(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-07
(45)【発行日】2023-08-16
(54)【発明の名称】抗ウイルス剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20230808BHJP
A01N 61/00 20060101ALI20230808BHJP
A01N 63/50 20200101ALI20230808BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20230808BHJP
A23L 2/44 20060101ALI20230808BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20230808BHJP
A23L 2/66 20060101ALI20230808BHJP
A23L 3/3463 20060101ALI20230808BHJP
A23L 3/3526 20060101ALI20230808BHJP
A23L 29/288 20160101ALI20230808BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20230808BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20230808BHJP
A23L 33/195 20160101ALI20230808BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230808BHJP
A61K 31/785 20060101ALI20230808BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230808BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230808BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230808BHJP
C11D 7/32 20060101ALI20230808BHJP
C11D 7/42 20060101ALI20230808BHJP
D06M 15/15 20060101ALI20230808BHJP
D06M 15/61 20060101ALI20230808BHJP
D06M 16/00 20060101ALI20230808BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230808BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48 100
A01N61/00 D
A01N63/50 100
A01P1/00
A23L2/00 P
A23L2/52
A23L2/66
A23L3/3463
A23L3/3526 501
A23L29/288
A23L33/10
A23L33/17
A23L33/195
A61K9/12
A61K31/785
A61K47/10
A61P31/12
A61P43/00 121
C11D7/32
C11D7/42
D06M15/15
D06M15/61
D06M16/00 Z
C12N15/31 ZNA
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022522221
(86)(22)【出願日】2021-05-14
(86)【国際出願番号】 JP2021018455
(87)【国際公開番号】W WO2021230358
(87)【国際公開日】2021-11-18
【審査請求日】2023-05-08
(31)【優先権主張番号】P 2020086137
(32)【優先日】2020-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】311002067
【氏名又は名称】ＪＮＣ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】横田 奈々
(72)【発明者】
【氏名】中野 智美
(72)【発明者】
【氏名】日夏 雅子
(72)【発明者】
【氏名】平木 純
(72)【発明者】
【氏名】福士 英明
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】特表平０４－５００５１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－０９５１１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１６７７８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－１１７６９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１１３３７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０１３９７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１８６０８７０（ＣＮ，Ａ）
【文献】NIKOLIC T. et al.，Preparation of cellulosic fibers with biological activity by immobilization of trypsin on periodate oxidized viscose fibers，Cellulose，2014年，21，pp.1369-1380
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／４８
Ａ６１Ｐ ３１／１２
Ａ６１Ｋ ４７／３４
Ａ６１Ｋ ４７／３２
Ａ６１Ｋ ９／１２
Ａ６１Ｋ ４７／１０
Ｃ１２Ｎ ９／５０
Ａ２３Ｌ ２９／２８８
Ａ２３Ｌ ３３／１０
Ａ２３Ｌ ３３／１９５
Ｃ１２Ｎ ９／１２
Ａ２３Ｌ ２／５２
Ａ２３Ｌ ２／６６
Ａ２３Ｌ ３３／１７
Ａ２３Ｌ ３／３４６３
Ａ２３Ｌ ３／３５２６
Ａ０１Ｐ １／００
Ａ０１Ｎ ６３／５０
Ａ０１Ｎ ６１／００
Ｃ１２Ｎ １５／３１
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用するための抗ウイルス剤であって、
前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシン様セリンプロテアーゼまたはトリプシンであり、
前記カチオン性ポリマーが、ポリリジンまたはポリエチレンイミンであり、
前記ノンエンベロープ型ウイルスが、カリシウイルス科に属するウイルスである、抗ウイルス剤。
【請求項2】
前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌またはＲｈｉｚｏｐｕｓ属に属する菌が産生するものである、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項3】
前記セリンプロテアーゼが、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質である、請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項4】
前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシンまたはナットウキナーゼである、請求項１～３の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項5】
前記セリンプロテアーゼが、トリプシンである、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項6】
前記ノンエンベロープ型ウイルスが、ノロウイルスである請求項１～５の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項7】
アルコールをさらに含む、請求項１～６の何れか一項に記載に抗ウイルス剤。
【請求項8】
噴霧剤の形態である、請求項１～７の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項9】
請求項１～７の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を塗布してなる、繊維製品。
【請求項10】
請求項１～７の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を含有する、飲食品組成物。
【請求項11】
請求項１～７の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を含有する、食品洗浄処理剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【0002】
通常、ノロウイルスをはじめとするノンエンベロープ型ウイルスの不活化には、次亜塩素酸や次亜塩素酸ナトリウムが用いられるが、これらは有機物が共存する場合や経時的にも不活化効果が劣化しやすく、使用時において十分な不活化効果が得られないことがあった。また安全性の観点から、次亜塩素酸ナトリウムは手指に使用することができず、さらには金属腐食性もあり使用方法が制限されていた。
本発明者等は、これまでに納豆抽出ペプチドとカチオン性ポリマーを組み合わせた抗ウイルス剤について見出し、この抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対するウイルス不活化作用があることを示した（特許文献１）。これにより、ノンエンベロープ型ウイルスに対して不活化効果を発揮し、かつ手指への適用や経口投与／摂取も可能な安全性の高い、抗ウイルス剤を提供した。
なお、特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは、バチルス属細菌が産生するセリンプロテアーゼの一種であるズブチリシンより派生するペプチドであると推定されているが、ズブチリシンそのものと特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは異なるものである。
本発明者等は、これまでに納豆抽出ペプチドとカチオン性ポリマーを組み合わせた抗ウイルス剤について見出し、この抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対するウイルス不活化作用があることを示した（特許文献１）。これにより、ノンエンベロープ型ウイルスに対して不活化効果を発揮し、かつ手指への適用や経口投与／摂取も可能な安全性の高い、抗ウイルス剤を提供した。
なお、特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは、バチルス属細菌が産生するセリンプロテアーゼの一種であるズブチリシンより派生するペプチドであると推定されているが、ズブチリシンそのものと特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは異なるものである。
【0003】
しかしながら、抗ウイルス剤の成分の１つである納豆抽出ペプチドは、単独ではノンエンベロープ型ウイルスを不活化することができず（特許文献１）、さらに納豆抽出ペプチドは、納豆中に存在するペプチドであるがその含量は１％程度と少なく、納豆抽出ペプチドを得るためには納豆を出発材料として抽出および精製を行なう必要があるため、製造コストが高いという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１９－１４７７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
そのため、安全性が高く、かつウイルス不活化能が高い抗ウイルス剤を、その製造コストを抑えつつ製造することが求められていた。
さらに、このような抗ウイルス剤の有する安全性の高さを維持しつつ、ウイルス不活化能をさらに高めるべく、継続的な検討を行うことは当技術分野において一般的に望まれることである。
さらに、このような抗ウイルス剤の有する安全性の高さを維持しつつ、ウイルス不活化能をさらに高めるべく、継続的な検討を行うことは当技術分野において一般的に望まれることである。
【0006】
上記状況に鑑み、安全性が高く、製造コストが安価な成分とカチオン性ポリマーからなる、ウイルス不活化能が高い抗ウイルス剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者等は、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ズブチリシンやナットウキナーゼ、トリプシン等のセリンプロテアーゼ含む抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化作用があること、および、カチオン性ポリマーと組み合わせることによって、セリンプロテアーゼを含む抗ウイルス剤のノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化作用を増強させることを見出し、本発明を完成させた。
【0008】
すなわち、この出願は、以下の発明を提供するものである。
［１］セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤。
［２］前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌またはＲｈｉｚｏｐｕｓ属に属する菌が産生するものである、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］前記セリンプロテアーゼが、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、抗ウイルス活性を有するタンパク質である、［１］又は［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシンまたはナットウキナーゼである、［１］～［３］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［５］前記セリンプロテアーゼが、トリプシンである、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［６］前記カチオン性ポリマーが、ポリリジンまたはポリエチレンイミンである、［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［７］前記ノンエンベロープ型ウイルスが、ノロウイルスである、［１］～［６］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［８］アルコールをさらに含む、［１］～［７］の何れかに記載に抗ウイルス剤。
［９］噴霧剤の形態である、［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［１０］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を塗布してなる、繊維製品。
［１１］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、飲食品組成物。
［１２］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、食品洗浄処理剤。
［１］セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤。
［２］前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌またはＲｈｉｚｏｐｕｓ属に属する菌が産生するものである、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］前記セリンプロテアーゼが、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、抗ウイルス活性を有するタンパク質である、［１］又は［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシンまたはナットウキナーゼである、［１］～［３］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［５］前記セリンプロテアーゼが、トリプシンである、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［６］前記カチオン性ポリマーが、ポリリジンまたはポリエチレンイミンである、［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［７］前記ノンエンベロープ型ウイルスが、ノロウイルスである、［１］～［６］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［８］アルコールをさらに含む、［１］～［７］の何れかに記載に抗ウイルス剤。
［９］噴霧剤の形態である、［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［１０］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を塗布してなる、繊維製品。
［１１］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、飲食品組成物。
［１２］［１］～［８］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、食品洗浄処理剤。
【発明の効果】
【0009】
安全性が高く、製造コストが安価な成分とカチオン性ポリマーからなる、ウイルス不活化能を有する抗ウイルス剤であって、セリンプロテアーゼ単独使用時と比較してウイルス不活化能をさらに高め、また安定的にウイルス不活化能を有する新規抗ウイルス剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0010】
＜抗ウイルス剤＞
本発明の抗ウイルス剤は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤である。
本発明の抗ウイルス剤は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤である。
【0011】
本発明のセリンプロテアーゼは、例えば、キモトリプシン及びキモトリプシンに類似するセリンプロテアーゼを含むキモトリプシン類セリンプロテアーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ズブチリシン、ナットウキナーゼ、トロンビン、プラスミン等が挙げられる。
【0012】
本発明においてセリンプロテアーゼは市販されている製品を使用してもよく、また主成分がセリンプロテアーゼではなくともセリンプロテアーゼが含有されていればよく、以下の商品名で市販されているものを例示できる：
アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ、プロタメックス（登録商標）、ＪＰＢＬ００１株を利用して生産されたアルカリプロテアーゼ、ＪＰＦＶ００１株を利用して生産されたプロテアーゼ（以上、ノボザイムジャパン株式会社製）；
ペプチターゼＲ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、プロチンＳＤ－ＡＹ１０、プロテアックス（以上、天野エンザイム株式会社製）；
ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｇ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｌ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＬ－１５ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＰＬ－３０、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－２０ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＸＬ－４１６Ｆ、デナチーム（登録商標）ＰＭＣ ＳＯＦＴＥＲ、デナチームＣＰＯ ＰＥＰＲＩＣＨ、プロテアーゼＣＬ－１５（以上、ナガセケムテックス株式会社製）；
アロアーゼ（登録商標）ＸＡ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＮＰ－１０、（以上、ヤクルト薬品工業株式会社製）；
オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ、（以上、エイチビィアイ株式会社製）；
スミチーム（登録商標）ＭＰ、（以上、新日本化学工業株式会社製）；
マキシプロＢＡＰ、マキシプロＰＳＰ、ＢａｋｅＺｙｍｅ（登録商標）Ｂ５００ＢＧ、ＢａｋｅＺｙｍｅ（登録商標）ＰＰＵ９５，０００（以上、ＤＳＭニュートリション ジャパン株式会社製）；
マグナックスＭＴ１０３、エンチロンＳＡ－１００、エンチロンＳＡ－１５０Ｐ、エンチロンＮＢＳ－１００（以上、洛東化成工業株式会社製）；
ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ ２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｍ ２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ ３０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ １５０、Ｏｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）ＰＲ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＰＲ ６Ｌ（以上、ダニスコジャパン株式会社製）；
ＡＤＭＩＬ（合同酒精株式会社製）；
コクラーゼ（登録商標）・Ｐ顆粒（三菱ケミカルフーズ株式会社製）。
アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ、プロタメックス（登録商標）、ＪＰＢＬ００１株を利用して生産されたアルカリプロテアーゼ、ＪＰＦＶ００１株を利用して生産されたプロテアーゼ（以上、ノボザイムジャパン株式会社製）；
ペプチターゼＲ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、プロチンＳＤ－ＡＹ１０、プロテアックス（以上、天野エンザイム株式会社製）；
ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｇ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｌ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＬ－１５ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＰＬ－３０、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－２０ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＸＬ－４１６Ｆ、デナチーム（登録商標）ＰＭＣ ＳＯＦＴＥＲ、デナチームＣＰＯ ＰＥＰＲＩＣＨ、プロテアーゼＣＬ－１５（以上、ナガセケムテックス株式会社製）；
アロアーゼ（登録商標）ＸＡ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＮＰ－１０、（以上、ヤクルト薬品工業株式会社製）；
オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ、（以上、エイチビィアイ株式会社製）；
スミチーム（登録商標）ＭＰ、（以上、新日本化学工業株式会社製）；
マキシプロＢＡＰ、マキシプロＰＳＰ、ＢａｋｅＺｙｍｅ（登録商標）Ｂ５００ＢＧ、ＢａｋｅＺｙｍｅ（登録商標）ＰＰＵ９５，０００（以上、ＤＳＭニュートリション ジャパン株式会社製）；
マグナックスＭＴ１０３、エンチロンＳＡ－１００、エンチロンＳＡ－１５０Ｐ、エンチロンＮＢＳ－１００（以上、洛東化成工業株式会社製）；
ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ ２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｍ ２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ ３０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ １５０、Ｏｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）ＰＲ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＰＲ ６Ｌ（以上、ダニスコジャパン株式会社製）；
ＡＤＭＩＬ（合同酒精株式会社製）；
コクラーゼ（登録商標）・Ｐ顆粒（三菱ケミカルフーズ株式会社製）。
【0013】
また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する細菌；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する細菌；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する菌；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属に属する菌が産生するセリンプロテアーゼであってもよい。
本発明において、セリンプロテアーゼを産生する菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓである。さらに好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉであり、これらの菌が産生するプロテアーゼは、強く安定した抗ウイルス活性を示す。またＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓとしてはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏを例示することが出来る。
本発明において、セリンプロテアーゼを産生する菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓである。さらに好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉであり、これらの菌が産生するプロテアーゼは、強く安定した抗ウイルス活性を示す。またＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓとしてはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏを例示することが出来る。
【0014】
また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、または、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、好ましくは９５％以上同一のアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質であってもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが産生するセリンプロテアーゼである。
なお、アミノ酸配列の同一性の数値を算出する方法については、当業者に既知の方法を用いる事ができ、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）が提供するアミノ酸ホモロジー検索で用いるｂｌａｓｔｐの規定パラメーターにより算出することができる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが産生するセリンプロテアーゼである。
なお、アミノ酸配列の同一性の数値を算出する方法については、当業者に既知の方法を用いる事ができ、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）が提供するアミノ酸ホモロジー検索で用いるｂｌａｓｔｐの規定パラメーターにより算出することができる。
【0015】
また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは、好ましくはキモトリプシン及びキモトリプシンに類似するセリンプロテアーゼを含むキモトリプシン類セリンプロテアーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ズブチリシン、ナットウキナーゼ、トロンビンまたはプラスミンである。さらに好ましくはズブチリシン様セリンプロテアーゼであり、具体的にはズブチリシンまたはナットウキナーゼである。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するズブチリシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生する配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するナットウキナーゼのアミノ酸配列の同一性は約９９％である。ズブチリシンやナットウキナーゼといったセリンプロテアーゼは工業的手法によって大量生産可能であるため、工業的手法による大量生産が行われていない納豆抽出ペプチドと比較して製造コストが安くなるという点が優れている。
トリプシンは食品にも利用できることが知られている安全な酵素であり、また工業的手法によって大量生産可能であるため安価に入手することが可能である。またトリプシンの有するアミノ酸配列は特に限定されることなく、いずれのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するズブチリシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏが産生する配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するナットウキナーゼのアミノ酸配列の同一性は約９９％である。ズブチリシンやナットウキナーゼといったセリンプロテアーゼは工業的手法によって大量生産可能であるため、工業的手法による大量生産が行われていない納豆抽出ペプチドと比較して製造コストが安くなるという点が優れている。
トリプシンは食品にも利用できることが知られている安全な酵素であり、また工業的手法によって大量生産可能であるため安価に入手することが可能である。またトリプシンの有するアミノ酸配列は特に限定されることなく、いずれのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【0016】
本発明において、カチオン性ポリマーは、抗ウイルス剤のウイルス不活化作用を増強させる限り特に限定されることはないが、好ましくはポリリジンまたはポリエチレンイミンである。
【0017】
特に限定されることはないが、本発明のカチオン性ポリマーとしてポリリジンを用いた場合は、ポリリジンは天然に存在するポリマーであるため安全性が高い。
ポリリジンはα－ポリリジン、ε－ポリリジンのいずれでもよく、特に限定されるものではないが、毒性の低さ、入手の容易さからε－ポリリジンが好ましい。また、通常はＬ－リジンのポリマーである。
ε－ポリリジンは、例えば特許第１２４５３６１号に記載の方法で製造することができる。
ポリリジンはα－ポリリジン、ε－ポリリジンのいずれでもよく、特に限定されるものではないが、毒性の低さ、入手の容易さからε－ポリリジンが好ましい。また、通常はＬ－リジンのポリマーである。
ε－ポリリジンは、例えば特許第１２４５３６１号に記載の方法で製造することができる。
【0018】
ポリリジンの重量平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは３０００以上、より好ましくは４０００以上であり、好ましくは１００００以下、より好ましくは８０００以下、さらに好ましくは６０００以下であり、３０００～６０００の範囲が特に好ましい。
ポリエチレンイミンの重量平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは３００～１０，０００，０００である。
なお、ここで重量平均分子量は、ＧＰＣ－ＬＡＬＬＳ法により測定された値である。
ポリエチレンイミンの重量平均分子量は、特に限定されないが、好ましくは３００～１０，０００，０００である。
なお、ここで重量平均分子量は、ＧＰＣ－ＬＡＬＬＳ法により測定された値である。
【0019】
また、本発明のカチオン性ポリマーは、通常はホモポリマーであるが、本発明の効果を損なわない限りにおいて、他のアミノ酸をモノマーとして含んでもよい。
【0020】
また、本発明のカチオン性ポリマーは、遊離の形であってもよいし、塩酸、硫酸、リン酸及び臭化水素酸から選ばれた少なくとも１種の無機酸、または酢酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸及びクエン酸から選ばれた少なくとも１種の有機酸の塩の形であってもよい。
【0021】
本発明の抗ウイルス剤におけるセリンプロテアーゼとカチオン性ポリマーとの含有比率は、抗ウイルス剤が抗ウイルス効果を発揮する限り特に限定されないが、使用時の質量比として１：１００～１００：１であることが好ましい。
【0022】
本発明の抗ウイルス剤を含む製剤の最終ｐＨは、抗ウイルス剤が抗ウイルス効果を発揮する限り特に限定されないが、好ましくはｐＨ６．０以上、より好ましくはｐＨ７．０～１１．０、さらに好ましくはｐＨ７．３～１０．３であり、適宜、対象となるウイルスの種類や濃度などに合わせて調整してもよく、また用途に応じて調整してもよい。
【0023】
本発明の抗ウイルス剤は、ノンエンベロープ型ウイルスを不活化の対象とするものである。ウイルス不活化の結果、ウイルスの感染力を減弱化またはウイルスの感染を阻止することができる。本発明に係る抗ウイルス剤は、次亜塩素酸または次亜塩素酸ナトリウムと異なり、有機物の共存下であっても抗ウイルス活性が低下しないため、適用し得る対象、条件、環境、形態等についての選択の幅が次亜塩素酸よりも格段に広い点でも優れる。
本発明の抗ウイルス剤が作用するノンエンベロープ型ウイルスは、特に限定されないが、例えばノロウイルス、ロタウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、ネコカリシウイルスが挙げられ、好ましくはノロウイルスである。
本発明の抗ウイルス剤が作用するノンエンベロープ型ウイルスは、特に限定されないが、例えばノロウイルス、ロタウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、ネコカリシウイルスが挙げられ、好ましくはノロウイルスである。
【0024】
なお、本明細書において、「抗ウイルス活性」は、例えば、当業者に既知の方法であるプラークアッセイ法またはＴＣＩＤ５０（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ、５０％組織培養感染量）法によって評価される。
【0025】
プラークアッセイ法の場合、試料未添加の場合と比べて、試料添加時のプラーク形成単位（ＰＦＵ）が小さい、より好ましくは１０倍小さく、さらに好ましくは１００倍小さいときに、該試料は抗ウイルス活性を有する、と判断する。
ＴＣＩＤ５０法の場合、試料未添加の場合に比べて試料添加時のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が小さい、より好ましくは１以上小さい、さらに好ましくは２以上小さいとき、すなわち抗ウイルス活性値が０より大きい、好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上であるときに、該試料は抗ウイルス活性を有する、と判断する。
なお、ノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化試験において、ヒトノロウイルスの培養は困難であることから、一般的に代替試験として使用されているネコカリシウイルスに対する試験によって評価することができる。また、ヒトノロウイルスではなくマウスノロウイルスを代替試験として使用することもできる。
ＴＣＩＤ５０法の場合、試料未添加の場合に比べて試料添加時のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が小さい、より好ましくは１以上小さい、さらに好ましくは２以上小さいとき、すなわち抗ウイルス活性値が０より大きい、好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上であるときに、該試料は抗ウイルス活性を有する、と判断する。
なお、ノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化試験において、ヒトノロウイルスの培養は困難であることから、一般的に代替試験として使用されているネコカリシウイルスに対する試験によって評価することができる。また、ヒトノロウイルスではなくマウスノロウイルスを代替試験として使用することもできる。
【0026】
本発明の別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のための、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーの使用である。
また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のための抗ウイルス剤の製造における、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーの使用である。
また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のために用いられる、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーである。
また、別の側面は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを対象に適用することを含む、該対象におけるノンエンベロープ型ウイルスの不活化方法である。セリンプロテアーゼを対象に適用することとは、例えば、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを飲食品組成物としてヒト等の哺乳動物に経口摂取させること、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを飲食品と接触若しくは混合させること、又はセリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを繊維製品に塗布することなどが挙げられる。
また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のための抗ウイルス剤の製造における、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーの使用である。
また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のために用いられる、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーである。
また、別の側面は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを対象に適用することを含む、該対象におけるノンエンベロープ型ウイルスの不活化方法である。セリンプロテアーゼを対象に適用することとは、例えば、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを飲食品組成物としてヒト等の哺乳動物に経口摂取させること、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを飲食品と接触若しくは混合させること、又はセリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーを繊維製品に塗布することなどが挙げられる。
【0027】
＜飲食品組成物＞
本発明の抗ウイルス剤は、経口摂取することが可能であるため、飲食品組成物に含有させる態様とすることができる。
本発明の抗ウイルス剤は、経口摂取することが可能であるため、飲食品組成物に含有させる態様とすることができる。
【0028】
本発明の飲食品組成物の態様としては、通常の食品、飲料、食品添加物、機能性表示食品、特定保健用食品等の保健機能食品、サプリメント等が挙げられ、特に限定されない。サプリメントとしては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形のサプリメントであってもよく；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液状のサプリメントであってもよい。
【0029】
飲食品組成物の形態としては、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、また錠菓、流動食、飼料等としてもよい。
かかる形態にする際には、本発明の抗ウイルス剤の他に、飲食品製造時に通常添加される成分、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味料及び香味料等を用いることができる。炭水化物としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及び、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味料としては、天然香味料（タウマチン、ステビア抽出物等）及び合成香味料（サッカリン、アスパルテーム等）を使用することができる。
かかる形態にする際には、本発明の抗ウイルス剤の他に、飲食品製造時に通常添加される成分、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味料及び香味料等を用いることができる。炭水化物としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及び、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味料としては、天然香味料（タウマチン、ステビア抽出物等）及び合成香味料（サッカリン、アスパルテーム等）を使用することができる。
【0030】
また、飲食品組成物は、添加物として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤、ｐＨ調整剤、着色剤等の通常飲食品にも添加されるものをさらに含んでもよい。
【0031】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α－デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【0032】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【0033】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【0034】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【0035】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸；ＣａＣｌ２等の二価の無機塩類等が挙げられる。
【0036】
矯味剤及び矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、液剤の場合に使用する担体としては、特に限定されないが水等の溶剤等が挙げられる。
なお、液剤の場合に使用する担体としては、特に限定されないが水等の溶剤等が挙げられる。
【0037】
また、飲食品組成物の一形態として、他に一般の飲食品に含有させる態様であってもよく、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品等の即席食品；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子等の菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類；これら以外の飲食品等に、本発明の抗ウイルス剤を添加してもよい。
【0038】
また、飲食品組成物の一形態として、食品洗浄処理剤が挙げられ、これは生鮮食品を含む飲食品に対して抗ウイルス処理を施し、食中毒の発生を予防するために使用するものである。例えば、ノロウイルスに汚染された生カキ等に対して、本発明の飲食品組成物である食品洗浄処理剤を用いて洗浄する態様が好ましく挙げられ、洗浄の際に該処理剤を生カキの洗い流し用の水に添加したり、該処理剤を含む水に生カキを浸漬したりすればよく、特に限定されない。
【0039】
本発明の飲食品組成物の好ましい摂取量は、抗ウイルス効果を発揮できる限り特に限定されず、例えば、約６０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日あたり、セリンプロテアーゼ量として０．０１ｍｇ～１００００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～１００００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～５０００ｍｇであり、カチオン性ポリマー量として０．０１ｍｇ～１０００００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～１０００００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～５００００ｍｇである。
【0040】
本発明の飲食品組成物の好ましい摂取タイミングは、特に限定されず、例えば、食前、食後または食間のいずれでもよい。また、摂取間隔は特に限定されない。
【0041】
本発明の飲食品組成物における、本発明の抗ウイルス剤の含有量は、抗ウイルス活性を有する限り特に限定されず、任意で良い。
【0042】
本発明の別の側面は、飲食品組成物の製造における、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマーの使用である。
また、別の側面は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマー、又はこれを有効成分として含有する飲食品組成物を摂取することを含む、ウイルス感染症を改善及び／又は予防する方法である。
また、別の側面は、セリンプロテアーゼおよびカチオン性ポリマー、又はこれを有効成分として含有する飲食品組成物を摂取することを含む、ウイルス感染症を改善及び／又は予防する方法である。
【0043】
＜他の製品の態様＞
その他に、本発明の抗ウイルス剤は、日用品、衛生用品など、種々の態様とすることができる。
その際の形態としては、特に限定されないが、噴霧剤の形態とすることができる。噴霧剤は、例えば、スプレー、エアロゾル、または乾燥噴霧の形態で使用される。噴霧剤は、圧縮ガスやポンプによる噴霧および／または吐出に適した剤型に加工される。例えば水、特に限定されないがｐＨ６．０以上、好ましくはｐＨ７．０～１１．０程度、より好ましくはｐＨ７．３～１０．３程度の緩衝液、または生理食塩水等に本発明の抗ウイルス剤を溶解させたり、揮発性溶媒に懸濁して製剤化したりする。噴霧剤は、口腔用噴霧剤や鼻腔噴霧剤など、生体に直接投与できる他、フェイスマスクや衣類などの繊維製品に塗布したり、加湿器等により室内に霧散させたりして使用できる。
その他に、本発明の抗ウイルス剤は、日用品、衛生用品など、種々の態様とすることができる。
その際の形態としては、特に限定されないが、噴霧剤の形態とすることができる。噴霧剤は、例えば、スプレー、エアロゾル、または乾燥噴霧の形態で使用される。噴霧剤は、圧縮ガスやポンプによる噴霧および／または吐出に適した剤型に加工される。例えば水、特に限定されないがｐＨ６．０以上、好ましくはｐＨ７．０～１１．０程度、より好ましくはｐＨ７．３～１０．３程度の緩衝液、または生理食塩水等に本発明の抗ウイルス剤を溶解させたり、揮発性溶媒に懸濁して製剤化したりする。噴霧剤は、口腔用噴霧剤や鼻腔噴霧剤など、生体に直接投与できる他、フェイスマスクや衣類などの繊維製品に塗布したり、加湿器等により室内に霧散させたりして使用できる。
【0044】
また、本発明の抗ウイルス剤を塗布してなる繊維製品も、本発明に包含される。
繊維製品は、合成繊維、再生繊維もしくは天然繊維、またはこれらの混紡を加工した衣類、衛生用品、寝装品、フイルム類、およびインテリア用品等である。特に限定されるものではないが、繊維製品としては、例えば、シャツ、外套、ズボン、スカート、ナイトウェア、下着類、靴下、手袋、帽子、白衣、看護衣、介護衣、作業着、フェイスマスク、シーツ、枕カバー、カーペット、布団、座布団、壁紙、各種フィルター類、カーテン、およびカーペット等が例示できる。
本発明に係る繊維製品は、例えば、繊維製品または製品加工前の繊維に、本発明の抗ウイルス剤をスプレー、浸漬、含浸、またはコーティング等の方法により塗布すればよい。
繊維製品は、合成繊維、再生繊維もしくは天然繊維、またはこれらの混紡を加工した衣類、衛生用品、寝装品、フイルム類、およびインテリア用品等である。特に限定されるものではないが、繊維製品としては、例えば、シャツ、外套、ズボン、スカート、ナイトウェア、下着類、靴下、手袋、帽子、白衣、看護衣、介護衣、作業着、フェイスマスク、シーツ、枕カバー、カーペット、布団、座布団、壁紙、各種フィルター類、カーテン、およびカーペット等が例示できる。
本発明に係る繊維製品は、例えば、繊維製品または製品加工前の繊維に、本発明の抗ウイルス剤をスプレー、浸漬、含浸、またはコーティング等の方法により塗布すればよい。
【0045】
本発明の抗ウイルス剤を種々の製品（飲食品組成物も含む）の態様とする場合には、本発明の効果を損なわない限りにおいて、適当な成分と任意に併用することができる。
かかる併用成分は、製品の剤型等に応じて適宜選択すればよく、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の炭素数５以下の低級アルコール；グリセリン、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール；グリシン、有機酸、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、デヒドロ酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、ヨードチンキ、ポピドンヨード、セチル酸化ベンザルコニウム、トリクロサン、クロルキシレノール、イソプロピルメチルフェノール、ラクトフェリン、ナイシン、バクテリオシン、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、酵素分解ハトムギ抽出物、しらこタンパク抽出物、ツヤプリシン、ペクチン分解物等の抗菌剤などが挙げられ、特に限定されない。これらのうち、水、低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種が併用成分として好ましく、抗菌性をも付与しうる観点から低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
かかる併用成分は、製品の剤型等に応じて適宜選択すればよく、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の炭素数５以下の低級アルコール；グリセリン、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール；グリシン、有機酸、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、デヒドロ酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、ヨードチンキ、ポピドンヨード、セチル酸化ベンザルコニウム、トリクロサン、クロルキシレノール、イソプロピルメチルフェノール、ラクトフェリン、ナイシン、バクテリオシン、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、酵素分解ハトムギ抽出物、しらこタンパク抽出物、ツヤプリシン、ペクチン分解物等の抗菌剤などが挙げられ、特に限定されない。これらのうち、水、低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種が併用成分として好ましく、抗菌性をも付与しうる観点から低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
【0046】
この他にも、クエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸等のアミノカルボン酸系キレート剤、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、ホスホノブタントリカルボン酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸等のホスホン酸系キレート剤、トリエタノールアミン、ポリアミン類等のアミン系キレート剤などの添加剤も、併用成分として好ましく挙げられる。
【実施例】
【0047】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【0048】
＜実施例１＞ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（プラークアッセイ法での評価）
ネコカリシウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ Ｆ－９ ＡＴＣＣ ＶＲ－７８２）を細胞に対して、所定の濃度に希釈した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４））で表面を洗浄したＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）に希釈したウイルス液を添加した。細胞増殖用培地（２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を５ｍＬ加え、細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認されるまで、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養した。懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、細胞をペレット化するために遠心分離した（３０００ｒｐｍ、１０分間）。遠心分離して得られた上澄み液をバイアル瓶に分注してウイルスストック液とし、－８５℃で保管した。
ズブチリシン（シグマアルドリッチ社、製品番号Ｐ４８６０、酵素活性≧２．４Ｕ／ｇ、組成（重量体積パーセント）：酵素９％；グリセロール５０％；水４１％）とナットウキナーゼ（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号１４７－０８８０１、活性≧２５０ＩＵ／ｇ、分子量約３１，０００）、ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、ロット番号２１６１１０２、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％）はそれぞれ、表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように精製水で調製した。
試料０．４５ｍＬに０．０５ｍＬのウイルスストック液を加えて室温にて３０分間静置した後、細胞増殖用培地（１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）で１０倍希釈した後、同様に１０２から１０６倍まで細胞増殖用培地で段階希釈した。この段階希釈して得られた液を段階希釈液として用いた。
あらかじめ細胞増殖用培地を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞）を組織培養用１２ウェルプレート（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ ＴＲ５００１）内で１ウェル当たり４×１０５の細胞数に播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１日間培養した。
段階希釈液を０．３ｍＬずつ１ウェルの細胞に接種し、再度ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１時間培養し、１ｍＬの細胞増殖用培地で２回洗浄後、積層用培地（１％ＣＭＣ加２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を重層させた。
ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２日間培養した後、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で固定および染色を行い、プラーク数を測定した。測定したプラーク数を式（（ウェルあたりのプラーク数／ウェルあたりの測定検体の体積（ｍＬ））×希釈倍率＝ＰＦＵ／ｍＬ）に当てはめ、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。
表１に示す通り、ズブチリシンを単独で使用した場合（試料＃２）よりも、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用した場合（試料＃３）の方が、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。さらに、表２に示す通り、ナットウキナーゼを単独で使用した場合（試料＃５）よりも、ナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用した場合（試料＃６）の方が、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。
つまり、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンとを併用することによって、ズブチリシンまたはナットウキナーゼを単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス効果が大きく増加することが示された。
ネコカリシウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ Ｆ－９ ＡＴＣＣ ＶＲ－７８２）を細胞に対して、所定の濃度に希釈した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４））で表面を洗浄したＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）に希釈したウイルス液を添加した。細胞増殖用培地（２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を５ｍＬ加え、細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認されるまで、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養した。懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、細胞をペレット化するために遠心分離した（３０００ｒｐｍ、１０分間）。遠心分離して得られた上澄み液をバイアル瓶に分注してウイルスストック液とし、－８５℃で保管した。
ズブチリシン（シグマアルドリッチ社、製品番号Ｐ４８６０、酵素活性≧２．４Ｕ／ｇ、組成（重量体積パーセント）：酵素９％；グリセロール５０％；水４１％）とナットウキナーゼ（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号１４７－０８８０１、活性≧２５０ＩＵ／ｇ、分子量約３１，０００）、ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、ロット番号２１６１１０２、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％）はそれぞれ、表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように精製水で調製した。
試料０．４５ｍＬに０．０５ｍＬのウイルスストック液を加えて室温にて３０分間静置した後、細胞増殖用培地（１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）で１０倍希釈した後、同様に１０２から１０６倍まで細胞増殖用培地で段階希釈した。この段階希釈して得られた液を段階希釈液として用いた。
あらかじめ細胞増殖用培地を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞）を組織培養用１２ウェルプレート（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ ＴＲ５００１）内で１ウェル当たり４×１０５の細胞数に播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１日間培養した。
段階希釈液を０．３ｍＬずつ１ウェルの細胞に接種し、再度ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１時間培養し、１ｍＬの細胞増殖用培地で２回洗浄後、積層用培地（１％ＣＭＣ加２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を重層させた。
ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２日間培養した後、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で固定および染色を行い、プラーク数を測定した。測定したプラーク数を式（（ウェルあたりのプラーク数／ウェルあたりの測定検体の体積（ｍＬ））×希釈倍率＝ＰＦＵ／ｍＬ）に当てはめ、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。
表１に示す通り、ズブチリシンを単独で使用した場合（試料＃２）よりも、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用した場合（試料＃３）の方が、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。さらに、表２に示す通り、ナットウキナーゼを単独で使用した場合（試料＃５）よりも、ナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用した場合（試料＃６）の方が、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。
つまり、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンとを併用することによって、ズブチリシンまたはナットウキナーゼを単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス効果が大きく増加することが示された。
【表1】
【表2】
【0049】
＜実施例２＞ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
抗ネコカリシウイルス活性が、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用することで増強されるかを確認した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表３または４で示される混合濃度で試料を調製した。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
ズブチリシン単独使用と比較して、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用することによってｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．４～２．３低下した（表５及び表６）。また、ナットウキナーゼ単独使用と比較して、ナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用することによってｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は最大で３．０低下した（ナットウキナーゼ１００ｐｐｍ）（表６）。すなわち、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用することによって、ズブチリシン、ナットウキナーゼまたはε－ポリリジンをそれぞれ単独で使用した場合と比較して抗ウイルス活性が相乗的に増加することが示された。
抗ネコカリシウイルス活性が、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用することで増強されるかを確認した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表３または４で示される混合濃度で試料を調製した。
【表3】
【表4】
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
ズブチリシン単独使用と比較して、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用することによってｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．４～２．３低下した（表５及び表６）。また、ナットウキナーゼ単独使用と比較して、ナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用することによってｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は最大で３．０低下した（ナットウキナーゼ１００ｐｐｍ）（表６）。すなわち、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用することによって、ズブチリシン、ナットウキナーゼまたはε－ポリリジンをそれぞれ単独で使用した場合と比較して抗ウイルス活性が相乗的に増加することが示された。
【表5】
【表6】
【0050】
＜実施例２＞セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
抗ネコカリシウイルス活性が、セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε－ポリリジンとを併用することで増強されるかを確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表７から８で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるようにＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で調製した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表７または８で示される混合濃度で試料を調製した。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、１０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε－ポリリジンを併用した場合、陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．１～４．５低下した（表９及び表１０）。すなわち、市販の酵素製剤とε－ポリリジンを併用することによって、市販の酵素製剤をそれぞれ単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス活性が相乗的に増加することが示され、またその抗ウイルス効果が安定的に発現することが示された。
抗ネコカリシウイルス活性が、セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε－ポリリジンとを併用することで増強されるかを確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表７から８で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるようにＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で調製した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表７または８で示される混合濃度で試料を調製した。
【表7】
【表8】
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε－ポリリジンを併用した場合、陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．１～４．５低下した（表９及び表１０）。すなわち、市販の酵素製剤とε－ポリリジンを併用することによって、市販の酵素製剤をそれぞれ単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス活性が相乗的に増加することが示され、またその抗ウイルス効果が安定的に発現することが示された。
【表9】
【表10】
【0051】
＜実施例４＞ズブチリシンを数種のポリカチオンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
抗ネコカリシウイルス活性が、ズブチリシンを数種のポリカチオンと併用することで増強されるかを確認した。実施例１で使用したズブチリシン、ポリエチレンイミン（純正化学株式会社、製品番号：２０１８Ｉ１６４５、分子量約１２００）、プロタミン硫酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号：１６８－０５１９２、サケ由来）、ＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社、製品番号：２９１００３４６）をそれぞれ使用し、表１１で示される混合濃度で試料を調製した。なお、試料＃１は陰性対照である。
試料０．４５ｍＬと実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液０．０５ｍＬを混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清を、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１０0～9倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル当たり２×１０４の細胞数を播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。段階希釈液を０．０５ｍＬずつ１ウェルの細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
表１１に示す通り、ズブチリシンとポリエチレンイミンを併用した場合のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．７であり、陰性対照（６．１）と比較して２．４低下しており、ズブチリシンとポリエチレンイミンを併用することによって、抗ウイルス活性を有することが示された。一方で、ズブチリシンとプロタミン硫酸塩又はＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩を併用した場合のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値はそれぞれ６．６または５．７であり、陰性対照の値と同程度の値であることより、ズブチリシンとプロタミン硫酸塩又はＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩を併用しても抗ウイルス活性を有さないことが示された。
抗ネコカリシウイルス活性が、ズブチリシンを数種のポリカチオンと併用することで増強されるかを確認した。実施例１で使用したズブチリシン、ポリエチレンイミン（純正化学株式会社、製品番号：２０１８Ｉ１６４５、分子量約１２００）、プロタミン硫酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号：１６８－０５１９２、サケ由来）、ＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社、製品番号：２９１００３４６）をそれぞれ使用し、表１１で示される混合濃度で試料を調製した。なお、試料＃１は陰性対照である。
試料０．４５ｍＬと実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液０．０５ｍＬを混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清を、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１０0～9倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル当たり２×１０４の細胞数を播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。段階希釈液を０．０５ｍＬずつ１ウェルの細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
表１１に示す通り、ズブチリシンとポリエチレンイミンを併用した場合のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．７であり、陰性対照（６．１）と比較して２．４低下しており、ズブチリシンとポリエチレンイミンを併用することによって、抗ウイルス活性を有することが示された。一方で、ズブチリシンとプロタミン硫酸塩又はＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩を併用した場合のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値はそれぞれ６．６または５．７であり、陰性対照の値と同程度の値であることより、ズブチリシンとプロタミン硫酸塩又はＤＥＡＥ－デキストラン塩酸塩を併用しても抗ウイルス活性を有さないことが示された。
【表11】
【0052】
＜実施例５＞海水中においてズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
海水中においても、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した時、抗ネコカリシウイルス活性を有するかを確認した。
使用した海水は、下記の人工海水Ａ及びＢである。
人工海水Ａ：観賞魚用人工海水（カミハタ、品番なし）を、製造者のマニュアルに記載される使用方法の通り、水道水５００ｍＬに対して一袋分（約１８．５ｇ）を入れて調製した。さらに、滅菌のためにオートクレーブ処理を行った。
人工海水Ｂ：テトラマリンソルトプロ（テトラ、品番：７０７５１）を、脱イオン水で３．５重量％になるように調整し、滅菌のためにオートクレーブ処理を行った。
表１２に記載される混合濃度で試料を調製し、セリンプロテアーゼ溶液とした。希釈溶媒は、試料＃１～＃３はＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）であり、試料＃４～＃７は人工海水Ａ又は人工海水Ｂである。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
表１２に示す通り、ナットウキナーゼとε－ポリリジンを併用した場合は、人工海水Ａ又はＢを使用した試料（＃６～７）の抗ネコカリシウイルス活性は、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を使用した試料（＃３）と比較してやや劣ったものの、コントロール試料（＃１）と比較すると抗ウイルス活性を有することが確認できた。
また、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用した場合は、人工海水Ａ又はＢを使用した試料（＃４～５）の抗ネコカリシウイルス活性は、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を使用した試料（＃２）と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が同等であり、海水中においても高い抗ウイルス活性が維持されることが示された。
海水中においても、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した時、抗ネコカリシウイルス活性を有するかを確認した。
使用した海水は、下記の人工海水Ａ及びＢである。
人工海水Ａ：観賞魚用人工海水（カミハタ、品番なし）を、製造者のマニュアルに記載される使用方法の通り、水道水５００ｍＬに対して一袋分（約１８．５ｇ）を入れて調製した。さらに、滅菌のためにオートクレーブ処理を行った。
人工海水Ｂ：テトラマリンソルトプロ（テトラ、品番：７０７５１）を、脱イオン水で３．５重量％になるように調整し、滅菌のためにオートクレーブ処理を行った。
表１２に記載される混合濃度で試料を調製し、セリンプロテアーゼ溶液とした。希釈溶媒は、試料＃１～＃３はＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）であり、試料＃４～＃７は人工海水Ａ又は人工海水Ｂである。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
【表12】
また、ズブチリシンとε－ポリリジンを併用した場合は、人工海水Ａ又はＢを使用した試料（＃４～５）の抗ネコカリシウイルス活性は、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を使用した試料（＃２）と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が同等であり、海水中においても高い抗ウイルス活性が維持されることが示された。
【0053】
＜比較例１＞海水中において納豆抽出物をε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
納豆（ヤマダフーズ 業務用極小粒納豆 ＹＭ－１８０）３００ｇを秤量し、３倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えて冷蔵庫内で一昼夜撹拌した。納豆をガーゼで取り除き、その溶液を５，０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を取り除いた。ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社 ポリリジン２５％水溶液 ２１６１１０２）を０．１％になるように加えて１時間スターラーで混和した後、５，０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を取り除いた。０．２２μｍ滅菌済フィルター（ＴＲＰ Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒｓ ０．２２μｍ）を使ってろ過滅菌した。硫酸アンモニウム（Ｗａｋｏ 試薬特級０１９－０３４３５）を飽和濃度の５０％になるように数回に分けて加えて、４℃で１時間撹拌した。その溶液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して沈殿を取り除き、上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度の７５％になるように数回に分けて加えて、４℃で１時間撹拌した。１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を捨て、氷冷下で沈殿に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＬを加えて溶解し、透析対象液とした。透析膜（積水メディカル株式会社 セルロースチューブ透析膜２７／３２ 製造番号：５２１７３７）約２５ｃｍを蒸留水で洗浄して可塑剤を取り除き、上記の透析対象液を空気と共に透析膜によって包み込んだ。外液としては、透析対象液の約１００倍容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用い、そこに透析対象液を包み込んだ透析膜を浮かべ、外液を撹拌しながら透析を一昼夜行った。その際３回程度外液を交換した。透析膜を切り開いて透析後の溶液を容器に移し、その容器の口を蓋の代わりにキムワイプと輪ゴムで覆い－８５℃ディープフリーザーで１時間程度冷凍した。凍結乾燥機（東京理化器機株式会社 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ－２０００）にこの容器を取り付け、２昼夜程度凍結乾燥を行い、納豆抽出物を得た。このようにして得た納豆抽出物を滅菌水で０．２％になるように溶解し、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌した。
人工海水Ａ及び人工海水Ｂは実施例４で使用したものと同じものを使用した。
表１３～１５に記載される混合濃度でサンプルを調製した。試験区＃１及び＃２は滅菌水、試験区＃３及び４は人工海水Ａ、試験区＃５及び＃６は人工海水Ｂをそれぞれ溶媒として用い、サンプル溶液とした。ウイルスストック液とサンプル溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
実施例５に記載する方法と同様の方法によりｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。その結果、納豆抽出物とポリリジンを併用することによって、滅菌水中ではｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は４．５であり、陰性対照（７．２）と比較して２．７低下しており、抗ネコカリシウイルス活性が示された（表１３）。一方で、人工海水Ａ及びＢ中においては、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値がそれぞれ６．３及び６．６であり、陰性対照（７．２及び７．３）と比較して０．９及び０．７の低下にとどまった（表１４及び表１５）。すなわち、納豆抽出物及びポリリジンを海水中で併用した場合の抗ネコカリシウイルス活性は、滅菌水中で併用した場合と比較して、著しく低下することが示された。
納豆（ヤマダフーズ 業務用極小粒納豆 ＹＭ－１８０）３００ｇを秤量し、３倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えて冷蔵庫内で一昼夜撹拌した。納豆をガーゼで取り除き、その溶液を５，０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を取り除いた。ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社 ポリリジン２５％水溶液 ２１６１１０２）を０．１％になるように加えて１時間スターラーで混和した後、５，０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を取り除いた。０．２２μｍ滅菌済フィルター（ＴＲＰ Ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒｓ ０．２２μｍ）を使ってろ過滅菌した。硫酸アンモニウム（Ｗａｋｏ 試薬特級０１９－０３４３５）を飽和濃度の５０％になるように数回に分けて加えて、４℃で１時間撹拌した。その溶液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して沈殿を取り除き、上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度の７５％になるように数回に分けて加えて、４℃で１時間撹拌した。１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を捨て、氷冷下で沈殿に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １０ｍＬを加えて溶解し、透析対象液とした。透析膜（積水メディカル株式会社 セルロースチューブ透析膜２７／３２ 製造番号：５２１７３７）約２５ｃｍを蒸留水で洗浄して可塑剤を取り除き、上記の透析対象液を空気と共に透析膜によって包み込んだ。外液としては、透析対象液の約１００倍容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用い、そこに透析対象液を包み込んだ透析膜を浮かべ、外液を撹拌しながら透析を一昼夜行った。その際３回程度外液を交換した。透析膜を切り開いて透析後の溶液を容器に移し、その容器の口を蓋の代わりにキムワイプと輪ゴムで覆い－８５℃ディープフリーザーで１時間程度冷凍した。凍結乾燥機（東京理化器機株式会社 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ－２０００）にこの容器を取り付け、２昼夜程度凍結乾燥を行い、納豆抽出物を得た。このようにして得た納豆抽出物を滅菌水で０．２％になるように溶解し、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過滅菌した。
人工海水Ａ及び人工海水Ｂは実施例４で使用したものと同じものを使用した。
表１３～１５に記載される混合濃度でサンプルを調製した。試験区＃１及び＃２は滅菌水、試験区＃３及び４は人工海水Ａ、試験区＃５及び＃６は人工海水Ｂをそれぞれ溶媒として用い、サンプル溶液とした。ウイルスストック液とサンプル溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
実施例５に記載する方法と同様の方法によりｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。その結果、納豆抽出物とポリリジンを併用することによって、滅菌水中ではｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は４．５であり、陰性対照（７．２）と比較して２．７低下しており、抗ネコカリシウイルス活性が示された（表１３）。一方で、人工海水Ａ及びＢ中においては、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値がそれぞれ６．３及び６．６であり、陰性対照（７．２及び７．３）と比較して０．９及び０．７の低下にとどまった（表１４及び表１５）。すなわち、納豆抽出物及びポリリジンを海水中で併用した場合の抗ネコカリシウイルス活性は、滅菌水中で併用した場合と比較して、著しく低下することが示された。
【表13】
【表14】
【表15】
【0054】
＜実施例６＞トリプシンをε－ポリリジンと併用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
トリプシンが、ε－ポリリジンと併用されることによって、抗ネコカリシウイルス活性が増強されるか調べた。トリプシン、ブタ脾臓由来（富士フイルム和光純薬、製品番号２０９－１９２８２、ロット番号ＳＥＧ１８７５）とε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％、ロット番号２１６１１０２）を、表１６中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるようにＴｒｉｓ－ＨＣｌで調製した。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
表１６に示す通り、トリプシン単独では５００ｐｐｍという低濃度を用いた場合は抗ウイルス活性を有さないが、トリプシンをε－ポリリジンと併用した場合はｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は４．９であり、陰性対照（６．８）と比較して１．９低下しており、トリプシンとε－ポリリジンと併用することで抗ウイルス活性を増強できることが示された。
トリプシンが、ε－ポリリジンと併用されることによって、抗ネコカリシウイルス活性が増強されるか調べた。トリプシン、ブタ脾臓由来（富士フイルム和光純薬、製品番号２０９－１９２８２、ロット番号ＳＥＧ１８７５）とε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％、ロット番号２１６１１０２）を、表１６中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるようにＴｒｉｓ－ＨＣｌで調製した。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
表１６に示す通り、トリプシン単独では５００ｐｐｍという低濃度を用いた場合は抗ウイルス活性を有さないが、トリプシンをε－ポリリジンと併用した場合はｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は４．９であり、陰性対照（６．８）と比較して１．９低下しており、トリプシンとε－ポリリジンと併用することで抗ウイルス活性を増強できることが示された。
【表16】
【0055】
＜実施例７＞細胞毒性試験
実施例１で用いたズブチリシン、ナットウキナーゼおよびε－ポリリジンを、それぞれ０．５～５０００μｇ／ｍＬの濃度となるように、１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地で適宜希釈し、４８ウェルプレートで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清中に添加した。７２時間後に、細胞数を測定し、当業者に既知の方法により５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を求めた。
２回の細胞数測定値を平均した値を用いた場合のＣＣ５０は、ズブチリシンが４．６μｇ／ｍＬ、ナットウキナーゼが１４５０μｇ／ｍＬ、ε－ポリリジンが２７μｇ／ｍＬであった。
実施例１で用いたズブチリシン、ナットウキナーゼおよびε－ポリリジンを、それぞれ０．５～５０００μｇ／ｍＬの濃度となるように、１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地で適宜希釈し、４８ウェルプレートで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清中に添加した。７２時間後に、細胞数を測定し、当業者に既知の方法により５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を求めた。
２回の細胞数測定値を平均した値を用いた場合のＣＣ５０は、ズブチリシンが４．６μｇ／ｍＬ、ナットウキナーゼが１４５０μｇ／ｍＬ、ε－ポリリジンが２７μｇ／ｍＬであった。
【0056】
＜実施例８＞抗マウスノロウイルス活性試験
実施例１で用いたズブチリシン、ナットウキナーゼおよびε－ポリリジンを、それぞれＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈することにより、最終濃度の４倍希釈液に調製した。
マウスノロウイルスのストック液は次の方法により調製した。１×１０６細胞／ｍＬのＲＡＷ２６４．７細胞を、１００ｍｍディッシュ（１ディッシュあたり１０ｍＬ）に加えて、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。培地は、１０％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭを使用した。翌日、マウスノロウイルス（ＭＮＶ Ｓ７－ＰＰ３株）のウイルス液を０．１ＰＦＵ／細胞に調製し、上記の細胞に１ディッシュあたり１ｍＬ加え、室温で１時間感染させた。維持培地（１％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭ）を１ディッシュあたり５ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。翌日、ＣＰＥ（ウイルス感染による細胞変性効果）が細胞全体に出現していることを確認の上、懸濁液を５０ｍＬチューブに入れ、４℃で１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。その上清を１．５ｍＬのマイクロチューブに適宜（０．１～１ｍＬ）分注してウイルスストック液とし、－８０℃で保存した。
ウイルスストック液をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈して２×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウイルス力価に調製した。
９６ウェルプレートの各ウェルに、上記調製したズブチリシン、ナットウキナーゼまたはＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を２０μＬ、上記調製したε－ポリリジンまたはＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を２０μＬ、および上記調製したウイルスストック液を４０μＬ（計８０μＬ／ウェル）加え、室温で３０分間～１時間放置した。その後、各ウェルから１０μＬ取り出し、すぐにＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で１００倍希釈し、１００μＬ回収した。その希釈液を２４ウェルプレートに単層状に培養したＲＡＷ２６４．７細胞に接種し、プラーク用培地を重層した。当業者に既知の方法により、培養２日後に細胞を固定し、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で染色し、その後プラーク数を測定した。表１７に示す通り、ズブチリシン、ナットウキナーゼまたはε－ポリリジンを単独で使用した場合と比較して、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した場合にプラーク数が少ないことが分かった。
つまり、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンとを併用することによって、ズブチリシンまたはナットウキナーゼを単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス効果が大きく増加することが示された。
実施例１で用いたズブチリシン、ナットウキナーゼおよびε－ポリリジンを、それぞれＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈することにより、最終濃度の４倍希釈液に調製した。
マウスノロウイルスのストック液は次の方法により調製した。１×１０６細胞／ｍＬのＲＡＷ２６４．７細胞を、１００ｍｍディッシュ（１ディッシュあたり１０ｍＬ）に加えて、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。培地は、１０％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭを使用した。翌日、マウスノロウイルス（ＭＮＶ Ｓ７－ＰＰ３株）のウイルス液を０．１ＰＦＵ／細胞に調製し、上記の細胞に１ディッシュあたり１ｍＬ加え、室温で１時間感染させた。維持培地（１％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭ）を１ディッシュあたり５ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。翌日、ＣＰＥ（ウイルス感染による細胞変性効果）が細胞全体に出現していることを確認の上、懸濁液を５０ｍＬチューブに入れ、４℃で１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。その上清を１．５ｍＬのマイクロチューブに適宜（０．１～１ｍＬ）分注してウイルスストック液とし、－８０℃で保存した。
ウイルスストック液をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈して２×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウイルス力価に調製した。
９６ウェルプレートの各ウェルに、上記調製したズブチリシン、ナットウキナーゼまたはＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を２０μＬ、上記調製したε－ポリリジンまたはＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を２０μＬ、および上記調製したウイルスストック液を４０μＬ（計８０μＬ／ウェル）加え、室温で３０分間～１時間放置した。その後、各ウェルから１０μＬ取り出し、すぐにＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で１００倍希釈し、１００μＬ回収した。その希釈液を２４ウェルプレートに単層状に培養したＲＡＷ２６４．７細胞に接種し、プラーク用培地を重層した。当業者に既知の方法により、培養２日後に細胞を固定し、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で染色し、その後プラーク数を測定した。表１７に示す通り、ズブチリシン、ナットウキナーゼまたはε－ポリリジンを単独で使用した場合と比較して、ズブチリシンまたはナットウキナーゼをε－ポリリジンと併用した場合にプラーク数が少ないことが分かった。
つまり、ズブチリシンまたはナットウキナーゼとε－ポリリジンとを併用することによって、ズブチリシンまたはナットウキナーゼを単独で使用した場合と比較して、抗ウイルス効果が大きく増加することが示された。
【表17】
【0057】
＜実施例９＞ナットウキナーゼ及びε－ポリリジンをアルコールと併用した時の抗マウスノロウイルス活性試験（プラークアッセイ法での評価）
マウスノロウイルスは実施例８で使用したものを用いた。
ナットウキナーゼ（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号１４７－０８８０１、活性≧２５０ＩＵ／ｇ、分子量約３１，０００）、ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、ロット番号２１６１１０２、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％）をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、それぞれ１％（ｗ／ｖ）に調整して０．０１ｍＬずつ９６ウェルプレートのウェル内で混合した。ここに９９．５％エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号０５７－００４５６）を０又は０．０５ｍＬ加え、合計の液量が０．０７５ｍＬになるようＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を加えた。また、陰性対照としてＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）０．０７５ｍＬを用意した。これらのウェルにウイルスストック液０．０２５ｍＬを加えて室温にて１時間静置した後、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で１００倍希釈した。
あらかじめ細胞増殖用培地（１０％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭ）を用いて、感染細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）を組織培養用２４ウェルプレート内で１ウェル当たり５×１０５の細胞数に播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１日間培養した。細胞増殖用培地を取り除いてウイルス希釈液０．１ｍＬをウェルに加え、３０分～１時間培養した後、積層用培地（１．５％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｌｏｎｚａ）添加ＤＭＥＭ培地）を重層させた。
ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２日間培養した後、１０％ホルマリンを加えて２時間～一晩固定し、２０％エタノールを含むゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で染色し、プラーク数を測定した。各条件２ウェルで試験を実施し、平均プラーク数を記録した。
その結果、ナットウキナーゼ及びε－ポリリジンとエタノールとを併用することで、抗マウスノロウイルス活性が増強されることが示された（表１８）。
マウスノロウイルスは実施例８で使用したものを用いた。
ナットウキナーゼ（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号１４７－０８８０１、活性≧２５０ＩＵ／ｇ、分子量約３１，０００）、ε－ポリリジン（ＪＮＣ株式会社、ロット番号２１６１１０２、重量平均分子量４７００、重量体積パーセント濃度２５％）をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、それぞれ１％（ｗ／ｖ）に調整して０．０１ｍＬずつ９６ウェルプレートのウェル内で混合した。ここに９９．５％エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号０５７－００４５６）を０又は０．０５ｍＬ加え、合計の液量が０．０７５ｍＬになるようＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を加えた。また、陰性対照としてＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）０．０７５ｍＬを用意した。これらのウェルにウイルスストック液０．０２５ｍＬを加えて室温にて１時間静置した後、ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で１００倍希釈した。
あらかじめ細胞増殖用培地（１０％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭ）を用いて、感染細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）を組織培養用２４ウェルプレート内で１ウェル当たり５×１０５の細胞数に播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１日間培養した。細胞増殖用培地を取り除いてウイルス希釈液０．１ｍＬをウェルに加え、３０分～１時間培養した後、積層用培地（１．５％Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｌｏｎｚａ）添加ＤＭＥＭ培地）を重層させた。
ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２日間培養した後、１０％ホルマリンを加えて２時間～一晩固定し、２０％エタノールを含むゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で染色し、プラーク数を測定した。各条件２ウェルで試験を実施し、平均プラーク数を記録した。
その結果、ナットウキナーゼ及びε－ポリリジンとエタノールとを併用することで、抗マウスノロウイルス活性が増強されることが示された（表１８）。
【表18】
【0058】
＜実施例１０＞各ｐＨにおける抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値での評価）
ズブチリシンあるいはセリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε―ポリリジンを併用した場合の、各ｐＨにおける抗ネコカリシウイルス活性を確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表１９から２２で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように、それぞれ表中に記載のｐＨに調整済みのＰＢＳ（－）（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０～７．５、ｐＨ９．０）を用いて調製した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表１９から２２で示される濃度で試料を調製した。
実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、１０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
ズブチリシンを用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．２以上では３．１以上低下した（表２３）。また、プロチンＳＤ－ＡＹ１０を用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．６以上の低下を示し、ｐＨ７．１以上では２．１以上低下した（表２３）。さらに、ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰを用いた場合、ｐＨ７．２において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．３以上では２．６以上低下した（表２３）。また、ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰ、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－２０ＦＧ、プロチンＳＤ－ＡＹ１０又はアルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧを用いた場合、ｐＨ６．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は０．２～０．７の低下であり、いずれも抗ウイルス活性が低いものであり（表２４）、その一方で、ｐＨ９．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．７～４．０の低下であり、いずれも抗ウイルス活性が高いものであった（表２５）。さらに、Ｐ「アマノ」３ＳＤを用いた場合、ｐＨ７．２において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．８以上の低下を示し、ｐＨ７．３以上では２．３以上低下した（表２６）。加えて、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＰＬ－３０を用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．３以上の低下を示し、ｐＨ７．１以上では２．３以上低下した（表２６）。また、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｇを用いた場合、ｐＨ７．３において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．６以上の低下を示し、ｐＨ７．４以上では３．１以上低下した（表２６）。すなわち、ズブチリシンの場合、好ましくはｐＨ６．０以上、より好ましくはｐＨ７．０～１１．０、さらに好ましくは７．３～１０．３で効果的に使用でき、各種セリンプロテアーゼおよび各種セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤において、抗ウイルス活性に対するｐＨの至適領域が異なり、活性の強度も異なるため、適宜ｐＨを調整すること、用途に応じてセリンプロテアーゼ製剤を選定することが好ましいことが示された。
ズブチリシンあるいはセリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤とε―ポリリジンを併用した場合の、各ｐＨにおける抗ネコカリシウイルス活性を確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表１９から２２で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように、それぞれ表中に記載のｐＨに調整済みのＰＢＳ（－）（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０～７．５、ｐＨ９．０）を用いて調製した。
この試験は複数回行っており、それぞれ表１９から２２で示される濃度で試料を調製した。
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ 細胞培養用マイクロプレート ポリスチレン製 平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値を測定した。
ズブチリシンを用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．２以上では３．１以上低下した（表２３）。また、プロチンＳＤ－ＡＹ１０を用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．６以上の低下を示し、ｐＨ７．１以上では２．１以上低下した（表２３）。さらに、ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰを用いた場合、ｐＨ７．２において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．３以上では２．６以上低下した（表２３）。また、ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰ、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－２０ＦＧ、プロチンＳＤ－ＡＹ１０又はアルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧを用いた場合、ｐＨ６．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は０．２～０．７の低下であり、いずれも抗ウイルス活性が低いものであり（表２４）、その一方で、ｐＨ９．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は３．７～４．０の低下であり、いずれも抗ウイルス活性が高いものであった（表２５）。さらに、Ｐ「アマノ」３ＳＤを用いた場合、ｐＨ７．２において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．８以上の低下を示し、ｐＨ７．３以上では２．３以上低下した（表２６）。加えて、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＰＬ－３０を用いた場合、ｐＨ７．０において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．３以上の低下を示し、ｐＨ７．１以上では２．３以上低下した（表２６）。また、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｇを用いた場合、ｐＨ７．３において陰性対照と比較してｌｏｇ ＴＣＩＤ５０値は１．６以上の低下を示し、ｐＨ７．４以上では３．１以上低下した（表２６）。すなわち、ズブチリシンの場合、好ましくはｐＨ６．０以上、より好ましくはｐＨ７．０～１１．０、さらに好ましくは７．３～１０．３で効果的に使用でき、各種セリンプロテアーゼおよび各種セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤において、抗ウイルス活性に対するｐＨの至適領域が異なり、活性の強度も異なるため、適宜ｐＨを調整すること、用途に応じてセリンプロテアーゼ製剤を選定することが好ましいことが示された。
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明によれば、ノンエンベロープ型ウイルスに対して不活化効果を発揮し、かつ手指への適用や経口摂取も可能な安全性の高い、新規な抗ウイルス剤が提供されるため、非常に有用である。
【配列表】