技術分野
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法に関する。本発明によれば、スクアレン又は３－デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインを効率的に合成することができる。
発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋
一方、スクアレン－ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３－デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている（非特許文献２～４）。
本発明者らは、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン－ホペン環化酵素をスクアレンに反応させることによって、３－デオキシアキレオールＡを得、さらにテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を反応させることによって、アンブレインの製造ができることを見出した（特許文献２)。
しかしながら、２段階目の反応である３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへ変換させる反応は副生成物が生じたり、スケールアップが困難等の課題があった。更に、特許文献２の方法は多段階反応であり、また収率についても改善の余地があった。
従って、本発明の目的は、簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋
本発明者らは、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、わずかな特定の変異を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを生成する活性を有することを見出した。本発明者らは、前記の変異に加えて、更なる変異を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを更に効率的に生成・・・ 続きを
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発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋
本発明の１つの態様の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によれば、変異型スクアレン－ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。また、微生物発酵により培養液に含まれる炭素源から効率的にアンブレインを合成することができる。
この特許の権利範囲[特許請求の範囲]
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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋
【図1】
変異型スクアレン－ホペン環化酵素及びテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を使用する、スクアレンを基質とした従来のアンブレイン合成経路（Ａ）並びに本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を使用する、３－デオキシアキレオールＡを基質としたアンブレイン合成経路（Ｂ）を示した図である。
【図2】
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いたスクアレンからアンブレインを生成する２つの経路を示した図である。
【図3】
Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）、Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体（実施例２）、Ｄ３７３Ｃ変異体（比較例１）、Ｙ１６７Ａ変異体（比較例２）、及びＬ５９６Ａ（比較例３）を用いて、スクアレンを基質としてアンブレインの生成効率を調べたグラフである。
【図4】
Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）、Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体（実施例２）、Ｄ３７３Ｃ変異体（比較例１）を用いて、スクアレンを基質として酵素反応させた際のアンブレイン及びその他反応生成物（副生成物）の比率を調べたグラフである。
【図5】
Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）を用いて、スクアレンを基質とし、基質濃度を変化させて、アンブレインの生産性を検討したグラフである。
【図6】
Ｌ５９６Ａ変異体（実施例５）、Ｌ５９６Ｆ変異体（実施例６）、野生型（比較例５）、Ｌ５９６Ｖ変異体（実施例７）、Ｌ５９６Ｐ変異体（比較例６）を用いて、３－デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインの生成効率を調べたグラフである。
【図7】
野生型（比較例５）、Ｌ５９６Ａ変異体（実施例５）を用いて、３－デオキシアキレオールＡを基質として酵素反応させた際のアンブレイン及びその他反応生成物（副生成物）の比率を調べたグラフである。
【図8】
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして１６７番目のチロシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして５９６番目のロイシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示した図である。
【図9】
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、５９６番目のロイシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、５９６番目のロイシンがフェニルアラニンに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、及び５９６番目のロイシンがバリンに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示した図である。
【図10】
バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス、及びバチルス・リケニフォルミスのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列、並びにアリシクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン－ホペン環化酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。
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