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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-29
(45)【発行日】2023-09-06
(54)【発明の名称】カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
(51)【国際特許分類】
C07D 493/10 20060101AFI20230830BHJP
C07D 311/82 20060101ALI20230830BHJP
C09B 29/01 20060101ALI20230830BHJP
G01N 33/573 20060101ALI20230830BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230830BHJP
【ＦＩ】
C07D493/10 CSP
C07D311/82
C09B29/01
G01N33/573 A
G01N33/574 D
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020503671
(86)(22)【出願日】2019-03-04
(86)【国際出願番号】 JP2019008403
(87)【国際公開番号】W WO2019168199
(87)【国際公開日】2019-09-06
【審査請求日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】P 2018037791
(32)【優先日】2018-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 次世代がん医療創生研究事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100203035
【弁理士】
【氏名又は名称】五味渕 琢也
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】浦野 泰照
(72)【発明者】
【氏名】神谷 真子
(72)【発明者】
【氏名】河谷 稔
(72)【発明者】
【氏名】岩城 弘尚
(72)【発明者】
【氏名】山本 恭子
(72)【発明者】
【氏名】久米 春喜
(72)【発明者】
【氏名】山田 大介
【審査官】阿久津 江梨子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００６／０００３３８３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】MOCK, William L. et al.，Arazoformyl peptide surrogates as spectrophotometric kinetic asay substrates for carboxypeptidase A，Analytical Biochemistry，1996年，vol.239, No.2，p.218-222，ISSN 0960-894X
【文献】MOCK, William L. et al.，Catalytic activity of carboxypeptidase B and of carboxypeptidase Y with anisylazoformyl substrates，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，1999年，Vol.9. No.2，p.187-192，ISSN 0960-894X
【文献】KURIKI, Yugo et al.，Establishment of molecular desigh strategy to obtain activatable fluorescent probes for carboxypepti，Journal of the American Chemical Society，2018年，Vol.140, No.5，p.1767-1773，ISSN 1520-5126
【文献】河谷稔 ほか，アゾホルミル基を活用した新規turn-on型カルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブの開発， 日本薬学会年会第１３８年会（金沢）発表要旨，[オンライン]，2018年02月01日，[検索日 2019.05.22]，26V-pm11S，インターネット：<URL:http://nenkai.pharm.or.jp/138/pc/isearch/asp>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ｃ０９Ｂ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し、
Ｒ １ の一価の置換基は、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選択され、
Ｒ １ が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基が１個又は２個以上存在していてもよく、
Ｒ １ が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、
Ｒ １ が示すアルコキシ基が置換基を有する場合は、当該アルコキシ基は、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基であってもよく：
Ｒ２は、ベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し、
Ｒ ２ の一価の置換基は、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアミノアルキル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基又は窒素上に置換基を有してもよいカルボキサミド基から選択され、
Ｒ ２ がアルキル基である場合は、該アルキル基にはハロゲン原子、スルホニル基、アルコキシ基が１個又は２個以上存在していてもよく；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｌは、アミノ酸残基を示し、
前記アミノ酸残基は、フェニルアラニン残基、グルタミン酸残基又はリジン残基であり、
当該アミノ酸残基のα－アミノ基がカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）の炭素と結合しており；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙ及びＺは、（Ｏ、ＯＨ）、（ＮＲ７Ｒ８、ＮＲ９Ｒ１０）、又は（Ｏ、ＮＲ９Ｒ１０）の組から選択され、
ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ７及びＲ８は一緒になってＲ７及びＲ８が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ７又はＲ８は、或いは、Ｒ７及びＲ８の両方は、夫々、Ｒ３及び／又はＲ５と一緒になって、Ｒ７及び／又はＲ８が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４及び／又はＲ６と一緒になって、Ｒ９及び／又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨである場合で、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基の場合は、Ｙ及びＺはアセチル化されていてもよい。）
【請求項2】
Ｌは以下の式で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。【請求項3】
Ｘは酸素原子である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項4】
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨであり、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基であり、Ｙ及びＺはアセチル化されており、以下の一般式（Ｖ）で表される、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。【請求項5】
以下の式から選択される化合物又はその塩。【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
【請求項7】
細胞内のカルボキシペプチダーゼを生体外で検出する方法であって、（ａ）請求項６に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法。
【請求項8】
前立腺がんを検知する方法であって、（ａ）請求項６に記載の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用する工程、及び（ｂ）前記蛍光プローブを適用した前立腺の手術検体の蛍光像を測定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【0002】
がんは日本人の死因の約３割を占める疾患であり、その外科的摘出は現状において最も効果的な治療法の一つである。しかしながら、目に見えないサイズのがんを発見し、確実に切除することは難しく再発の原因となっている。そこで、本発明者らの研究グループでは微小ながんを可視化するべく、がん特異的に高発現するアミノペプチダーゼの活性検出蛍光プローブを開発してきたが、一方でタンパク質のカルボキシ末端の加水分解酵素であるカルボキシペプチダーゼも一部ががんマーカーとして知られている。
【0003】
カルボキシペプチダーゼは、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を認識し、加水分解により切断する酵素群の総称であり、これまでに様々な生命現象や疾患との関連性が報告されている（非特許文献１）。例えば、prostate specific membrane antigen（ＰＳＭＡ）は前立腺がんのバイオマーカー（非特許文献２）として、carboxypeptidase Bは膵疾患のバイオマーカーとして臨床的に重要な標的酵素群であることが報告されている（非特許文献３）。
【0004】
また、ｉＰＳ細胞から肝前駆細胞への分化マーカーとしてcarboxypepitdase Mが報告されている（非特許文献４）。さらに、angiotensin converting enzyme（ＡＣＥ）の阻害剤は、高血圧治療薬として汎用されており、創薬標的として重要である（非特許文献５）。このように、カルボキシペプチダーゼは生物学研究のみならず創薬や診断の観点からも重要な酵素群である。
【0005】
上記で記載したような重要性から、カルボキシペプチダーゼの酵素活性を検出する手法はこれまでに数多く開発されてきた。しかしながら、その大部分は、酵素反応生成物の蛍光誘導体化や抽出といった煩雑な操作や、放射性同位体等を用いる必要があったため、測定の簡便性などに課題があった。
一部のカルボキシペプチダーゼを標的として、基質が酵素によって代謝されることで蛍光が上昇するタイプの蛍光基質も報告されているものの、酵素認識部位が蛍光制御に用いられているため、基質の種類が著しく限られるだけでなく、紫外光による励起を必要とするため、生細胞やｉｎ ｖｉｖｏでの応用が難しいという課題を有していた。
一部のカルボキシペプチダーゼを標的として、基質が酵素によって代謝されることで蛍光が上昇するタイプの蛍光基質も報告されているものの、酵素認識部位が蛍光制御に用いられているため、基質の種類が著しく限られるだけでなく、紫外光による励起を必要とするため、生細胞やｉｎ ｖｉｖｏでの応用が難しいという課題を有していた。
【0006】
また、従来のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブは反応点を２つ持ち、検出に時間がかかるという課題があった。また、臨床的に重要ながんマーカーであるＰＳＭＡに基質として認識されず、検出することができないという課題も存在した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Rawlings, N. D. & Salvesen, G. Handbook of Proteolytic Enzymes 3rd Edition. elsevier (2013).
【文献】Silver, D. A., Pellicer, I., Fair, W. R., Heston, W. D. W. & Cordon-Cardo, C. Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clin. cancer Res. 3, 81-85 (1997).
【文献】Appelros, S., Thim, L. & Borgstrom, a. Activation peptide of carboxypeptidase B in serum and urine in acute pancreatitis. Gut 42, 97-102 (1998).
【文献】Kido, T., Koui, Y., Suzuki, K., Kobayashi, A., Miura, Y., Chern, E. Y., Tanaka, M. & Miyajima, A. CPM is a useful cell surface marker to isolate expandable bi-potential liver progenitor cells derived from human iPS cells. Stem Cell Reports 5, 508-515 (2015).
【文献】Hooper, N. M. Angiotensin converting enzyme: Implications from molecular biology for its physiological functions. Int. J. Biochem. 23, 641-647 (1991).
【文献】Kuriki, Y., Kamiya, M., Kubo, H., Komatsu, T., Ueno, T., Tachibana, R., Hayashi, K., Hanaoka, K., Yamashita, S., Ishizawa, T., Kokudo, N. & Urano, Y. Establishment of molecular design strategy to obtain activatable fluorescent probes for carboxypeptidases. submitted
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、可視光領域で機能する蛍光骨格を母核として、カルボキシペプチダーゼの活性を高感度に可視化することができる蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、フルオレセイン等の蛍光色素の骨格に対して基質アミノ酸の加水分解に伴い自発的な脱炭酸・脱窒素反応を示すアゾアミド基を導入することで、反応点を１つに抑えつつ高感度な検出が可能なカルボキシペプチダーゼ活性全般に適用可能な蛍光プローブ設計法の確立に成功し、本発明を完成させるに至った。
【0010】
即ち、本発明は、
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２は、ベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｌは、アミノ酸残基を示し；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙ及びＺは、（Ｏ、ＯＨ）、（ＮＲ７Ｒ８、ＮＲ９Ｒ１０）、又は（Ｏ、ＮＲ９Ｒ１０）の組から選択され、
ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ７及びＲ８は一緒になってＲ７及びＲ８が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ７又はＲ８は、或いは、Ｒ７及びＲ８の両方は、夫々、Ｒ３及び／又はＲ５と一緒になって、Ｒ７及び／又はＲ８が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４及び／又はＲ６と一緒になって、Ｒ９及び／又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨである場合で、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基の場合は、Ｙ及びＺはアセチル化されていてもよい。）
［２］Ｌは以下の式で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ｒ’は、アミノ酸の側鎖を表す。）
［３］Ｒ２の一価の置換基が、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアミノアルキル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基又は窒素上に置換基を有してもよいカルボキサミド基から選択される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｘは酸素原子である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨであり、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基であり、Ｙ及びＺはアセチル化されており、以下の一般式（Ｖ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ａｃはアセチル基を表す。）
［６］以下の式から選択される化合物又はその塩。
（Ｒ２は、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
［８］細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）［７］に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法。
［９］前立腺がんを検知する方法であって、（ａ）［７］に記載の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用する工程、及び（ｂ）前記蛍光プローブを適用した前立腺の手術検体の蛍光像を測定することを含む、方法。
を提供するものである。
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２は、ベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｌは、アミノ酸残基を示し；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙ及びＺは、（Ｏ、ＯＨ）、（ＮＲ７Ｒ８、ＮＲ９Ｒ１０）、又は（Ｏ、ＮＲ９Ｒ１０）の組から選択され、
ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ７及びＲ８は一緒になってＲ７及びＲ８が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ７又はＲ８は、或いは、Ｒ７及びＲ８の両方は、夫々、Ｒ３及び／又はＲ５と一緒になって、Ｒ７及び／又はＲ８が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４及び／又はＲ６と一緒になって、Ｒ９及び／又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく、
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨである場合で、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基の場合は、Ｙ及びＺはアセチル化されていてもよい。）
［２］Ｌは以下の式で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ２の一価の置換基が、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアミノアルキル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基又は窒素上に置換基を有してもよいカルボキサミド基から選択される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｘは酸素原子である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨであり、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基であり、Ｙ及びＺはアセチル化されており、以下の一般式（Ｖ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］以下の式から選択される化合物又はその塩。
［７］［１］～［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
［８］細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）［７］に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法。
［９］前立腺がんを検知する方法であって、（ａ）［７］に記載の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用する工程、及び（ｂ）前記蛍光プローブを適用した前立腺の手術検体の蛍光像を測定することを含む、方法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【0011】
本発明による蛍光プローブは、ターゲットとするカルボキシペプチダーゼによって認識されるアミノ酸を有し、標的カルボキシペプチダーゼとの反応前はほぼ無蛍光だが、酵素との反応により、可視光領域の蛍光が回復することができることから、カルボキシペプチダーゼの活性を高感度に可視化することが可能である。
また、本発明の蛍光プローブをin vitro酵素系、培養細胞系に適用すると、標的カルボキシペプチダーゼ活性を迅速に蛍光検出できることができる。
本発明の蛍光プローブを適用することにより、臨床検体内のがんの可視化が可能となると考えられ、特に前立腺がんの可視化に有効である。
また、本発明の蛍光プローブをin vitro酵素系、培養細胞系に適用すると、標的カルボキシペプチダーゼ活性を迅速に蛍光検出できることができる。
本発明の蛍光プローブを適用することにより、臨床検体内のがんの可視化が可能となると考えられ、特に前立腺がんの可視化に有効である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＰＳＭＡ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの蛍光スペクトルを示す。
【図2】ＣＰＭ、阻害剤（ＭＧＴＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＬｙｓの蛍光スペクトルを示す。
【図3】ＣＰＡ１、阻害剤（ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＰｈｅの蛍光スペクトルを示す。
【図4】細胞ライセート、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの相対蛍光強度を示す。
【図5】培養細胞、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの相対蛍光強度を示す。
【図6】６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）とＭＤＣＫ細胞のライセートのＰＢＳ溶液を反応させて、経時的な蛍光強度変化を測定した結果。
【図7】ＭＤＣＫ細胞を用いた６－ＦＤＡＡＦＬｙｓ（化合物２４）の生細胞イメージングの結果を示す。
【図8】ＭＤＣＫ細胞を用いた６－ＦＤＡＡＦＬｙｓ（化合物２４）の生細胞イメージングの結果を示す。
【図9】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の吸収スペクトルを示す。
【図10】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の蛍光スペクトルを示す。
【図11】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧの酵素反応に伴う蛍光強度の変化を示す。
【図12】様々な濃度の２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）溶液にＰＳＭＡを添加した際の、反応初期における蛍光増加率をプロットした図。
【図13】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡと２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を１０時間反応させた後の溶液及び、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を行った結果を示す。
【図14】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡと２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を１０時間反応させた後の溶液及び、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を行った結果を示す。
【図15】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の細胞ライセートとの反応性を調べた結果を示す。
【図16】ＬＮＣａＰ細胞を用いた２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧの生細胞イメージングの結果を示す。
【図17】ＰＣ３細胞を用いた２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧの生細胞イメージングの結果を示す。
【図18a】阻害剤（２－ＰＭＰＡ）を添加した場合のＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧの生細胞イメージングの結果を示す。
【図18b】阻害剤（２－ＰＭＰＡ）を添加した場合のＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧの生細胞イメージングの結果を示す。
【図19】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いてＬＮＣａＰ細胞のイメージングを行った後、回収した細胞外液及び、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＭＳ分析を行った結果を示す。
【図20】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いてＬＮＣａＰ細胞のイメージングを行った後、回収した細胞外液及び、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＭＳ分析を行った結果を示す。
【図21】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧのヒト前立腺がん手術検体を用いた検討結果を示す。
【図22】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧのヒト前立腺がん手術検体を用いた検討結果を示す。
【図23】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧのヒト前立腺がん手術検体を用いた検討結果を示す。
【図24】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧのヒト前立腺がん手術検体を用いた検討結果を示す。
【図25】２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧのヒト前立腺がん手術検体を用いた検討結果を示す。
【図26】検体イメージングを行った各部位の蛍光強度の３０分後、６０分後、２４０分後での蛍光強度の増加率をまとめた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
【0014】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【0015】
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
【0016】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
【0017】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【0018】
本発明の好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【0019】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、ベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す。
Ｒ２の一価の置換基としては、好ましくは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアミノアルキル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基又は窒素上に置換基を有してもよいカルボキサミド基から選択され、より好ましくは、炭素数１～６のアルキル又は炭素数１～６のアルコキシ基から選択される。理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｒ２が疎水性の基である炭素数１～６のアルキル又は炭素数１～６のアルコキシ基の場合は、本発明の化合物が細胞膜上で蛍光性物質に変化した後に、細胞膜透過性が上がるため細胞内に取り込まれ易くなり、生細胞イメージングに好適に使用することが可能である。
また、Ｒ２がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、スルホニル基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒ２の一価の置換基としては、好ましくは、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のヒドロキシアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のアミノアルキル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミド基又は窒素上に置換基を有してもよいカルボキサミド基から選択され、より好ましくは、炭素数１～６のアルキル又は炭素数１～６のアルコキシ基から選択される。理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｒ２が疎水性の基である炭素数１～６のアルキル又は炭素数１～６のアルコキシ基の場合は、本発明の化合物が細胞膜上で蛍光性物質に変化した後に、細胞膜透過性が上がるため細胞内に取り込まれ易くなり、生細胞イメージングに好適に使用することが可能である。
また、Ｒ２がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、スルホニル基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【0020】
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【0021】
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ５及びＲ６の詳細については、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ５及びＲ６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【0022】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択される。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは、酸素原子である。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは、酸素原子である。
【0023】
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である。Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒａ及びＲｂがともにメチル基であることがより好ましい。
Ｒａ及びＲｂが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲａ及びＲｂが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒａ及びＲｂがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒａ及びＲｂが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲａ及びＲｂが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒａ及びＲｂがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【0024】
Ｒｃは、炭素数１～６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基である。フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒｃは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒｃがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒｃは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒｃがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
【0025】
一般式（Ｉ）において、Ｙ及びＺは、（Ｏ、ＯＨ）、（ＮＲ７Ｒ８、ＮＲ９Ｒ１０）、又は（Ｏ、ＮＲ９Ｒ１０）の組から選択される。
【0026】
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨである場合は、一般式（Ｉ）は以下のように表すことができる。
【0027】
Ｙ、Ｚが、夫々、ＮＲ７Ｒ８、ＮＲ９Ｒ１０である場合は、一般式（Ｉ）は以下のように表すことができる。
【0028】
Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＮＲ９Ｒ１０である場合は、一般式（Ｉ）は以下のように表すことができる。
【0029】
ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示す。
Ｒ７及びＲ８は一緒になってＲ７及びＲ８が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ７又はＲ８は、或いは、Ｒ７及びＲ８の両方は、夫々、Ｒ３及び／又はＲ５と一緒になって、Ｒ７及び／又はＲ８が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
Ｒ７及びＲ８は一緒になってＲ７及びＲ８が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ７又はＲ８は、或いは、Ｒ７及びＲ８の両方は、夫々、Ｒ３及び／又はＲ５と一緒になって、Ｒ７及び／又はＲ８が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
【0030】
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～３個のアルキル基を示す。
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４及び／又はＲ６と一緒になって、Ｒ９及び／又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４及び／又はＲ６と一緒になって、Ｒ９及び／又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
【0031】
また、Ｙ、Ｚが、夫々、Ｏ、ＯＨである場合で、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基の場合は、Ｙ及びＺはアセチル化されていてもよい。即ち、Ｒ２のベンゼン環上に存在する一価の置換基がカルボキシル基の場合は、Ｙ、Ｚは、（ＡｃＯ、ＡｃＯ）であってもよい（Ａｃは、アセチル基を表す）。この場合、一般式（Ｉ）は以下のように表すことができる。
【0032】
一般式（Ｉ）において、Ｌはアミノ酸残基を示す。
【0033】
一般式（Ｉ）のＬは以下の式で表すことができる。
【0034】
式（１）において、Ｒ’は、アミノ酸の側鎖を表す。
【0035】
また、この場合、一般式（Ｉ）の化合物は以下の一般式（Ｉａ）で表すことができる。
Ｒ’はアミノ酸の側鎖を表す。
【0036】
Ｌのアミノ酸残基としては、任意のアミノ酸の残基から選択される。アミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、スレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、プロリン、オルニチン、Ｎ－メチルロイシン、２，３－ジアミノプロパン酸、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、α－ヒドロキシロイシンなどが挙げられる。
本発明において、Ｌのアミノ酸残基は、好ましくは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基である。
本発明において、Ｌのアミノ酸残基は、好ましくは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基である。
【0037】
本発明においては、フルオレセインやローダミン等の蛍光色素の骨格に対して基質アミノ酸の加水分解に伴い自発的な脱炭酸・脱窒素反応を示すアゾアミド基を導入することを１つの特徴としている。これにより、カルボキシペプチダーゼとの反応点を１つに抑え、かつ高感度な検出が可能なカルボキシペプチダーゼ活性全般に適用可能な蛍光プローブを提供することができる。
【0038】
理論に拘束されることを意図するものではないが、各カルボキシぺプチダーゼが基質とするアミノ酸をアゾアミド基と縮合させた一般式（Ｉ）の化合物から、酵素反応によってアミノ酸が切り出され、続く脱炭酸・脱窒素反応が自発的に生じることにより、フルオレセイン等の蛍光色素が生成する。反応前の蛍光プローブは光誘起電子移動によって弱蛍光状態で存在する一方、反応生成物のフルオレセイン等の蛍光色素は強蛍光性であるため、酵素反応によって蛍光の上昇が観測できる。
【0039】
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の化合物（一般式（Ｉａ）による）とカルボキシペプチダーゼとの反応の一般式を以下に示す。
【0040】
一般式（Ｉ）における以下の式で表されるアミノ酸と縮合させたアゾアミド基は、ベンゼン環の任意の位置に導入することができるが、カルボキシペプチダーゼの種類によっては、アミノ酸と縮合させたアゾアミド基のベンゼン環への導入位置によって反応しやすくなることから、Ｒ２に対してメタ位又はパラ位に導入することが好ましい。ここで、一般式（Ｉ）において、Ｒ２としてカルボキシ基を有する場合は、メタ位を５位、パラ位を６位と呼び、Ｒ２としてカルボキシ基以外の置換基を有する場合は、メタ位を４位、パラ位を５位と呼ぶ。
【0041】
以下に本発明の一般式（Ｉ）の化合物の非限定的例を示す。
【0042】
本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、後述する実施例で示すように、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）は、グルタミン酸を基質とする前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対するプローブとして機能することができ、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）は、塩基性アミノ酸を基質とするカルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）に対するプローブとして機能することができ、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）は、嵩高いアミノ酸を基質とするカルボキシぺプチダーゼＡ（ＣＰＡ）に対するプローブとして機能することができる。
【0043】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【0044】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【0045】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される化合物を製造することができる。
【0046】
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブである。
【0047】
本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブは、幅広いカルボキシペプチダーゼの検出に適用することが可能である。例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＭ、グルタミン酸を基質とする前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）等に適用することができる。
【0048】
本発明のもう１つの実施態様は、細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）本発明の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法である。
【0049】
また、本発明のもう１つの実施態様は、前立腺がんを検知する方法であって、（ａ）本発明の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用する工程、及び（ｂ）前記蛍光プローブを適用した前立腺の手術検体の蛍光像を測定することを含む、方法である。
（ａ）の工程の本発明の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用するには、例えば、本発明の蛍光プローブの溶液（例えば、１ｘＴＢＳバッファーで希釈して、濃度が５０μＭ程度）を検体全体が浸るように滴下することが挙げられる。また、本発明の蛍光プローブを適用する前に、臨床検体を１ｘＴＢＳバッファー等で洗浄することが好ましい。
臨床検体としては、前立腺がんの手術検体等が挙げられる。
本発明の蛍光プローブを適用した前立腺の臨床検体の蛍光像を測定して、明るい蛍光を示す部位ががんの割合が高いと判断することができる。この場合、蛍光強度自体が高いことでがんの割合が高いと判断してもよいが、好ましくは、本発明の蛍光プローブを適用して一定時間（例えば、３０分、６０分等）経過後の蛍光強度の増加率を指標として、増加率が高い部位ががんの割合が高いと判断することができる。
（ａ）の工程の本発明の蛍光プローブを前立腺の臨床検体に適用するには、例えば、本発明の蛍光プローブの溶液（例えば、１ｘＴＢＳバッファーで希釈して、濃度が５０μＭ程度）を検体全体が浸るように滴下することが挙げられる。また、本発明の蛍光プローブを適用する前に、臨床検体を１ｘＴＢＳバッファー等で洗浄することが好ましい。
臨床検体としては、前立腺がんの手術検体等が挙げられる。
本発明の蛍光プローブを適用した前立腺の臨床検体の蛍光像を測定して、明るい蛍光を示す部位ががんの割合が高いと判断することができる。この場合、蛍光強度自体が高いことでがんの割合が高いと判断してもよいが、好ましくは、本発明の蛍光プローブを適用して一定時間（例えば、３０分、６０分等）経過後の蛍光強度の増加率を指標として、増加率が高い部位ががんの割合が高いと判断することができる。
【0050】
本発明の前立腺がんを検知する方法においては、本発明の蛍光プローブの中でも、Ｒ２が炭素数１～６のアルキル又は炭素数１～６のアルコキシ基である化合物を用いると、細胞内にプローブがより取り込まれ易くなり、前立腺がんをより効果的に検知することができ好ましい。
【0051】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに一般式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【実施例】
【0052】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0053】
［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブである５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）を合成した。
以下のスキーム１により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブである５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）を合成した。
【0054】
スキーム１：カルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブの合成（１）
【0055】
（１）化合物４の合成
Ｈ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物１）（１．３ｇ、４．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（２５０μＬ）のジクロロメタン溶液（４５ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（８６０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で２ｈｒ撹拌した．０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物４）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
HRMS after derivatization by methanol (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 340.1737; found, 347.1731 (-0.6 mmu).
Ｈ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物１）（１．３ｇ、４．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（２５０μＬ）のジクロロメタン溶液（４５ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（８６０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で２ｈｒ撹拌した．０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物４）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
HRMS after derivatization by methanol (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 340.1737; found, 347.1731 (-0.6 mmu).
【0056】
（２）化合物５の合成
Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物２）（６９１ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（４００μＬ）のジクロロメタン溶液（１５ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（３９５ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で３０分撹拌した。０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物５）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物２）（６９１ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（４００μＬ）のジクロロメタン溶液（１５ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（３９５ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で３０分撹拌した。０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物５）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
【0057】
（３）化合物６の合成
Ｈ－Ｐｈｅ－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物３）（１５５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（１００μＬ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（１２０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で約１ｈ撹拌した。０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物６）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
Ｈ－Ｐｈｅ－ＯｔＢｕ塩酸塩（化合物３）（１５５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピリジン（１００μＬ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を、－１０℃に冷却し、トリホスゲン（１２０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、０．６７ｅｑ）を加え、アルゴン雰囲気下で、－１０℃で約１ｈ撹拌した。０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（化合物６）を透明液体として得た。目的物はさらなる精製を行わず、そのまま次反応に使用した。
【0058】
（４）化合物８の合成
５－アミノフルオレセイン（化合物７）（１．９２ｇ、５．５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および炭酸セシウム（３．９７ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を１０ｍＬＤＭＦ溶液に溶解し、無水酢酸（１．１４ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、水を加えジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、目的の粗生成物を黄色の油状物質として得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物８）（１．９４ｇ、８１％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.20 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.92-6.89 (m, 3H), 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 2.3, 8.7 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 169.6, 168.9, 151.8, 151.5, 149.0, 141.6, 129.0, 127.4, 124.4, 122.4, 117.5, 117.1, 110.1, 108.2, 81.6, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 454.0897; found, 454.0888 (-0.9 mmu).
５－アミノフルオレセイン（化合物７）（１．９２ｇ、５．５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）および炭酸セシウム（３．９７ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を１０ｍＬＤＭＦ溶液に溶解し、無水酢酸（１．１４ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、水を加えジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、目的の粗生成物を黄色の油状物質として得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物８）（１．９４ｇ、８１％）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.20 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.92-6.89 (m, 3H), 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 2.3, 8.7 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 169.6, 168.9, 151.8, 151.5, 149.0, 141.6, 129.0, 127.4, 124.4, 122.4, 117.5, 117.1, 110.1, 108.2, 81.6, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 454.0897; found, 454.0888 (-0.9 mmu).
【0059】
（５）化合物１０の合成
化合物８（４００ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（９６ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（２６５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１５分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（化合物９）を粗生成物として得た。続いて、合成中間体をアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）に溶解した後に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３１４μＬ、１．８ｍｍｏｌ、２ｅｑ）および化合物４の粗生成物（１．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を加えて、室温で１時間撹拌を行った。反応液に０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的物の粗生成物を黄色液体として得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で粗精製を行った後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１０）（２５．７ｍｇ、４％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 2.2 Hz, 8.4 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 0.7 Hz, 2.0 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.89-6.88 (m (br), 4H), 4.31-4.28 (dd, J = 4.8 Hz, 9.6 Hz, 1H), 2.38-2.29 (m, 8H), 2.16-2.07 (m, 1H), 1.94-1.84 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 173.9, 173.1, 171.2, 170.5, 153.8, 152.9, 130.0, 128.5, 125.6, 122.2, 119.2, 118.1, 111.5, 107.4, 83.1, 83.0, 81.8, 54.2, 32.6, 28.4, 28.3, 28.2, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 754.2582; found, 754.2595 (1.3 mmu).
化合物８（４００ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（９６ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（２６５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１５分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（化合物９）を粗生成物として得た。続いて、合成中間体をアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）に溶解した後に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３１４μＬ、１．８ｍｍｏｌ、２ｅｑ）および化合物４の粗生成物（１．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を加えて、室温で１時間撹拌を行った。反応液に０．１Ｎ塩酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的物の粗生成物を黄色液体として得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で粗精製を行った後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１０）（２５．７ｍｇ、４％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 2.2 Hz, 8.4 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 0.7 Hz, 2.0 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.89-6.88 (m (br), 4H), 4.31-4.28 (dd, J = 4.8 Hz, 9.6 Hz, 1H), 2.38-2.29 (m, 8H), 2.16-2.07 (m, 1H), 1.94-1.84 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 173.9, 173.1, 171.2, 170.5, 153.8, 152.9, 130.0, 128.5, 125.6, 122.2, 119.2, 118.1, 111.5, 107.4, 83.1, 83.0, 81.8, 54.2, 32.6, 28.4, 28.3, 28.2, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 754.2582; found, 754.2595 (1.3 mmu).
【0060】
（６）化合物１２の合成
化合物１０（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタンに溶解し、そこに二酸化マンガン（ＭｎＯ２）（２５０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、８４ｅｑ）を加えて、１０分間室温で撹拌した。反応懸濁液を濾過し、黄色の合成中間体（化合物１１）のジクロロメタン溶液を得た。続いて、ろ液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて、６時間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去することで、目的物の粗生成物を黄色固体として得た。粗生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１２）（６ｍｇ、２９％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.26 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 0.5 Hz, 8.2 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.64-4.60 (m, 1H), 2.55-2.51 (m, 2H), 2.38-2.35 (m, 1H), 2.23 (s, 6H), 2.16-2.12 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 176.1, 174.0, 170.5, 169.6, 163.6, 157.9, 154.3, 154.1, 152.8, 131.7, 130.1, 128.9, 126.7, 121.2, 119.5, 117.0, 111.7, 83.3, 54.4, 31.2, 27.8, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 640.1174; found, 640.1172 (-0.2 mmu).
化合物１０（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタンに溶解し、そこに二酸化マンガン（ＭｎＯ２）（２５０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、８４ｅｑ）を加えて、１０分間室温で撹拌した。反応懸濁液を濾過し、黄色の合成中間体（化合物１１）のジクロロメタン溶液を得た。続いて、ろ液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて、６時間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去することで、目的物の粗生成物を黄色固体として得た。粗生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１２）（６ｍｇ、２９％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.26 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 0.5 Hz, 8.2 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.64-4.60 (m, 1H), 2.55-2.51 (m, 2H), 2.38-2.35 (m, 1H), 2.23 (s, 6H), 2.16-2.12 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 176.1, 174.0, 170.5, 169.6, 163.6, 157.9, 154.3, 154.1, 152.8, 131.7, 130.1, 128.9, 126.7, 121.2, 119.5, 117.0, 111.7, 83.3, 54.4, 31.2, 27.8, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 640.1174; found, 640.1172 (-0.2 mmu).
【0061】
（７）５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）の合成
化合物１２（１．８ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し、そこに０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ）を加えて、３０分間室温で撹拌した。反応液を希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）で酸性化した後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）（１．７ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.58 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.33 (dd, J = 1.8 Hz, 8.2 Hz , 1H), 7.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.83 (br, 4H), 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.62 (dd, J = 4.9 Hz, 9.2 Hz, 1H), 2.56-2.52 (m, 2H), 2.42-2.33 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H); HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 556.0963; found, 556.0965 (0.2 mmu).
化合物１２（１．８ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯに溶解し、そこに０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ）を加えて、３０分間室温で撹拌した。反応液を希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）で酸性化した後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）（１．７ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.58 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 8.33 (dd, J = 1.8 Hz, 8.2 Hz , 1H), 7.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.83 (br, 4H), 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.62 (dd, J = 4.9 Hz, 9.2 Hz, 1H), 2.56-2.52 (m, 2H), 2.42-2.33 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H); HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 556.0963; found, 556.0965 (0.2 mmu).
【0062】
（８）化合物１５の合成
６－アミノフルオレセイン（化合物１４）（１．０５ｇ、３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を出発物質に、化合物８の合成と同様のプロトコルで合成を行い、目的化合物（１５）（１．３８ｇ、ｑｕｎａｔ．）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 2.3 Hz, 8.6 Hz, 2H), 6.75 (dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.31 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 169.6, 169.1, 156.4, 153.3, 151.9, 151.4, 129.2, 126.9, 117.8, 117.2, 116.6, 115.0, 110.3, 107.6, 80.3, 21.3; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 454.0897; found, 454.0888 (-0.9 mmu).
６－アミノフルオレセイン（化合物１４）（１．０５ｇ、３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を出発物質に、化合物８の合成と同様のプロトコルで合成を行い、目的化合物（１５）（１．３８ｇ、ｑｕｎａｔ．）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 2.3 Hz, 8.6 Hz, 2H), 6.75 (dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.31 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 169.6, 169.1, 156.4, 153.3, 151.9, 151.4, 129.2, 126.9, 117.8, 117.2, 116.6, 115.0, 110.3, 107.6, 80.3, 21.3; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 454.0897; found, 454.0888 (-0.9 mmu).
【0063】
（９）化合物１７の合成
化合物１５（４７０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（１１０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（３００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１５分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（化合物１６）を粗生成物として得た。続いて、合成中間体を１０ｍＬのアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）に溶解した後に，Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３８０μＬ、１．８ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）および化合物４の粗生成物（１．５ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ）を加えて、室温で１時間撹拌を行った。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で粗精製を行った後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１７）（９７．６ｍｇ、１２％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.83 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.06-7.03 (m, 3H), 6.90 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.80 (ddd, J = 1.3 Hz, 3.2 Hz, 8.6 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.49 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.27-4.24 (dd, J = 4.8 Hz, 8.4 Hz, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.22-2.15 (m, 2H), 2.03-2.00 (m, 1H), 1.81-1.35 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.35 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 172.4, 171.6, 169.1, 169.0, 158.4, 155.7, 154.4, 152.0, 151.5, 129.1, 127.0, 118.3, 117.8, 116.8, 114.9, 110.4, 106.7, 82.4, 81.0, 80.8, 52.9, 31.6, 28.1, 28.0, 27.7, 21.2; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 754.2582; found, 754.2585 (0.3 mmu).
化合物１５（４７０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（１１０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（３００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１５分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（化合物１６）を粗生成物として得た。続いて、合成中間体を１０ｍＬのアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）に溶解した後に，Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３８０μＬ、１．８ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ）および化合物４の粗生成物（１．５ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ）を加えて、室温で１時間撹拌を行った。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で粗精製を行った後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物１７）（９７．６ｍｇ、１２％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.83 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.06-7.03 (m, 3H), 6.90 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.80 (ddd, J = 1.3 Hz, 3.2 Hz, 8.6 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.49 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.27-4.24 (dd, J = 4.8 Hz, 8.4 Hz, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.22-2.15 (m, 2H), 2.03-2.00 (m, 1H), 1.81-1.35 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.35 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 172.4, 171.6, 169.1, 169.0, 158.4, 155.7, 154.4, 152.0, 151.5, 129.1, 127.0, 118.3, 117.8, 116.8, 114.9, 110.4, 106.7, 82.4, 81.0, 80.8, 52.9, 31.6, 28.1, 28.0, 27.7, 21.2; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 754.2582; found, 754.2585 (0.3 mmu).
【0064】
（１０）化合物１８の合成
化合物１５（１９９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を出発物質に、化合物１０の合成と同様のプロトコルで合成を行い、目的化合物（化合物１８）（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、９．６％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.06-7.04 (m, 3H), 6.90 (dd, J = 1.2 Hz, 8.8 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 2.3Hz, 8.4 Hz, 2H), 6.73 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.50 (d, J = 1.7, 1H), 6.01 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.30-4.25 (m, 1H), 3.00-2.95 (m, 2H), 2.30 (s, 6H), 1.98 (s, 2H), 1.78-1.71 (m, 1H), 1.59-1.50 (m, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.25-1.21 (m,2H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.0, 170.1, 170.1, 170.0, 156.9, 155.4, 153.0, 153.0, 152.4, 152.4, 129.9, 127.8, 119.0, 118.6, 118.6, 117.6, 117.5, 115.7, 111.0, 107.3, 82.8, 81.2, 53.5, 40.6, 32.4, 29.7, 28.7, 28.2, 22.6, 21.4; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+H]+, 775.31850; found, 775.31915 (0.7 mmu).
化合物１５（１９９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を出発物質に、化合物１０の合成と同様のプロトコルで合成を行い、目的化合物（化合物１８）（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、９．６％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.06-7.04 (m, 3H), 6.90 (dd, J = 1.2 Hz, 8.8 Hz, 2H), 6.81 (dd, J = 2.3Hz, 8.4 Hz, 2H), 6.73 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.50 (d, J = 1.7, 1H), 6.01 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.30-4.25 (m, 1H), 3.00-2.95 (m, 2H), 2.30 (s, 6H), 1.98 (s, 2H), 1.78-1.71 (m, 1H), 1.59-1.50 (m, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.25-1.21 (m,2H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.0, 170.1, 170.1, 170.0, 156.9, 155.4, 153.0, 153.0, 152.4, 152.4, 129.9, 127.8, 119.0, 118.6, 118.6, 117.6, 117.5, 115.7, 111.0, 107.3, 82.8, 81.2, 53.5, 40.6, 32.4, 29.7, 28.7, 28.2, 22.6, 21.4; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+H]+, 775.31850; found, 775.31915 (0.7 mmu).
【0065】
（１１）化合物１９の合成
化合物１５（３５８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（５７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）溶液（１．５ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（２３７ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１０分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（１６）を粗生成物として得た。そのうち１／３量を次反応に用いた。合成中間体（化合物１６）（０．２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を化合物４の粗生成物（０．５ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１３０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ）を加えて１時間室温で撹拌した。反応液は直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行うことで、目的化合物（化合物１９）の粗生成物（１１３ｍｇ、化合物１５から５９％）を黄色固体として得た。化合物１９はさらなる精製を行わず、次反応に用いた。
HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 716.2215; found, 716.2213 (-0.2 mmu).
化合物１５（３５８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を４℃に冷却した濃塩酸（１２Ｎ ＨＣｌａｑ）（２ｍＬ）に溶解し、そこに、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）（５７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）溶液（１．５ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、３０分間氷浴下で撹拌した。原料の消費を確認した後に、塩化スズＩＩ（ＳｎＣｌ２）（２３７ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の希塩酸（１Ｎ ＨＣｌａｑ）溶液（２ｍＬ）を氷浴下でゆっくり滴下し、さらに１０分間氷浴下で撹拌を行った。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をゆっくり滴下し中和を行った後に、酢酸エチルで抽出を行い、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで、黄色油状の合成中間体（１６）を粗生成物として得た。そのうち１／３量を次反応に用いた。合成中間体（化合物１６）（０．２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を化合物４の粗生成物（０．５ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１３０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ）を加えて１時間室温で撹拌した。反応液は直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行うことで、目的化合物（化合物１９）の粗生成物（１１３ｍｇ、化合物１５から５９％）を黄色固体として得た。化合物１９はさらなる精製を行わず、次反応に用いた。
HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 716.2215; found, 716.2213 (-0.2 mmu).
【0066】
（１２）化合物２３の合成
化合物１７（２０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を出発物質として化合物１２と同様のプロトコルで目的化合物（化合物２３）（４．６ｍｇ、２７％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.16 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.27-8.26 (m (br), 2H), 7.68 (dd, J = 1.0 Hz, 1.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.91 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.56-4.51 (m, 1H), 2.46-2.43 (m, 2H), 2.03-2.00 (m, 7H), 2.07-2.01 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 176.1, 173.9, 170.5, 169.6, 163.4, 157.6, 155.6, 154.1, 152.9, 130.5, 130.1, 127.9, 127.8, 119.5, 118.5, 117.1, 111.7, 83.3, 54.4, 31.1, 27.8, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 640.1174; found, 640.1146 (-2.8 mmu).
化合物１７（２０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を出発物質として化合物１２と同様のプロトコルで目的化合物（化合物２３）（４．６ｍｇ、２７％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.16 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.27-8.26 (m (br), 2H), 7.68 (dd, J = 1.0 Hz, 1.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.91 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.56-4.51 (m, 1H), 2.46-2.43 (m, 2H), 2.03-2.00 (m, 7H), 2.07-2.01 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 176.1, 173.9, 170.5, 169.6, 163.4, 157.6, 155.6, 154.1, 152.9, 130.5, 130.1, 127.9, 127.8, 119.5, 118.5, 117.1, 111.7, 83.3, 54.4, 31.1, 27.8, 20.9; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 640.1174; found, 640.1146 (-2.8 mmu).
【0067】
（１３）化合物２４の合成
化合物１８（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を出発物質に、化合物１２の合成と同様のプロトコルで合成を行い、合成中間体（化合物２１）を経て目的化合物（化合物２４）（１１．５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : δ 8.27-8.26 (m, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.21 (d, J = 2.2 , 2H), 6.97 (d, J = 8.7 ,2H), 6.91 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.48 (s, 1H), 2.90 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.03-2.01(m, 1H), 1.86-1.83 (m, 1H), 1.71-1.65 (m, 2H), 1.52-1.46 (m, 2H); HRMS (ESI+) Calcd for [M+H] +,533.16669 ; Found, 533.16743 (0.7 mmu)
化合物１８（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を出発物質に、化合物１２の合成と同様のプロトコルで合成を行い、合成中間体（化合物２１）を経て目的化合物（化合物２４）（１１．５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : δ 8.27-8.26 (m, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.21 (d, J = 2.2 , 2H), 6.97 (d, J = 8.7 ,2H), 6.91 (dd, J = 2.2 Hz, 8.7 Hz, 2H), 4.48 (s, 1H), 2.90 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.03-2.01(m, 1H), 1.86-1.83 (m, 1H), 1.71-1.65 (m, 2H), 1.52-1.46 (m, 2H); HRMS (ESI+) Calcd for [M+H] +,533.16669 ; Found, 533.16743 (0.7 mmu)
【0068】
（１４）６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）の合成
化合物２３（１．５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を出発物質として化合物１３と同様のプロトコルで目的化合物６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）（１．４ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.2-8.25 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 6.80-6.78 (m, 4H), 6.65 (dd, J = 2.0 Hz, 10.8 Hz, 2H), 4.55 (dd, J = 4.9 Hz, 9.2 Hz, 1H), 2.48-2.44 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 1H), 2.10-2.03 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ176.2, 174.0,169.9, 163.4, 162.5, 157.1, 154.7, 154.0, 131.9, 130.6, 128.1, 127.1, 119.7, 114.5, 111.4, 103.6, 71.4, 54.4, 31.1, 27.8; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 556.0963; found, 556.0957 (-0.6 mmu).
化合物２３（１．５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を出発物質として化合物１３と同様のプロトコルで目的化合物６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）（１．４ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.2-8.25 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 6.80-6.78 (m, 4H), 6.65 (dd, J = 2.0 Hz, 10.8 Hz, 2H), 4.55 (dd, J = 4.9 Hz, 9.2 Hz, 1H), 2.48-2.44 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 1H), 2.10-2.03 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ176.2, 174.0,169.9, 163.4, 162.5, 157.1, 154.7, 154.0, 131.9, 130.6, 128.1, 127.1, 119.7, 114.5, 111.4, 103.6, 71.4, 54.4, 31.1, 27.8; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+Na]+, 556.0963; found, 556.0957 (-0.6 mmu).
【0069】
（１５）６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）の合成
化合物１８（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を出発物質として、合成中間体（化合物２４）を経由して、化合物１２、化合物１３と同様のプロトコルで目的化合物６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）（４．０ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ、化合物１８から１８％）を黄色固体として得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 12.85 (s, 1H), 10.20 (s, 2H), 8.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.62 (s, 2H), 7.49 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.56(dd, J = 2.1 Hz, 8.8 Hz, 2H), 4.24-4.18 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 2H), 1.86-1.77 (m, 1H), 1.71-1.62 (m, 1H), 1.56-1.46 (m, 2H), 1.41-1.33 (m, 2H); HRMS (ESI+) Calcd for [M+H] +, 617.18782 ; Found, 617.18867 (0.9mmu)
化合物１８（３３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を出発物質として、合成中間体（化合物２４）を経由して、化合物１２、化合物１３と同様のプロトコルで目的化合物６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）（４．０ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ、化合物１８から１８％）を黄色固体として得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 12.85 (s, 1H), 10.20 (s, 2H), 8.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.62 (s, 2H), 7.49 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.56(dd, J = 2.1 Hz, 8.8 Hz, 2H), 4.24-4.18 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 2H), 1.86-1.77 (m, 1H), 1.71-1.62 (m, 1H), 1.56-1.46 (m, 2H), 1.41-1.33 (m, 2H); HRMS (ESI+) Calcd for [M+H] +, 617.18782 ; Found, 617.18867 (0.9mmu)
【0070】
（１６）６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）の合成
化合物１９の粗生成物（１１３ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、少量の二酸化マンガン（ＭｎＯ２）を加えて１０分間室温で撹拌した。反応懸濁液を濾過し、黄色の合成中間体（化合物２２）のジクロロメタン溶液を得た。続いて、ろ液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて，２４時間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去することで、目的物の粗生成物を黄色固体として得た。粗生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物２７）（２３ｍｇ、化合物１９から２７％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 1.6, 8.4 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 0.4, 1.6 Hz, 1H), 7.27-7.20 (m, 4H), 7.19-7.17 (m, 1H), 6.70 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.57 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, 2H), 4.51-4.45 (m, 1H), 3.20-3.15 (m, 1H), 2.97-2.91 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 172.0, 167.8, 162.0, 159.8, 158.2, 155.7, 153.8, 152.0, 137.3, 129.3, 129.2, 129.1, 128.4, 126.8, 126.6, 115.8, 112.8, 109.0, 102.3, 83.6, 55.0, 36.5; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+H]+, 552.1399; found, 552.1401 (0.2 mmu).
化合物１９の粗生成物（１１３ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、少量の二酸化マンガン（ＭｎＯ２）を加えて１０分間室温で撹拌した。反応懸濁液を濾過し、黄色の合成中間体（化合物２２）のジクロロメタン溶液を得た。続いて、ろ液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて，２４時間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去することで、目的物の粗生成物を黄色固体として得た。粗生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で再精製を行い、凍結乾燥で溶媒を除去することで目的化合物（化合物２７）（２３ｍｇ、化合物１９から２７％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 1.6, 8.4 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 0.4, 1.6 Hz, 1H), 7.27-7.20 (m, 4H), 7.19-7.17 (m, 1H), 6.70 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.57 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, 2H), 4.51-4.45 (m, 1H), 3.20-3.15 (m, 1H), 2.97-2.91 (m, 1H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 172.0, 167.8, 162.0, 159.8, 158.2, 155.7, 153.8, 152.0, 137.3, 129.3, 129.2, 129.1, 128.4, 126.8, 126.6, 115.8, 112.8, 109.0, 102.3, 83.6, 55.0, 36.5; HRMS (ESI+) m/z calcd. for [M+H]+, 552.1399; found, 552.1401 (0.2 mmu).
【0071】
［実施例１］
フルオレセイン、５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）の吸収・蛍光スペクトル測定
吸収・蛍光スペクトル測定の結果から、５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３），６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）および６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）は、強蛍光性のフルオレセインと比較して生理的条件下においてほとんど蛍光性を有しないことが明らかとなった。尚、吸収スペクトルの測定はＵＶ－２４５０（ＳＩＭＡＤＺＵ）、蛍光スペクトルの測定はＦ－７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。
フルオレセイン、５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）の吸収・蛍光スペクトル測定
吸収・蛍光スペクトル測定の結果から、５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３），６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）および６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）は、強蛍光性のフルオレセインと比較して生理的条件下においてほとんど蛍光性を有しないことが明らかとなった。尚、吸収スペクトルの測定はＵＶ－２４５０（ＳＩＭＡＤＺＵ）、蛍光スペクトルの測定はＦ－７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。
【0072】
表１にフルオレセイン、５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）の分光学的性質を記載した。
【0073】
【表1】
【0074】
［実施例２］
酵素アッセイ
５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）に対してＰＳＭＡを適用したところ、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのみ酵素反応による蛍光上昇が観測された。尚、酵素反応に伴う蛍光スペクトルの変化は以下のように測定した。また、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのＰＳＭＡに対する反応性をミカエリスメンテンプロットを作成することで評価した。
酵素アッセイ
５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物１３）、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）に対してＰＳＭＡを適用したところ、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのみ酵素反応による蛍光上昇が観測された。尚、酵素反応に伴う蛍光スペクトルの変化は以下のように測定した。また、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのＰＳＭＡに対する反応性をミカエリスメンテンプロットを作成することで評価した。
【0075】
（１）１０μＭプローブを２００μＬの各アッセイバッファーに溶解した溶液を２本用意した。
（アッセイバッファー：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）
（２）それぞれ０．４４μｇのＰＳＭＡを添加し、３７℃で１５時間インキュベートした。そのうち１本は、ＰＳＭＡ特異的阻害剤２－（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ）－ｐｅｎｔａｎｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ（２－ＰＭＰＡ）（終濃度１０μＭ）も同時に添加し、３７℃で１５時間インキュベーションした。
（３）（２）のインキュベート後の溶液はそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ緩衝液で２８００μＬに希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
（アッセイバッファー：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）
（２）それぞれ０．４４μｇのＰＳＭＡを添加し、３７℃で１５時間インキュベートした。そのうち１本は、ＰＳＭＡ特異的阻害剤２－（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ）－ｐｅｎｔａｎｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ（２－ＰＭＰＡ）（終濃度１０μＭ）も同時に添加し、３７℃で１５時間インキュベーションした。
（３）（２）のインキュベート後の溶液はそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ緩衝液で２８００μＬに希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
【0076】
ＰＳＭＡ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の５－ｆｌｕＡＦＧｌｕ、６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの蛍光スペクトルを図１に示す（５１６ｎｍでのＳ／Ｎ～４１７）。また、ＰＳＭＡを添加した６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）の見掛けの動的パラメータを表２に示す。
【0077】
【表2】
【0078】
また同様に、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）に対してカルボキシぺプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、６－ｆｌｕＡＦＰｈｅ（化合物２７）に対してカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）を適用したところ、酵素反応による蛍光上昇が観測された。
【0079】
＜ＣＰＭ＞
（１）１０μＭプローブを２００μＬのアッセイバッファーに溶解した溶液を３本用意した。
（アッセイバッファー：５０ｍＭ ＭＥＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）
（２）（１）の溶液の１本目にはＣＰＭ ０．８３μｇを添加し、２本目にはＣＰＭ ０．８３μｇとＣＰＭ特異的阻害剤３－（２－ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－２－（ｍｅｒｃａｐｔｏｍｅｔｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＭＧＴＡ）終濃度１０μＭを添加し、３本目にはこれらを添加せずに３７℃で２．５時間インキュベートした。
（３）（２）のインキュベート後の溶液２００μＬをそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ緩衝液２８００μＬで希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
（１）１０μＭプローブを２００μＬのアッセイバッファーに溶解した溶液を３本用意した。
（アッセイバッファー：５０ｍＭ ＭＥＳ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０）
（２）（１）の溶液の１本目にはＣＰＭ ０．８３μｇを添加し、２本目にはＣＰＭ ０．８３μｇとＣＰＭ特異的阻害剤３－（２－ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－２－（ｍｅｒｃａｐｔｏｍｅｔｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＭＧＴＡ）終濃度１０μＭを添加し、３本目にはこれらを添加せずに３７℃で２．５時間インキュベートした。
（３）（２）のインキュベート後の溶液２００μＬをそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ緩衝液２８００μＬで希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
【0080】
ＣＰＭ、阻害剤（ＭＧＴＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＬｙｓの蛍光スペクトルを図２に示す（５１４ｎｍでのＳ／Ｎ～７２）。
【0081】
＜ＣＰＡ＞
（１）１０μＭプローブを６００μＬの各アッセイバッファーに溶解した溶液を３本用意した。
（アッセイバッファー：Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））（２）２μｇのＣＰＡを１８μＬの５ｎｇ／ｍＬ ｔｒｙｐｓｉｎｅ溶液で１時間活性化させた
（３）（１）の溶液に（２）の溶液９μＬを添加し、３７℃で５時間インキュベートした。そのうち１本は、ＣＰＡ特異的阻害剤ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤（終濃度１０μｇ／ｍＬ）も同時に添加し、３７℃で５時間インキュベーションした。
（４）（３）のインキュベート後の溶液のうち２００μＬをそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ阻害剤で２８００μＬに希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
（１）１０μＭプローブを６００μＬの各アッセイバッファーに溶解した溶液を３本用意した。
（アッセイバッファー：Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））（２）２μｇのＣＰＡを１８μＬの５ｎｇ／ｍＬ ｔｒｙｐｓｉｎｅ溶液で１時間活性化させた
（３）（１）の溶液に（２）の溶液９μＬを添加し、３７℃で５時間インキュベートした。そのうち１本は、ＣＰＡ特異的阻害剤ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤（終濃度１０μｇ／ｍＬ）も同時に添加し、３７℃で５時間インキュベーションした。
（４）（３）のインキュベート後の溶液のうち２００μＬをそれぞれ２００ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ阻害剤で２８００μＬに希釈し、蛍光スペクトルを測定した。
【0082】
ＣＰＡ１、阻害剤（ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＰｈｅの蛍光スペクトルを図３に示す（５１７ｎｍでのＳ／Ｎ～１３）。図中のｗｏＣＰＡはＣＰＡ１を添加しない場合の結果である。
【0083】
［実施例３］
細胞ライセートアッセイ
ＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞であるＬＮＣａＰおよびＰＳＭＡ非発現前立腺がん細胞であるＰＣ３の細胞ライセートを作成し、それぞれに対して６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）を添加したところ、ＬＮＣａＰ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＰＣ３細胞ライセートやＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡを添加したＬＮＣａＰ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
細胞ライセートアッセイ
ＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞であるＬＮＣａＰおよびＰＳＭＡ非発現前立腺がん細胞であるＰＣ３の細胞ライセートを作成し、それぞれに対して６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）を添加したところ、ＬＮＣａＰ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＰＣ３細胞ライセートやＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡを添加したＬＮＣａＰ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
【0084】
（１）タンパク質濃度を０．２ｍｇ／ｍＬに調整した各細胞ライセートに対して、終濃度１０μＭの６－ｆｌｕＡＦＧｌｕをそれぞれ加え、３７℃でインキュベーションを行いながら、経時的に蛍光強度をプレートリーダーを用いて測定した。また、ＬＮＣａＰ細胞ライセートのサンプルのうち、１本は、ＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡ（１０μＭ）も同時に添加し、測定を行った。
（２）得られた各ライセートの蛍光強度を０分を１として規格化した上で、インキュベーション時間を横軸にしてプロットを行った。
（２）得られた各ライセートの蛍光強度を０分を１として規格化した上で、インキュベーション時間を横軸にしてプロットを行った。
【0085】
細胞ライセート、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの相対蛍光強度を図４に示す。
【0086】
［実施例４］
生細胞アッセイ
ＰＳＭＡ発現細胞であるＬＮＣａＰおよびＰＳＭＡ非発現細胞であるＰＣ３を９６ウェルプレート上に培養し、そこに６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）の１０μＭ水溶液を添加し、経時的に観察を行った。その結果、ＬＮＣａＰではＰＣ３と比較して、有意な蛍光強度の上昇が観察された。またＬＮＣａＰにおける蛍光上昇は、ＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡによって、有意に抑制された。
生細胞アッセイ
ＰＳＭＡ発現細胞であるＬＮＣａＰおよびＰＳＭＡ非発現細胞であるＰＣ３を９６ウェルプレート上に培養し、そこに６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）の１０μＭ水溶液を添加し、経時的に観察を行った。その結果、ＬＮＣａＰではＰＣ３と比較して、有意な蛍光強度の上昇が観察された。またＬＮＣａＰにおける蛍光上昇は、ＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡによって、有意に抑制された。
【0087】
（１）ポリ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅでコートした９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ上に、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３を培養し、細胞密度が約９０％コンフルエントになった時点で実験を行った。
（２）各ウェルの溶液を、１０μＭの６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのＴＢＳ溶液に交換し、ウェルの蛍光強度を経時的にプレートリーダーを用いて測定した。
（３）得られた各ウェルの蛍光強度値を０分を１として規格化した上で、インキュベーション時間を横軸にしてプロットを行った。
（２）各ウェルの溶液を、１０μＭの６－ｆｌｕＡＦＧｌｕのＴＢＳ溶液に交換し、ウェルの蛍光強度を経時的にプレートリーダーを用いて測定した。
（３）得られた各ウェルの蛍光強度値を０分を１として規格化した上で、インキュベーション時間を横軸にしてプロットを行った。
【0088】
培養細胞、阻害剤（２－ＰＭＰＡ、１０μＭ）を添加した後の６－ｆｌｕＡＦＧｌｕの相対蛍光強度を図５に示す。図中、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【0089】
［実施例５］
ＣＰＭ発現培養細胞（ＭＤＣＫ細胞）を用いた検討
（１）細胞ライセートとの反応性
６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）とＣＰＭ発現培養細胞であるＭＤＣＫ細胞のライセート（０．２ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液２００μＬを３７℃にて反応させ、経時的な蛍光強度変化を測定した。一方にはＣＰＭ阻害剤であるＭＧＴＡを加えた。
Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ、ｎ＝３、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ終濃度：１０μＭ、阻害剤（ＭＧＴＡ）終濃度：１０μＭ
結果を図６に示す。ＭＤＣＫ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＭＧＴＡを添加したＭＤＣＫ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
ＣＰＭ発現培養細胞（ＭＤＣＫ細胞）を用いた検討
（１）細胞ライセートとの反応性
６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ（化合物２６）とＣＰＭ発現培養細胞であるＭＤＣＫ細胞のライセート（０．２ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液２００μＬを３７℃にて反応させ、経時的な蛍光強度変化を測定した。一方にはＣＰＭ阻害剤であるＭＧＴＡを加えた。
Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ、ｎ＝３、６－ｆｌｕＡＦＬｙｓ終濃度：１０μＭ、阻害剤（ＭＧＴＡ）終濃度：１０μＭ
結果を図６に示す。ＭＤＣＫ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＭＧＴＡを添加したＭＤＣＫ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
【0090】
（２）生細胞イメージング
ＭＤＣＫ細胞にＨＢＳＳ（＋）で希釈した６－ＦＤＡＡＦＬｙｓ（化合物２４）の溶液（終濃度：１０μＭ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養しながら以下の条件で共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。結果を図７及び８に示す。
Ｅｘ／ｅｍ：４８８／５００－５５０ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ
ＣＰＭを高発現するＭＤＣＫ細胞を用いた生細胞イメージングを行い、６－ＦＤＡＡＦＬｙｓを加えることで時間経過とともに細胞内の蛍光強度増大が観察された。一方ＣＰＭ阻害剤のＭＧＴＡを加えたＭＤＣＫ細胞の場合は、蛍光強度の増大が抑制された。
ＭＤＣＫ細胞にＨＢＳＳ（＋）で希釈した６－ＦＤＡＡＦＬｙｓ（化合物２４）の溶液（終濃度：１０μＭ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養しながら以下の条件で共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。結果を図７及び８に示す。
Ｅｘ／ｅｍ：４８８／５００－５５０ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ
ＣＰＭを高発現するＭＤＣＫ細胞を用いた生細胞イメージングを行い、６－ＦＤＡＡＦＬｙｓを加えることで時間経過とともに細胞内の蛍光強度増大が観察された。一方ＣＰＭ阻害剤のＭＧＴＡを加えたＭＤＣＫ細胞の場合は、蛍光強度の増大が抑制された。
【0091】
［合成実施例２］
以下のスキーム２により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブである２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を合成した。
以下のスキーム２により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブである２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を合成した。
【0092】
スキーム２：カルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プローブ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ）の合成（２）
【0093】
【0094】
（１）Ｎ，Ｎ－ジアリル－３－ブロモ－４－メチルアニリン（２６）の合成
３－ブロモ－４－メチルアニリン（２５）（３．０４ｇ、０．０１６ｍｏｌ、１ｅｑ）、炭酸カリウム（３．３８ｇ、０．０２４ｍｏｌ、１．５ｅｑ）をアセトニトリル１５ｍＬに溶解し、臭化アリル（５．６５ｍＬ、０．０６５ｍｏｌ、４ｅｑ）を加えて８０℃アルゴン雰囲気下で２３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０－８５／１５）によって精製し、化合物２６（３．４１ｇ、７９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ. 7.07 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.94 (m, 1H), 6.61 (m, 1H), 5.91-5.84 (m, 2H), 5.24-5.20 (m, 4H), 3.92 (m, 4H), 2.33 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ. 148.0, 133.6, 130.9, 125.6, 124.9, 116.3, 116.0, 111.7, 52.9, 21.6.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ. 7.07 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.94 (m, 1H), 6.61 (m, 1H), 5.91-5.84 (m, 2H), 5.24-5.20 (m, 4H), 3.92 (m, 4H), 2.33 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ. 148.0, 133.6, 130.9, 125.6, 124.9, 116.3, 116.0, 111.7, 52.9, 21.6.
【0095】
（２）２Ｍｅ５Ａｌｌｙｌ２Ｎ－ＴＧ（２８）の合成
Ｎ，Ｎ－ジアリル－３－ブロモ－４－メチルアニリン（２６）（１．０６ｇ、３．９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をテトラヒドロフラン８ｍＬに溶解し、－７８℃アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌し、１Ｍ ｓｅｃ－ブチルリチウム シクロヘキサン、ノルマルヘキサン溶液（４ｍＬ、４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をゆっくり滴下した。１５分後、テトラヒドロフラン１１ｍＬに溶解したｄｉＴＢＳ－キサンテン（２７）（Shieh, P., Hangauer, M. J. & Bertozzi, C. R. Fluorogenic Azidofluoresceins for Biological Imaging. J. Am. Chem. Soc. 134, 17428-17431 (2012)に従って合成）（１．８２ｇ、３．９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え、室温に戻しながらアルゴン雰囲気下で１時間撹拌した。２Ｎ塩酸 ２ｍＬを加え、室温で２０分間撹拌した後、ろ過により化合物２８（１．５８ｇ）をクルードとして得た。
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 398.17507 (C26H24NO3), found 398.17548 (- 0.4 mmu).
HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 398.17507 (C26H24NO3), found 398.17548 (- 0.4 mmu).
【0096】
（３）２Ｍｅ５Ａｌｌｙｌ２Ｎ－ＴＧ－ＭＯＭ（２９）の合成
２Ｍｅ５Ａｌｌｙｌ２Ｎ－ＴＧ（２８）（５００．８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、炭酸カリウム（２０９．６ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解し、クロロメチルメチルエーテル（１４３μＬ、１．８８ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を加え、室温で１５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０－５０／５０）によって粗精製を行い、２Ｍｅ５Ａｌｌｙｌ２Ｎ－ＴＧ－ＭＯＭ（２９）（１５３．３ｍｇ）をクルードとして得た。
【0097】
（４）２Ｍｅ５ＮＨ２－ＴＧ－ＭＯＭ（３０）の合成
２Ｍｅ５Ａｌｌｙｌ２Ｎ－ＴＧ－ＭＯＭ（２９）（２６９．７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、１，３－ジメチルバルビツール酸（７６４．３ｍｇ、４．８９ｍｍｏｌ、８ｅｑ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１４３．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ）を脱酸素ジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、室温で１９時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝１００／０－９０／１０）によって粗精製を行った。さらに、分取ＴＬＣ（溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）によって精製を行い、２Ｍｅ５ＮＨ２－ＴＧ－ＭＯＭ（３０）（１５４．８ｍｇ、７０％）を得た。
1H NMR (400MHz, CD3OD): δ. 7.31 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.25 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.06 (dd, 1H, J = 9.0 Hz, 2.4 Hz), 6.87 (dd, 1H, J = 8.3 Hz, 2.4 Hz), 6.62 (dd, 1H, J = 9.6 Hz, 2.0 Hz), 6.59 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.49 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 5.37 (s, 2H), 3.50 (s, 3H), 1.9 (s, 3H); 13C NMR (101MHz, CD3OD): δ. 187.5, 164.5, 161.6, 156.3, 155.8, 147.3, 133.8, 133.2, 132.4, 131.5, 129.6, 125.6, 118.8, 118.0, 116.6, 116.5, 116.3, 105.6, 104.0, 95.8, 56.9, 18.5. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 362.13868 (C22H20NO4), found 362.13958 (- 0.9 mmu).
1H NMR (400MHz, CD3OD): δ. 7.31 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.25 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.06 (dd, 1H, J = 9.0 Hz, 2.4 Hz), 6.87 (dd, 1H, J = 8.3 Hz, 2.4 Hz), 6.62 (dd, 1H, J = 9.6 Hz, 2.0 Hz), 6.59 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.49 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 5.37 (s, 2H), 3.50 (s, 3H), 1.9 (s, 3H); 13C NMR (101MHz, CD3OD): δ. 187.5, 164.5, 161.6, 156.3, 155.8, 147.3, 133.8, 133.2, 132.4, 131.5, 129.6, 125.6, 118.8, 118.0, 116.6, 116.5, 116.3, 105.6, 104.0, 95.8, 56.9, 18.5. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 362.13868 (C22H20NO4), found 362.13958 (- 0.9 mmu).
【0098】
（５）２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の合成
２Ｍｅ５ＮＨ２－ＴＧ－ＭＯＭ（３０）（２９．５ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を予め４℃に冷却しておいた６Ｎ塩酸 ０．５ｍＬに溶解し、反応液を０℃に冷却した。０．１ｍＬの水に溶解した亜硝酸ナトリウム（５．０７ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、０．９ｅｑ）を滴下し、０℃で５分間撹拌した。０．１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解した塩化スズ（ＩＩ）（１３．９３ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、０．９ｅｑ）を滴下し、直後に１ｍＬのジクロロメタンに溶解したｄｉｔＢｕＧｌｕ－ＮＣＯ（５８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）を加えた後、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ１１以上になるまで加え、０℃で４０分間激しく撹拌した。２Ｎ塩酸をｐＨ７になるまで加え、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過により無水硫酸ナトリウムを除いた。ろ液に二酸化マンガンを過剰量加え、室温で２０分間撹拌した。セライトろ過により二酸化マンガンを除き、溶媒を減圧留去した。残渣をセミ分取ＨＰＬＣにより精製し、中間体を得た。化合物にジクロロメタン０．５ｍＬ、トリフルオロ酢酸０．５ｍＬを加えて、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣をセミ分取ＨＰＬＣにより精製し、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）（１．９ｍｇ、４．６％（２ｓｔｅｐｓ））を得た。
1H NMR (400MHz, CD3OD): δ. 8.20 (dd, 1H, J = 8.3 Hz, 2.0 Hz), 7.94 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 7.23 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.12 (dd, 1H, J = 9.3 Hz, 2.2 Hz), 4.60-4.56 (m, 1H), 2.51-2.47 (m, 2H), 2.38-2.29 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.13-2.03 (m, 1H); 13C NMR (101MHz, CD3OD): δ. 176.2, 174.4, 174.0, 163.8, 160.8, 150.9, 143.9, 134.2, 133.6, 133.5, 126.4, 125.6, 122.3, 117.6, 104.0, 54.4, 31.1, 27.8, 20.0. ※4級炭素のピークが一本不足 HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 504.14014 (C26H22N3O8), found 504.13930 (+ 0.8 mmu).
1H NMR (400MHz, CD3OD): δ. 8.20 (dd, 1H, J = 8.3 Hz, 2.0 Hz), 7.94 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 7.23 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.12 (dd, 1H, J = 9.3 Hz, 2.2 Hz), 4.60-4.56 (m, 1H), 2.51-2.47 (m, 2H), 2.38-2.29 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.13-2.03 (m, 1H); 13C NMR (101MHz, CD3OD): δ. 176.2, 174.4, 174.0, 163.8, 160.8, 150.9, 143.9, 134.2, 133.6, 133.5, 126.4, 125.6, 122.3, 117.6, 104.0, 54.4, 31.1, 27.8, 20.0. ※4級炭素のピークが一本不足 HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ calcd for 504.14014 (C26H22N3O8), found 504.13930 (+ 0.8 mmu).
【0099】
［実施例５］
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の吸収・蛍光スペクトル測定
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の吸収・蛍光スペクトル測定の結果を図９及び図１０に示す。２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）は、強蛍光性のフルオレセインと比較して生理的条件下においてほとんど蛍光性を有しないことが明らかとなった。尚、吸収スペクトルの測定はＵＶ－２４５０（ＳＩＭＡＤＺＵ）、蛍光スペクトルの測定はＦ－７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の吸収・蛍光スペクトル測定
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の吸収・蛍光スペクトル測定の結果を図９及び図１０に示す。２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）は、強蛍光性のフルオレセインと比較して生理的条件下においてほとんど蛍光性を有しないことが明らかとなった。尚、吸収スペクトルの測定はＵＶ－２４５０（ＳＩＭＡＤＺＵ）、蛍光スペクトルの測定はＦ－７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。
【0100】
表３に２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の分光学的性質を記載した。
【0101】
【表3】
【0102】
［実施例６］酵素アッセイ
（１）ＰＳＭＡ精製酵素との反応性 ２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（１０μＭ、２００μＬ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡ（０．４４μｇ）を１ｘＴＢＳバッファー中、３７℃にて反応させ、３０分おきに蛍光強度を測定した。阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ、Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ．ｎ＝３．
、酵素反応に伴う蛍光強度変化は実施例２に記載の方法と同様に測定した。結果を図１１に示す。
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）に対してＰＳＭＡを適用したところ、酵素反応による蛍光上昇が観測された。また、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）の存在下においては、蛍光上昇が観測されなかった。
（１）ＰＳＭＡ精製酵素との反応性 ２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（１０μＭ、２００μＬ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡ（０．４４μｇ）を１ｘＴＢＳバッファー中、３７℃にて反応させ、３０分おきに蛍光強度を測定した。阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ、Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ．ｎ＝３．
、酵素反応に伴う蛍光強度変化は実施例２に記載の方法と同様に測定した。結果を図１１に示す。
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）に対してＰＳＭＡを適用したところ、酵素反応による蛍光上昇が観測された。また、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）の存在下においては、蛍光上昇が観測されなかった。
【0103】
また、様々な濃度の２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）溶液にＰＳＭＡを添加した際の、反応初期における蛍光増加率をプロットしたものを図１２に、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧと６－ｆｌｕＡＦＧｌｕ（化合物２５）の見掛けの動的パラメータを表４に示す。
【0104】
【表4】
【0105】
（２）反応溶液のＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡと２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を１０時間反応させた後の溶液及び、標品として合成した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
プローブ濃度：１０μＭ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、酵素反応溶液）、２μＭ（２ＭｅＴＧ）．結果を図１３及び図１４に示す。
上記の結果から、ＰＳＭＡ存在下で蛍光性を示す２ＭｅＴＧ及び２Ｍｅ５ＯＨ－ＴＧの生成が確認された。阻害剤（２－ＰＭＰＡ）を添加した場合やＰＳＭＡ非存在下では、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは安定であることが示された。
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＰＳＭＡと２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）を１０時間反応させた後の溶液及び、標品として合成した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析を行った。
プローブ濃度：１０μＭ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、酵素反応溶液）、２μＭ（２ＭｅＴＧ）．結果を図１３及び図１４に示す。
上記の結果から、ＰＳＭＡ存在下で蛍光性を示す２ＭｅＴＧ及び２Ｍｅ５ＯＨ－ＴＧの生成が確認された。阻害剤（２－ＰＭＰＡ）を添加した場合やＰＳＭＡ非存在下では、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは安定であることが示された。
【0106】
［実施例７］
前立腺がん由来培養細胞を用いた検討
（１）細胞ライセートとの反応性
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（２０μＭ、１００μＬ）と細胞ライセート（０．３６ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）をＴＢＳ－Ｔバッファー中、３７℃にて反応させ、３０分おきに蛍光強度を測定した。測定の手順は実施例３に記載した通りである。
Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ、ｎ＝３、プローブ終濃度：１０μＭ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ
結果を図１５に示す。ＬＮＣａＰ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＰＣ３細胞ライセートやＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡを添加したＬＮＣａＰ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
前立腺がん由来培養細胞を用いた検討
（１）細胞ライセートとの反応性
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（２０μＭ、１００μＬ）と細胞ライセート（０．３６ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）をＴＢＳ－Ｔバッファー中、３７℃にて反応させ、３０分おきに蛍光強度を測定した。測定の手順は実施例３に記載した通りである。
Ｅｘ／ｅｍ：４８５／５３５ｎｍ、ｎ＝３、プローブ終濃度：１０μＭ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ
結果を図１５に示す。ＬＮＣａＰ細胞ライセートでは大幅な蛍光増大が観察された一方で、ＰＣ３細胞ライセートやＰＳＭＡ特異的阻害剤２－ＰＭＰＡを添加したＬＮＣａＰ細胞ライセートではほとんど蛍光増大が観察されなかった。
【0107】
（２）生細胞イメージング
ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ高発現）又はＰＣ３細胞（ＰＳＭＡ非発現）にＨＢＳＳ（＋）で希釈した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（終濃度：１０μＭ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養しながら１時間おきに以下の条件で共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。
Ｅｘ／ｅｍ：４９０／５００－６００ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ
結果を図１６及び図１７に示す。ＰＳＭＡを高発現するＬＮＣａＰ細胞を用いた場合は、時間の経過とともに蛍光像の蛍光強度が増大しているのに対して（図１６）、ＰＳＭＡ非発現のＰＣ３細胞を用いた場合は蛍光像に変化は見られなかった（図１７）。
ＬＮＣａＰ細胞（ＰＳＭＡ高発現）又はＰＣ３細胞（ＰＳＭＡ非発現）にＨＢＳＳ（＋）で希釈した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ（化合物３２）の溶液（終濃度：１０μＭ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養しながら１時間おきに以下の条件で共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。
Ｅｘ／ｅｍ：４９０／５００－６００ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ
結果を図１６及び図１７に示す。ＰＳＭＡを高発現するＬＮＣａＰ細胞を用いた場合は、時間の経過とともに蛍光像の蛍光強度が増大しているのに対して（図１６）、ＰＳＭＡ非発現のＰＣ３細胞を用いた場合は蛍光像に変化は見られなかった（図１７）。
【0108】
（３）阻害剤実験
プローブ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ）及び阻害剤を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１５時間培養後、共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。プローブ濃度：１０μＭ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ、Ｅｘ／ｅｍ：４９０／５００－６００ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ．
細胞内外の領域をそれぞれ１０ヶ所ずつＲＯＩで囲い、蛍光強度の平均値を求めた。図１８ａに撮影した蛍光像を、図１８ｂに阻害剤を添加した場合と未添加の場合の蛍光強度の平均値を示す。
図１８ａから、阻害剤を添加した場合は、蛍光像の強度が上昇しないことが示される。また、図１８ｂの左側のグラフ（阻害剤を添加しない場合）から、細胞内での蛍光強度の平均値が細胞外に比べて非常に高いことが示されている。このことから、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは、細胞内へより取り込まれやすい蛍光プローブであることが示唆される。
プローブ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ）及び阻害剤を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１５時間培養後、共焦点顕微鏡にて蛍光像を撮影した。プローブ濃度：１０μＭ、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）濃度：１０μＭ、Ｅｘ／ｅｍ：４９０／５００－６００ｎｍ、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：５０μｍ．
細胞内外の領域をそれぞれ１０ヶ所ずつＲＯＩで囲い、蛍光強度の平均値を求めた。図１８ａに撮影した蛍光像を、図１８ｂに阻害剤を添加した場合と未添加の場合の蛍光強度の平均値を示す。
図１８ａから、阻害剤を添加した場合は、蛍光像の強度が上昇しないことが示される。また、図１８ｂの左側のグラフ（阻害剤を添加しない場合）から、細胞内での蛍光強度の平均値が細胞外に比べて非常に高いことが示されている。このことから、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは、細胞内へより取り込まれやすい蛍光プローブであることが示唆される。
【0109】
（４）細胞外液のＬＣ－ＵＶ／ＭＳ分析
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いてＬＮＣａＰ細胞のイメージングを行った後、回収した細胞外液及び、標品として合成した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＭＳ分析を以下の条件で行った。
プローブ濃度：１０μＭ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ，細胞外液）、２μＭ（２ＭｅＴＧ）．
結果を図１９及び図２０に示す。
上記の結果から、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）非存在下において、蛍光性を示す２ＭｅＴＧの生成が確認された。また、阻害剤を添加した場合は２ＭｅＴＧは生成せず、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは安定であることが示された。
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いてＬＮＣａＰ細胞のイメージングを行った後、回収した細胞外液及び、標品として合成した２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ、２ＭｅＴＧのＬＣ－ＭＳ分析を以下の条件で行った。
プローブ濃度：１０μＭ（２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ，細胞外液）、２μＭ（２ＭｅＴＧ）．
結果を図１９及び図２０に示す。
上記の結果から、阻害剤（２－ＰＭＰＡ）非存在下において、蛍光性を示す２ＭｅＴＧの生成が確認された。また、阻害剤を添加した場合は２ＭｅＴＧは生成せず、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧは安定であることが示された。
【0110】
［実施例８］
ヒト前立腺がん手術検体を用いた検討
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いて、以下のプロトコルによりヒト前立腺がん手術検体を用いた検討を行った。
ヒト前立腺がん手術検体を用いた検討
２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを用いて、以下のプロトコルによりヒト前立腺がん手術検体を用いた検討を行った。
【0111】
＜プロトコル＞
１．手術検体を１ｘＴＢＳバッファーで洗浄
２．５０μＭの２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液（１ｘＴＢＳバッファーで希釈）を検体全体が浸るように滴下
３．ヒーターで４０℃に加温しながら、Ｍａｅｓｔｒｏにて４時間後まで蛍光像を撮影
４．４時間後の蛍光像から判断し、明るい蛍光を示す部位と蛍光を示さない部位をそれぞれ数ヶ所ずつ選んで切り出し、１０％ホルマリン溶液で固定
５．病理医に依頼して各部位のＨＥ染色・ＰＳＭＡ免疫染色を行い、がん部位の割合やＰＳＭＡ発現を評価
１．手術検体を１ｘＴＢＳバッファーで洗浄
２．５０μＭの２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液（１ｘＴＢＳバッファーで希釈）を検体全体が浸るように滴下
３．ヒーターで４０℃に加温しながら、Ｍａｅｓｔｒｏにて４時間後まで蛍光像を撮影
４．４時間後の蛍光像から判断し、明るい蛍光を示す部位と蛍光を示さない部位をそれぞれ数ヶ所ずつ選んで切り出し、１０％ホルマリン溶液で固定
５．病理医に依頼して各部位のＨＥ染色・ＰＳＭＡ免疫染色を行い、がん部位の割合やＰＳＭＡ発現を評価
【0112】
４種類の検体を用いて行った結果を図２１～図２４に示す。また、上記プロトコルを変更（プローブ溶液に浸したガーゼで表面を覆う方法に変更し、一時的にガーゼを外して蛍光像を撮影）して行った結果を図２５に示す。
各図の（ａ）は、手術検体をＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液に浸す前と、浸してから４時間後の写真を示し（右側は蛍光像である）、（ｂ）の左側のグラフは、手術検体の選択部位におけるＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液に浸してから４時間後までの蛍光強度の変化を示し、（ｃ）は、各部位におけるＰＳＭＡ発現、がん部位の割合、ＧＳを評価した結果を示す。ここで、ＧＳとは悪性腫瘍を評価する指標で、値が高い程悪性度が高い。
また、検体イメージングを行った各部位の蛍光強度の３０分後、６０分後、２４０分後での蛍光強度の増加率を図２６にまとめた。ここで、黒の棒グラフはがん部位を含むもの、白の棒グラフはがん部位を含まないものである。
各図の（ａ）は、手術検体をＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液に浸す前と、浸してから４時間後の写真を示し（右側は蛍光像である）、（ｂ）の左側のグラフは、手術検体の選択部位におけるＭｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧ溶液に浸してから４時間後までの蛍光強度の変化を示し、（ｃ）は、各部位におけるＰＳＭＡ発現、がん部位の割合、ＧＳを評価した結果を示す。ここで、ＧＳとは悪性腫瘍を評価する指標で、値が高い程悪性度が高い。
また、検体イメージングを行った各部位の蛍光強度の３０分後、６０分後、２４０分後での蛍光強度の増加率を図２６にまとめた。ここで、黒の棒グラフはがん部位を含むもの、白の棒グラフはがん部位を含まないものである。
【0113】
これらの結果から、蛍光強度の上昇とがん部位の有無やＰＳＭＡの発現量には大まかな相関があり、２Ｍｅ５ＧｌｕＡＦ－ＴＧを前立腺がんイメージングプローブとして利用できる可能性が示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】