィコシアニンであってもよい。あるいは、アロフィコシアニンを含有し、Ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンとの混合物を組成物に含有させてもよい。
Ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンとの混合比は、例えば、質量比で３～９．５：０．５～７が好ましく、６～９．５：０．５～４がより好ましく、７～８：２～３がさらに好ましい。

【0034】

＜スピルリナ酵素分解物＞
スピルリナ酵素分解物は、本実施形態に係る組成物における有効成分の一種であり、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を有する。
スピルリナ酵素分解物は、酵素を作用させ、上述したスピルリナのタンパク質、糖類等を分解させることにより得られる酵素分解物である。

【0035】

酵素分解に用いる酵素としては、特に制限されず、例えば、グルカナーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、ヌクレアーゼ等を用いることができる。これらの中でも、スピルリナの分解が好適に行われる観点から、酵素分解に用いる酵素としては、プロテアーゼが好ましい。上記酵素は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
なお、酵素分解に用いる酵素の由来は、特に制限されず、例えば、Aspergillus niger、Aspergillus melleus、Aspergillus oryzae、Rhizopus niveus、Bacillus subtilis、Arthrobacter sp.、Trichoderma viride等を用いることができる。

【0036】

プロテアーゼとしては、特に制限されず、市販のプロテアーゼ製剤を用いることができる。プロテアーゼ製剤としては、例えば、スミチームＬＰ、スミチームＦＬ－Ｇ、スミチームＣＰ、スミチームＦＰ－Ｇ、スミチームＭＰ（新日本化学工業株式会社）、ブロメラインＦ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、パパインＷ－４０、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、サモアーゼＣ１００、サモアーゼＣ１６０、プロチンＳＤ－ＮＹ１０（プロチンＳＤ－ＰＣ１０Ｆ）（天野エンザイム株式会社）等を用いることができる。

【0037】

スピルリナ酵素分解物のタンパク質の分子量分布としては、分子量５００未満の成分の割合が２０質量％以上であるのが好ましく、３０質量％以上がより好ましく、３５質量％以上がさらに好ましい。スピルリナ酵素分解物のタンパク質の分子量分布が上記下限値以上であれば、スピルリナ酵素分解物が生体内への吸収性に優れる。
分子量分布の値は、ゲル濾過カラムを用いて試料を液体クロマトグラフィー分析することにより得ることができる。

【0038】

酵素分解の処理方法は、特に制限されず、常法に従って処理することができる。酵素分解の反応条件においても特に制限されず、酵素の種類、活性度合及び添加量等に合わせて、至適温度、至適ｐＨ及び反応時間等の反応条件を適宜調整すればよい。酵素分解処理により得られたスピルリナ酵素分解物は、必要に応じて、遠心分離、ろ過、脱塩、濃縮、乾燥、溶媒抽出、希釈及び添加剤の添加等の操作により、目的とする形態及び性状に調整することができる。

【0039】

下記に本実施形態に係る組成物におけるスピルリナ酵素分解物の調製方法の一例を示す。
スピルリナ水溶液を２０～７０℃で加熱する。水溶液を用いる酵素の至適ｐＨに調整した後、スピルリナ中のタンパク質に対して、０．０１質量％以上、好ましくは０.１～１０質量％の酵素を加えて１～２４時間攪拌する。攪拌後、加熱や冷却により失活・酵素分解を停止させた後、遠心分離する。遠心分離後、得られた上清を凍結乾燥させてスピルリナ酵素分解物を得る。

【0040】

＜フィコシアニン酵素分解物＞
フィコシアニン酵素分解物は、本実施形態に係る組成物における有効成分の一種であり、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を有する。
フィコシアニン酵素分解物は、酵素を作用させ、上述したフィコシアニンを分解させることにより得られる酵素分解物である。

【0041】

酵素分解に用いる酵素としては、特に制限されず、上述したスピルリナ酵素分解物で説明した酵素を用いることができため、説明は省略する。なお、酵素分解に用いる酵素としては、上述したスピルリナ酵素分解物と同様に、プロテアーゼを用いるのが好ましい。

【0042】

フィコシアニン酵素分解物の分子量分布としては、分子量５００未満の成分の割合が２０質量％以上であるのが好ましく、３０質量％以上がより好ましく、３５質量％以上がさらに好ましい。フィコシアニン酵素分解物の分子量分布が上記下限値以上であれば、フィコシアニン酵素分解物が生体内への吸収性に優れる。
分子量分布の値は、ゲル濾過カラムを用いて試料を液体クロマトグラフィー分析することにより得ることができる。

【0043】

酵素分解に用いられるプロテアーゼ及び酵素分解処理方法としては、特に制限されず、上述したスピルリナ酵素分解物で説明したものと同様であるため、説明は省略する。

【0044】

下記に本実施形態に係る組成物におけるフィコシアニン酵素分解物の調製方法の一例を示す。
フィコシアニン水溶液を２０～７０℃で加熱する。水溶液を用いる酵素の至適ｐＨに調整した後、フィコシアニンに対して、０．０１質量％以上、好ましくは０.１～１０質量％の酵素を加えて１～２４時間攪拌する。攪拌後、加熱や冷却により失活・酵素分解を停止させた後、遠心分離する。遠心分離後、得られた上清を凍結乾燥させてフィコシアニン酵素分解物を得る。

【0045】

＜筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物＞
後述する実施例に示すように、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物の有効成分は、筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子の発現抑制を緩和することが認められた。上記有効成分によって発現抑制が緩和される筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子としては、例えば、Myh13(Myosin, heavy chain 13)、Myh2(Myosin, heavy chain 2)、Myl2(Myosin, light polypeptide 2)、Myh6(Myosin, heavy chain 6)、Tnni1(Troponin I type 1)、Tnnc1((Troponin C type 1)、Itm2a(Integral membrane protein 2A)及びNeu2 (Neuraminidase 2)等が挙げられる。
従って、本実施形態に係る組成物は、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物として用いることができる。

【0046】

筋肉量の増加及び低下抑制の対象となる筋としては、特に制限されないが、骨格筋が好ましい。骨格筋は、膝関節の伸展や股関節の屈曲、具体的には膝を伸ばして立ち上がる動作、歩行動作、走行動作等に関与すると考えられている。骨格筋量が増加すると、立ち上がり、歩行、走行等の動作が向上し、特にサルコペニア（sarcopenia、筋肉減弱症）及びロコモティブシンドローム（locomotive syndrome、運動器症候群）の治療、予防又は改善等に有効であると考えられる。
ここで、ロコモティブシンドロームとは、加齢や運動不足などにより筋肉、骨等の運動器の部位に支障をきたし、日常生活が困難になった状態の症状をいう。ロコモティブシンドロームが運動器全般の症状を含む概念であるのに対し、サルコペニアはその運動器の中でも筋肉量、筋力、身体的機能に着目した症状であるとされている。

【0047】

骨格筋としては、例えば、胸鎖乳突筋、大胸筋、小胸筋、前鋸筋、鎖骨下筋、腹直筋、外腹斜筋、内腹斜筋、腹横筋、腰方形筋、僧帽筋、広背筋、脊柱起立筋、肩甲挙筋、菱形筋、三角筋、小円筋、棘上筋、棘下筋、肩甲下筋、大円筋、烏口腕筋、上腕二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、上腕三頭筋、肘筋、円回内筋、方形回内筋、回外筋、尺側手根屈筋、橈側手根屈筋、長掌筋、浅指屈筋、深指屈筋、長母指屈筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、指伸筋、示指伸筋、小指伸筋、長母指伸筋、短拇指伸筋、長母指外転筋、中様筋（４筋）、掌側骨間筋（３筋）、背側骨間筋（４筋）、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、短掌筋、母指内転筋、短拇指屈筋、母指対立筋、短拇指外転筋、大腿直筋、外側公筋、中間公筋、内側広筋、腸骨筋、大腰筋、小腰筋、縫工筋、恥骨筋、大腿筋膜張筋、大殿筋、大腿二頭筋、大腿四頭筋、半腱様筋、半膜様筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、長内転筋、短内転筋、大内転筋、深層外旋六筋、腓腹筋、ヒラメ筋、膝窩筋、後脛骨筋、長趾屈筋、長母趾屈筋、足底筋、前脛骨筋、長腓骨筋、短腓骨筋、第３腓骨筋、長母趾伸筋及び長趾伸筋等が挙げられる。

【0048】

＜筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物＞
後述する実施例に示すように、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物の有効成分は、筋萎縮に関与すると想定される遺伝子の発現亢進を緩和することが認められた。上記有効成分によって発現が抑制される筋萎縮に関与すると想定される遺伝子としては、例えば、Ddit4(DNA-damage-inducible transcript 4)、Junb(Jun B proto-oncogene)、Egr1(zif-268, Early growth response protein 1、Sdc4(Syndecan 4)、Kcnk5(Potassium channel, subfamily K, member 5)及びRasd2 (Rhes, RASD family, member 2)等が挙げられる。
従って、本実施形態に係る組成物は、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、筋肉量の増加及び筋萎縮を抑制するための組成物として用いることができる。

【0049】

筋萎縮とは、筋細胞の減少や縮小により筋肉量が低下することを指し、長期間の安静臥床や骨折などによるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）、加齢（老化ともいう）に伴うもの等が挙げられる。従って、筋萎縮を抑制するとは、不活動や加齢に伴う筋肉量の低下を抑制することを意味する。

【0050】

筋肉量の増加及び筋萎縮の抑制の対象となる筋は、上述した筋肉量の増加及び低下抑制のための組成物で説明した筋と同様であるため、説明は省略する。

【0051】

（食品組成物）
本実施形態に係る組成物は、食品の分野において、一般の食品の他、目的となる作用を有効に発揮できる有効な量の有効成分を食品素材として各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物として提供することができる。本実施形態に係る組成物は、例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、機能性表示食品、病者用食品、食品添加剤、飼料及び飼料添加剤等の食品組成物に好適に用いることができる。食品組成物の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形状、液状、ゲル状等であり得る。

【0052】

なお、機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品であり、販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られた食品である。本実施形態に係る食品組成物には、筋肉量の増加及び低下抑制及び／又は筋肉量の増加及び筋萎縮の抑制を目的とした食品組成物として、「自立した日常生活を送る上で必要な筋肉量及び筋力の低下抑制に役立つ」、「歩行能力の改善に役立つ」、「筋肉量や筋力の維持」、「筋肉量や筋力の維持をサポート」、「中高年齢者において加齢により衰える歩行能力の維持」、「加齢によって衰える筋肉の維持に役立つ筋肉をつくる力をサポート」等の表示が付されていてもよい。

【0053】

食品組成物としては、例えば、清涼飲料水、炭酸飲料、果汁入り飲料、野菜汁入り飲料、果汁及び野菜汁入り飲料、牛乳等の畜乳、豆乳、乳飲料、ドリンクタイプのヨーグルト、ドリンクタイプやスティックタイプのゼリー、コーヒー、ココア、茶飲料、栄養ドリンク、エナジー飲料、スポーツドリンク、ミネラルウォーター、ニア・ウォーター、ノンアルコールのビールテイスト飲料等の非アルコール飲料；飯類、麺類、パン類及びパスタ類等炭水化物含有飲食品；チーズ類、ハードタイプ又はソフトタイプのヨーグルト、畜乳その他の油脂原料による生クリーム、アイスクリーム等の乳製品；クッキー、ケーキ、チョコレート等の洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、ラムネ等のタブレット菓子（清涼菓子）、キャンディー類、ガム類、ゼリーやプリン等の冷菓や氷菓、スナック菓子等の各種菓子類；ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％ 以下のノンアルコールビール、発泡酒、その他雑酒、酎ハイ等のアルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）、味噌汁等のスープ類等の加工食品、みそ、しょうゆ、ふりかけ、その他シーズニング調味料等の調味料及び濃厚流動食等の流動食等が挙げられる。
また、食品組成物が、例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、機能性表示食品、病者用食品、食品添加剤、飼料及び飼料添加剤等の場合は、錠剤（チュアブル錠等を含む）、カプセル、トローチ、シロップ、ゼリー、顆粒、粉末等であってもよい。

【0054】

本実施形態に係る食品組成物には、上記有効成分に加えて、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種又は２種以上自由に選択して配合してもよい。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤及びｐＨ調整剤等の、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。

【0055】

（医薬組成物）
本実施形態に係る組成物は、医薬品の分野において、目的となる作用を有効に発揮できる有効な量の有効成分と共に、薬学的に許容される担体や添加剤等を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物として提供することができる。本実施形態に係る組成物は、例えば、上述したサルコペニア又はロコモティブシンドロームの治療、予防又は改善用の医薬組成物に好適に用いることができる。なお、医薬組成物としては、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
医薬組成物の形態としては、特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形状、液状、ゲル状等であり得る。

【0056】

医薬組成物は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤などの添加剤等を含有させることができる。医薬組成物は、経口用であってもよく非経口用であってもよいが、経口用であることがより好ましい。経口用としては、通常用いられる投与形態、例えば、錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型とすることができる。非経口用としては、通常用いられる投与形態、例えば、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射（皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射等）、又はスプレー剤の剤型で鼻孔内投与などが挙げられる。

【0057】

下記に食品組成物及び／又は医薬組成物の形態が錠剤の場合の一例を示す。
食品組成物及び／又は医薬組成物の形態が、例えば、錠剤（タブレットともいう）である場合、有効成分を、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、酸化防止剤、等張化剤、緩衝剤、コーティング剤、矯味剤、溶解補助剤、基剤、分散剤、安定化剤、着色剤等の添加剤と適宜組み合わせて、常法に従って調製することができる。

【0058】

賦形剤としては、でんぷん及びその誘導体（デキストリン、カルボキシメチルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、糖類（乳糖、白糖、ブドウ糖、トレハロース等）等、クエン酸又は同塩類、リンゴ酸又は同塩類、エチレンジアミン四酢酸又は同塩類が挙げられる。

【0059】

結合剤としては、でんぷん及びその誘導体（アルファー化デンプン、デキストリン等）、セルロース及びその誘導体（エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、糖類（ブドウ糖、白糖等）、エタノール等が挙げられる。

【0060】

崩壊剤としては、でんぷん及びその誘導体（カルボキシメチルスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ等）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム等）、トラガント、ゼラチン、寒天等が挙げられる。

【0061】

滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、酸化チタン、リン酸水素カルシウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ショ糖脂肪酸エステル、食用油脂等が挙げられる。

【0062】

保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等）、リン酸塩類（リン酸ナトリウム、ポリリン酸カルシウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等）、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸グリセリン、糖類等が挙げられる。

【0063】

酸化防止剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、エリソルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸、システイン、チオグリセロール、ブチルヒドロキシアニゾール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ｄｌ－α－トコフェロール等が挙げられる。

【0064】

等張化剤としては、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、デキストリン、グリセリン、ブドウ糖等が挙げられる。
緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、塩酸、ホウ酸、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム等）等が挙げられる。

【0065】

コーティング剤としては、セルロース誘導体（ヒドロキシプロピルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）、セラック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン類（ポリ－２－ビニルピリジン、ポリ－２－ビニル－５－エチルピリジン等）、ポリビニルアセチルジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコールフタレート、メタアクリレート・メタアクリル酸共重合体等が挙げられる。
矯味剤としては、糖類（ブドウ糖、白糖、乳糖等）、サッカリンナトリウム、糖アルコール類等が挙げられる。

【0066】

溶解補助剤としては、エチレンジアミン、ニコチン酸アミド、サッカリンナトリウム、クエン酸、クエン酸塩類、安息香酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセリン、ポリプレングリコール、ベンジルアルコール等が挙げられる。

【0067】

基剤としては、脂肪類（豚脂等）、植物油（オリーブ油、ゴマ油等）、動物油、ラノリン酸、ワセリン、パラフィン、樹脂、ベントナイト、グリセリン、グリコール油、等が挙げられる。

【0068】

分散剤として、アラビアゴム、トラガント、セルロース誘導体（メチルセルロース等）、アルギン酸ナトリウム、ポリソルベート類、ソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
安定化剤としては、亜硫酸塩類（亜硫酸水素ナトリウム等）、窒素、二酸化炭素等が挙げられる。

【0069】

本実施形態に係る食品組成物及び／又は医薬組成物における有効成分の総含有量（組成物中に含まれる全ての有効成分の含有量を合算した含有量）は、食品や医薬品の種類、成分、及び形態等の条件により異なり、本発明の効果が得られる範囲で特に制限されるものではなく、適宜選択することができる。

【0070】

また特に、本実施形態に係る食品組成物及び／又は医薬組成物の形態が錠剤である場合、錠剤における有効成分の総含有量としては、本発明の効果が得られる範囲で特に制限されるものではないが、食品組成物及び／又は医薬組成物の全質量中、有効成分の乾燥重量換算で、２０質量％以上であると好ましく、５０質量％以上であるとより好ましい。また、上記総含有量としては、１００質量％以下であればよく、９９質量％以下であると好ましい。

【0071】

本発明において、有効成分の総摂取量は、特に限定されず、食品や医薬品の種類、成分等により適宜選択されるが、例えば、成人１人に対して１日当たり、有効成分の乾燥重量換算で０．０１ｇ以上が好ましく、０．０３ｇ以上がより好ましく、また、１０ｇ以下が好ましく、４ｇ以下がより好ましい。

【実施例】

【0072】

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0073】

［試験例１］
サルコペニアモデルである坐骨神経切除モデルラットを用いて、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物が、筋肉及び筋萎縮に与える作用を評価した。

【0074】

＜被験物質＞
被験物質として、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物を用いた。

【0075】

＜＜スピルリナ＞＞
屋外の培養池において、塩基性条件下（ｐＨ１１）でスピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）を増殖した。次に、増殖したスピルリナ・プラテンシスの噴霧乾燥した藻体粉末５０ｇを、オートクレーブで５００ｍＬの蒸留水に懸濁し、圧力を調節することにより、１２０℃の抽出温度で１時間抽出した。
抽出液をクエン酸にてｐＨを４．０に調整した。これを、遠心分離にて藻体残渣及びタンパク質（不溶性画分）を除去してスピルリナ熱水抽出液であるスピルリナエキスを得た。
得られたスピルリナエキスを噴霧乾燥後、破砕して、粉末状のスピルリナを得た。

【0076】

＜＜フィコシアニン＞＞
１％塩化カルシウム（無水）溶液１３００Ｌに屋外培養槽で生産したスピルリナ乾燥藻体（噴霧乾燥品）６５ｋｇを加え、１５分間の攪拌により均一懸濁液とした後、２０℃１５時間、静置条件下で藍藻類中のフィコシアニンを溶液中に抽出し抽出液を得た。
この抽出液にリン酸二水素ナトリウム３２ｋｇを添加し、０．５時間攪拌した後、２０℃、静置下で２．５時間反応させ、リン酸カルシウムを生成させると共に該リン酸カルシウムにフィコシアニンの夾雑物を吸着させて吸着物を得た。この後抽出液を遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、１５分間の遠心分離を行い、藍藻類の残渣及び吸着物を抽出液から除去した。得られたフィコシアニンの抽出液は、分画分子量１０，０００の分離膜を使用した限外濾過により低分子成分及び塩類を除去した後、トレハロース、クエン酸三ナトリウムを加えて混合し、噴霧乾燥を行い、フィコシアニン色素乾燥物１５ｋｇを得た。これを、フィコシアニンとした。なお、フィコシアニンの色素粉末１００質量％中、フィコシアニン含量は約３０質量％（Ｃ－フィコシアニン約２２質量％、アロフィコシアニン約８質量％であった。

【0077】

＜＜スピルリナ酵素分解物＞＞
上記スピルリナ１００ｇを１４００ｍＬの蒸留水に溶解させた後、５０～５２℃に加熱した。次いで、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を添加し、水溶液のｐＨを７．０に調整した。スピルリナ中のタンパク質に対して、２質量％のプロチン（ＳＤ－ＮＹ１０、天野エンザイム株式会社製）を水溶液に添加した後、５０～５２℃で６時間攪拌し、スピルリナを酵素分解させた。反応後の溶液を室温まで冷却した後、遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、１５分間の遠心分離を行った。上清を採取した後、凍結乾燥させて、スピルリナのプロテアーゼ分解物である、スピルリナ酵素分解物６２ｇを得た。

【0078】

＜＜フィコシアニン酵素分解物＞＞
上記フィコシアニン１７ｇを１４００ｍＬの蒸留水に溶解させた後、５０～５２℃に加熱した。次いで、１Ｎの塩酸を添加し、水溶液のｐＨを７．０に調整した。フィコシアニンに対して、２質量％のプロチン（ＳＤ－ＮＹ１０、天野エンザイム株式会社製）を水溶液に添加した後、５０～５２℃で６時間攪拌し、フィコシアニンを酵素分解させた。反応後の溶液を室温まで冷却した後、遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、１５分間の遠心分離を行った。上清を採取した後、凍結乾燥させて、フィコシアニンのプロテアーゼ分解物である、フィコシアニン酵素分解物１６ｇを得た。

【0079】

＜坐骨神経切除モデルの作製＞
Ｓｌｃ：ＳＤ雄ラット（日本エスエルシー株式会社）を使用した。サルコペニアモデルである坐骨神経切除モデルラットの作製は下記の通りに行った。
被験物質の投与１４日目の投与後に、ラットの左後肢を剃毛した後、左大腿部を切開した。筋肉を筋繊維に沿って分割して坐骨神経を露出させた。坐骨神経１ｃｍを切除した後、切開部を縫合し、坐骨神経切除モデルラットを作製した。

【0080】

＜試験系＞
実験群、被験物質、投与用量、処置及び例数を下記の表１に示す。投与回数及び投与期間としては、１日１回の頻度で２１日間経口投与した（投与液量：１０ｍＬ／ｋｇ）。なお、Ａ１群をＳｈａｍ群（坐骨神経切除を実施していない通常のラット群）、Ａ２群を媒体群ともいう。

【0081】

【表1】

【0082】

＜筋重量の測定＞
Ａ１～Ａ６群において、被験物質の投与２１日目、両側後肢の腓腹筋及びヒラメ筋を摘出し、湿重量(ｇ)を測定した。
Ａ１～Ａ６群の各筋の筋肉量（両側後肢の各筋の湿重量（ｇ）／体重（g）、重量％）を算出した。
また、Ａ３～Ａ６群の各筋の平均筋肉量をＡ２群（媒体群）と比較し、Ａ３～Ａ６群の筋肉量の増加率（％）を算出した（Ａ３～Ａ６群の両側後肢における各筋の平均筋肉量（重量％）／Ａ２群（媒体群）の両側後肢における各筋の平均筋肉量（重量％）×１００）。
さらに、Ａ１～Ａ６群の各筋の変化率（左後肢の各筋の平均湿重量（ｇ）／右後肢の各筋の平均湿重量（ｇ）×１００、重量％）を算出した。

【0083】

＜ＤＮＡマイクロアレイ＞
Ａ１～Ａ３及びＡ６群それぞれの切除側腓腹筋からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイに用いた。ＤＮＡマイクロアレイは下記の通りに行った。

【0084】

ＲＮＡサンプルを各群ごとにプールして、Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent)を用いてｃＤＮＡの合成、Ｃｙ３ラベル化ｃＲＮＡ合成と精製を行った。得られたラベル化ｃＲＮＡの濃度、Ｃｙ３インコーポレーションを、２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍ及び３２０ｎｍでの吸光度より算出し、基準値（Ｃｙ３－ＣＴＰ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＞ ６ ｐｍｏｌ／μｇ）を満たしていることを確認した。次いで、Gene Expression Hybridization Kit (Agilent)を用い、それぞれのラベル化ｃＲＮＡをフラグメンテーションし、Whole Mouse Genome Microarray Ver2.0（Agilent）にアプライ、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションした。次いで、Gene Expression Wash Buffer 1及び2 (Agilent)を用い，アレイスライドを洗浄した。マイクロアレイスキャナーでスキャンしたアレイ画像を，アレイ解析ソフトウェアGenePix Pro (Molecular Devices)で数値化した。蛍光強度値をノーマライズし，Ｓｈａｍ群に対して他の各群の割合を算出した。

【0085】

＜筋重量の測定結果＞
筋肉量の増加率の結果を表２に示す。

【0086】

【表2】

【0087】

左後肢（坐骨神経切除）における腓腹筋において、フィコシアニンを投与したＡ６群の筋肉量の増加率が１０２．０％であり、筋肉量が増加した。
左後肢（坐骨神経切除）におけるヒラメ筋において、スピルリナ酵素分解物を投与したＡ４群の筋肉量の増加率が１０３．７％であり、筋肉量が増加した。
右後肢における腓腹筋において、フィコシアニン酵素分解物を投与したＡ５群の筋肉量の増加率が１０２．５％であり、筋肉量が増加した。
右後肢におけるヒラメ筋において、フィコシアニンを投与したＡ６群の筋肉量の増加率が１０５．０％であり、筋肉量が増加した。

【0088】

変化率の結果を表３に示す。

【0089】

【表3】

【0090】

サルコペニアモデルマウスであるＡ２群（媒体群）の腓腹筋及びヒラメ筋の変化率は通常ラットであるＡ１群（Ｓｈａｍ群）に対して有意に減少していた。
ここで、被験物質を投与したＡ３～Ａ６群の変化率の値がＡ２群の変化率の値と比較して増加していれば、被験物質により筋肉量が増加していると考えられている。
腓腹筋において、スピルリナ酵素分解物を投与したＡ４群、フィコシアニンを投与したＡ６の変化率は、Ａ２群に対して増加した。
ヒラメ筋において、スピルリナ酵素分解物を投与したＡ４群、フィコシアニン酵素分解物を投与したＡ５群の変化率は、Ａ２群に対して増加した。

【0091】

＜ＤＮＡマイクロアレイ結果＞
＜＜筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子＞＞
筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子発現量の結果を図１に示す。
図１は、Ａ１群（Ｓｈａｍ群）に対する、腓腹筋における筋肉量の増加及び低下抑制に関与すると想定される遺伝子発現量の割合を示す図である。
図１に示すように、腓腹筋においてスピルリナ又はフィコシアニンの投与により、Ａ２群（媒体群）と比較して、筋肉の構造タンパク質である、ミオシン生成に関連するMyh13、Myh2、Myl2、Myh6及びトロポニン生成に関連するTnni1、Tnnc1の発現抑制が緩和していることが認められた。また、筋形成に関する、筋衛星細胞マーカーであるItm2a及び筋形成、筋芽細胞分化に関与するNeu2の発現抑制が緩和していることが認められた。従って、スピルリナ及びフィコシアニンは筋肉量を増加する作用及び筋肉量の低下を抑制する作用を有することが認められた。また、本結果から、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物においても、同様に筋肉量を増加する作用及び筋肉量の低下を抑制する作用を発揮するものと推察された。

【0092】

＜＜筋萎縮に関与すると想定される遺伝子＞＞
筋萎縮関連遺伝子発現量の結果を図２示す。
図２は、Ａ１群（Ｓｈａｍ群）に対する、腓腹筋における筋萎縮に関与すると想定される遺伝子発現量の割合を示す図である。
図２に示すように、腓腹筋においてスピルリナ又はフィコシアニンの投与により、Ａ２群（媒体群）と比較して、筋萎縮及び筋再生に関与するDdit4、Junb、Egr1及び筋再生に関与するSdc4、Kcnk5及びRasd2の発現亢進が緩和していることが認められた。従って、スピルリナ及びフィコシアニンは筋萎縮を抑制する作用を有することが認められた。また、本結果から、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物においても、同様に筋萎縮を抑制する作用を発揮するものと推察された。

【0093】

以上の筋重量の測定結果及びＤＮＡマイクロアレイ結果から、スピルリナ、フィコシアニン、スピルリナ酵素分解物及びフィコシアニン酵素分解物からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する組成物は、筋肉量を増加する作用、筋肉量の低下を抑制する作用及び筋萎縮を抑制する作用を示す組成物であることが認められた。

【図1】

【図2】