ホーム > 特許ランキング > 一丸ファルコス株式会社
▶ 一丸ファルコス株式会社の特許一覧 ▶ 国立大学法人広島大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-28
(45)【発行日】2023-09-05
(54)【発明の名称】癌転移抑制用のＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチド
(51)【国際特許分類】
A61K 38/10 20060101AFI20230829BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230829BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20230829BHJP
【ＦＩ】
A61K38/10
A61P35/04
A61P43/00 111
C07K7/08 ZNA
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2023528145
(86)(22)【出願日】2022-12-26
(86)【国際出願番号】 JP2022047969
【審査請求日】2023-05-10
(31)【優先権主張番号】P 2022027791
(32)【優先日】2022-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年３月５日、日本薬学会第１４１年会Ｗｅｂ要旨集（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ－ｉｍｇ／ｐｈａｒｍ１４１／２８ＰＣ２＿０２－０９／ｐｕｂｌｉｃ／ｐｄｆ？ｔｙｐｅ＝ｉｎ）で発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年３月２８日、日本薬学会第１４１年会（オンライン学会）で発表
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000119472
【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100110973
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 洋
(74)【代理人】
【識別番号】110002697
【氏名又は名称】めぶき弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100116528
【弁理士】
【氏名又は名称】三宅 俊男
(72)【発明者】
【氏名】吾郷 由希夫
(72)【発明者】
【氏名】浅野 智志
(72)【発明者】
【氏名】坂元 孝太郎
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２１／２００２５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】浅野 智志, 吾郷 由希夫，神経ペプチドVIP-VPAC2 受容体シグナルは，がん細胞遊走を制御する新規の分子機構である，J Oral Biosci.，2021年，Suppl.，p.282, 3-P1-P77
【文献】SAKAMOTO K. et al.，Generation of KS-133 as a novel bicyclic peptide with a potent and selective VIPR2 antagonist activity that counteracts cognitive decline in a mouse model of psychiatric disorders，Front Pharmacol.，2021年，12，Article 751587, pp.1-15
【文献】LEE Y. et al.，Up-regulation of PI3K/Akt signaling by 17β-estradiol through activation of estrogen receptor-α, but not estrogen receptor-β, and stimulates cell growth in breast cancer cells，Biochemical and Biophysical Research Communications，2005年，336，pp. 1221-1226
【文献】河原崎 哲, 他5名，癌抑制遺伝子PTENの機能解析，Biotherapy，2004年，18(2)，pp.151-160
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）：ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システインを表し、
Ｘ３は、プロリン又はセリンを表し、
Ｘ７は、リジンを表し、
Ｘ８は、チロシンを表し、
Ｘ１１が、アスパラギン酸を表し
Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、
Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基がアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基がアミド化されている。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌転移抑制のための組成物。
【請求項2】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の活性化された癌細胞を含む対象を治療するための請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記癌細胞内におけるＡＫＴのリン酸化を抑制する請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【0001】
本出願は、２０２２年２月２５日に日本で出願された日本国特許出願第２０２２－０２７７９１号の優先権を主張し、その全体が参照によりここに明示的に組み込まれるものとする。
【技術分野】
【0002】
本発明は癌転移抑制のための組成物に関し、より詳細には、癌転移抑制のためのＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
細胞の遊走は、進化的に保存されたメカニズムであり、胚発生、免疫、血管新生、創傷治癒といった正常なプロセスだけでなく、癌の転移などの病原性のプロセスにおいても役割を果たしている。細胞の遊走は、細胞内のアクチン線維の局在によって制御され、細胞の前縁部にラメリポディア（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）と呼ばれる突出した構造（突起）が形成される。成長因子、サイトカイン、ケモカインなどによる細胞外刺激は、ラメリポディアの形成を誘導する。例えば、ケモカインとその受容体であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を介したシグナル伝達の場合、ＧＴＰに結合したＧαｉがＳＲＫ様キナーゼを直接活性化し、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナルをアップレギュレートする。活性化されたＰＩ３Ｋは，ホスファチジルイノシトール４，５－二リン酸［ＰＩ（４，５）Ｐ２］をホスファチジルイノシトール３，４，５－三リン酸［ＰＩ（３，４，５）Ｐ３］に変換する。ＰＩ（３，４，５）Ｐ３は、ＡＫＴのリン酸化を促進すると共に、ＷＡＳＰファミリーのｖｅｒｐｒｏｌｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＷＡＶＥ２）の細胞膜への移動を促進し、ＧＥＦ－Ｒａｃを介したアクチンフィラメントのリモデリングを制御することで、ラメリポディアの形成を促進する。実際に、ＰＩ３Ｋの機能獲得変異（すなわち、ＰＩ３Ｋのｐ１１０触媒サブユニットの変異）は、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３シグナル伝達経路を増強し、乳癌などで頻繁に見られる。活性化されたＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路は、癌細胞の成長と運動性を誘導し、その結果、癌細胞の移動と浸潤が促進される。
【0004】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）と近縁の神経ペプチドである血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、中枢及び末梢神経系に広く発現している。その受容体であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）：ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２（ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２とも呼ばれる）は、脳に広く発現しているが、心血管系、腎系、消化器系、免疫系、内分泌系、生殖器系などの多数の末梢標的臓器にも発現している。ＶＩＰと腫瘍の増殖との関係については多くの報告がある。注目すべきは、卵巣上皮腫瘍、膠芽腫、浸潤性乳癌などのいくつかの種類の癌において、ＶＩＰＲ２ ｍＲＮＡの発現及び／又はＶＩＰＲ２遺伝子のコピー数の増加が報告されていることである。しかし、癌におけるＶＩＰＲ２の病態生理学的な役割などについては、まだほとんど分かっていない。
【0005】
一方、本発明者らは、新規なＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチド群を見出し、これらについて開示している（非特許文献１及び特許文献１参照）。その中の代表的な二環性ペプチドであるＫＳ－１３３（非特許文献２に開示。後述する実施例ではＳｅｑ－１０（配列番号２）と称する。）は、精神疾患モデルマウスにおける認知機能の低下を抑制することも報告している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（２０１８），５０３：１９７３－１９７９．
【文献】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０２１），１２：７５１５８７
【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５５２（２０２１）１０６－１１３
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開ＷＯ２０２１／２００２５９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明が解決しようとする課題は、例えば、癌細胞の遊走に影響を及ぼすＶＩＰＲ２シグナルの役割とそのメカニズムを調べることにより、癌転移抑制手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、ＶＩＰ－ＶＩＰＲ２シグナルが、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３の合成を介してＷＡＶＥ２によるラメリポディア形成のためのアクチンの局在と伸長を制御することにより、インビトロ及びインビボでの癌細胞の遊走を制御していることの発見に基づき、創作された。すなわち、本発明はＶＩＰＲ２の機能を阻害することにより癌転移を抑制する手段を提供するものであり、具体的には以下の実施形態を含む。
【0010】
式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌転移抑制のための組成物。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌転移抑制のための組成物。
【0011】
上記式（Ｉ）の環状ペプチドにおいて、Ｘ１が、システインを表し、Ｘ３が、プロリン又はセリンを表し、Ｘ７が、リジンを表し、Ｘ８が、チロシンを表し、Ｘ１１が、アスパラギン酸を表し、Ｘ１２及びＸ１３が、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｎ末端アミノ基がアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基がアミド化されていることが好ましい。
【0012】
当該組成物は、例えば、ＶＩＰＲ２を介して、ＡＫＴやＷＡＶＥ２といったＰＩ３Ｋ下流のシグナル伝達経路が活性化された癌細胞を含む対象を治療するために用いることもでき、ＶＩＰＲ２を介しての癌細胞内におけるＡＫＴのリン酸化を抑制するために用いることもできる。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係る環状ペプチドを含む組成物は、例えば、ＶＩＰＲ２の機能を阻害することにより、癌転移を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図9】図９は、ＶＩＰＲ２を過剰発現したＭＣＦ－７細胞において、ＶＩＰＲ２アンタゴニストであるＫＳ－１３３を添加したとき（ＫＳ－１３３群）又はＫＳ－１３３を添加しなかったとき（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）の細胞増殖効果を確認した結果である。当該確認は、各群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群、ＫＳ－１３３）Ｎ＝４で行った。グラフの数値（各群の平均値）を、表３に示す。データは平均値±ＳＤで示した。Ｄａｙ０と比べて、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１を示す（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。ＶＩＰＲ２を過剰発現したＭＣＦ－７細胞では、ＫＳ－１３３の添加によって、培養２日目以降から細胞増殖が著しく抑制された。一方、コントロール群では、経日的な細胞増殖が確認された。
【発明を実施するための形態】
【0015】
次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【0016】
（定義）
本明細書においてペプチドは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）で結合しているものを指し、例えば２～２０アミノ酸がアミド結合したものとすることができる。また、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。ペプチド結合を形成するカルボニル基に隣接する１番目の炭素原子をＣα炭素と称する。
本明細書においてペプチドは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）で結合しているものを指し、例えば２～２０アミノ酸がアミド結合したものとすることができる。また、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。ペプチド結合を形成するカルボニル基に隣接する１番目の炭素原子をＣα炭素と称する。
【0017】
本明細書において「任意のアミノ酸、又はその誘導体」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、非天然構造を有する人工のアミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物、さらに官能基を有するカルボン酸も含む。非天然アミノ酸の例として、Ｄ体アミノ酸、主鎖の構造が天然型と異なるα／α－二置換アミノ酸（２－アミノイソ酪酸といったα－メチル化アミノ酸など）、Ｎ－アルキル－アミノ酸（Ｎ－メチル化アミノ酸など）、Ｎ－置換グリシン（ペプトイド）、主鎖が伸長しているアミノ酸（βホモアミノ酸やγホモアミノ酸）、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（シクロヘキシルアラニンやアリルグリシンや２－（２－ピリジル）－グリシンや３－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－アラニンなど）、側鎖の一部が置換されているアミノ酸（ノルロイシンやジアミノプロパン酸や３－（２－ピリジル）－アラニンなど）、側鎖に余分の官能基を有するアミノ酸；側鎖に余分のＣやアルキル基やメチル基を有するアミノ酸（ホモノルロイシンやγ－メチルロイシンなど）、側鎖にハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を有するアミノ酸（３－クロロ－アラニンなど）、側鎖にハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を有するカルボン酸（３－クロロプロパン酸など）、側鎖に官能基を有するカルボン酸（３－ブテン酸など）、側鎖に余分のＮやアミノ基を有するアミノ酸（β－アジドアラニンやオルニチンなど）、側鎖に余分のＯやメトキシ基を有するアミノ酸（Ｏ－メチル－セリンやＯ－メチル－スレオニンなど）、側鎖に余分のヒドロキシ基を有するアミノ酸（３－ヒドロキシ－フェニルアラニンなど）、側鎖に余分のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸（３－カルボキシ－フェニルアラニンなど）、側鎖に余分のＳを有するアミノ酸（エチオニンなど）、側鎖中のカルボン酸官能基がエステルで保護されているアミノ酸（アスパラギン酸－４－メチルエステルなど）、側鎖のチオ基（－Ｓ－）が酸化されてスルフィニル基（－Ｓ（＝Ｏ）－）やスルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）に変換されているアミノ酸（メチオニンスルホキシド）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0018】
本明細書において、「ＶＩＰＲ２」はマウス、ラット、イヌ、サル、ヒトなどの哺乳類のタンパク質、「血管作動性腸管ペプチド受容体２」を意味する。
【0019】
本明細書において、「癌転移抑制」は、例えば、原発性の腫瘍が未だ転移していない場合における腫瘍の転移を抑制すること、又は既に腫瘍が転移している場合におけるさらなる腫瘍の転移を抑制することの何れか又は両方を意味する。癌細胞の転移は、癌細胞が発生した場所（原発巣）から移動して、遠隔部位に再び腫瘍を形成することをいう。そのメカニズムは種々の研究報告があるが、例えば、癌細胞の１）原発巣での増殖、２）原発巣からの癌細胞の離脱と脈管（血管やリンパ管）への浸潤、３）脈管内での移動、４）転移臓器の血管内皮への接着、５）転移臓器への浸潤、６）転移臓器内での増殖などの過程から構成されている。これらの過程における癌細胞の移動には細胞の遊走が重要な役割を果たしており、これを阻害することによって癌転移を抑制することができると考えられる。
【0020】
（環状ペプチド）
本発明の１つの有効成分である環状ペプチドは特許文献１に開示されており、その内容は全て参照により本願に組み込まれるものとする。特許文献１に開示されたペプチドは、非特許文献１に開示されたＶＩｐｅｐ－３のＶＩＰＲ２結合活性にかかわる特徴（ファーマコフォア）を維持又は増強しつつ、二環状化により安定化されたものである。これらの文献に開示されたペプチドはいずれも本発明の新規用途に用いることが可能である。
本発明の１つの有効成分である環状ペプチドは特許文献１に開示されており、その内容は全て参照により本願に組み込まれるものとする。特許文献１に開示されたペプチドは、非特許文献１に開示されたＶＩｐｅｐ－３のＶＩＰＲ２結合活性にかかわる特徴（ファーマコフォア）を維持又は増強しつつ、二環状化により安定化されたものである。これらの文献に開示されたペプチドはいずれも本発明の新規用途に用いることが可能である。
【0021】
これらの環状ペプチドの中でも、癌転移抑制のために特に適した実施形態の環状ペプチドは、下記式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）で表されるアミノ酸配列からなる。式（１）において、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）で表されるアミノ酸配列からなる。式（１）において、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。
【0022】
さらに好ましい実施形態の環状ペプチドは、上記式（１）において、Ｘ１が、システインを表し、Ｘ３が、プロリン又はセリンを表し、Ｘ７が、リジンを表し、Ｘ８が、チロシンを表し、Ｘ１１が、アスパラギン酸を表し、そして、Ｘ１２及びＸ１３が、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表す。Ｎ末端アミノ基はアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基はアミド化されている。
【0023】
上記式（１）に含まれる個々の環状ペプチドとしては、例えば、以下のような例を挙げることができる。
ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２（配列番号１）
Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２（配列番号２）及び特許文献１の段落００５６から段落００５９に記載されたペプチドである。
ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２（配列番号１）
Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２（配列番号２）及び特許文献１の段落００５６から段落００５９に記載されたペプチドである。
【0024】
本発明に係るペプチドは、上記式（１）で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換された相同性を有するペプチドであっても、ＶＩＰＲ２に対する結合活性を有するものは包含する。本明細書において、「１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されているペプチド」という場合、それらのアミノ酸の個数は、そのペプチドがＶＩＰＲ２結合活性を有する限りは特に限定されないが、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１個若しくは２個である。欠失、付加、及び／又は置換されている場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【0025】
このような上記アミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び/又は置換されたアミノ酸配列として、前記アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
【0026】
本発明に係るペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その種々の誘導体、及び／又は修飾体も包含する。係る誘導体としては、ペプチドの飽和脂肪鎖が不飽和脂肪鎖に置換されているもの、ペプチドの原子の一部が放射性または非放射性の同位体原子を含む他の原子に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がチオアミド結合（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｓ）－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルケン（－Ｃ＝Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルキル（－Ｃ－Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がヒドロキシエチレン（－Ｃ（－ＯＨ）－Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がエステル（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルケン（－Ｃ＝Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合が（－Ｃ－ＮＨ－）に置換されているもの、又はペプチドのアミド結合が（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ－）に置換されているものなどが挙げられ、係る修飾体としては、ペプチドのα位炭素が二置換されているもの、ペプチドのアミド結合がＮ－アルキル化されているもの、ペプチドの官能基の一部がハロゲン化、シアノ化、ニトロ化、オキソ化、ヒドロキシ化、アミノ化、デアミノ化、デヒドロ化、アミド化、アセチル化、メトキシ化、プレニル化、アルキル化などの修飾を受けているもの（例えば、ペプチドのアミノ基の一部がアセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化又はデアミノ化されているもの、ペプチドのカルボキシ基の一部がＮ－ピロリジニル化やＮ－ピペリジニル化されていたり、アミド（アミド、メチルアミド、エチルアミド、ｐ－ニトロアニリド、β－ナフチルアミド等）やエステル（メチルエステル、エチルエステル、チオエステル等）になっているものなど）、ペプチドのＳがスルホキシドＳ（＝Ｏ）又はスルホンＳ（＝Ｏ）２になっているもの、ペプチドがケミカルリンカーを介して多量体化しているもの、ペプチドがビオチン標識化されているもの、ペプチドが蛍光標識化されているもの、ペプチドが発光標識化されているもの、さらにはアルキル鎖、ポリエチレングリコール、抗体、レクチン類、糖鎖、酵素、膜透過性ペプチド、低分子化合物、又はタンパク質のユビキチン化を誘導する分子などとペプチドを融合させたもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
本発明に係るペプチドは、ペプチドの塩も包含する。ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム、又はアルカリ、若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【0028】
本発明に係るペプチドは、プロドラッグであってもよい。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸などによる反応によって本発明に係るペプチドに変換される化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解などを起こして本発明に係るペプチドに変化する化合物、胃酸などにより加水分解などを起こして本発明に係るペプチドに変化する化合物をいう。
【0029】
本発明に係るペプチドのプロドラッグとしては、本発明に係るペプチドのアミノ基がアシル化、アルキル化またはリン酸化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、又はｔｅｒｔ－ブチル化された化合物）、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基がアシル化、アルキル化、リン酸化、又はホウ酸化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、又はジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物）、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基やカルボキシ基がエステル化、又はアミド化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基やカルボキシ基がＣ１－６アルキルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、又はメチルアミド化された化合物）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は自体公知の方法によって本発明に係るペプチドから製造することができる。
【0030】
本発明に係るペプチドのプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３～１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明に係るペプチドに変化するものであってもよい。
【0031】
本明細書において、プロドラッグは塩を形成していてもよく、係る塩としては、本発明に係るペプチドの塩として例示したものが挙げられる。
【0032】
本発明に係るペプチドは、結晶であってもよく、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても本発明に係るペプチドに包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【0033】
本発明に係るペプチドは、薬学的に許容され得る共結晶や共結晶塩であってもよい。ここで共結晶、又は共結晶塩とは、各々が異なる物理的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解性及び安定性等）を持つ、室温で二種、又はそれ以上の独特な固体から構成される結晶性物質を意味する。共結晶、又は共結晶塩は、自体公知の共結晶化法に従い製造することができる。
【0034】
（環状ペプチドを含む組成物）
本発明の1つの有効成分としての環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体は、医薬、診断薬、研究用試薬として組成物の形態で使用することが可能である。組成物（例えば、医薬組成物）の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、又は経直腸投与）、注射投与（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）、経皮投与等が挙げられる。組成物中のペプチドは、代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ペプチドにアルキル鎖、ポリエチレングリコール、又は糖鎖などを付加することで、血中滞留時間を長くする、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
本発明の1つの有効成分としての環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体は、医薬、診断薬、研究用試薬として組成物の形態で使用することが可能である。組成物（例えば、医薬組成物）の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、又は経直腸投与）、注射投与（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）、経皮投与等が挙げられる。組成物中のペプチドは、代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ペプチドにアルキル鎖、ポリエチレングリコール、又は糖鎖などを付加することで、血中滞留時間を長くする、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
【0035】
上記の組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（注射剤など）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤等の放出制御製剤（徐放性マイクロカプセルなど）であってもよい。製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドが経粘膜吸収されにくい場合は、難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
【0036】
丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
【0037】
本発明の組成物は、癌転移抑制作用を有することから、腫瘍が転移した患者及び腫瘍が転移するリスクが高い患者に投与することができる。従って、当該組成物は、腫瘍の転移が発生する前に被験体に投与してもよく、腫瘍の転移が発生した後に被験体に投与してもよい。当該被検体における適用対象は、細胞であれば特に限定されないが、腫瘍細胞が好ましい。癌の種類に制限はなく、例としては、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、口腔癌、咽頭癌、咽喉癌、舌癌、食道癌、腎癌、卵巣癌等が挙げられる。
【0038】
本発明の組成物は、上記疾患に有用な各種の化学療法、外科的治療、放射線療法といった他の医薬や治療法と組み合わせて併用してもよい。
【0039】
本発明の組成物を哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、３０μｇ～１０００ｍｇ、１００μｇ～５００ｍｇ、１００μｇ～１００ｍｇを１回、又は数回に分けて投与することができる。
【0040】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、係る変更も本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【0041】
（ペプチド合成）
本実施例に使用した全てのペプチドの化学合成は、株式会社スクラム（東京、日本）に委託し、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる標準的な固相合成法を自動合成機ＳｙｒｏＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）で実施した。Ｃ末端に位置する側鎖保護アミノ酸－レジンを合成カラムに入れて、装置をセットした。続いて、Ｆｍｏｃ基で保護した次アミノ酸に１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて活性化し、カラムに入れて反応させた。反応終了後に洗浄し、２０％ピペリジンを用いて、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。本工程を繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長し、最終アミノ酸のＦｍｏｃ基を脱保護した後、装置からペプチドレジンを取り出した。
本実施例に使用した全てのペプチドの化学合成は、株式会社スクラム（東京、日本）に委託し、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる標準的な固相合成法を自動合成機ＳｙｒｏＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）で実施した。Ｃ末端に位置する側鎖保護アミノ酸－レジンを合成カラムに入れて、装置をセットした。続いて、Ｆｍｏｃ基で保護した次アミノ酸に１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて活性化し、カラムに入れて反応させた。反応終了後に洗浄し、２０％ピペリジンを用いて、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。本工程を繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長し、最終アミノ酸のＦｍｏｃ基を脱保護した後、装置からペプチドレジンを取り出した。
【0042】
ペプチドの環状化は、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２０１６，１０６（６）：８４３－８５２；Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．２０１５，４４（１）９１－１０２；Ｎａｔ Ｃｈｅｍ．２０１４，６（１１）１００９－１０１６等に記載の手法を参考とした。例として、Ｓｅｑ－１とＳｅｑ－１０の環状化を以下に示す。直鎖の側鎖保護ペプチドレジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にて膨潤させ、２％ヒドラジン溶液中で５～１０分間反応させることで、リジンの側鎖の保護基（Ｄｄｅ）とアスパラギン酸の側鎖の保護基（ＯＤｍａｂ）を脱保護した後、カップリング試薬であるＯｘｉｍａ Ｐｕｒｅとジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加え、５０℃で３時間反応させた。レジンを洗浄後、ＴＦＡを加えて、チオール基の保護基を脱保護すると同時にレジンから単環ペプチドを切り出した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、単環ペプチドを精製した後、凍結乾燥した。単環ペプチドをＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）とアセトニトリルの混液に溶解後、ＤＭＳＯを添加し、室温で３６時間撹拌することで、ジスルフィド結合によって、ペプチドを環状化した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、二環ペプチドであるＳｅｑ－１とＳｅｑ－１０を精製した後、凍結乾燥した。最終的に得られたペプチドの分子量は、ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定し、目的物を同定した。
【0043】
本実施例で合成したペプチドの理論分子量、実測分子量、純度、環状化タイプ、配列を表１に示す。また、これらの中でＳｅｑ－１及びＳｅｑ－１０のアミノ酸配列を以下に示す。なお、表１及び以下のアミノ酸配列において、Ｄ体表記のないアミノ酸はＬ体を示す。
【0044】
【表1】
【0045】
Ｓｅｑ－１：ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２ （配列番号１）
Ｓｅｑ－１０：Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２ （配列番号２）
Ｓｅｑ－１０：Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２ （配列番号２）
【0046】
Ｓｅｑ－１とＳｅｑ－１０は、ＶＩｐｅｐ－３（非特許文献１参照）のＣ末端３残基（Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ）を除去し、１位－１０位間のＳ－Ｓ結合と７位－１１位間のアミド結合によって二環化したペプチドである。
【0047】
（参考例）ＶＩＰＲ２シグナルによる癌細胞の遊走メカニズムの解析
材料と方法
＜プラスミドとｓｉＲＮＡ＞
ｐＣＭＶ６－ＡＮ－Ｍｙｃ－ＤＤＫベクター（ＰＳ１０００１６）及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｓ１０Ｃ－０６００）は、コスモ・バイオ株式会社から購入した。ｐＥＧＦＰ－Ｎ２ベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。ｐＣＭＶ６－ＶＩＰＲ２－Ｍｙｃ－ＤＤＫプラスミドは，ｐＣＭＶ６－ＡＮ－Ｍｙｃ－ＤＤＫベクターとＶＩＰＲ２ｃＤＮＡから構築した。得られたプラスミドからＶＩＰＲ２－Ｍｙｃ領域をｐＥＧＦＰ－Ｎ２ベクターにクローニングした。ヒトＶＩＰＲ２－ｓｉＲＮＡ（ｓｉ１、３０２４８１３６５３－００００８０及び－００００９０；ｓｉ２、３０２４８１３６５３－００００２０及び－００００３０；ｓｉ３、３０２４８１３６５３－００００５０及び－００００６０）は、シグマ・アルドリッチ社から購入した。
材料と方法
＜プラスミドとｓｉＲＮＡ＞
ｐＣＭＶ６－ＡＮ－Ｍｙｃ－ＤＤＫベクター（ＰＳ１０００１６）及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｓ１０Ｃ－０６００）は、コスモ・バイオ株式会社から購入した。ｐＥＧＦＰ－Ｎ２ベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。ｐＣＭＶ６－ＶＩＰＲ２－Ｍｙｃ－ＤＤＫプラスミドは，ｐＣＭＶ６－ＡＮ－Ｍｙｃ－ＤＤＫベクターとＶＩＰＲ２ｃＤＮＡから構築した。得られたプラスミドからＶＩＰＲ２－Ｍｙｃ領域をｐＥＧＦＰ－Ｎ２ベクターにクローニングした。ヒトＶＩＰＲ２－ｓｉＲＮＡ（ｓｉ１、３０２４８１３６５３－００００８０及び－００００９０；ｓｉ２、３０２４８１３６５３－００００２０及び－００００３０；ｓｉ３、３０２４８１３６５３－００００５０及び－００００６０）は、シグマ・アルドリッチ社から購入した。
【0048】
＜抗体＞
抗ＧＡＰＤＨ抗体（＃２１１８）、抗ＷＡＶＥ２抗体（＃３６５９）、抗パンＡＫＴ抗体（＃４６９１）、抗リン酸化ＡＫＴ抗体（Ｓｅｒ４７３；＃４０６０）、抗リン酸化ＡＫＴ抗体（Ｔｈｒ３０８；＃２９６５）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
抗ＧＡＰＤＨ抗体（＃２１１８）、抗ＷＡＶＥ２抗体（＃３６５９）、抗パンＡＫＴ抗体（＃４６９１）、抗リン酸化ＡＫＴ抗体（Ｓｅｒ４７３；＃４０６０）、抗リン酸化ＡＫＴ抗体（Ｔｈｒ３０８；＃２９６５）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
【0049】
＜ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰ過剰発現細胞の作製＞
ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所）から購入した。リポフェクタミン３０００（インビトロジェン社）を用いて、メーカーの推奨に従って、コントロールｓｉＲＮＡ及びＶＩＰＲ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰをコードする発現ベクター又はコントロールのＥＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクトし、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク社）の存在下で１４日間培養することで、安定的にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰを発現する細胞株を樹立した。
ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株は、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所）から購入した。リポフェクタミン３０００（インビトロジェン社）を用いて、メーカーの推奨に従って、コントロールｓｉＲＮＡ及びＶＩＰＲ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰをコードする発現ベクター又はコントロールのＥＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクトし、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク社）の存在下で１４日間培養することで、安定的にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰ又はＥＧＦＰを発現する細胞株を樹立した。
【0050】
＜ウェスタンブロッティング＞
ウエスタンブロッティングは、以前に記載した方法（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｏｐｅｎ３，４６３－４７４；Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９，１２７２９）に従って実施した。
ウエスタンブロッティングは、以前に記載した方法（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｏｐｅｎ３，４６３－４７４；Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１９，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９，１２７２９）に従って実施した。
【0051】
＜ランダム遊走試験とトランスウェル遊走試験＞
ＭＣＦ－７細胞（１．５×１０４個）を無血清培地で３５ｍｍ培養皿に播種し、接着するまで培養した後、１００ｎＭのＶＩＰ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）で刺激した。移動アッセイでは、サーモプレート（株式会社東海ヒット製）を用いて、３７℃で１時間ごとに１２時間、ライブセルイメージング（ＢＺ－Ｘ８００；株式会社キーエンス）により細胞をモニターした。細胞のトラッキング解析は、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ ｐｒｅｍｉｅｒ ｖｅｒ．９．４（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
ＭＣＦ－７細胞（１．５×１０４個）を無血清培地で３５ｍｍ培養皿に播種し、接着するまで培養した後、１００ｎＭのＶＩＰ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）で刺激した。移動アッセイでは、サーモプレート（株式会社東海ヒット製）を用いて、３７℃で１時間ごとに１２時間、ライブセルイメージング（ＢＺ－Ｘ８００；株式会社キーエンス）により細胞をモニターした。細胞のトラッキング解析は、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ ｐｒｅｍｉｅｒ ｖｅｒ．９．４（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【0052】
また、ボイデンチャンバーを用いて、以前に記載した方法（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２，３２４２－３２５２）に従って実施した。ウェルには、２００ｎＭのＶＩＰを含む６００μＬの無血清培養液を加えた。細胞（１×１０４個）を１００μＬの無血清培養液に懸濁し、インサートに加えた。３７℃で３０時間または４８時間、細胞を遊走させた。膜の上面に付着した非移動性の細胞を除去し、下面に付着した移動性の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡でカウントした。
【0053】
＜マウス腹腔内転移試験＞
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞の腹腔内転移は、ＣａｂｒａｌらがＨｅＬａ細胞を用いて行った方法を改変して評価した（Ｃａｂｒａｌら、２００７年、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．１２１，１４６－１５５）。簡単に説明すると、５週齢の年齢を合わせた雌のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ；日本チャールズリバー株式会社）に、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞又はＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（６×１０６個／２００μＬ）を腹腔内に接種した（ｎ＝３／グループ）。腫瘍の成長と転移は，ＮｉｇｈｔＯＷＬ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたライブアニマルイメージングで可視化し、６週間にわたり毎週モニタリングした。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞の腹腔内転移は、ＣａｂｒａｌらがＨｅＬａ細胞を用いて行った方法を改変して評価した（Ｃａｂｒａｌら、２００７年、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．１２１，１４６－１５５）。簡単に説明すると、５週齢の年齢を合わせた雌のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ；日本チャールズリバー株式会社）に、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞又はＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（６×１０６個／２００μＬ）を腹腔内に接種した（ｎ＝３／グループ）。腫瘍の成長と転移は，ＮｉｇｈｔＯＷＬ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたライブアニマルイメージングで可視化し、６週間にわたり毎週モニタリングした。
【0054】
＜統計解析＞
統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用した。ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（２群の場合）及びＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（２群以上の場合）に加え、Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いた。ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると判断した。
統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用した。ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（２群の場合）及びＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（２群以上の場合）に加え、Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いた。ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると判断した。
【0055】
結果
＜ＶＩＰ－ＶＩＰＲ２シグナルはＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞のＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路を促進する＞
ＶＩＰがＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路を介した細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、癌細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路の下流シグナルであるＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングで評価した。図１Ａに示すように、ＭＣＦ－７細胞を３時間飢餓状態にした後、０～１０００ｎＭのＶＩＰで１０分間刺激すると、ＶＩＰの添加濃度依存的にＡＫＴがリン酸化した。図１Ｂに示すように、このＡＫＴのリン酸化は、ＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制された。図１Ｃに示すように、このＡＫＴのリン酸化は、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において顕著に増大した。すべての実験は独立して少なくとも３回実施し、同様のデータが得られた。代表的な画像を図１Ａ－Ｃに示した。これらの結果は、ＭＣＦ－７やＭＤＡ－ＭＢ－２３１といった乳癌細胞において、ＶＩＰで誘導されるＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路の活性化が、ＶＩＰＲ２を介していることを示している。
＜ＶＩＰ－ＶＩＰＲ２シグナルはＭＣＦ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞のＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路を促進する＞
ＶＩＰがＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路を介した細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、癌細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路の下流シグナルであるＡＫＴのリン酸化をウェスタンブロッティングで評価した。図１Ａに示すように、ＭＣＦ－７細胞を３時間飢餓状態にした後、０～１０００ｎＭのＶＩＰで１０分間刺激すると、ＶＩＰの添加濃度依存的にＡＫＴがリン酸化した。図１Ｂに示すように、このＡＫＴのリン酸化は、ＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制された。図１Ｃに示すように、このＡＫＴのリン酸化は、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において顕著に増大した。すべての実験は独立して少なくとも３回実施し、同様のデータが得られた。代表的な画像を図１Ａ－Ｃに示した。これらの結果は、ＭＣＦ－７やＭＤＡ－ＭＢ－２３１といった乳癌細胞において、ＶＩＰで誘導されるＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路の活性化が、ＶＩＰＲ２を介していることを示している。
【0056】
＜ＶＩＰ－ＶＩＰＲ２シグナルは、ＭＣＦ－７乳癌細胞の細胞遊走を促進する＞
ＶＩＰＲ２の発現が癌細胞の運動性に影響を与えるかどうかを調べるために、ＭＣＦ－７細胞の細胞遊走を調べた。図２Ａに示すように、１００ｎＭのＶＩＰ存在下において、ＭＣＦ－７細胞は培養時間の経過と共に移動するが、この移動はＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制された。一方、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＣＦ－７細胞では、細胞の移動に加えて、細胞の形態が変化し、仮足が顕著に観察された。図２Ｂは、コントロールｓｉＲＮＡ及びＶＩＰＲ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＣＦ－７細胞のトラックプロットを分析し、グラフ化した結果である。個々の細胞の開始点を図の中央にすると、ＭＣＦ－７細胞の移動がＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制されることが示された。図２Ｃは、移動速度の比較を棒グラフで示す。ＭＣＦ－７細胞の移動速度は、ＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制され、反対にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＣＦ－７細胞では有意に加速した。データは平均値±ＳＤで示した。表示されたグループ間で＊＊＊：ｐ＜０．００１（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｄｕｎｎ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）。
ＶＩＰＲ２の発現が癌細胞の運動性に影響を与えるかどうかを調べるために、ＭＣＦ－７細胞の細胞遊走を調べた。図２Ａに示すように、１００ｎＭのＶＩＰ存在下において、ＭＣＦ－７細胞は培養時間の経過と共に移動するが、この移動はＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制された。一方、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＣＦ－７細胞では、細胞の移動に加えて、細胞の形態が変化し、仮足が顕著に観察された。図２Ｂは、コントロールｓｉＲＮＡ及びＶＩＰＲ２ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＣＦ－７細胞のトラックプロットを分析し、グラフ化した結果である。個々の細胞の開始点を図の中央にすると、ＭＣＦ－７細胞の移動がＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制されることが示された。図２Ｃは、移動速度の比較を棒グラフで示す。ＭＣＦ－７細胞の移動速度は、ＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡで強力に抑制され、反対にＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現させたＭＣＦ－７細胞では有意に加速した。データは平均値±ＳＤで示した。表示されたグループ間で＊＊＊：ｐ＜０．００１（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｄｕｎｎ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）。
【0057】
図７に示したトランスウェルチャンバーアッセイを用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の移動能を評価した。細胞を無血清培地に懸濁した（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００ｍＬ）。２００ｎＭのＶＩＰを含む無血清培地６を各ｗｅｌｌに６００μＬずつ加え、３μｍの細孔５を有するインサート３をｗｅｌｌに沈めた後、懸濁した細胞１をインサート３に加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。３０時間後、細胞を固定し、インサート３表面の細胞を除いた後、ＶＩＰに誘導されて裏面に移動した細胞２のＥＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡によって検出した。蛍光画像を基にインサートの裏面に移動した細胞数をグラフ化した。図３は、ＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の移動を、トランスウェルチャンバーアッセイを用いて測定した結果である。ＶＩＰ（２００ｎＭ）をウェルに加え、細胞をインサートに加え、３７℃で３０時間インキュベートし、インサートの裏側に移動した細胞を定量化してグラフに示した。ＶＩＰ存在下において、インサートの裏側に移動した細胞の数が増加し、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを発現させた細胞ではその移動が更に顕著に亢進した。データは平均値±ＳＤで示した。表示されたグループ間で＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定の後、Ｄｕｎｎの多重比較検定）。これらの結果は、ＶＩＰによって誘導される細胞移動が、ＶＩＰＲ２の発現量に依存して促進されることを示している。
【0058】
＜ＶＩＰＲ２を過剰発現させるとＷＡＶＥ２豊富なラメリポディアが形成される＞
ＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ）をコラーゲンコートカバーグラスに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。２４時間後、無血清培地で洗浄し、新しい無血清培地を加えて細胞をインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２条件下）。３時間後、１００ｎＭのＶＩＰを含む無血清培地に置き換え、３０分間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＷＡＶＥ２抗体を用いて免疫染色を行った。その蛍光染色像から細胞膜直下のＷＡＶＥ２ ｒｉｃｈ領域の表面積を測定しグラフ化した。
ＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ）をコラーゲンコートカバーグラスに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。２４時間後、無血清培地で洗浄し、新しい無血清培地を加えて細胞をインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２条件下）。３時間後、１００ｎＭのＶＩＰを含む無血清培地に置き換え、３０分間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＷＡＶＥ２抗体を用いて免疫染色を行った。その蛍光染色像から細胞膜直下のＷＡＶＥ２ ｒｉｃｈ領域の表面積を測定しグラフ化した。
【0059】
その結果を図４に示す。棒グラフは、ラメリポディアの面積を示す。データは平均値±ＳＤで示した。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、指示されたグループ間（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とＤｕｎｎの多重比較検定）。ｎ．ｓ．は統計的に有意でないことを示す。ＶＩＰ刺激によってＭＤＡ－ＭＢ－２３１のＷＡＶＥ２ ｒｉｃｈなラメリポディアの面積が拡張した。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＥＧＦＰの発現するコントロールＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と比較して、ラメリポディアの面積の拡張がより顕著であった。
【0060】
＜ＶＩＰＲ２の過剰発現はｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の転移を促進する＞
ＶＩＰＲ２が生体内での腫瘍の転移・拡散に役割を果たしているかどうかを調べるために、ヌードマウスの腹腔内にＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を接種した。一週間おきにＮｉｇｈｔＯＷＬを用いてｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、癌細胞の全身性の遊走を観察した。その結果を図５Ａに示す。パネルは、１週目、４週目、６週目のｉｎ ｖｉｖｏでのＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の蛍光画像である。図５Ｂのグラフは、１週目に移植された部分と、次に密集した部分（矢尻）との距離（投与部位から最も遠い細胞集団までの距離）を、表示した週で示している。
ＶＩＰＲ２が生体内での腫瘍の転移・拡散に役割を果たしているかどうかを調べるために、ヌードマウスの腹腔内にＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定的に発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を接種した。一週間おきにＮｉｇｈｔＯＷＬを用いてｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージングを行い、癌細胞の全身性の遊走を観察した。その結果を図５Ａに示す。パネルは、１週目、４週目、６週目のｉｎ ｖｉｖｏでのＥＧＦＰ又はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の蛍光画像である。図５Ｂのグラフは、１週目に移植された部分と、次に密集した部分（矢尻）との距離（投与部位から最も遠い細胞集団までの距離）を、表示した週で示している。
【0061】
これらの結果は、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と比較して、腹腔内を遠方に移動したことを示している。以上の結果から、ＶＩＰＲ２の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の移動を促進させることが明らかになった。
【0062】
＜ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＶＩＰによるＰＩ３Ｋ／ＰＩ（３，４，５）Ｐ３経路の活性化を阻害する＞
ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＶＩＰによるＡＫＴのリン酸化をＫＳ－１３３の非存在下と存在下で評価した。ＫＳ－１３３は添加濃度依存的にＶＩＰによって誘導されるＡＫＴのリン酸化を強力に抑制した。ＫＳ－１３３はＡＫＴの発現には影響を与えなかった。
ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＶＩＰによるＡＫＴのリン酸化をＫＳ－１３３の非存在下と存在下で評価した。ＫＳ－１３３は添加濃度依存的にＶＩＰによって誘導されるＡＫＴのリン酸化を強力に抑制した。ＫＳ－１３３はＡＫＴの発現には影響を与えなかった。
【0063】
＜ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３はＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞の遊走を抑制する＞
図７に示したトランスウェルを用いて、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞の遊走に対するＫＳ－１３３の効果を調べた。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、０～１０００ｎＭの各濃度のＫＳ－１３３を含む無血清培地に懸濁した（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）。２００ｎＭのＶＩＰと上記各濃度のＫＳ－１３３を含む無血清培地６を各ｗｅｌｌに６００μＬずつ加え、３μｍの細孔５を有するインサート３をｗｅｌｌに沈めた後、懸濁した細胞１をインサート３に加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。４８時間後、細胞を固定し、インサート３表面の細胞を除いた後、ＶＩＰに誘導されて裏面に移動した細胞２のＥＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡によって検出した。蛍光画像を基にインサートの裏面に移動した細胞数をグラフ化した。その結果を図８に示す。
図７に示したトランスウェルを用いて、ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞の遊走に対するＫＳ－１３３の効果を調べた。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、０～１０００ｎＭの各濃度のＫＳ－１３３を含む無血清培地に懸濁した（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）。２００ｎＭのＶＩＰと上記各濃度のＫＳ－１３３を含む無血清培地６を各ｗｅｌｌに６００μＬずつ加え、３μｍの細孔５を有するインサート３をｗｅｌｌに沈めた後、懸濁した細胞１をインサート３に加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。４８時間後、細胞を固定し、インサート３表面の細胞を除いた後、ＶＩＰに誘導されて裏面に移動した細胞２のＥＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡によって検出した。蛍光画像を基にインサートの裏面に移動した細胞数をグラフ化した。その結果を図８に示す。
【0064】
図８Ａは、遊走した細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。図８Ｂ及び表２は、各濃度のＫＳ－１３３を添加したときの遊走した細胞数を示す。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを安定発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１のＶＩＰ誘導性の細胞遊走はＫＳ－１３３の添加によって抑制された（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ， Ｄｕｎｎ’ｓ ｍｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔの結果、ＫＳ－１３３未添加に対して有意差が認められたのは１００ｎＭ以上のＫＳ－１３３添加時のみ）。
【0065】
【表2】
【0066】
＜ＶＩＰＲ２を過剰発現したＭＣＦ－７細胞において、選択的なＶＩＰＲ２アンタゴニストであるＫＳ－１３３を添加したときの細胞増殖抑制効果＞
当該効果を確認した。細胞の増殖試験は非特許文献３に準じて実施した。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを過剰発現させたＭＣＦ－７細胞を３５ｍｍ培養ディッシュに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で６時間播種し、培養液を２％ＦＢＳ、１００ｎＭのＶＩＰ、０又は１００ｎＭのＫＳ－１３３を含む新鮮な培地に交換した（０日目）。ＢＺ－Ｘ８００（Ｋｅｙｅｎｃｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）蛍光顕微鏡で細胞を観察し、ヘマサイトメーターを用いてトリパンブルー色素染色法により２４時間ごとに最大４日間細胞数をカウントした（ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）。
当該効果を確認した。細胞の増殖試験は非特許文献３に準じて実施した。ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを過剰発現させたＭＣＦ－７細胞を３５ｍｍ培養ディッシュに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの密度で６時間播種し、培養液を２％ＦＢＳ、１００ｎＭのＶＩＰ、０又は１００ｎＭのＫＳ－１３３を含む新鮮な培地に交換した（０日目）。ＢＺ－Ｘ８００（Ｋｅｙｅｎｃｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）蛍光顕微鏡で細胞を観察し、ヘマサイトメーターを用いてトリパンブルー色素染色法により２４時間ごとに最大４日間細胞数をカウントした（ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）。
【0067】
ＶＩＰＲ２－ＥＧＦＰを過剰発現させたＭＣＦ－７細胞に対して、ＶＩＰＲ２アンタゴニストであるＫＳ－１３３を添加し（非特許文献２）、当該細胞の増殖効果を確認した。確認した結果を図９及び表３に示す。ＶＩＰＲ２を過剰発現したＭＣＦ－７細胞では、ＫＳ－１３３の添加によって、培養２日目以降から細胞増殖が著しく抑制された。一方、コントロール群では、経日的な細胞増殖が確認された。この確認した結果から、ＶＩＰ－ＶＩＰＲ２シグナルが乳がん細胞の増殖を引き起こすことが明らかとなった。
【0068】
【表3】
【産業上の利用可能性】
【0069】
本発明に係る環状ペプチドを含む組成物は、癌転移抑制剤などの医薬品として使用される可能性がある。
【符号の説明】
【0070】
１ 細胞
２ ＶＩＰに誘導されて移動した細胞
３ インサート
４ ＫＳ－１３３（あり又はなし）／無血清培地
５ 細孔（３μｍ）
６ ２００ｎＭのＶＩＰ＋ＫＳ－１３３（あり又はなし）／無血清培地
２ ＶＩＰに誘導されて移動した細胞
３ インサート
４ ＫＳ－１３３（あり又はなし）／無血清培地
５ 細孔（３μｍ）
６ ２００ｎＭのＶＩＰ＋ＫＳ－１３３（あり又はなし）／無血清培地
【要約】
癌細胞の遊走に影響を及ぼすＶＩＰＲ２シグナルの役割とそのメカニズムを調べることにより、癌転移抑制手段を開示する。式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１２、及びＸ１３は明細書に記載のとおりである。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌転移抑制のための組成物が提供される。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ１１、Ｘ１２、及びＸ１３は明細書に記載のとおりである。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌転移抑制のための組成物が提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】