特許7336154血液組織関門インビトロモデル、及び薬物の血液組織関門移行性評価方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-23
(45)【発行日】2023-08-31
(54)【発明の名称】血液組織関門インビトロモデル、及び薬物の血液組織関門移行性評価方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20230824BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230824BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021552405
(86)(22)【出願日】2020-10-14
(86)【国際出願番号】 JP2020038721
(87)【国際公開番号】W WO2021075451
(87)【国際公開日】2021-04-22
【審査請求日】2022-02-25
(31)【優先権主張番号】P 2019190832
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(72)【発明者】
【氏名】竹澤 俊明
(72)【発明者】
【氏名】宇津 美秋
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－１１５２６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０５－５０３９２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－２３８６８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１６６９１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１７９３７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２９５５４７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２２５８３５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】組織培養研究，2012年，Vol.31, No.1，p.27 (OG-1-1)
【文献】次世代を担う創薬・医療薬理シンポジウム2019 プログラム・要旨集，2019年08月30日，p.45
【文献】第１３３回日本薬学会年会要旨集，2013年，p.99 (28pmC-109)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、
前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、
前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器由来細胞が由来する臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞であり、
前記臓器由来細胞は、脳由来細胞、又は肝臓由来細胞、或いはこれらのクローン化された細胞であり、前記臓器は、脳、又は肝臓である、血液組織関門インビトロモデル。
【請求項2】
前記培養液は、無血清培養液である、請求項１に記載の血液組織関門インビトロモデル。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の血液組織関門インビトロモデルを用いて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
【請求項4】
請求項１又は２に記載の血液組織関門インビトロモデルにおいて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液組織関門インビトロモデル、及び薬物の血液組織関門移行性評価方法に関する。
本願は、２０１９年１０月１８日に、日本に出願された特願２０１９－１９０８３２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年１０月１８日に、日本に出願された特願２０１９－１９０８３２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
創薬及び医療の分野では、血液脳関門、皮膚、肝類洞等のヒト正常組織の毛細血管や、癌や炎症等の病巣組織の毛細血管における化学物質の透過性を外挿できる血管内皮の培養モデルの開発が切望されてきた。
特に、血液脳関門については、多孔質膜上で血管内皮細胞を培養することで、様々な培養モデルが開発されてきた（例えば、特許文献１～４及び非特許文献１参照。）。
特に、血液脳関門については、多孔質膜上で血管内皮細胞を培養することで、様々な培養モデルが開発されてきた（例えば、特許文献１～４及び非特許文献１参照。）。
【0003】
バリア機能を有する血管内皮の培養モデルとして、特許文献１で脳微小血管の内皮細胞を多孔質の個体支持体上で、コンフルエント単層となるまで増殖させて構築した血液脳関門のインビトロモデルが提案されている。
特許文献２では、トランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と同ラット由来の不死化アストロサイト細胞株との共培養による血液脳関門再構築モデルが提案されている。
特許文献３では、脳毛細血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトの共培養系で構築した血液脳関門インビトロモデル、及び所定の病態条件に対応する培養液を利用して構築した病態血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
特許文献４では、血管内皮細胞、ペリサイト、及びアストロサイトの３種類の細胞層が、直接的な相互作用が可能な状態で層構造を形成することで、解剖学的構造をより正確に再現した血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
非特許文献１では、世界で初めて血液脳関門のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構築系モデルが開発されている。
特許文献２では、トランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と同ラット由来の不死化アストロサイト細胞株との共培養による血液脳関門再構築モデルが提案されている。
特許文献３では、脳毛細血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトの共培養系で構築した血液脳関門インビトロモデル、及び所定の病態条件に対応する培養液を利用して構築した病態血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
特許文献４では、血管内皮細胞、ペリサイト、及びアストロサイトの３種類の細胞層が、直接的な相互作用が可能な状態で層構造を形成することで、解剖学的構造をより正確に再現した血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
非特許文献１では、世界で初めて血液脳関門のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構築系モデルが開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第１９９１／０５０３８号
【文献】特開２００１－２３８６８１号公報
【文献】特許第５１１３３３２号公報
【文献】国際公開第２０１７／１７９３７５号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Cell Mol Neurobiol. 2007 Sep;27(6):687-94. Epub 2007 Sep 6. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells.Nakagawa S, Deli MA, Nakao S, Honda M, Hayashi K, Nakaoke R, Kataoka Y, Niwa M.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、上述した先行技術文献においては、（１）操作性が容易な培養モデルであること、（２）ヒト型の培養モデルであること、（３）化学物質の透過性試験までを行うにあたり、簡便な操作性と優れた再現性を有すること等が満足されていない技術的な課題を有するのみならず、ヒト型の様々な組織の血管内皮の培養モデルが開発されていないことから、これまでの培養モデルはいずれも製薬会社等で動物実験を代替して普及する段階には達していない。
【0007】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、容易に構築可能な、脳組織を含めヒト型の様々な組織の血液組織関門インビトロモデル、及び簡便かつ優れた再現性を有する当該血液組織関門インビトロモデルを利用した、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の態様を含む。
［１］コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
［２］前記培養液は、無血清培養液である、［１］に記載の血液組織関門インビトロモデル。
［３］コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、臓器由来細胞の馴化培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
［４］前記馴化培養液は、無血清培養液である、［３］に記載の血液組織関門インビトロモデル。
［５］［１］～［４］のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルを用いて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
［６］［１］～［４］のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルにおいて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
［１］コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
［２］前記培養液は、無血清培養液である、［１］に記載の血液組織関門インビトロモデル。
［３］コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、臓器由来細胞の馴化培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
［４］前記馴化培養液は、無血清培養液である、［３］に記載の血液組織関門インビトロモデル。
［５］［１］～［４］のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルを用いて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
［６］［１］～［４］のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルにおいて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、容易に構築可能な、脳組織を含めヒト型の様々な組織の血液組織関門インビトロモデル、及び簡便かつ優れた再現性を有する当該血液組織関門インビトロモデルを利用した、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００の概略図である。
【図2】実施形態の血液組織関門インビトロモデル１０１の概略図である。
【図3】実施例１における血管内皮培養モデルの作製工程を示す図である。
【図4】実施例１における血管内皮培養モデルにおける細胞の写真である。
【図5】実施例２における皮膚血管内皮培養モデルの経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【図6】実施例３における皮膚血管の「器官様プレート型」モデル由来の馴化培養液の効果の検討結果である。
【図7】実施例４における炎症皮膚血管内皮モデルの経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【図8】実施例５における炎症皮膚血管内皮培養モデルの蛍光物質の透過性評価結果である。
【図9】実施例６における組織特異的血管内皮培養モデルの経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【図10】（Ａ）実施例７におけるｈＣＭＥＣ／Ｄ３の親株（Ｐａｒｅｎｔ）及びクローン細胞株（クローンＡ）の写真である。（Ｂ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｐａｒｅｎｔ）の経内皮電気抵抗値の測定結果である。（Ｃ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（クローンＡ）の経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【図11】実施例７におけるヒスタミン添加後のｈＣＭＥＣ／Ｄ３（クローンＡ）の経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【図12】実施例７におけるヒスタミン添加後のｈＣＭＥＣ／Ｄ３（クローンＡ）の蛍光物質の透過性評価結果である。
【図13】（Ａ）実施例８における馴化培養液回収の説明図である。（Ｂ）実施例８における馴化培養液回収の説明図である。（Ｃ）馴化培養液を加えたＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルにおけるｄａｙ４の経内皮電気抵抗値の測定結果である。（Ｄ）馴化培養液を加えたＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルにおけるｄａｙ７の経内皮電気抵抗値の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【0012】
≪血液組織関門インビトロモデル≫
１実施形態において、本発明は、コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデルを提供する。
１実施形態において、本発明は、コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデルを提供する。
【0013】
図１は、第１実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００の概略図である。培養器１は、培養液２を収容しており、コラーゲンビトリゲル膜３を吊るすハンガー４によって、コラーゲンビトリゲル膜３を培養液２中に浸漬している。
コラーゲンビトリゲル膜３の上面には、ヒト血管内皮細胞５が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜３の下面には、臓器由来細胞６が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜３の多孔性により両細胞間のクロストークが可能となっている。
コラーゲンビトリゲル膜３の上面には、ヒト血管内皮細胞５が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜３の下面には、臓器由来細胞６が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜３の多孔性により両細胞間のクロストークが可能となっている。
【0014】
ヒト血管内皮細胞５は、増殖状態にあって未だ終末分化していない細胞であり、臓器由来細胞６に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である。例えば、臓器由来細胞６として、脳のアストロサイトを用いる場合、ヒト血管内皮細胞５は、血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞に分化する細胞である。
ヒト血管内皮細胞５としては、ヒト新生児包皮由来微小血管内皮細胞、各種ヒト幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、等）、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原が導入されたヒト脳微小血管内皮細胞株）等が挙げられる。
ヒト血管内皮細胞５としては、ヒト新生児包皮由来微小血管内皮細胞、各種ヒト幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、等）、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原が導入されたヒト脳微小血管内皮細胞株）等が挙げられる。
【0015】
従来のバリア機能を有する血液脳関門モデルは、血管内皮細胞とペリサイトとアストロサイト等の異種細胞との共培養系で構築されているため、容易に操作可能な培養モデルではなかった。
また、ヒト型の血液脳関門モデルを生産する方法としては、温度感受性ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原を含有するベクターを、ヒトの血液脳関門から単離培養した脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトに導入して作製する方法が報告されているが、培養の温度管理が容易ではなかった。
本実施形態においては、上述したヒト血管内皮細胞を用いることで容易に血液組織関門インビトロモデルを構築することができる。
また、ヒト型の血液脳関門モデルを生産する方法としては、温度感受性ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原を含有するベクターを、ヒトの血液脳関門から単離培養した脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトに導入して作製する方法が報告されているが、培養の温度管理が容易ではなかった。
本実施形態においては、上述したヒト血管内皮細胞を用いることで容易に血液組織関門インビトロモデルを構築することができる。
【0016】
本実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００は、脳組織を含めヒト型の様々な組織の血液組織関門インビトロモデルに適用可能である。適用可能な組織としては、血液脳関門、皮膚、肝類洞等が挙げられる。コラーゲンビトリゲル膜３に配置する臓器由来細胞６を変えることで、これらの血液組織関門インビトロモデルに対応可能である。対応する臓器由来細胞６としては、腎臓由来細胞、小腸等消化器官由来細胞、膀胱等泌尿器由来細胞、骨格筋由来細胞、心筋由来細胞、平滑筋由来細胞、脂肪由来細胞、肺由来細胞、膵臓由来細胞、副腎由来細胞、甲状腺由来細胞、皮膚由来細胞、脳由来細胞、又は肝臓由来細胞等が挙げられる。より具体的には、ヒト皮膚由来線維芽細胞、Ｃ６細胞（ラット神経グリア細胞腫瘍に由来する細胞株）、ＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳ細胞（ヒト肝がん細胞株）等が挙げられる。
【0017】
コラーゲンビトリゲル膜３において、「ビトリゲル」とは、従来のハイドロゲルを、ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に結合水を部分除去することで、ガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を進行させた後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルのことを指し、本発明者によって、「ビトリゲル（ｖｉｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）」と命名されている。
本明細書において、用語「ビトリゲル」を用いる際には、用語「（登録商標）」を省略して用いる場合がある。
また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示でき、ネイティブコラーゲンがさらに好ましい。
本明細書において、用語「ビトリゲル」を用いる際には、用語「（登録商標）」を省略して用いる場合がある。
また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示でき、ネイティブコラーゲンがさらに好ましい。
【0018】
培養器１が収容する培養液２としては、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられる。後述するように、本実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００を薬物の血液組織関門移行性評価方法に用いる場合には、評価対象の化合物のタンパク質への非特異的吸着回避の観点から無血清培養液が好ましい。
【0019】
図２は、第２実施形態の血液組織関門インビトロモデル１０１の概略図である。第１実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００と異なり、コラーゲンビトリゲル膜３の下面には、臓器由来細胞６は配置されず、培養液２の代わりに、馴化培養液２０が用いられている。
【0020】
馴化培養液２０としては、臓器由来細胞６を一定期間培養するのに用いられた培養液が挙げられる。また、第１実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００で用いられた培養液を本実施形態で用いてもよい。第１実施形態の血液組織関門インビトロモデル１００で用いられた培養液を用いる場合、血液組織関門インビトロモデル１００におけるハンガー内の培養液を血液組織関門インビトロモデル１０１におけるハンガー内にそのまま移し、血液組織関門インビトロモデル１００におけるハンガー外の培養液を血液組織関門インビトロモデル１０１におけるハンガー外にそのまま移してもよく、血液組織関門インビトロモデル１００におけるハンガー内の培養液を血液組織関門インビトロモデル１０１におけるハンガー外に移し、血液組織関門インビトロモデル１００におけるハンガー外の培養液を血液組織関門インビトロモデル１０１におけるハンガー内に移してもよく、血液組織関門インビトロモデル１００におけるハンガー内外の培養液を混ぜて血液組織関門インビトロモデル１０１に移してもよい。
馴化培養液２０を用いることで、コラーゲンビトリゲル膜３の下面に、臓器由来細胞６を配置する手間が省ける。また、後述するように、本実施形態の血液組織関門インビトロモデル１０１を、薬物の血液組織関門移行性評価方法に用いる場合には、評価対象の化合物の臓器由来細胞６への非特異的吸着を回避することができる。更に、評価対象の化合物のタンパク質への非特異的吸着回避の観点から、馴化培養液２０として、無血清培養液を用いることが好ましい。
馴化培養液２０を用いることで、コラーゲンビトリゲル膜３の下面に、臓器由来細胞６を配置する手間が省ける。また、後述するように、本実施形態の血液組織関門インビトロモデル１０１を、薬物の血液組織関門移行性評価方法に用いる場合には、評価対象の化合物の臓器由来細胞６への非特異的吸着を回避することができる。更に、評価対象の化合物のタンパク質への非特異的吸着回避の観点から、馴化培養液２０として、無血清培養液を用いることが好ましい。
【0021】
≪薬物の血液組織関門移行性評価方法≫
１実施形態において、本発明は、上記血液組織関門インビトロモデルを用いて、コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上記血液組織関門インビトロモデルを用いて、コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供する。
【0022】
係る方法において、血管の内腔側を外挿するコラーゲンビトリゲル膜の上方部から、組織側を外挿するコラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定することにより、所望する組織での作用を期待する薬物が、血液組織関門移行性を有するかを容易に判断することができる。また、係る方法を用いることで、血液組織関門自体に作用する薬物をスクリーニングすることもできる。
【0023】
また、１実施形態において、本発明は、上記血液組織関門インビトロモデルを用いて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供する。
上述した血液組織関門インビトロモデルにおいて、病態条件に対応する培養液を用いる、又は、疾患を患っている患者由来の細胞を用いる等により、病態のインビトロモデルを作製することができる。
そして、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデル、それぞれにおける薬物の組織移行性を検討することにより、病態組織選択的に移行する薬物をスクリーニングすることができる。
上述した血液組織関門インビトロモデルにおいて、病態条件に対応する培養液を用いる、又は、疾患を患っている患者由来の細胞を用いる等により、病態のインビトロモデルを作製することができる。
そして、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデル、それぞれにおける薬物の組織移行性を検討することにより、病態組織選択的に移行する薬物をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【0024】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0025】
［実施例１］ヒト新生児包皮由来微小血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ;ＨＭＶＥＣ）、及び同由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＤＦ）を用いた血管内皮培養モデルの作製
（１）予め培養したＨＤＦ(クラボウより購入、ＫＦ－４００９)を回収し、１．３×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＤＦの懸濁液を調製した。培養液は、１０％ウシ胎児血清(Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ)、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入、１１８８５－０８４)を用いた。
（２）次いで、オプションリング（関東化学株式会社より購入、０８３６９－９６）を装着したａｄ－ＭＥＤビトリゲル（登録商標）２（１２ウエル）、０８３６３－９６）のチャンバー裏面に、（１）で調製したＨＤＦの懸濁液を４．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．３ｍＬ加え、培養した（図３のｄａｙ－１参照。）。
（３）次いで、（２）の翌日（図３のｄａｙ０参照。）に予め培養したＨＭＶＥＣ(クラボウより購入、ＫＥ－４２０９)を回収し、１．４×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＭＶＥＣの懸濁液を調製した。培養液は、５％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＦＧＦ－ｂ、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１μｇ／ｍＬヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、１０ｍＭ Ｌ－グルタミン、１５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＶＥＧＦ、０．７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬヘパリン硫酸、３０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、１５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ含有ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ(Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入、ＬＭ－０００２)を用いた。
（４）次いで、（２）で用意したチャンバーを１２ウェルプレートにセットし、チャンバーの内側に（３）で調製したＨＭＶＥＣの懸濁液を７．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．５ｍＬ加えた。次いで、チャンバーの外側にＨＭＶＥＣの培養液を１．５ｍＬ加えた。
なお、図３に示すように、ＨＭＶＥＣとＨＤＦをインサート両面に培養したモデルを皮膚血管の「器官様プレート型」モデル、ＨＭＶＥＣ又はＨＤＦの１種類の細胞のみを培養したモデルを「組織シート型」モデルと定義する。
（５）次いで、位相差顕微鏡を用いて、ｄａｙ０、ｄａｙ２、ｄａｙ６に「器官様プレート型」モデル（図４の（Ａ）～（Ｃ）参照。）、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル（図４の（Ｄ）～（Ｆ）参照。）。ＨＤＦの「組織シート型」モデル（図４の（Ｇ）～（Ｉ）参照。）を観察した。
（１）予め培養したＨＤＦ(クラボウより購入、ＫＦ－４００９)を回収し、１．３×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＤＦの懸濁液を調製した。培養液は、１０％ウシ胎児血清(Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ)、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入、１１８８５－０８４)を用いた。
（２）次いで、オプションリング（関東化学株式会社より購入、０８３６９－９６）を装着したａｄ－ＭＥＤビトリゲル（登録商標）２（１２ウエル）、０８３６３－９６）のチャンバー裏面に、（１）で調製したＨＤＦの懸濁液を４．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．３ｍＬ加え、培養した（図３のｄａｙ－１参照。）。
（３）次いで、（２）の翌日（図３のｄａｙ０参照。）に予め培養したＨＭＶＥＣ(クラボウより購入、ＫＥ－４２０９)を回収し、１．４×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＭＶＥＣの懸濁液を調製した。培養液は、５％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＦＧＦ－ｂ、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１μｇ／ｍＬヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、１０ｍＭ Ｌ－グルタミン、１５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＶＥＧＦ、０．７５ｕｎｉｔｓ／ｍＬヘパリン硫酸、３０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、１５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ含有ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ(Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入、ＬＭ－０００２)を用いた。
（４）次いで、（２）で用意したチャンバーを１２ウェルプレートにセットし、チャンバーの内側に（３）で調製したＨＭＶＥＣの懸濁液を７．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．５ｍＬ加えた。次いで、チャンバーの外側にＨＭＶＥＣの培養液を１．５ｍＬ加えた。
なお、図３に示すように、ＨＭＶＥＣとＨＤＦをインサート両面に培養したモデルを皮膚血管の「器官様プレート型」モデル、ＨＭＶＥＣ又はＨＤＦの１種類の細胞のみを培養したモデルを「組織シート型」モデルと定義する。
（５）次いで、位相差顕微鏡を用いて、ｄａｙ０、ｄａｙ２、ｄａｙ６に「器官様プレート型」モデル（図４の（Ａ）～（Ｃ）参照。）、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル（図４の（Ｄ）～（Ｆ）参照。）。ＨＤＦの「組織シート型」モデル（図４の（Ｇ）～（Ｉ）参照。）を観察した。
【0026】
［実施例２］皮膚血管内皮培養モデルの経内皮電気抵抗(ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＴＥＥＲ)値の経時的変化の測定
（１）実施例１で作製した３種類のモデルのＴＥＥＲ値をｄａｙ０、ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、及びｄａｙ６に測定した。測定前に、各モデルのチャンバー内及びチャンバー外に入っている培養液を除去し、予め室温に戻しておいたＨＭＶＥＣの培養液をチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ｍＬ加えた。
（２）次いで、ＴＥＥＲ測定装置（関東化学株式会社より購入、４０２２５－９７）につないだ専用電極（関東化学株式会社より購入、１４１３６－９７）を各モデルのチャンバーにセットし、ＴＥＥＲ値を記録した。ネガティブコントロールであるＨＤＦの「組織シート型」モデルのＴＥＥＲ値は、ｄａｙ３が最大値(１１．６９±０．２７Ω・ｃｍ２)であった（図５参照。）。これに対し、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのｄａｙ３のＴＥＥＲ値は、２３．５３±０．４５Ω・ｃｍ２であった。一方、「器官様プレート型」モデルは、ｄａｙ１より高いＴＥＥＲ値を示し、ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、及びｄａｙ６のＴＥＥＲ値は、それぞれ、２２．６２±３．０６Ω・ｃｍ２、３１．５０±２．４６Ω・ｃｍ２、４２．６３±３．９４Ω・ｃｍ２、及び５７．２４±７．２９Ω・ｃｍ２であった。以上より、「器官様プレート型」モデルは、高い内皮バリア機能を有することが確認された。
（１）実施例１で作製した３種類のモデルのＴＥＥＲ値をｄａｙ０、ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、及びｄａｙ６に測定した。測定前に、各モデルのチャンバー内及びチャンバー外に入っている培養液を除去し、予め室温に戻しておいたＨＭＶＥＣの培養液をチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ｍＬ加えた。
（２）次いで、ＴＥＥＲ測定装置（関東化学株式会社より購入、４０２２５－９７）につないだ専用電極（関東化学株式会社より購入、１４１３６－９７）を各モデルのチャンバーにセットし、ＴＥＥＲ値を記録した。ネガティブコントロールであるＨＤＦの「組織シート型」モデルのＴＥＥＲ値は、ｄａｙ３が最大値(１１．６９±０．２７Ω・ｃｍ２)であった（図５参照。）。これに対し、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのｄａｙ３のＴＥＥＲ値は、２３．５３±０．４５Ω・ｃｍ２であった。一方、「器官様プレート型」モデルは、ｄａｙ１より高いＴＥＥＲ値を示し、ｄａｙ１、ｄａｙ２、ｄａｙ３、及びｄａｙ６のＴＥＥＲ値は、それぞれ、２２．６２±３．０６Ω・ｃｍ２、３１．５０±２．４６Ω・ｃｍ２、４２．６３±３．９４Ω・ｃｍ２、及び５７．２４±７．２９Ω・ｃｍ２であった。以上より、「器官様プレート型」モデルは、高い内皮バリア機能を有することが確認された。
【0027】
［実施例３］皮膚血管の「器官様プレート型」モデル由来の馴化培養液(ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ)の効果の検討
（１）実施例２で用いたｄａｙ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのチャンバー内、及び外の培養液を除去し、同じく実施例２で用いたｄａｙ６の「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外のＣＭを加えて２４時間培養した（図６（Ａ）参照）。
（２）次いで、ＴＥＥＲ値を測定したところ、培養液を加えたＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル (ＨＭＶＥＣ＋培養液) のＴＥＥＲ値は１４．５±１．５１Ω・ｃｍ２であったのに対し、ＣＭを加えた同モデル (ＨＭＶＥＣ＋ＣＭ) のＴＥＥＲ値は２７．０４±７．７７ Ω・ｃｍ２であり、統計学的に有意な差を認めた（**Ｐ＜０．０１、ｔ検定により検定）（図６（Ｂ）参照） 。以上より、「器官様プレート型」モデルのＣＭには内皮バリア機能を強化する作用があることが確認された。
（１）実施例２で用いたｄａｙ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのチャンバー内、及び外の培養液を除去し、同じく実施例２で用いたｄａｙ６の「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外のＣＭを加えて２４時間培養した（図６（Ａ）参照）。
（２）次いで、ＴＥＥＲ値を測定したところ、培養液を加えたＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル (ＨＭＶＥＣ＋培養液) のＴＥＥＲ値は１４．５±１．５１Ω・ｃｍ２であったのに対し、ＣＭを加えた同モデル (ＨＭＶＥＣ＋ＣＭ) のＴＥＥＲ値は２７．０４±７．７７ Ω・ｃｍ２であり、統計学的に有意な差を認めた（**Ｐ＜０．０１、ｔ検定により検定）（図６（Ｂ）参照） 。以上より、「器官様プレート型」モデルのＣＭには内皮バリア機能を強化する作用があることが確認された。
【0028】
［実施例４］炎症皮膚血管内皮モデルのＴＥＥＲ値の測定
（１）実施例２で用いたｄａｙ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル、及び「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいた添加剤を含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍをチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ｍＬ加えた。
（２）次いで、チャンバーに電極をセットし、ＴＥＥＲ値を測定した。この時の測定値を、測定開始時（０秒） の値とした。
（３）次いで、チャンバー内のＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを除去し、ヒスタミン二塩酸塩（東京化成工業株式会社より購入、Ｈ０１４６）を含有するＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを加えた。次いで、ＴＥＥＲ測定を開始し、１０秒ごとに１８０秒間ＴＥＥＲ値を連続測定した。「器官様プレート型」モデルでは測定開始時の値が約５０Ω・ｃｍ２であったのに対し、１ｎＭヒスタミンの添加により約３２Ω・ｃｍ２まで減少し、この変化はヒスタミンを加えていないコントロールと比較して統計学的に有意な変化であった（***Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）。さらに、１μＭ ヒスタミンの添加では約２３Ω・ｃｍ２まで減少したが、この変化はコントロールおよび１ｎＭヒスタミン添加の両方と比較して統計学的に有意な変化であった（***Ｐ＜０．００１、###Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）（図７（Ａ）参照）。一方、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルでは測定開始時の値が約５．７Ω・ｃｍ２であったのに対し、１００ μＭヒスタミンの添加で約３．２Ω・ｃｍ２まで減少したが、この変化はコントロールと比較して統計学的に有意な差ではなかった（二元配置分散分析により検定）（図７（Ｂ）参照）。以上より、「器官様プレート型」モデルは「組織シート型」モデルよりも低濃度のヒスタミンに濃度依存的に応答し、ＴＥＥＲ値の変化を統計学的な有意な差をもって検出できることが示された。
（１）実施例２で用いたｄａｙ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル、及び「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいた添加剤を含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍをチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ｍＬ加えた。
（２）次いで、チャンバーに電極をセットし、ＴＥＥＲ値を測定した。この時の測定値を、測定開始時（０秒） の値とした。
（３）次いで、チャンバー内のＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを除去し、ヒスタミン二塩酸塩（東京化成工業株式会社より購入、Ｈ０１４６）を含有するＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを加えた。次いで、ＴＥＥＲ測定を開始し、１０秒ごとに１８０秒間ＴＥＥＲ値を連続測定した。「器官様プレート型」モデルでは測定開始時の値が約５０Ω・ｃｍ２であったのに対し、１ｎＭヒスタミンの添加により約３２Ω・ｃｍ２まで減少し、この変化はヒスタミンを加えていないコントロールと比較して統計学的に有意な変化であった（***Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）。さらに、１μＭ ヒスタミンの添加では約２３Ω・ｃｍ２まで減少したが、この変化はコントロールおよび１ｎＭヒスタミン添加の両方と比較して統計学的に有意な変化であった（***Ｐ＜０．００１、###Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）（図７（Ａ）参照）。一方、ＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルでは測定開始時の値が約５．７Ω・ｃｍ２であったのに対し、１００ μＭヒスタミンの添加で約３．２Ω・ｃｍ２まで減少したが、この変化はコントロールと比較して統計学的に有意な差ではなかった（二元配置分散分析により検定）（図７（Ｂ）参照）。以上より、「器官様プレート型」モデルは「組織シート型」モデルよりも低濃度のヒスタミンに濃度依存的に応答し、ＴＥＥＲ値の変化を統計学的な有意な差をもって検出できることが示された。
【0029】
［実施例５］炎症皮膚血管内皮培養モデルの蛍光物質の透過性評価
（１）実施例２で用いたｄａｙ ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいたＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＨＢＳＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入、１４０２５－０９２) をチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ ｍＬ加えて２回洗浄した。
（２）次いで、ＨＢＳＳをチャンバー外に１．８ｍＬ、１００μＭヒスタミン含有ＨＢＳＳをチャンバー内に０．５ｍＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。
（３）次いで、 チャンバー内の溶液を除去し、１００μＭヒスタミン及び１０μｇ/ｍＬ Ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ (Ｕｒａｎｉｎｅ)（東京化成工業株式会社より購入、Ｆ００９６）又は５００μｇ/ｍＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｄｅｘｔｒａｎ (ＦＤ)－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入、ＦＤ４－１００ＭＧ）又は５００μｇ/ｍＬ ＦＤ－４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入、ＦＤ４０Ｓ－１００ＭＧ）を含有するＨＢＳＳをチャンバー内に０．５ｍＬ加え、室温で６０分間インキュベートした。
（４）次いで、チャンバー外の溶液１００μＬを９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓより購入）を用いて蛍光強度を測定した(λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍ) 。あわせて、各蛍光物質の希釈系列を用いて検量線を作製し、チャンバー外へ移行した蛍光物質の量を求めた。
（５）次いで、次式に基づいて各蛍光物質の見かけの透過係数Ｐａｐｐ（ｃｍ/ｓｅｃ） を求めた。
Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×１／Ａ×１／Ｃ０
ｄＱ／ｄｔ; 単位時間あたりの移行量(μｇ／ｓｅｃ)、Ａ; 表面積 (ｃｍ２)、Ｃ０; 各蛍光物質の初濃度
１００μＭヒスタミンの添加により、Ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（分子量３７６）、ＦＤ－４（分子量４，０００）、及びＦＤ－４０（分子量４０，０００）のいずれの分子のＰａｐｐも上昇した（図８（Ａ）－（Ｃ）参照）。特に、ＦＤ－４についてはＣｏｎｔｒｏｌのＰａｐｐが３．１５×１０－６±９．８３×１０－７ｃｍ／ｓｅｃであったのに対し、１００μＭヒスタミンの添加により約２倍の５．８８×１０－６±５．５２×１０－７ｃｍ／ｓｅｃまで上昇し、この変化は統計学的に有意な変化であった（*Ｐ＜０．０５、ｔ検定により検定）。以上より、皮膚血管の「器官様プレート型」モデルではヒスタミン誘発の炎症によって分子量４，０００程度の中分子の透過性が上昇することが確認された。
係る結果から、評価に用いた分子量の異なる上記３種の化合物は、病態組織選択的透過性がそれぞれ異なる化合物ということができる。即ち、本発明によれば、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、薬物の移行性を比較評価することにより、病態組織選択的に透過性を有する薬物をスクリーニングすることができる。
（１）実施例２で用いたｄａｙ ６のＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいたＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＨＢＳＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより購入、１４０２５－０９２) をチャンバー内に０．５ｍＬ、チャンバー外に１．５ ｍＬ加えて２回洗浄した。
（２）次いで、ＨＢＳＳをチャンバー外に１．８ｍＬ、１００μＭヒスタミン含有ＨＢＳＳをチャンバー内に０．５ｍＬ加え、室温で１０分間インキュベートした。
（３）次いで、 チャンバー内の溶液を除去し、１００μＭヒスタミン及び１０μｇ/ｍＬ Ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ (Ｕｒａｎｉｎｅ)（東京化成工業株式会社より購入、Ｆ００９６）又は５００μｇ/ｍＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｄｅｘｔｒａｎ (ＦＤ)－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入、ＦＤ４－１００ＭＧ）又は５００μｇ/ｍＬ ＦＤ－４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈより購入、ＦＤ４０Ｓ－１００ＭＧ）を含有するＨＢＳＳをチャンバー内に０．５ｍＬ加え、室温で６０分間インキュベートした。
（４）次いで、チャンバー外の溶液１００μＬを９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓより購入）を用いて蛍光強度を測定した(λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍ) 。あわせて、各蛍光物質の希釈系列を用いて検量線を作製し、チャンバー外へ移行した蛍光物質の量を求めた。
（５）次いで、次式に基づいて各蛍光物質の見かけの透過係数Ｐａｐｐ（ｃｍ/ｓｅｃ） を求めた。
Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×１／Ａ×１／Ｃ０
ｄＱ／ｄｔ; 単位時間あたりの移行量(μｇ／ｓｅｃ)、Ａ; 表面積 (ｃｍ２)、Ｃ０; 各蛍光物質の初濃度
１００μＭヒスタミンの添加により、Ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（分子量３７６）、ＦＤ－４（分子量４，０００）、及びＦＤ－４０（分子量４０，０００）のいずれの分子のＰａｐｐも上昇した（図８（Ａ）－（Ｃ）参照）。特に、ＦＤ－４についてはＣｏｎｔｒｏｌのＰａｐｐが３．１５×１０－６±９．８３×１０－７ｃｍ／ｓｅｃであったのに対し、１００μＭヒスタミンの添加により約２倍の５．８８×１０－６±５．５２×１０－７ｃｍ／ｓｅｃまで上昇し、この変化は統計学的に有意な変化であった（*Ｐ＜０．０５、ｔ検定により検定）。以上より、皮膚血管の「器官様プレート型」モデルではヒスタミン誘発の炎症によって分子量４，０００程度の中分子の透過性が上昇することが確認された。
係る結果から、評価に用いた分子量の異なる上記３種の化合物は、病態組織選択的透過性がそれぞれ異なる化合物ということができる。即ち、本発明によれば、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、薬物の移行性を比較評価することにより、病態組織選択的に透過性を有する薬物をスクリーニングすることができる。
【0030】
［実施例６］組織特異的血管内皮培養モデルの作製及びＴＥＥＲ値の測定
（１）実施例１で作製したＨＭＶＥＣとＨＤＦを用いた「器官様プレート型」モデルと同様の方法で、ＨＭＶＥＣとラットグリオーマ細胞株Ｃ６（理化学研究所バイオリソースセンターより提供、ＲＣＢ２８５４）又はＨＭＶＥＣと肝がん細胞株ＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳ（理化学研究所バイオリソースセンターより提供されたＨｅｐＧ２を馴化培養し再寄託した細胞株、ＲＣＢ４６７９）を用いた「器官様プレート型」モデルを作製した。Ｃ６とＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳの培養液は、１０％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ ｕｎｉｔｓ/ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ/ｍＬ ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭを用いた。
（２）次いで、実施例２と同様の方法で経時的なＴＥＥＲ値の変化を測定した。結果を図９に示す。皮膚由来のＨＤＦ（図９（Ａ）参照。）のみならず、脳由来のＣ６（図９（Ｂ）参照。）、肝臓由来のＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳ（図９（Ｃ）参照。）を用いても血管内皮培養モデルが作製できることが確認された。
（１）実施例１で作製したＨＭＶＥＣとＨＤＦを用いた「器官様プレート型」モデルと同様の方法で、ＨＭＶＥＣとラットグリオーマ細胞株Ｃ６（理化学研究所バイオリソースセンターより提供、ＲＣＢ２８５４）又はＨＭＶＥＣと肝がん細胞株ＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳ（理化学研究所バイオリソースセンターより提供されたＨｅｐＧ２を馴化培養し再寄託した細胞株、ＲＣＢ４６７９）を用いた「器官様プレート型」モデルを作製した。Ｃ６とＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳの培養液は、１０％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ ｕｎｉｔｓ/ｍＬ ペニシリン、１００ μｇ/ｍＬ ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭを用いた。
（２）次いで、実施例２と同様の方法で経時的なＴＥＥＲ値の変化を測定した。結果を図９に示す。皮膚由来のＨＤＦ（図９（Ａ）参照。）のみならず、脳由来のＣ６（図９（Ｂ）参照。）、肝臓由来のＨｅｐＧ２－ＮＩＡＳ（図９（Ｃ）参照。）を用いても血管内皮培養モデルが作製できることが確認された。
【0031】
［実施例７］ｈＣＭＥＣ／Ｄ３クローン細胞株の作製及びＴＥＥＲ値の測定
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３は、増殖能が高く汎用されているヒト血管内皮細胞株であるが、内皮バリア機能が低いため血液組織関門モデルの構築には不適である。そこで、本細胞から内皮バリア機能を有するクローン細胞株を選別し、その炎症応答性を確認した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３は、増殖能が高く汎用されているヒト血管内皮細胞株であるが、内皮バリア機能が低いため血液組織関門モデルの構築には不適である。そこで、本細胞から内皮バリア機能を有するクローン細胞株を選別し、その炎症応答性を確認した。
【0032】
Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入し、培養を開始したｈＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｐａｒｅｎｔ）をコラーゲンビトリゲル膜チャンバー内で培養し、経時的にＴＥＥＲ値を測定すると、７日間培養しても５Ω・ｃｍ２未満であったことから、本細胞は、内皮バリア機能がほとんどないことが示唆された（図１０（Ａ）及び（Ｂ）参照。）。そこで、本細胞を限界希釈法によりクローニングしたところ、内皮バリア機能を有するクローンＡを得ることができた（図１０（Ａ）及び（Ｃ）参照。）。
【0033】
クローンＡをコラーゲンビトリゲル膜チャンバー内で１０日間培養し、チャンバー内にヒスタミン（Ｈｉｓ）１００μＭを加えて１分おきにＴＥＥＲ値を測定したところ、測定開始時の値に対し、ヒスタミン添加１５分後には約７０％減少した（図１１参照。）。この変化はＣｏｎｔｒｏｌと比較して統計学的に有意な変化であった（***Ｐ＜０．００１二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）。一方、ヒスタミン受容体の下流因子であるＲＯＣＫの阻害薬であるＹ－２７６３２で前処理すると、ヒスタミンによるＴＥＥＲ値の減少が有意に抑制されたことから（###Ｐ＜０．００１、二元配置分散分析の後Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）、クローンＡはヒスタミン応答性に優れた細胞株であることが示唆された（図１１参照。）。
【0034】
クローンＡをコラーゲンビトリゲル膜チャンバー内で１６日間培養し、チャンバー内にヒスタミン（Ｈｉｓ）１００μＭ、及び４種類の蛍光物質（Ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＤ－４、ＦＤ－１０、及びＦＤ－４０）を加えて１時間インキュベートし、チャンバー外へ移行した蛍光物質量を測定した。この結果、ヒスタミンによってＦＤ－４（分子量４，０００）及びＦＤ－１０（分子量１０，０００）の透過性のみが亢進した（図１２参照。）。特にＦＤ－１０の透過性の亢進は統計学的に有意な変化であった（*Ｐ＜０．０５、ｔ検定により検定）。よって、クローンＡにおいてヒスタミンが誘発する血管透過性の亢進には分子サイズ選択性があることが示唆された。
これらの結果、生理的な濃度のヒスタミンによる内皮バリア機能変化を定量的に評価することができたことから、本クローン細胞株は、薬物の組織移行性評価モデルの構築に適していると考えられる。
これらの結果、生理的な濃度のヒスタミンによる内皮バリア機能変化を定量的に評価することができたことから、本クローン細胞株は、薬物の組織移行性評価モデルの構築に適していると考えられる。
【0035】
［実施例８］ＨＤＦの「組織シート型」モデル由来のＣＭの効果の検討
（１）予め培養したＨＤＦを回収し、８．０×１０４細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＤＦの懸濁液を調製した。培養液は、５％ ＦＢＳ、５ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＦＧＦ－ｂ、５０μｇ/ｍＬ アスコルビン酸、１μｇ/ｍＬ ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、１０ ｍＭ Ｌ－グルタミン、１５ ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＩＧＦ－１、５ｎｇ/ｍＬ組み換えヒトＥＧＦ、５ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＶＥＧＦ、０．７５ｕｎｉｔｓ/ｍＬ ヘパリン硫酸、３０ｍｇ/ｍＬ ゲンタマイシン、１５μｇ/ｍＬ アムホテリシンＢ含有ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを用いた。
（１）予め培養したＨＤＦを回収し、８．０×１０４細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＤＦの懸濁液を調製した。培養液は、５％ ＦＢＳ、５ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＦＧＦ－ｂ、５０μｇ/ｍＬ アスコルビン酸、１μｇ/ｍＬ ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、１０ ｍＭ Ｌ－グルタミン、１５ ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＩＧＦ－１、５ｎｇ/ｍＬ組み換えヒトＥＧＦ、５ｎｇ/ｍＬ 組み換えヒトＶＥＧＦ、０．７５ｕｎｉｔｓ/ｍＬ ヘパリン硫酸、３０ｍｇ/ｍＬ ゲンタマイシン、１５μｇ/ｍＬ アムホテリシンＢ含有ＶａｓｃｕＬｉｆｅ（登録商標）Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを用いた。
【0036】
（２）次いで、１２穴プレートに設置したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーの外側に１．５ｍＬの培養液を注入し、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー内に（１）で調製したＨＤＦの懸濁液を４．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．５ｍＬ加えて６日間培養した。この間、毎日培養液を交換した。培養４日目、５日目、及び６日目のチャンバー内及び外のＣＭを回収して混合した(図１３（Ａ）参照。)。
【0037】
（３）次いで、予め培養したＨＤＦを回収し、１．３×１０５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨＤＦの懸濁液を調製した。
（４）また、オプションリングを装着したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーのチャンバー裏面に、（３）で調製したＨＤＦの懸濁液を４．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．３ｍＬ加えて培養した。細胞が接着した２時間後にオプションリングを外して１２穴プレートに設置し、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの外側に１．５ｍＬ、内側に０．５ｍＬの培養液を注入して６日間培養した。この間、毎日培養液を交換した。培養４日目、５日目、及び６日目のチャンバー内及び外のＣＭを回収して混合した（図１３（Ｂ）参照。）。
（４）また、オプションリングを装着したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーのチャンバー裏面に、（３）で調製したＨＤＦの懸濁液を４．０×１０４細胞／ｃｍ２となるように０．３ｍＬ加えて培養した。細胞が接着した２時間後にオプションリングを外して１２穴プレートに設置し、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの外側に１．５ｍＬ、内側に０．５ｍＬの培養液を注入して６日間培養した。この間、毎日培養液を交換した。培養４日目、５日目、及び６日目のチャンバー内及び外のＣＭを回収して混合した（図１３（Ｂ）参照。）。
【0038】
（５）次いで、実施例１で作製したＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデルのチャンバー内及び外に、回収したＣＭ(ＨＤＦ－ＣＭ ｉｎ及びＨＤＦ－ＣＭ ｏｕｔ)又は培養液をｄａｙ０からｄａｙ７まで添加し、ｄａｙ４及びｄａｙ７においてＴＥＥＲ値を測定した。培養液を加えたＨＭＶＥＣの「組織シート型」モデル（ＨＭＶＥＣ＋培養液) のＴＥＥＲ値はｄａｙ４（図１３（Ｃ）参照。）及びｄａｙ７（図１３（Ｄ）参照。）においてそれぞれ１８．０±１．４１Ω・ｃｍ２及び１７．６±３．１７Ω・ｃｍ２であった。これに対し、ＨＤＦ－ＣＭ ｉｎを加えた同モデル（ＨＭＶＥＣ＋（ＨＤＦ－ＣＭ ｉｎ））のＴＥＥＲ値は、ｄａｙ４及びｄａｙ７において、それぞれ３３．５±１．０１Ω・ｃｍ２及び３３．０±２．６７Ω・ｃｍ２あった。またＨＤＦ－ＣＭ ｏｕｔを加えた同モデル(ＨＭＶＥＣ＋（ＨＤＦ－ＣＭ ｏｕｔ）)のＴＥＥＲ値は、ｄａｙ４及びｄａｙ７においてそれぞれ３３．９±３．６８Ω・ｃｍ２及び３２．７±２．１９Ω・ｃｍ２であった。ＨＤＦ－ＣＭ ｉｎ及びＨＤＦ－ＣＭ ｏｕｔを加えた時のＴＥＥＲ値は、ｄａｙ４及びｄａｙ７のいずれにおいても培養液を加えた時と比較して統計学的に有意に高い値であった（**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法により検定）。以上の結果を実施例３と比較すると、「器官様プレート型」モデルのＣＭよりもＨＤＦの「組織シート型」モデルのＣＭの方が内皮バリア機能を強化する作用が強いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【0039】
本発明によれば、容易に構築可能な、脳組織を含めヒト型の様々な組織の血液組織関門インビトロモデル、及び簡便かつ優れた再現性を有する当該血液組織関門インビトロモデルを利用した、組織特異的な血管透過性化学物質の評価方法を提供することができる。
【符号の説明】
【0040】
１００，１０１…血液組織関門インビトロモデル、１…培養器、２…培養液、３…コラーゲンビトリゲル膜、４…ハンガー、５…ヒト血管内皮細胞、６…臓器由来細胞。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】