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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-08
(45)【発行日】2023-08-17
(54)【発明の名称】化合物及び誘導体化試薬、並びに化合物の合成方法
(51)【国際特許分類】
C07D 249/12 20060101AFI20230809BHJP
【ＦＩ】
C07D249/12 508
C07D249/12 CSP
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021165742
(22)【出願日】2021-10-07
(65)【公開番号】P2022101457
(43)【公開日】2022-07-06
【審査請求日】2022-03-23
(31)【優先権主張番号】P 2020214897
(32)【優先日】2020-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000004271
【氏名又は名称】日本電子株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100112874
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 薫
(72)【発明者】
【氏名】東 達也
(72)【発明者】
【氏名】小川 祥二郎
(72)【発明者】
【氏名】滝脇 正貴
(72)【発明者】
【氏名】福沢 世傑
【審査官】早乙女 智美
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／０９９１０８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１０／０１９５６６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０２０／０２０８５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Ogawa, S. et al.，Comparative evaluation of new Cookson-type reagents for LC/ESI-MS/MSassay of 25-hydroxyvitamin D3 in neonatal blood samples，Biomedical Chromatography，2016年，30(6)，pp. 938-945
【文献】Ogawa, S. et al.，Enhancing analysis throughput, sensitivity and specificity inLC/ESI-MS/MS assay of plasma 25-hydroxyvitamin D3 by derivatization withtriplex 4-(4-dimethylaminophenyl)-1,2,4-triazoline-3,5-dione (DAPTAD)isotopologues，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2017年，136，pp. 126-133
【文献】Ogawa, S. et al.，A novel Cookson-type reagent for enhancingsensitivity and specificity in assessment of infant vitamin D status usingliquid chromatography/tandem mass spectrometry，RapidCommunications in Mass Spectrometry，2013年，27(21)，pp. 2453-2460
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の一般式（１００）で表される化合物。【化1】
【請求項2】
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【化2】
【請求項3】
下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬。
【化3】
【請求項4】
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、請求項３に記載の誘導体化試薬。
【化4】
【請求項5】
ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の式（Ｉ）で表される化合物の合成方法であって、
【化5】
前記ハロゲン化アリールが、ｐ－フルオロ安息香酸メチルである、
前記合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化合物及び誘導体化試薬、並びに化合物の合成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ビタミンＤ代謝物の定量においては、タンデム質量分析計（以下、「ＭＳ／ＭＳ」とも呼ぶ。）を備えた液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（以下、「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ」と称する場合がある。）を用いた分析が広く普及している。そして、イオン化効率およびクロマト分離については誘導体化試薬により誘導体化することにより改善されることが知られている。ここで用いられる誘導体化試薬は、１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン構造を有する。
【0003】
ビタミンＤ代謝物の誘導体化法については、例えば、４－[４－ジメチルアミノフェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＤＡＰＴＡＤ）が提案されている（非特許文献１を参照）。ビタミンＤ代謝物の誘導体化法は、ビタミンＤ代謝物（ビタミンＤを含めてもよい。）が有するジエン部分にディールス・アルダー反応をさせて、ビタミンＤ代謝物の誘導体を形成することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ. Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ. ２０１３, ２７, ２４５３－２４６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、非特許文献１で提案された技術では、ビタミンＤ代謝物の検出感度の更なる向上を図れないおそれがある。
【0006】
そこで、本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、ビタミンＤ代謝物の検出感度の更なる向上を実現することができる化合物、及びその化合物を含有する、ビタミンＤ代謝物を誘導体化するための誘導体化試薬、並びにその化合物の合成方法を提供することを第１の目的とする。
【0007】
そして、本発明においては、分析対象の範囲をビタミンＤ代謝物に限定されないで、分析対象の範囲を、ジエンを有する化合物まで拡げることができる。したがって、本発明は、ジエンを有する化合物の検出感度の更なる向上を実現することができる化合物及びその化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬、並びにその化合物の合成方法を提供することを第２の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上述の目的を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、ジエンを有する化合物（特には、ビタミンＤ代謝物が挙げられる。）の検出感度の更なる向上を実現することができる化合物及びその化合物を含有する、ジエンを有する化合物（特には、ビタミンＤ代謝物が挙げられる。）を誘導体化するための誘導体化試薬、並びにその化合物の合成方法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明では、第１の側面として、下記の一般式（１００）で表される化合物を提供する。
【化1】
【0010】
上記の一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0011】
本発明に係る第１の側面の化合物において、前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であってもよい。
【化2】
【0012】
また、本発明では、第２の側面として、下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬を提供する。
【化3】
【0013】
上記の一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0014】
本発明に係る第２の側面の誘導体化試薬において、前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であってもよい。
【化4】
【0015】
さらに、本発明では、第３の側面として、ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の一般式（１００）で表される化合物の合成方法を提供する。
【化5】
【0016】
上記の一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0017】
さらに、本発明に係る第３の側面の合成方法において、前記一般式（１００）で表され
る化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であってもよく、
前記飽和の複素環式アミン化合物が、ピペリジンであってもよい。
また、本発明は、
ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、前記式（Ｉ）で表される化合物の合成方法であって、
前記複素環式アミン化合物が、ピペリジンであり、
前記ハロゲン化アリールが、ｐ－フルオロ安息香酸メチルである、
前記合成方法も提供する。
る化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であってもよく、
前記飽和の複素環式アミン化合物が、ピペリジンであってもよい。
【化6】
ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、前記式（Ｉ）で表される化合物の合成方法であって、
前記複素環式アミン化合物が、ピペリジンであり、
前記ハロゲン化アリールが、ｐ－フルオロ安息香酸メチルである、
前記合成方法も提供する。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、ジエンを有する化合物（特には、ビタミンＤ代謝物が挙げられる。）の検出感度の更なる向上を実現することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【0021】
なお、説明は以下の順序で行う。
１．本発明の概要
２．第１の実施形態（化合物の例１）
３．第２の実施形態（誘導体化試薬の例）
４．第３の実施形態（化合物の合成方法の例）
５．第４の実施形態（化合物の例２）
６．実施例
６－１．実施例１
６－２．実施例２
６－３．分析結果
１．本発明の概要
２．第１の実施形態（化合物の例１）
３．第２の実施形態（誘導体化試薬の例）
４．第３の実施形態（化合物の合成方法の例）
５．第４の実施形態（化合物の例２）
６．実施例
６－１．実施例１
６－２．実施例２
６－３．分析結果
【0022】
＜１．本発明の概要＞
まず、本発明の概要について説明をする。本発明は、化合物及びジエンを有する化合物（特には、ビタミンＤ代謝物）を誘導体化するための誘導体化試薬、並びにその化合物の合成方法に関する。
まず、本発明の概要について説明をする。本発明は、化合物及びジエンを有する化合物（特には、ビタミンＤ代謝物）を誘導体化するための誘導体化試薬、並びにその化合物の合成方法に関する。
【0023】
従来技術では、生体内に微量存在する活性型ビタミンＤ（例えば、１,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、１,２５（ＯＨ）２Ｄ３）を検出定量するには抗体カラムを用いた濃縮が必要である（例えば、非特許文献Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０１７, ４７３, １７３－１７９.を参照。）。しかしながら、誘導体化試薬ＤＡＰＴＡＤでは、感度的に十分とは言えず、より精確な定量のためには、ＤＡＰＴＡＤよりも、更に高感度な誘導体化試薬の開発が望まれている。例えば、１,２５（ＯＨ）２Ｄ３はビタミンＤの生理作用の中心を占める重要な代謝物なので、その精確な定量は大きな需要がある。
【0024】
本発明は、以上の状況を鑑みてなされたものである。本発明は、臨床検査分野、なかでも質量分析を用いたビタミンＤ代謝物を高感度で検出するためのものであり、質量分析計製造のメーカーに関わらず、使用できるものである。今後、臨床検査分野において質量分析によるビタミンＤ代謝物の定量が広く普及するためにはいつでもどこでもどのメーカーの装置でも同じ値が出せることが必須であり、本発明は検出感度向上により、各メーカーの機種間差を埋めることで普及を支援するものである。
【0025】
以下、本発明を実施するための好適な形態について詳細に説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0026】
＜２．第１の実施形態（化合物の例１）＞
本発明に係る第１の実施形態（化合物の例１）の化合物は、下記の一般式（１００）で表される化合物（４－シクロアルキルアミノフェニル－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン）である。
本発明に係る第１の実施形態（化合物の例１）の化合物は、下記の一般式（１００）で表される化合物（４－シクロアルキルアミノフェニル－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン）である。
【0027】
【化7】
【0028】
一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0029】
一般式（１００）で表される化合物は、下記の式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。式（Ｉ）で表される化合物は、一般式（１００）で表される化合物において、ｎ＝５（６員環の飽和複素環）である化合物であり、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）である。
【0030】
【化8】
【0031】
＜３．第２の実施形態（誘導体化試薬の例）＞
本発明に係る第２の実施形態（誘導体化試薬の例）の誘導体化試薬は、下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬である。そして、下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する誘導体化試薬は、クックソン型誘導体化試薬である。
本発明に係る第２の実施形態（誘導体化試薬の例）の誘導体化試薬は、下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬である。そして、下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する誘導体化試薬は、クックソン型誘導体化試薬である。
【0032】
【化9】
【0033】
一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0034】
本発明に係る第２の実施形態の誘導体化試薬は、液体クロマトグラフィーが接続されたタンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による定量分析のために、ジエンを有する化合物、特には、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、及び爪などの生物検体中のビタミンＤ代謝物を誘導体化し、高感度で検出するための試薬である。このように、本発明により提供される誘導体化用試薬は、生物検体に含まれるジエンを有する化合物を誘導体化するために用いられてよい。前記生物検体は、上記で列挙されたものに限られず、生物（特には哺乳類、より特にはヒト）に含まれる液状成分又は固形状成分であってよい。
【0035】
そして、ジエンを有する化合物は、本発明に係る第２の実施形態の誘導体化試薬に含まれる一般式（１００）で表される化合物とディールス・アルダー反応により定量的に反応して誘導体化され、例えば、ＬＣ／ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）－ＭＳ／ＭＳによる定量分析においては、ジエンを有する化合物（例えば、ビタミンＤ代謝物）を高感度で、高選択的に検出することができる。
【0036】
一般式（１００）で表される化合物は、下記の式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。式（Ｉ）で表される化合物は、一般式（１００）で表される化合物において、ｎ＝５（６員環の飽和複素環構造）である化合物であり、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）である。
【0037】
【化10】
【0038】
以下に、誘導体化の対象となるジエンを有する化合物を、具体的に詳細に説明する。
【0039】
ジエンを有する化合物としては、例えば、ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物、ｓ－ｔｒａｎｓ－ジエンを有する化合物等が挙げられる。なお、ｓ－ｔｒａｎｓ－ジエンを有する化合物を、前述した一般式（１００）で表される化合物（例えば、ＰＩＰＴＡＤ）を含有する誘導体化試薬又は後述する一般式（１００－１）で表される化合物を含有する誘導体化試薬を用いて、誘導体化する場合、前熱処理をして、ｓ－ｔｒａｎｓ－ジエンを有する化合物を、ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物に異性化をする必要がある。
【0040】
次に、ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物の具体例について説明する。ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、ステロイド、ビタミンＤまたはビタミンＤ代謝物等が挙げられる。
【0041】
ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物のうち、ステロイドとしては、特に限定されないが、天然に存在する化合物に限られず、合成物やその類縁体であってもよく、例えば、７－デヒドロコレステロール、エルゴステロール、共役リノール酸、ビタミンＡ等が挙げられる。
【0042】
ｓ－ｃｉｓ－ジエンを有する化合物のうち、ビタミンＤは、広義の分類ではセコステロイドに属し、植物性食品に由来するビタミンＤ２と動物性食品や皮膚産生に由来するビタミンＤ３の総称である。両者は側鎖構造のみが異なる同族体であり、ヒトの体内では同様に代謝され、同等の生理活性を有すると考えられている。このため、本明細書においては、両者を区別せず、単にビタミンＤと表記する場合がある。また、本明細書において、ビタミンＤ及びビタミンＤ代謝物を単にビタミンＤとも表記する場合がある。これらは、天然若しくは合成により得られたビタミンＤ又はビタミンＤ代謝の中間体及び生成物等の、ビタミンＤの変換により生成したビタミンＤに関連するいずれかの分子種を意味する。
【0043】
そのようなビタミンＤ（ビタミンＤ代謝物）の分子種としては、特に限定されないが、例えば、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（２５（ＯＨ）Ｄ３）、２５－ヒドロキシビタミンＤ２（２５（ＯＨ）Ｄ２）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２（１，２５（ＯＨ）２Ｄ２）、２３，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（２３，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、２５，２６－ジヒドロキシビタミンＤ３（２５，２６（ＯＨ）２Ｄ３）、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、４β，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４β，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－２３，２６－ラクトン（２５（ＯＨ）Ｄ３Ｌａｃｔｏｎｅ）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３－２３，２６－ラクトン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３Ｌａｃｔｏｎｅ）等が挙げられる。ビタミンＤの分子種は、前記の分子種の異性体であってもよく、例えば、３－エピ－２５－ヒドロキシビタミンＤ３（３－エピ－２５（ＯＨ）Ｄ３）等が挙げられる。また、これらのビタミンＤの分子種は硫酸塩であってもよく、例えば、２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３β－硫酸塩（２５（ＯＨ）Ｄ３Ｓ）や２５－ヒドロキシビタミンＤ３－３β－グルクロン酸（２５（ＯＨ）Ｄ３Ｇｌｕｃ）等が挙げられる。なお、ビタミンＤの定量分析の際には、これらのビタミンＤ（ビタミンＤ代謝物）の分子種が複数種含まれていても構わない。
【0044】
例えば、２５（ＯＨ）Ｄ３と、ＰＩＰＴＡＤとの誘導体化反応の反応式は、以下のとおりである。
【0045】
【化11】
【0046】
工程Ｓ２００において、２５（ＯＨ）Ｄ３（１）のｓ－ｃｉｓ－ジエン部分にＰＩＰＴＡＤ（Ｉ）が付加して、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体（２）が形成される。２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体（２）は、アルキル基の電子供与効果で窒素原子の電子密度が高まるので、プロトンがより付加しやすくなり、イオン化がよりしやすい。
【0047】
＜４．第３の実施形態（化合物の合成方法の例）＞
本発明に係る第３の実施形態（化合物の合成方法の例）の化合物の合成方法は、ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の一般式（１００）で表される化合物の合成方法である。
本発明に係る第３の実施形態（化合物の合成方法の例）の化合物の合成方法は、ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の一般式（１００）で表される化合物の合成方法である。
【0048】
【化12】
【0049】
一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。
【0050】
一般式（１００）で表される化合物は、下記の式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。式（Ｉ）で表される化合物は、一般式（１００）で表される化合物において、ｎ＝５（６員環の飽和複素環）である化合物であり、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）である。
【0051】
式（Ｉ）で表される化合物の合成方法における求核置換反応では、飽和の複素環式アミン化合物は、ピペリジンが用いられる。そして、式（Ｉ）で表される化合物の合成方法における求核置換反応では、ハロゲン化アリールは、好適には、ｐ－フルオロ安息香酸メチルが用いられる。
【0052】
【化13】
【0053】
＜５．第４の実施形態（化合物の例２）＞
本発明に係る第４の実施形態（化合物の例２）の化合物は、下記の一般式（１００－１）で表される化合物である。
本発明に係る第４の実施形態（化合物の例２）の化合物は、下記の一般式（１００－１）で表される化合物である。
【0054】
【化14】
【0055】
一般式（１００－１）中、Ｘは、Ｎ（窒素）原子、Ｐ（リン）原子、Ｏ（酸素）原子又はＳ（硫黄）原子であり、一般式（１００－１）中、ｎは１以上の整数であり、ｎ１は１以上の整数である。
【0056】
一般式（１００－１）で表される化合物を含有する試薬は、本発明に係る第１の実施形態（化合物の例１）の化合物と同様に、ジエンを有する化合物を誘導体化することができる。ジエンを有する化合物の具体例は上記のとおりである。
【0057】
一般式（１００－１）で表される化合物の合成方法は、上述した、一般式（１００）で表される化合物の合成方法と同様に、ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含むことができる。
【0058】
＜６．実施例＞
以下に、実施例を挙げて、本発明の効果等について具体的に説明をする。なお、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
以下に、実施例を挙げて、本発明の効果等について具体的に説明をする。なお、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【0059】
＜６－１．実施例１＞
[４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））の合成]
下記のスキームに基づき、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））を合成した。
[４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））の合成]
下記のスキームに基づき、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））を合成した。
【0060】
【化15】
【0061】
１．４－（１－ピペリジニル)安息香酸メチル（ＩＩＩ）の合成［工程Ｓ１］
ｐ－フルオロ安息香酸メチル（ＩＩ）（２５６μＬ、２ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）と、ピペリジン（３１１μＬ、６．０ｍｍｏｌ）とを加え、１２時間加熱還流させた。反応液を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し，飽和食塩水（２５ｍＬ×２）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥し，溶媒を減圧留去後、４－（１－ピペリジニル)安息香酸メチル（ＩＩＩ）を無色固体（４０３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）として得た。
ｐ－フルオロ安息香酸メチル（ＩＩ）（２５６μＬ、２ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）と、ピペリジン（３１１μＬ、６．０ｍｍｏｌ）とを加え、１２時間加熱還流させた。反応液を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し，飽和食塩水（２５ｍＬ×２）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥し，溶媒を減圧留去後、４－（１－ピペリジニル)安息香酸メチル（ＩＩＩ）を無色固体（４０３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）として得た。
【0062】
２．４－（１－ピペリジニル)安息香酸（ＩＶ）の合成［工程Ｓ２］
４－（１－ピペリジニル)安息香酸メチル（ＩＩＩ）（３６０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）と、水酸化ナトリウム（１００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）とを５０％メタノール水溶液１０ｍＬを用いて、混合し、１００℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し，残渣を水２ｍＬで溶解させた。次いで、溶液を氷冷し、１０％塩酸を加えて酸性化させた。析出した、４－（１－ピペリジニル)安息香酸（ＩＶ）の無色粉末を冷水でよく洗浄しながら吸引ろ過して回収した（２９０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）。
４－（１－ピペリジニル)安息香酸メチル（ＩＩＩ）（３６０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）と、水酸化ナトリウム（１００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）とを５０％メタノール水溶液１０ｍＬを用いて、混合し、１００℃で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し，残渣を水２ｍＬで溶解させた。次いで、溶液を氷冷し、１０％塩酸を加えて酸性化させた。析出した、４－（１－ピペリジニル)安息香酸（ＩＶ）の無色粉末を冷水でよく洗浄しながら吸引ろ過して回収した（２９０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）。
【0063】
３．４－（１－ピペリジニル)安息香酸アジド（Ｖ）の合成［工程Ｓ３］
４－（１－ピペリジニル)安息香酸（ＩＶ）（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ） で溶解させ、ＤＰＰＡ（２６５μＬ、１．２ｍｍｏｌ)、及びトリエチルアミン（５００μＬ）を滴下し、氷冷下で１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（２５ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥し，溶媒を減圧留去後、残渣を、ワコーゲル(R)（登録商標）６０Ｎ（粒子径６３～２１２μｍ）を充填したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０×１２ｍｍ ｉ．ｄ．）に付した。ヘキサン－酢酸エチル（９：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し，４－（１－ピペリジニル)安息香酸アジド（Ｖ）を無色固体（１７０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）として得た。
４－（１－ピペリジニル)安息香酸（ＩＶ）（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ） で溶解させ、ＤＰＰＡ（２６５μＬ、１．２ｍｍｏｌ)、及びトリエチルアミン（５００μＬ）を滴下し、氷冷下で１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（２５ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥し，溶媒を減圧留去後、残渣を、ワコーゲル(R)（登録商標）６０Ｎ（粒子径６３～２１２μｍ）を充填したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５０×１２ｍｍ ｉ．ｄ．）に付した。ヘキサン－酢酸エチル（９：１、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去し，４－（１－ピペリジニル)安息香酸アジド（Ｖ）を無色固体（１７０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）として得た。
【0064】
４．４－（１-ピペリジニル)フェニルセミカルバジド（ＶＩＩ）の合成［工程Ｓ４及び工程Ｓ５］
４－（１－ピペリジニル)安息香酸アジド（Ｖ）（１７０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を、トルエン（２ｍＬ）に溶解させ、２０分間還流して、化合物（ＶＩ）に変換した［工程Ｓ４］。化合物（ＶＩ）を単離することなく、反応液にカルバジン酸エチル（１１０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌後，さらに１時間還流した。放冷後，生成した沈殿物を冷トルエンで洗浄しながら吸引ろ過し、４－（１-ピペリジニル)フェニルセミカルバジド（ＶＩＩ）を無色固体（２１０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）として得た。
４－（１－ピペリジニル)安息香酸アジド（Ｖ）（１７０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を、トルエン（２ｍＬ）に溶解させ、２０分間還流して、化合物（ＶＩ）に変換した［工程Ｓ４］。化合物（ＶＩ）を単離することなく、反応液にカルバジン酸エチル（１１０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のベンゼン溶液（１ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌後，さらに１時間還流した。放冷後，生成した沈殿物を冷トルエンで洗浄しながら吸引ろ過し、４－（１-ピペリジニル)フェニルセミカルバジド（ＶＩＩ）を無色固体（２１０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）として得た。
【0065】
５．４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリジン－３,５－ジオン(ＶＩＩＩ)の合成［工程Ｓ６］
４－（１－ピペリジニル)フェニルセミカルバジド（ＶＩＩ）（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に炭酸カリウム（９０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の水溶液（５ｍＬ）を加え、９０℃で、３時間撹拌した。ユニバーサルｐＨ試験紙で確認しながら反応液に酢酸を加え、そのｐＨを約６に調整した。溶媒を減圧留去後、残渣をワコーゲル(R)（登録商標）１００Ｃ１８（粒子径６３～２１２μｍ）を充填したＯＤＳカラムクロマトグラフィー（３００×１０ｍｍ ｉ．ｄ．）に付した。ＭｅＯＨ－水 （３：７、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去後，水により再結晶し、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－
１,２,４－トリアゾリジン－３,５－ジオン(ＶＩＩＩ)の無色固体（４８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を得た。
1H‐NMR (CD3OD) δ 7.24 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.20 (m, 4H), 1.70 (m, 4H), 1.61 (m, 2H) （図２）．
４－（１－ピペリジニル)フェニルセミカルバジド（ＶＩＩ）（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に炭酸カリウム（９０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の水溶液（５ｍＬ）を加え、９０℃で、３時間撹拌した。ユニバーサルｐＨ試験紙で確認しながら反応液に酢酸を加え、そのｐＨを約６に調整した。溶媒を減圧留去後、残渣をワコーゲル(R)（登録商標）１００Ｃ１８（粒子径６３～２１２μｍ）を充填したＯＤＳカラムクロマトグラフィー（３００×１０ｍｍ ｉ．ｄ．）に付した。ＭｅＯＨ－水 （３：７、ｖ／ｖ）溶出画分を集め、溶媒を減圧留去後，水により再結晶し、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－
１,２,４－トリアゾリジン－３,５－ジオン(ＶＩＩＩ)の無色固体（４８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を得た。
1H‐NMR (CD3OD) δ 7.24 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.20 (m, 4H), 1.70 (m, 4H), 1.61 (m, 2H) （図２）．
【0066】
６．４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５-ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）（Ｉ）の合成［工程Ｓ７］
４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリジン－３,５－ジオン(ＶＩＩＩ)（２ｍｇ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヨードベンゼンジアセテート（３ｍｇ）を加え室温で３時間撹拌した．反応液を遠心分離（１０００ｇ、１０ｍｉｎ）し、上清を、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５-ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）（Ｉ）の酢酸エチル溶液（２μｇ／１０μＬ）として保存した。なお、本溶液は－１８℃で保存した。
４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリジン－３,５－ジオン(ＶＩＩＩ)（２ｍｇ）を酢酸エチル（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヨードベンゼンジアセテート（３ｍｇ）を加え室温で３時間撹拌した．反応液を遠心分離（１０００ｇ、１０ｍｉｎ）し、上清を、４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５-ジオン（ＰＩＰＴＡＤ）（Ｉ）の酢酸エチル溶液（２μｇ／１０μＬ）として保存した。なお、本溶液は－１８℃で保存した。
【0067】
＜６－２．実施例２＞
[４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））によるビタミンＤ代謝物の分析]
濃縮乾固された、５成分のビタミンＤ代謝物（２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）のそれぞれに対し、ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ）の酢酸エチル溶液（２μｇ／１０μＬ）を１００μＬ加えて、室温で、３０分間静置した。エタノール２０μＬを添加することで反応停止後、窒素ガス吹付乾固した。５０％アセトニトリル溶液１００μＬで再溶解した後に、１０μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、分析した。
[４－[４－（１－ピペリジニル)フェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））（ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ））によるビタミンＤ代謝物の分析]
濃縮乾固された、５成分のビタミンＤ代謝物（２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）のそれぞれに対し、ＰＩＰＴＡＤ（Ｉ）の酢酸エチル溶液（２μｇ／１０μＬ）を１００μＬ加えて、室温で、３０分間静置した。エタノール２０μＬを添加することで反応停止後、窒素ガス吹付乾固した。５０％アセトニトリル溶液１００μＬで再溶解した後に、１０μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、分析した。
【0068】
なお、比較例としては、５成分のビタミンＤ代謝物（２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）のそれぞれに対し、ＤＡＰＴＡＤ（３）（４－[４－ジメチルアミノフェニル]－１,２,４－トリアゾリン－３,５－ジオン）の酢酸エチル溶液（２μｇ／１０μＬ）を用いた。
【0069】
例えば、２５（ＯＨ）Ｄ３と、ＤＡＰＴＡＤとの誘導体化反応の反応式は、以下のとおりである。
【0070】
【化16】
【0071】
工程Ｓ５００において、２５（ＯＨ）Ｄ３（１）のｓ－ｃｉｓ－ジエン部分にＤＡＰＴＡＤ（３）が付加して、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体（４）が形成される。
【0072】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、Ｘｅｖｏ ＴＱ－ＸＳ 三連四重極質量分析計に、日本ウォーターズ株式会社製、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉ-Ｃｌａｓｓ システムを接続して使用した。
【0073】
（ＬＣ分析条件）
分析カラムはＣ１８系であり、分析対象が、２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３である場合についての
ＬＣ分析条件は、下記の表１に示されたとおりであり、分析対象が、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３である場合についてのＬＣ分析条件は、下記の表２に示されたとおりである。
分析カラムはＣ１８系であり、分析対象が、２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３である場合についての
ＬＣ分析条件は、下記の表１に示されたとおりであり、分析対象が、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３である場合についてのＬＣ分析条件は、下記の表２に示されたとおりである。
【0074】
（ＭＳ／ＭＳ分析条件）
イオン化条件は、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）ポジティブであり、分析対象（上記５成分のビタミンＤ代謝物のＰＩＰＴＡＤ誘導体、及び上記５成分のビタミンＤ代謝物のＤＡＰＴＡＤ誘導体）、並びにＭＲＭパラメータは、下記の表３に示されたとおりである。
イオン化条件は、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）ポジティブであり、分析対象（上記５成分のビタミンＤ代謝物のＰＩＰＴＡＤ誘導体、及び上記５成分のビタミンＤ代謝物のＤＡＰＴＡＤ誘導体）、並びにＭＲＭパラメータは、下記の表３に示されたとおりである。
【0075】
なお、データの解析には、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標） ＭａｓｓＬｉｎｘ ４．１ソフトウェア内の自動処理システムであるＱｕａｎＬｉｎｘを用いた。
【0076】
【表1】
【0077】
【表2】
【0078】
【表3】
【0079】
＜６－３．分析結果＞
分析結果を図１に示す。図１の横軸は、左から順に、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、１,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体及び１,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体であり、縦軸はイオン強度である。
分析結果を図１に示す。図１の横軸は、左から順に、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体、１,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体及び１,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体であり、縦軸はイオン強度である。
【0080】
図１は、５成分のビタミンＤ代謝物（２５（ＯＨ）Ｄ３、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）のそれぞれについてのＰＩＰＴＡＤによる誘導体及びＤＡＰＴＡＤによる誘導体のイオン強度の比較（Ａｒｅａ比較）の結果を示す。
【0081】
図１に示されるように、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は８３４９４であり、２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は５０３８６であった。すなわち、２５（ＯＨ）Ｄ３について、ＰＩＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤに比べて約１．７倍の感度向上が達成された。
【0082】
図１に示されるように、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は１０８８７であり、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は６４８０であった。すなわち、３－ｅｐｉ（エピ）－２５（ＯＨ）Ｄ３について、ＰＩＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤに比べて約１．７倍の感度向上が達成された。
【0083】
図１に示されるように、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＰＩＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は１３７８６であり、２５（ＯＨ）Ｄ２－ＤＡＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は５８６８であった。すなわち、２５（ＯＨ）Ｄ２について、ＰＩＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤに比べて約２．３倍の感度向上が達成された。
【0084】
図１に示されるように、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は８５８６であり、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は６４４５であった。すなわち、２４,２５（ＯＨ）２Ｄ３について、ＰＩＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤに比べて約１．３倍の感度向上が達成された。
【0085】
図１に示されるように、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＰＩＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は６３７６．３であり、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体のイオン強度は２８７１であった。すなわち、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３について、ＰＩＰＴＡＤは、ＤＡＰＴＡＤに比べて約２．２倍の感度向上が達成された。
【0086】
ところで、本発明は、上記各実施形態及び上記各実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更することが可能である。
【0087】
また、本明細書に記載された効果はあくまでも例示であって限定されるものではなく、また他の効果があってもよい。
【0088】
また、本発明は、以下のような構成を取ることもできる。
[１]
下記の一般式（１００）で表される化合物。
（該一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。）
[２]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、[１]に記載の化合物。
[３]
下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬。
（該一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。）
[４]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、[３]に記載の誘導体化試薬。
[５]
ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の一般式（１００）で表される化合物の合成方法。
（該一般式（１００）中、ｎは２以上の整数である。）
[６]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であり、
前記複素環式アミン化合物が、ピペリジンである、[５]に記載の合成方法。
[１]
下記の一般式（１００）で表される化合物。
【化17】
[２]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、[１]に記載の化合物。
【化18】
下記の一般式（１００）で表される化合物を含有する、ジエンを有する化合物を誘導体化するための誘導体化試薬。
【化19】
[４]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物である、[３]に記載の誘導体化試薬。
【化20】
ハロゲン化アリールと、飽和の複素環式アミン化合物との求核置換反応を含む、下記の一般式（１００）で表される化合物の合成方法。
【化21】
[６]
前記一般式（１００）で表される化合物が、下記の式（Ｉ）で表される化合物であり、
前記複素環式アミン化合物が、ピペリジンである、[５]に記載の合成方法。
【化22】
【図1】
【図2】
