ホーム > 特許ランキング > 学校法人東京理科大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-03
(45)【発行日】2023-08-14
(54)【発明の名称】ジャスモン酸内生促進剤及びジャスモン酸内生促進方法
(51)【国際特許分類】
A01N 37/34 20060101AFI20230804BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20230804BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20230804BHJP
【ＦＩ】
A01N37/34 106
A01P21/00 ZNA
A01G7/06 A
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020563382
(86)(22)【出願日】2019-12-25
(86)【国際出願番号】 JP2019050992
(87)【国際公開番号】W WO2020138228
(87)【国際公開日】2020-07-02
【審査請求日】2021-06-23
(31)【優先権主張番号】P 2018241785
(32)【優先日】2018-12-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100136939
【弁理士】
【氏名又は名称】岸武 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】朽津 和幸
(72)【発明者】
【氏名】北畑 信隆
(72)【発明者】
【氏名】斉藤 優歩
(72)【発明者】
【氏名】倉持 幸司
【審査官】中島 芳人
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１３８６０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１５２３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】英国特許出願公告第００９５１６５１（ＧＢ，Ａ）
【文献】特表２００２－５４０１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第１９９４／０１８８３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Environmental Pollution, 2019, Vol.252, p.706-714
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｎ ３７／
Ａ０１Ｇ ７／
Ｃ０７Ｃ、Ｃ０７Ｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化合物Ｅ１～Ｅ４の少なくとも１種を有効成分として含有するジャスモン酸内生促進剤。【化1】
【請求項2】
請求項１に記載のジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることを含むジャスモン酸内生促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジャスモン酸内生促進剤及びジャスモン酸内生促進方法に関する。
【背景技術】
【0002】
サリチル酸及びジャスモン酸は、植物の成長や防御免疫応答等の役割を担う植物ホルモンとして知られている。従来、サリチル酸経路やジャスモン酸経路を活性化させる農薬成分が種々提案されている。
【0003】
例えば、植物におけるサリチル酸経路を活性化させる農薬成分としては、プロベナゾール（３－（２－プロペノキシ）－１，２－ベンゾチアゾール １，１－ジオキシド）が開発されており、イネのいもち病の防除等の目的で広く使用されている。プロペナゾールは、植物におけるサリチル酸の内生を促進する作用を有し、それ自体はサリチル酸様作用を有しない。そのため、環境負荷が小さく、薬剤耐性菌出現のリスクが低いという特長を有する。
【0004】
一方、ジャスモン酸経路を活性化させる農薬成分としては、プロヒドロジャスモン等のジャスモン酸アナログが開発されており（例えば、特許文献１参照）、植物の成長調節等の目的で広く使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第９４／１８８３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、ジャスモン酸アナログは、それ自体がジャスモン酸様作用を有するため、環境負荷が大きく、また、過剰応答により植物の成長に悪影響を与えるリスクもある。そのため、植物におけるジャスモン酸の内生を促進する農薬成分の開発が望まれていたが、そのような農薬成分はこれまで知られていないのが現状であった。
【0007】
本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、植物におけるジャスモン酸の内生を促進する新規なジャスモン酸内生促進剤及びジャスモン酸内生促進方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するジャスモン酸内生促進剤。
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、１価の有機基、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロキシ基、メルカプト基、シアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、スルファミノ基、スルフィノ基、スルファモイル基、ホスホ基、ホスホノ基、又はボロニル基を示し、ｎ個のＲ１は少なくともシアノ基又はハロゲン原子を含む。ｎは１～５の整数を示す。ｎが２以上である場合、ｎ個のＲ１はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ１同士で結合して環構造を形成していてもよい。ｍは０～５の整数を示す。ｍが２以上である場合、ｍ個のＲ２はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ２同士で結合して環構造を形成していてもよい。］
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するジャスモン酸内生促進剤。
【化1】
【0009】
＜２＞ ｎ個のＲ１が少なくともシアノ基を含む＜１＞に記載のジャスモン酸内生促進剤。
【0010】
＜３＞ ｎが２以上である＜１＞又は＜２＞に記載のジャスモン酸内生促進剤。
【0011】
＜４＞ ｎ個のＲ１が少なくともシアノ基及びハロゲン原子を含む＜３＞に記載のジャスモン酸内生促進剤。
【0012】
＜５＞ 前記式（１）で表される化合物又はその塩が、下記式（２）で表される化合物又はその塩である＜４＞に記載のジャスモン酸内生促進剤。
［式中、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ４は１価の有機基、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロキシ基、メルカプト基、シアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、スルファミノ基、スルフィノ基、スルファモイル基、ホスホ基、ホスホノ基、又はボロニル基を示す。ｐは０～３の整数を示す。ｐが２以上である場合、ｐ個のＲ４はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ４同士で結合して環構造を形成していてもよい。Ｒ２及びｍは前記式（１）と同義である。］
【化2】
【0013】
＜６＞ 前記式（２）で表される化合物又はその塩が、下記式（３－１）若しくは（３－２）で表される化合物又はその塩である＜５＞に記載のジャスモン酸内生促進剤。
［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ、及びｐは前記式（２）と同義である。］
【化3】
【0014】
＜７＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることを含むジャスモン酸内生促進方法。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、植物におけるジャスモン酸の内生を促進する新規なジャスモン酸内生促進剤及びジャスモン酸内生促進方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるジャスモン酸内生量を示す図である。
【図2A】化合物Ｅ１を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を示す図である。
【図2B】化合物Ｅ２を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を示す図である。
【図3】化合物Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を示す図である。
【図4】化合物Ｅ１、Ｅ６の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を示す図である。
【図5】化合物Ｅ１又は抗癌剤イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ－３８を添加したときのＭＲＣ－５細胞の生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
＜ジャスモン酸内生促進剤＞
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、下記式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。
【0018】
【化4】
【0019】
上記式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、１価の有機基、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロキシ基、メルカプト基、シアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、スルファミノ基、スルフィノ基、スルファモイル基、ホスホ基、ホスホノ基、又はボロニル基を示す。ただし、ｎ個のＲ１は少なくともシアノ基又はハロゲン原子を含む。
【0020】
Ｒ１又はＲ２で示される１価の有機基としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、非芳香族複素環基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、カルボキシ基、ホルミル基、ホルミルオキシ基、アセタール化ホルミル基、ホルムアミド基、イソシアネート基、カルバモイル基；－ＯＲ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、－ＮＨＲ、－ＮＲ２、－Ｃ（＝ＮＲ）Ｒ、－Ｃ（＝ＮＲ）ＮＨＲ、－Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ２、－ＳＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、－Ｃ（＝Ｎ－ＯＲ）Ｒ、－Ｃ（＝ＮＲ）ＯＲ、－ＯＣ（＝ＮＲ）Ｒ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）ＯＲ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、－ＮＲＣ（＝Ｏ）ＮＲ２、－ＮＨＣ（＝ＮＲ）Ｒ、－ＮＲＣ（＝ＮＲ）Ｒ、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｒ、－ＮＨＳ（＝Ｏ）２Ｒ、－ＮＲＳ（＝Ｏ）２Ｒ、－ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＲ２、－ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＲ２、－ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ、－ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨＲ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨＲ、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ２、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲ２）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＨＲ）２、又は－ＳｉＲ３で表される基（式中、Ｒはそれぞれ独立に、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、非芳香族複素環基、又はヘテロアリール基を示す。）；等が挙げられる。
【0021】
アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等の炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～１０の直鎖状又は分岐鎖状の基が挙げられる。
【0022】
シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、ビシクロ［３．２．１］オクチル基、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル基等の炭素数３～２０、好ましくは炭素数３～１０の基が挙げられる。
【0023】
アルケニル基としては、ビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、１，３－ブタジエニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等の炭素数２～２０、好ましくは炭素数２～１０の直鎖状又は分岐鎖状の基が挙げられる。
【0024】
アルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等の炭素数２～２０、好ましくは炭素数２～１０の直鎖状又は分岐鎖状の基が挙げられる。
【0025】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ピレニル基、フルオレニル基、インデニル基、アセナフチレニル、インダニル基、アセナフテニル基等の単環式又は２～４環の縮合多環式の基が挙げられる。
【0026】
非芳香族複素環基としては、アゼチジニル基、ピロリジニル基、ピロリニル基、ピペリジル基、テトラヒドロピリジル基、ホモピペリジニル基、オクタヒドロアゾシニル基、イミダゾリジニル基、イミダゾリニル基、ピラゾリジニル基、ピラゾリニル基、ピペラジニル基、ホモピペラジニル基、２－ピペラジノニル基等の単環式の含窒素基；テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、ピラニル基等の単環式の含酸素基；モルホリニル基等の単環式の含窒素・酸素基；チオモルホリニル基等の単環式の含窒素・硫黄基；インドリニル基、イソインドリニル基、テトラヒドロキノリニル基、テトラヒドロイソキノリニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラニル基、クロマニル基、クロメニル基、イソクロマニル基、１，３－ベンゾジオキソリル基、１，３－ベンゾジオキサニル基、１，４－ベンゾジオキサニル基等の２環式の含酸素基；２，３－ジヒドロベンゾチエニル基等の２環式の含硫黄基；ベンゾモルホリニル基、ジヒドロピラノピリジル基、ジヒドロジオキシノピリジル基、ジヒドロピリドオキサジニル基等の２環式の含窒素・酸素基；２－アザスピロ［３．３］オクチル基、２－オキサスピロ［３．３］オクチル基、６－アザ－２－オキサスピロ［３．３］オクチル基、１－アザスピロ［４．５］デシル基、１－オキサスピロ［４．５］デシル基等のヘテロ環式スピロ環基；などが挙げられる。
【0027】
ヘテロアリール基としては、ピロリル基、ピリジル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基等の単環式の含窒素基；フラニル基等の単環式の含酸素基；チエニル等の単環式の含硫黄基；オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、オキサジアゾリル基等の単環式の含窒素・酸素基；チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾリル基等の単環式の含窒素・硫黄基；インドリル基、イソインドリル基、ベンズイミダゾリル基、インダゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、テトラヒドロキノリル基、キノリル基、テトラヒドロイソキノリル基、イソキノリル基、キノリジニル基、シンノリニル基、フタラジニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ナフチリジニル基、ピロロピリジル基、イミダゾピリジル基、ピラゾロピリジル基、ピリドピラジル基、プリニル基、プテリジニル基等の２環式の含窒素基；ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基等の２環式の含酸素基；ベンゾチエニル基等の２環式の含硫黄基；ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、ベンゾオキサジアゾリル基等の２環式の含窒素・酸素基；ベンゾチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、ベンゾチアジアゾリル基、チアゾロピリジル基等の２環式の含窒素・硫黄基；などが挙げられる。
【0028】
アリールアルキル基としては、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリチル基、フェネチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
【0029】
アセタール化ホルミル基としては、エチレンアセタール化ホルミル基、プロピレンアセタール化ホルミル基等が挙げられる。
【0030】
Ｒ１又はＲ２で示される１価の有機基は、上記で例示した１種以上の有機基が結合した基であってもよい。また、Ｒ１又はＲ２で示される１価の有機基は、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロキシ基、メルカプト基、シアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、スルファミノ基、スルフィノ基、スルファモイル基、ホスホ基、ホスホノ基、ボロニル基等の１種以上の基で適宜置換されていてもよい。
【0031】
Ｒ１又はＲ２で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【0032】
上記式（１）中、ｎは１～５の整数を示す。ｎが２以上である場合、ｎ個のＲ１はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ１同士で結合して環構造を形成していてもよい。ｎは１～３であることが好ましく、１又は２であることがより好ましく、２であることがさらに好ましい。ｎが１である場合、Ｒ１はシアノ基であることが好ましい。ｎが２以上である場合、ｎ個のＲ１は少なくともシアノ基を含むことが好ましく、少なくともシアノ基及びハロゲン原子を含むことがより好ましい。このとき、ハロゲン原子としてはフッ素原子及び塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
【0033】
上記式（１）中、ｍは０～５の整数を示す。ｍが２以上である場合、ｍ個のＲ２はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ２同士で結合して環構造を形成していてもよい。ｍは０～２であることが好ましく、０又は１であることがより好ましく、１であることがさらに好ましい。ｍ個のＲ２は、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基を含むことが好ましい。
【0034】
上記式（１）で表される化合物の中でも、下記式（２）で表される化合物が好ましく、下記式（３－１）又は（３－２）で表される化合物がより好ましい。
【0035】
【化5】
【0036】
【化6】
【0037】
上記式中、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ４は１価の有機基、シアノ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ニトロキシ基、メルカプト基、シアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基、スルホ基、スルファミノ基、スルフィノ基、スルファモイル基、ホスホ基、ホスホノ基、又はボロニル基を示す。ハロゲン原子及び１価の有機基としては、Ｒ１及びＲ２について例示した基が挙げられる。
【0038】
上記式中、ｐは０～３の整数を示す。ｐが２以上である場合、ｐ個のＲ４はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、隣接する炭素原子に結合するＲ４同士で結合して環構造を形成していてもよい。ｐは０又は１であることが好ましく、０であることがより好ましい。
【0039】
上記式中、Ｒ２及びｍは上記式（１）と同義である。ｍが１である場合、Ｒ２の置換位置は特に制限されないが、エーテル結合の酸素原子が結合している炭素原子を１位としたときに４位であることが好ましい。
【0040】
上記式（１）で表される化合物が酸性官能基又は塩基性官能基を有する場合、当該化合物は、農芸化学的に許容可能な塩の形態であってもよい。例えば、上記式（１）で表される化合物が酸性官能基を有する場合、当該化合物は、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩などの形態であってもよい。また、上記式（１）で表される化合物が塩基性官能基を有する場合、当該化合物は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩の形態であってもよく、酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機酸との塩の形態であってもよい。
【0041】
上記式（１）で表される化合物の具体例としては、例えば以下の化合物が挙げられる。ただし、上記式（１）で表される化合物がこれらの具体例に限定されるものではない。
【0042】
【化7】
【0043】
上記式（１）で表される化合物又はその塩は、それ自体はジャスモン酸様作用を有しないものの、植物におけるジャスモン酸の内生を促進する作用を有する。
【0044】
ジャスモン酸は、植物の抵抗性誘導作用を有することが知られている。したがって、本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、植物の抵抗性誘導剤と言い換えることもできる。抵抗性誘導作用としては、病原菌感染耐性の強化、食虫害耐性の強化等が挙げられる。
【0045】
また、ジャスモン酸は、植物の成長調節作用を有することも知られている。したがって、本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、植物の成長調節剤と言い換えることもできる。成長調節作用としては、例えば、発根促進、発芽促進、着花促進、開花促進、生育促進、結実率向上、果実肥大、熟期促進、着色向上、糖度向上、果実落下防止等が挙げられる。
【0046】
なお、植物におけるジャスモン酸の内生が促進されたか否かは、ジャスモン酸の生成量を直接測定するほか、ジャスモン酸シグナルに応答する遺伝子（ジャスモン酸応答性遺伝子）の発現量を測定することによっても確認することができる。ジャスモン酸応答性遺伝子としては、ＰＤＦ１．２遺伝子、ＰＲ－４遺伝子、ＰＲ－１ｂ遺伝子、ＶＳＰ２遺伝子等が挙げられる。
【0047】
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、上記式（１）で表される化合物又はその塩に加えて、農芸化学的に許容可能な担体（固体担体、液体担体、又はガス担体）、界面活性剤、安定化剤、その他の製剤用補助剤等の他の成分を含有していてもよい。
【0048】
固体担体としては、カオリナイト、アタパルジャイト、ベントナイト、モンモリロナイト、パイロフィライト、セリサイト、タルク、酸性白土、珪藻土等の鉱物；トウモロコシ穂軸粉、クルミ殻粉、小麦粉、大豆粉、木粉等の植物性有機物；クマロン樹脂、石油樹脂、アルキド樹脂、ポリ塩化ビニル、ケトン樹脂等の合成高分子化合物；などが挙げられる。
【0049】
液体担体としては、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類；アセトン、エチルメチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸アミル、エチレングリコールアセテート等のエステル類；ベンゼン、トルエン、メチルナフタレン等の芳香族炭化水素類；ｎ－ヘキサン、ケロシン、ホワイトオイル等の脂肪族炭化水素類；ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；大豆油、綿実油等の植物油類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の酸アミド類；アセトニトリル、イソブチロニトリル等のニトリル類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；などが挙げられる。
【0050】
ガス担体としては、ＬＰＧ（液化石油ガス）、空気、窒素ガス、炭酸ガス、ジメチルエーテル等が挙げられる。
【0051】
界面活性剤としては、アルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩類、アルキルアリールスルホン酸塩類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、多価アルコールエステル類、リグニンスルホン酸塩類等が挙げられる。
【0052】
安定化剤としては、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＴＣＰ（リン酸トリクレジル）等が挙げられる。
【0053】
製剤用補助剤としては、カゼイン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸カルシウム等が挙げられる。
【0054】
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、上記のほかに、植物ホルモン剤、殺菌剤、殺虫剤、除草剤、肥料等をさらに含有していてもよい。
【0055】
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤の剤形は特に制限されない。ジャスモン酸内生促進剤の剤形としては、粉剤、粒剤、粉粒剤、水和剤、錠剤、水溶剤、乳剤、懸濁剤、液剤、油剤、ペースト剤、エアゾール剤等が挙げられる。
【0056】
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤は、希釈せずにそのまま用いてもよく、必要に応じて希釈して用いてもよい。
【0057】
＜ジャスモン酸内生促進方法＞
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進方法は、上述した本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることを含む。本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることにより、植物におけるジャスモン酸の内生を促進することができる。
本実施形態に係るジャスモン酸内生促進方法は、上述した本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることを含む。本実施形態に係るジャスモン酸内生促進剤を植物に接触させることにより、植物におけるジャスモン酸の内生を促進することができる。
【0058】
上述したとおり、ジャスモン酸は、植物の抵抗性誘導作用や成長調節作用を有することが知られている。したがって、本実施形態に係るジャスモン酸内生促進方法は、植物の抵抗性誘導方法や植物の成長調節方法と言い換えることもできる。
【0059】
対象植物としては、例えば、穀類（稲、小麦等）、豆類（大豆、小豆等）、芋類（馬鈴薯、サツマイモ等）、果実類（リンゴ、ブドウ等）、葉菜類（キャベツ、ホウレンソウ等）、果菜類（トマト、ナス等）、根菜類（大根、ニンジン等）、花卉類（キク、バラ等）、特用作物（綿、麻等）などが挙げられる。
【0060】
植物への施用部位は特に制限されず、植物の種類、施用目的等に応じて適宜選択することができる。施用部位としては、例えば、種子、花芽、花（花房）、果実（果房）、茎葉、根等が挙げられる。
【0061】
植物への施用方法も特に制限されず、植物の種類、ジャスモン酸内生促進剤の剤形、施用目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、種子の浸漬又はコーティング；茎葉への噴霧又は散布；土壌への灌注又は散布；水耕液への添加；などが挙げられる。植物への施用は、一回だけ行ってもよく複数回行ってもよい。
【実施例】
【0062】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【0063】
なお、以下の試験例１、２では、上記式（１）で表される化合物として、下記式で表される化合物Ｅ１、Ｅ２（いずれもＭａｙｂｒｉｄｇｅ社）、及び化合物Ｅ３（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。また、比較用の化合物として、下記式で表される比較化合物Ｃ１（東京化成工業株式会社）及び比較化合物Ｃ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。
【0064】
【化8】
【0065】
また、以下の試験例３～５では、上記式（１）で表される化合物として、合成例１～４で合成した化合物Ｅ１、Ｅ４～Ｅ６を用いた。
【0066】
＜合成例１：化合物Ｅ１の合成＞
【化9】
【0067】
ナス型フラスコに、２，６－ジフルオロベンゾニトリル（９９５ｍｇ，７．１６ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェノール（８７１ｍｇ，７．０２ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１．４０１ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１５０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製し、化合物Ｅ１（１．４３ｇ，８４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４６－７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４６－７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ）．
【0068】
＜合成例２：化合物Ｅ４の合成＞
【化10】
【0069】
ナス型フラスコに、２－クロロ－６－フルオロベンゾニトリル（１００．４ｍｇ，０．６４５４ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェノール（７９．９ｍｇ，０．６４４ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１１８ｇ，０．８５３ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１５０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製し、化合物Ｅ４（１６５ｍｇ，９９％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．３７（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．３７（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
【0070】
＜合成例３：化合物Ｅ５の合成＞
【化11】
【0071】
ナス型フラスコに、２－ブロモ－６－フルオロベンゾニトリル（１０２ｍｇ，０．５１０ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェノール（６３．４ｍｇ，０．５１１ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（９５．６ｍｇ，０．６９２ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１５０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を３回のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１；２回、トルエン／ヘキサン／１／２；１回）により精製し、化合物Ｅ５（１３４ｍｇ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．３１－７．２８（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．３Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．３１－７．２８（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝６．５，２．３Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
【0072】
＜合成例４：化合物Ｅ６の合成＞
【化12】
【0073】
ナス型フラスコに、２，６－ジフルオロベンゾニトリル（１３０ｍｇ，０．９３４ｍｍｏｌ）、４－イソプロポキシフェノール（６６．８ｍｇ，０．４３９ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１６３ｍｇ，１．１８２ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、９０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を２回のカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル＝１０／１；１回、ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１；１回）により精製し、化合物Ｅ６（１０４ｍｇ，８８％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４３－７．３８（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．３５（ｄ，Ｊ＝６．０，６Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４３－７．３８（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．３５（ｄ，Ｊ＝６．０，６Ｈ）．
【0074】
＜合成例５：化合物Ｅ７の合成＞
【化13】
【0075】
ナス型フラスコに、２，６－ジフルオロベンゾニトリル（１０１ｍｇ，０．７２７ｍｍｏｌ）、４－エトキシフェノール（１００ｍｇ，０．７２７ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１７５．７ｍｇ，１．２７１３ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１５０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製し、化合物Ｅ７（６３．３ｍｇ，３４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４０－７．３６（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４０－７．３６（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）．
【0076】
＜合成例６：化合物Ｅ８の合成＞
【化14】
【0077】
ナス型フラスコに、２，６－ジフルオロベンゾニトリル（９８．３ｍｇ，０．７０７ｍｍｏｌ）、３－メトキシフェノール（４４．６ｍｇ，０．３５９ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１３１ｍｇ，０．９４６ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、９０℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製し、化合物Ｅ８（９５．９ｍｇ，１００％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４７－７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝０．８，２．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６９－６．６５（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．４７－７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝０．８，２．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６９－６．６５（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ）．
【0078】
＜合成例７：化合物Ｅ９の合成＞
【化15】
【0079】
ナス型フラスコに、２－フルオロベンゾニトリル（１００ｍｇ，０．８２６ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェノール（１０２．２ｍｇ，０．８２４ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１５１ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１００℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を２回のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１；１回、ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１；１回）により精製し、化合物Ｅ９（１５４ｍｇ，８３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．６２（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４６－７．４１（ｍ，１Ｈ），７．１０－７．０１（ｍ，３Ｈ），６．９７－６．９０（ｍ，２Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．６２（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４６－７．４１（ｍ，１Ｈ），７．１０－７．０１（ｍ，３Ｈ），６．９７－６．９０（ｍ，２Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ）．
【0080】
＜合成例８：化合物Ｅ１０の合成＞
【化16】
【0081】
ナス型フラスコに、２－フルオロベンゾニトリル（１０３ｍｇ，０．８５３ｍｍｏｌ）、フェノール（８０．３ｍｇ，０．８５３ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１５８ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン封入をした。その後、ジメチルアセトアミド中、１００℃で１６時間撹拌を行った。反応溶液に酢酸エチルを加えて希釈し、水を加えて反応を終了させた。その後、有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和食塩水とで１回ずつ洗浄した後、水で２回洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を２回のカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１）により精製し、化合物Ｅ１０（１４８ｍｇ）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．６５（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．４６（ｍ，１Ｈ），７．４５－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１５－７．０７（ｍ，３Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，０．６Ｈｚ，１Ｈ）．
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ ７．６５（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．４６（ｍ，１Ｈ），７．４５－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１５－７．０７（ｍ，３Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，０．６Ｈｚ，１Ｈ）．
【0082】
＜試験例１：ジャスモン酸内生量の測定＞
（サンプル調製）
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に９～１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に２４時間静置した。この植物体２０～６０ｍｇ程度（約３個体）と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。
（サンプル調製）
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に９～１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に２４時間静置した。この植物体２０～６０ｍｇ程度（約３個体）と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。
【0083】
（ジャスモン酸の抽出及び測定）
凍結したサンプルを、ビーズ式ホモジナイザー（Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；ワケンビーテック株式会社）を用いて３０００ｒｐｍ、６０秒間の条件で破砕した後、７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液１ｍＬとｄ２－ＪＡ（内部標準物質）１０ｎｇとを添加して、ボルテックスによりよく混合した。この液を１００００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離して、上清を回収した。内部標準物質は加えずに同じ工程をさらに２回繰り返し、合計で３ｍＬの抽出液を回収した。
凍結したサンプルを、ビーズ式ホモジナイザー（Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；ワケンビーテック株式会社）を用いて３０００ｒｐｍ、６０秒間の条件で破砕した後、７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液１ｍＬとｄ２－ＪＡ（内部標準物質）１０ｎｇとを添加して、ボルテックスによりよく混合した。この液を１００００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離して、上清を回収した。内部標準物質は加えずに同じ工程をさらに２回繰り返し、合計で３ｍＬの抽出液を回収した。
【0084】
次いで、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標） Ｖａｃ ３ｃｃ（５００ｍｇ） Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ社）に下記１．～６．の順で溶液をアプライした。
１．アセトニトリル（１カラム分、約３ｍＬ）
２．１００％メタノール（１カラム分）
３．蒸留水（１カラム分）
４．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（２カラム分）
５．サンプル上清（全量）
６．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（１カラム分）
そして、上記５．のアプライ直後から上記６．の流出完了までの溶液を回収（約６ｍＬ）し、回収液を窒素吹付方式により容量が３０％以下になるまで濃縮した。
１．アセトニトリル（１カラム分、約３ｍＬ）
２．１００％メタノール（１カラム分）
３．蒸留水（１カラム分）
４．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（２カラム分）
５．サンプル上清（全量）
６．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（１カラム分）
そして、上記５．のアプライ直後から上記６．の流出完了までの溶液を回収（約６ｍＬ）し、回収液を窒素吹付方式により容量が３０％以下になるまで濃縮した。
【0085】
次いで、Ｏａｓｉｓ（登録商標） ＭＡＸ ３ｃｃ（６０ｍｇ） Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ社）に下記１．～１１．の順で溶液をアプライした。
１．アセトニトリル（１カラム分、約３ｍＬ）
２．１００％メタノール（１カラム分）
３．１％酢酸水溶液（１カラム分）
４．濃縮サンプル（１カラム分）
５．５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）（１カラム分）
６．蒸留水（１カラム分）
７．１００％メタノール（１カラム分）
８．蒸留水（１カラム分）
９．１％酢酸水溶液（１カラム分）
１０．３０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（１カラム分）
１１．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（２カラム分）
そして、上記１１．のアプライ直後から流出完了までの溶液を回収（約６ｍＬ）し、回収液を窒素吹付方式により容量が１ｍＬ以下になるまで濃縮し、測定サンプルとした。測定サンプルは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の測定用チューブに分注した後、測定まで－８０℃で保存した。
１．アセトニトリル（１カラム分、約３ｍＬ）
２．１００％メタノール（１カラム分）
３．１％酢酸水溶液（１カラム分）
４．濃縮サンプル（１カラム分）
５．５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）（１カラム分）
６．蒸留水（１カラム分）
７．１００％メタノール（１カラム分）
８．蒸留水（１カラム分）
９．１％酢酸水溶液（１カラム分）
１０．３０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（１カラム分）
１１．７０％メタノール＋１％酢酸の水溶液（２カラム分）
そして、上記１１．のアプライ直後から流出完了までの溶液を回収（約６ｍＬ）し、回収液を窒素吹付方式により容量が１ｍＬ以下になるまで濃縮し、測定サンプルとした。測定サンプルは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の測定用チューブに分注した後、測定まで－８０℃で保存した。
【0086】
次いで、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりジャスモン酸（ＪＡ）の内生量を測定した。測定条件は以下のとおりである。また、検出条件を下記表１に示す。
移動層：アセトニトリル／水（０．１％酢酸を含む）＝３／７
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
保持時間：１０．９～１１．１ｍｉｎ
インジェクション量：１０μＬ
カラム：Ｃ８／２ｍｍ×１００ｍｍ
移動層：アセトニトリル／水（０．１％酢酸を含む）＝３／７
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
保持時間：１０．９～１１．１ｍｉｎ
インジェクション量：１０μＬ
カラム：Ｃ８／２ｍｍ×１００ｍｍ
【0087】
【表1】
【0088】
化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、比較化合物Ｃ１、Ｃ２の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるジャスモン酸内生量を図１に示す。図１から分かるように、化合物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３をシロイヌナズナに接触させた場合には、ジャスモン酸の内生量が有意に増加した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【0089】
＜試験例２：ＰＤＦ１．２遺伝子の発現量の測定（１）＞
（サンプル調製）
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に９～１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（２５μＭ）又は化合物Ｅ２（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に２４時間静置した。この植物体２０～６０ｍｇ程度（約３個体）と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ２の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。
（サンプル調製）
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に９～１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（２５μＭ）又は化合物Ｅ２（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に２４時間静置した。この植物体２０～６０ｍｇ程度（約３個体）と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ２の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。
【0090】
（ＲＮＡ抽出及び逆転写反応）
凍結したサンプルを、ビーズ式ホモジナイザー（Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；ワケンビーテック株式会社）を用いて３０００ｒｐｍ、６０秒間の条件で破砕した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を用いてＲＮＡ抽出を行った。
凍結したサンプルを、ビーズ式ホモジナイザー（Ｂｅａｄ Ｓｍａｓｈ １２；ワケンビーテック株式会社）を用いて３０００ｒｐｍ、６０秒間の条件で破砕した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を用いてＲＮＡ抽出を行った。
【0091】
次いで、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社）を用いて逆転写反応を行った。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡの濃度測定を行い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＲＮＡｓｅ－ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏと混ぜて１／１２μｇ／μＬ（０．５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して６μＬのＨ２Ｏ）にし、ＰＣＲチューブに入れて、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷した。そこに４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２μＬ）を加え、タッピングした後、遠心分離し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（２μＬ）を添加し、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間の順でインキュベートし、得られたサンプルをｃＤＮＡサンプルとした。
【0092】
（リアルタイムＰＣＲ）
ｃＤＮＡサンプルに滅菌水を加えて８～１０倍に希釈した。希釈したサンプル（１μＬ）、蒸留水（３．４μＬ）、各種プライマー（１０μＭ）（フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれについて０．３μＬ）、及びＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）（５μＬ）を混合し、リアルタイムＰＣＲ用の９６穴プレートの１ウェルに分注した。
ｃＤＮＡサンプルに滅菌水を加えて８～１０倍に希釈した。希釈したサンプル（１μＬ）、蒸留水（３．４μＬ）、各種プライマー（１０μＭ）（フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれについて０．３μＬ）、及びＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）（５μＬ）を混合し、リアルタイムＰＣＲ用の９６穴プレートの１ウェルに分注した。
【0093】
次いで、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いてＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を定量した。ＰＣＲ条件は、［９５℃、６０秒間］×１サイクル、［９５℃、１５秒間→６０℃、６０秒間］×４０サイクル、［９５℃、１５ｓｅｃ→６０℃、３０秒間→９５℃、１５秒間］×１サイクルとした。定量化にはΔΔＣｔ法を用い、この値を相対的発現量とした。ΔΔＣｔ法の参照遺伝子としてはＥＦ１－α遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの配列を下記表２に示す。
【0094】
【表2】
【0095】
化合物Ｅ１、Ｅ２の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａ及び図２Ｂから分かるように、化合物Ｅ１、Ｅ２をシロイヌナズナに接触させた場合には、ＰＤＦ１．２遺伝子の発現が顕著に亢進した。
【0096】
＜試験例３：ＰＤＦ１．２遺伝子の発現量の測定（２）＞
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（５０μＭ）、化合物Ｅ４（５０μＭ）、又は化合物Ｅ５（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に４８時間静置した。８個体の植物体と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。そして、試験例２と同様に、凍結したサンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写リアルタイムＰＣＲによりＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を定量した。
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で２～３日間静置した後、長日処理条件下に１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（５０μＭ）、化合物Ｅ４（５０μＭ）、又は化合物Ｅ５（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に４８時間静置した。８個体の植物体と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。そして、試験例２と同様に、凍結したサンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写リアルタイムＰＣＲによりＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を定量した。
【0097】
化合物Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を図３に示す。図３から分かるように、化合物Ｅ１、Ｅ４、Ｅ５をシロイヌナズナに接触させた場合には、ＰＤＦ１．２遺伝子の発現が顕著に亢進した。
【0098】
＜試験例４：ＰＤＦ１．２遺伝子の発現量の測定（３）＞
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で３～７日間静置した後、長日処理条件下に１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（５０μＭ）又は化合物Ｅ６（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に４８時間静置した。８個体の植物体と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ６の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。そして、試験例２と同様に、凍結したサンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写リアルタイムＰＣＲによりＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を定量した。
透明な９６穴プレートにシロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）の種子をまき、１／２ＭＳ培地（１５０μＬ）に浸した。冷暗所で３～７日間静置した後、長日処理条件下に１０日間静置して生育した。その後、化合物Ｅ１（５０μＭ）又は化合物Ｅ６（５０μＭ）を含有する１／２ＭＳ培地（１００μＬ）に置換し、１０分間減圧処理をして、明所に４８時間静置した。８個体の植物体と粉砕用ビーズ２個とをチューブに入れ、直ちに液体窒素で凍結させて－８０℃で保存した。なお、ネガティブコントロールとしては、化合物Ｅ１、Ｅ６の各化合物の代わりにＤＭＳＯを添加した。そして、試験例２と同様に、凍結したサンプルからＲＮＡを抽出し、逆転写リアルタイムＰＣＲによりＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を定量した。
【0099】
化合物Ｅ１、Ｅ６の各化合物を接触させたシロイヌナズナにおけるＰＤＦ１．２遺伝子の発現量を図４に示す。図４から分かるように、化合物Ｅ１、Ｅ６をシロイヌナズナに接触させた場合には、ＰＤＦ１．２遺伝子の発現が顕著に亢進した。
【0100】
＜試験例５：化合物Ｅ１の細胞毒性の確認＞
ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞ＭＲＣ－５を９６穴プレートに５０００個／ウェルの細胞密度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１日間培養した。培養後、培地に各種濃度となるように化合物Ｅ１を添加し、さらに２日間培養した。その後、ＷＳＴ－８法により生細胞数を測定し、ＭＲＣ－５細胞の生存率を算出した。なお、コントロールとしては、化合物Ｅ１の代わりに、抗癌剤イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ－３８を添加した。
ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞ＭＲＣ－５を９６穴プレートに５０００個／ウェルの細胞密度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１日間培養した。培養後、培地に各種濃度となるように化合物Ｅ１を添加し、さらに２日間培養した。その後、ＷＳＴ－８法により生細胞数を測定し、ＭＲＣ－５細胞の生存率を算出した。なお、コントロールとしては、化合物Ｅ１の代わりに、抗癌剤イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ－３８を添加した。
【0101】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】