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特許7353616糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-22
(45)【発行日】2023-10-02
(54)【発明の名称】糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230925BHJP
C07K 14/405 20060101ALI20230925BHJP
A61K 36/05 20060101ALI20230925BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20230925BHJP
A61K 38/16 20060101ALN20230925BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K14/405
A61K36/05
A61P35/00
A61K38/16
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019033404
(22)【出願日】2019-02-26
(65)【公開番号】P2020137423
(43)【公開日】2020-09-03
【審査請求日】2021-12-03
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術）「高度ダウンストリーム技術の開発（海洋性生物由来のレクチンタンパク質を利用したリガンド開発）」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】堀 貫治
(72)【発明者】
【氏名】平山 真
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】再公表特許第２００６／０９３０８８（ＪＰ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－１４１６７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１４７８３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Jpn. J. Phycol. (Sorui)，2007年，Vol. 55，pp. 33-38
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／１２－１／１３
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖結合性タンパク質をコードし、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、又は該配列番号１のヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項2】
ハネモ（Bryopsis）属由来であることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来であることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖結合性を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は該配列番号３に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、を含むことを特徴とする新規タンパク質。
【請求項5】
ハネモ（Bryopsis）属由来であることを特徴とする請求項４に記載の新規タンパク質。
【請求項6】
ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来であることを特徴とする請求項５に記載の新規タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドに関し、特に糖鎖結合性のタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞表面や体液中に存在する糖タンパク質や糖脂質等の複合糖質の糖鎖は、一種の情報素子として機能し、発生、免疫、がん、感染等の重要な生命現象に深く関わっている。一方、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンは糖鎖認識分子として機能し、糖鎖と同様に生物学的に重要な役割を担っている。
【0003】
これまでに、海藻類又は藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。レクチンの一部は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス等のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献１～１１）。また、糖鎖はウイルスに限らず、上述のようにがんにも関連しており、近年、硫酸化グリコサミノグリカンががん組織における主要ながん免疫抗原であることや（非特許文献１２）、がん細胞の発生や転移に深く関与していること（非特許文献１３及び１４）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Boyd,M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother.41, 1521-1530, 1997.
【文献】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. AgentsChemother. 47, 2518-2525, 2003.
【文献】Helle,F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.
【文献】Barrientos,L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.
【文献】Dey,B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.
【文献】O’Keefe, B. R. et al.,J. Virol. 84, 2511-2521,2010.
【文献】Hori,K.et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.
【文献】Sato,Y.,Okuyama, S., and Hori, K., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.
【文献】Sato,Y.,Morimoto,K., Hirayama, M., and Hori, K. Biochem. Biophys. Res. commun. 405,291-296, 2011.
【文献】佐藤雄一郎、平山 真、藤原佳史、森本金治郎、堀 貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)
【文献】Sato,Y.,Hirayama, M., Morimoto,K., Yamamoto, N., Okuyama, S., and Hori, K. J. Biol.Chem. 286, No.22, 19446-19458, 2011.
【文献】Hiroto Kato et al., Cell Reports. 20,1073-1087, 2017.
【文献】Adam Pudelko et al., The FEBS Journal(First published: 13 January2019, online: https://doi.org/10.1111/febs.14748)
【文献】Shuji Mizumoto et al., J. Biol. Chem.287, 18985-18994, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、現在のところそのような硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖を特異的に認識する物質はまだ十分に知られているとは言いがたく、その数は限られているため、上記物質が十分に供給できる状況にはなっていない。そのような物質は、がんの治療や診断に利用できる可能性があるため、新規物質がさらに多く見出され、その特性が明らかにされることが必要である。
【0006】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、上記のようながんの診断及び治療への利用可能性がある硫酸化糖鎖を認識する新規タンパク質を探索し、提供できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ハネモ属（Bryopsis属）の藻類から得られたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡから新規のタンパク質（レクチン）を発現させることに成功した。
【0008】
具体的に、本発明に係る新規ポリヌクレオチドは、糖鎖結合性タンパク質をコードし、 配列番号１若しくは２のヌクレオチド配列を含む、又は該配列番号１若しくは２のヌクレオチド配列若しくはそれらと相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする。
【0009】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）、ハネモ（Bryopsis plumose）、オオハネモ（Bryopsis maxima）等のハネモ（Bryopsis）属由来であってもよい。
【0010】
本発明に係る新規タンパク質は、糖鎖結合性を有し、配列番号３若しくは４に記載のアミノ酸配列、又は該配列番号３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、を含むことを特徴とする。
【0011】
また、本発明に係る新規タンパク質は、硫酸基を含む糖鎖を特異的に認識することを特徴とし、ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）、ハネモ（Bryopsis plumose）、オオハネモ（Bryopsis maxima）等のハネモ（Bryopsis）属由来であってもよい。
【0012】
本発明に係るがんの治療用又は診断用医薬組成物は、上記本発明に係る新規タンパク質を含むことを特徴とする。本発明に係る医薬組成物は、がん細胞に発現し、がん抗原となることが知られている硫酸化グリコサミノグリカン等の硫酸基を含む糖鎖を認識できる上記新規タンパク質を含むため、がん治療やがん診断への利用が可能である。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係るポリヌクレオチドは糖鎖結合性の新規タンパク質をコードし、当該新規タンパク質は、がん抗原となる硫酸化糖鎖を認識できるため、がんの治療や診断に利用できる可能性があり、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実施例１で得られたＢｃＢｒｙ１－１の全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図2】実施例１で得られたＢｃＢｒｙ１－２の全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び演繹アミノ酸配列を示す図である。
【図3】実施例２におけるHis-rBcBry1-1の発現を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図4】実施例２におけるHis-rBcBry1-1に対するＦａｃｔｏｒ Ｘａによる酵素消化条件を検討するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図5】実施例２におけるHis-rBcBry1-1の抗Ｈｉｓタグ抗体による検出可能性を検討するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図6】実施例４における糖鎖固定化アレイで用いた糖鎖を示す図である。
【図7】実施例４におけるAnti-His-tag-Alexa Fluor 647によるHis-rBcBry1-1N及びCの検出可能性を検討するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図8】実施例４におけるHis-rBcBry1-1Cの糖鎖固定化アレイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0016】
本発明の一実施形態は、ハネモ属藻類であるネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来の新規タンパク質（ＢｃＢｒｙ１）である。本発明に係る新規タンパク質は、糖鎖結合性を有し、例えば配列番号１又は２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。配列番号１又は２のヌクレオチド配列により発現されるタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３又は４に示される。
【0017】
本明細書中で用いられる用語「タンパク質」は、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、本発明に係るタンパク質は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【0018】
用語「単離された」ポリペプチド又はタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。一方、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質の場合においても、任意の適切な技術によって実質的に精製され、宿主細胞から単離されたものが用いられる。
【0019】
本発明に係るタンパク質は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るタンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【0020】
一実施形態において、本発明に係るタンパク質は、配列番号３若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号３若しくは４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体である。本発明に係るタンパク質は、従来公知のレクチンのアミノ酸配列との相同性が非常に低い新規タンパク質であるという特徴を有する。
【0021】
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、及びタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【0022】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【0023】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が、糖鎖結合性を有する所望の変異体であるか否かを容易に決定し得る。
【0024】
上記「１個若しくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、若しくは付加できる程度の数（好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【0025】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間又は引き続く操作及び保存の間の安定性及び持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【0026】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクター及び細胞等を用いて行なうことができる。
【0027】
本発明者らは、上記本発明に係るタンパク質が、硫酸基を含む糖鎖を認識することを見出した。ここで、「糖鎖」とは、直鎖又は分岐したオリゴ糖又は多糖を意味する。また上記糖鎖は、タンパク質との結合様式によって、アスパラギンと結合するＮ－グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｎ型糖鎖」、「Ｎ－グリカン」という）及びセリン、スレオニンなどと結合するＯ－グリコシド結合糖鎖（以下、「Ｏ型糖鎖」、「Ｏ－グリカン」という）に大別され、他にＬｅｗｉｓ型、ＡＢＯ型、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）やＬａｃシリーズ等が知られている。
【0028】
なお、オリゴ糖とは、単糖又は単糖の置換誘導体が２～１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。多糖は、構成糖の種類によって異なるが、ウロン酸やエステル硫酸を多く含む糖質を酸性多糖、中性糖のみのものを中性多糖という。多糖のうち、ムコ多糖とよばれる一群の多糖は、ほとんどがタンパク質と結合しており、プロテオグリカンという。単糖とは、糖鎖の構成単位となるもので、加水分解によってそれ以上簡単な分子にならない基本的物質である。
【0029】
さらに、単糖は、カルボキシル基などの酸性側鎖を有する酸性糖、ヒドロキシル基がアミノ基で置換されたアミノ糖、それ以外の中性糖の３つに大別される。生体内に存在する単糖としては、酸性糖はＮ－アセチルノイラミン酸やＮ－グリコリルノイラミン酸（以下、「Ｎｅｕ５Ｇｃ」という）等のシアル酸や、ウロン酸等があり、アミノ糖としてはＮ－アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」という）やＮ－アセチルガラクトサミン等があり、中性糖としてはグルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等が挙げられる。
【0030】
ポリペプチドが糖鎖と結合するか否かは、下記実施例に示す方法を用いることができるが、他に例えば標的となる糖鎖、又は糖鎖が結合した糖タンパク質等を固定化したカラムに、試験対象であるポリペプチドを通し、当該カラムにポリペプチドが結合したか否かをその通過液に含まれるポリペプチドの量、又は特異的溶出剤でカラムから溶出したポリペプチドの量により評価することができる。また標的となる糖鎖が結合した糖タンパク質をメンブレン等に固定化し、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート、ペルオキシダーゼ等で標識したポリペプチドを用いて検出するウエスタンブロット法（法医学の実際と研究、37, 155, 1994 参照）、ドットブロット法（AnalyticalBiochemistry, 204(1), 198, 1992 参照）等を用いて評価することができる。
【0031】
本発明は、上述したように、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。
【0032】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【0033】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マー又は１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【0034】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側又は３’側で上述のタグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【0035】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【0036】
このような変異体としては、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。変異体は、コード若しくは非コード領域、又はその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、又は付加を生成し得る。
【0037】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【0038】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【0039】
上記ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring HarborLaboratory（1989）に記載されている方法のような周知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【0040】
ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【0041】
本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【0042】
本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び／又は長さのものを用いてもよい。
【0043】
あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【実施例】
【0044】
以下に、本発明に係る新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドについて詳細に説明するための実施例を示す。
【0045】
［実施例１：ネザシハネモ由来ＢｃＢｒｙ－１のｃＤＮＡクローニング］
＜方法＞
（ＲＮＡ採取用試料）
ＲＮＡ採取用試料として、広島県広島市宇品で採集したネザシハネモ（Bryopsis corticulans）藻体をRNAlater（Ambion）中で細断後、使用時まで－３０℃で保存していたものを用いた。
＜方法＞
（ＲＮＡ採取用試料）
ＲＮＡ採取用試料として、広島県広島市宇品で採集したネザシハネモ（Bryopsis corticulans）藻体をRNAlater（Ambion）中で細断後、使用時まで－３０℃で保存していたものを用いた。
【0046】
（全ＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡの精製及びｃＤＮＡの合成）
上記サンプルに対してPureLink Plant RNA Reagent（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡを試料として、NucleoTrap mRNA（Macherey-Nagel）を用いてｍＲＮＡを精製した。さらに、同ｍＲＮＡを対象に、GeneRacer Kit（Invitrogen）を用いて完全長ｃＤＮＡを合成した。いずれの操作においても、キット付属のマニュアルに従って行った。
上記サンプルに対してPureLink Plant RNA Reagent（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡを試料として、NucleoTrap mRNA（Macherey-Nagel）を用いてｍＲＮＡを精製した。さらに、同ｍＲＮＡを対象に、GeneRacer Kit（Invitrogen）を用いて完全長ｃＤＮＡを合成した。いずれの操作においても、キット付属のマニュアルに従って行った。
【0047】
（ＢｃＢｒｙ－１のｃＤＮＡクローニング）
ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来Ｂｒｙ－１（ＢｃＢｒｙ－１）を対象としたRapidAmplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法はGeneRacer KitTM（Invitrogen）及びBlend Taq（登録商標）（TOYOBO）を用いてマニュアルに従って行った。まず、既知Bryopsis sp.由来Ｂｒｙ－１のＮ末端部分アミノ酸配列を参考に縮重プライマーＢｒｙ１－Ｆ１、Ｂｒｙ１－Ｆ２を設計し、３’ＲＡＣＥを行った。まず、Ｂｒｙ１－Ｆ１（５’－ ＧＧIＧＧIＴＡＹＧＴIＡＴＨＡＡ－３’；配列番号５）及びGeneRacer 3’ primerのプライマーペアを用いて増幅されたＰＣＲ産物（アニーリング温度５２℃）をアガロースゲル電気泳動後に切り出して精製した。ここで、Iはイノシン、ＹはＣ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴをそれぞれ示すIＵＢコードである。これを鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄプライマーとしてＢｒｙ１－Ｆ２（５’－ ＡＣIＴＴＹＧＡＹＧＡＹＧＣIＡＣIＴＡＹＧＡ－３’；配列番号６）及びGeneRacer 3’ nested primerのプライマーペアを用いて、さらにＰＣＲ増幅（アニーリング温度６４℃）した。得られたＰＣＲ産物につき、pGEM-T Easyベクターに挿入後、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing kitを用いて常法により塩基配列決定に供した。その結果、明らかに配列が異なる２種類のＢｃＢｒｙ－１の３’末端配列及びｐｏｌｙＡテイルを含む配列が得られたことから、一方をＢｃＢｒｙ１－１、他方をＢｃＢｒｙ１－２とした。これら２遺伝子につき、さらに全長塩基配列の決定を試みるために、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２の３’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-3’endR（５’－ ＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＣ－３’；配列番号７）及びBcBry1-2-3’endR（５’－ ＣＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴＡＣ－３’；配列番号８）、並びに両ＢｃＢｒｙ１に共通する配列からBcBry1-common-R1（５’－ＡＣＴＴＴＧＴＡＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣ－３’；配列番号９）を設計した。BcBry1-1-3’endR又はBcBry-1-2-3’endRを１ｓｔＰＣＲに、BcBry1-common-R1をnested PCRに用いる５’ＲＡＣＥを行い、得られたＰＣＲ産物につき、上述と同様に塩基配列決定に供した。その結果、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２それぞれの５’末端配列を決定できた。ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２の５’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-5’endF（５’－ ＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＴＧ－３’；配列番号１０）及びBcBry1-2-5’endF（５’－ ＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣ－３’；配列番号１１）を設計し、BcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペア、並びにBcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペアを用いて、高正確性DNA polymerase、KOD plus Neo（TOYOBO）によってBryopsis corticulans由来のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。これにより、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡの全長をコードするＤＮＡ断片を得て、常法を用いてそれらの塩基配列を確認した。
ネザシハネモ（Bryopsis corticulans）由来Ｂｒｙ－１（ＢｃＢｒｙ－１）を対象としたRapidAmplification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法はGeneRacer KitTM（Invitrogen）及びBlend Taq（登録商標）（TOYOBO）を用いてマニュアルに従って行った。まず、既知Bryopsis sp.由来Ｂｒｙ－１のＮ末端部分アミノ酸配列を参考に縮重プライマーＢｒｙ１－Ｆ１、Ｂｒｙ１－Ｆ２を設計し、３’ＲＡＣＥを行った。まず、Ｂｒｙ１－Ｆ１（５’－ ＧＧIＧＧIＴＡＹＧＴIＡＴＨＡＡ－３’；配列番号５）及びGeneRacer 3’ primerのプライマーペアを用いて増幅されたＰＣＲ産物（アニーリング温度５２℃）をアガロースゲル電気泳動後に切り出して精製した。ここで、Iはイノシン、ＹはＣ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴをそれぞれ示すIＵＢコードである。これを鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄプライマーとしてＢｒｙ１－Ｆ２（５’－ ＡＣIＴＴＹＧＡＹＧＡＹＧＣIＡＣIＴＡＹＧＡ－３’；配列番号６）及びGeneRacer 3’ nested primerのプライマーペアを用いて、さらにＰＣＲ増幅（アニーリング温度６４℃）した。得られたＰＣＲ産物につき、pGEM-T Easyベクターに挿入後、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing kitを用いて常法により塩基配列決定に供した。その結果、明らかに配列が異なる２種類のＢｃＢｒｙ－１の３’末端配列及びｐｏｌｙＡテイルを含む配列が得られたことから、一方をＢｃＢｒｙ１－１、他方をＢｃＢｒｙ１－２とした。これら２遺伝子につき、さらに全長塩基配列の決定を試みるために、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２の３’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-3’endR（５’－ ＧＣＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＣ－３’；配列番号７）及びBcBry1-2-3’endR（５’－ ＣＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴＡＣ－３’；配列番号８）、並びに両ＢｃＢｒｙ１に共通する配列からBcBry1-common-R1（５’－ＡＣＴＴＴＧＴＡＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣ－３’；配列番号９）を設計した。BcBry1-1-3’endR又はBcBry-1-2-3’endRを１ｓｔＰＣＲに、BcBry1-common-R1をnested PCRに用いる５’ＲＡＣＥを行い、得られたＰＣＲ産物につき、上述と同様に塩基配列決定に供した。その結果、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２それぞれの５’末端配列を決定できた。ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２の５’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-5’endF（５’－ ＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＴＧ－３’；配列番号１０）及びBcBry1-2-5’endF（５’－ ＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣ－３’；配列番号１１）を設計し、BcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペア、並びにBcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペアを用いて、高正確性DNA polymerase、KOD plus Neo（TOYOBO）によってBryopsis corticulans由来のｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。これにより、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡの全長をコードするＤＮＡ断片を得て、常法を用いてそれらの塩基配列を確認した。
【0048】
＜結果＞
（ＢｃＢｒｙ－１のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列）
得られた全長ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡの配列情報をそれぞれ図１及び２に示す。また、Bryopsis sp.由来Ｂｒｙ－１の既知Ｎ末端アミノ酸との比較及びSignalPprogramを用いたシグナルペプチド配列予測結果から、成熟タンパク質領域を推定した。上記ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡから得られるアミノ酸配列もそれぞれ図１及び図２に示す。図１に示すように、ＢｃＢｒｙ１－１の全長ｃＤＮＡは、それぞれ５７５ヌクレオチドの長さを有し（当該全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１２とする。）、８１～８３番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、４３８～４４０番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該ｃＤＮＡの８１～４４０番目のヌクレオチド配列を配列番号１とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３とする。一方、図２に示すように、ＢｃＢｒｙ１－２の全長ｃＤＮＡは、それぞれ４９５ヌクレオチドの長さを有し（当該全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１３とする。）、１２～１５番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、３６９～３７１番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該ｃＤＮＡの１２～３７１番目のヌクレオチド配列を配列番号２とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４とする。
（ＢｃＢｒｙ－１のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列）
得られた全長ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡの配列情報をそれぞれ図１及び２に示す。また、Bryopsis sp.由来Ｂｒｙ－１の既知Ｎ末端アミノ酸との比較及びSignalPprogramを用いたシグナルペプチド配列予測結果から、成熟タンパク質領域を推定した。上記ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２のｃＤＮＡから得られるアミノ酸配列もそれぞれ図１及び図２に示す。図１に示すように、ＢｃＢｒｙ１－１の全長ｃＤＮＡは、それぞれ５７５ヌクレオチドの長さを有し（当該全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１２とする。）、８１～８３番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、４３８～４４０番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該ｃＤＮＡの８１～４４０番目のヌクレオチド配列を配列番号１とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３とする。一方、図２に示すように、ＢｃＢｒｙ１－２の全長ｃＤＮＡは、それぞれ４９５ヌクレオチドの長さを有し（当該全長ｃＤＮＡ配列を配列番号１３とする。）、１２～１５番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、３６９～３７１番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該ｃＤＮＡの１２～３７１番目のヌクレオチド配列を配列番号２とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４とする。
【0049】
図１及び図２に示すように、ＢｃＢｒｙ１－１及びＢｃＢｒｙ１－２の成熟タンパク質領域はともに１００アミノ酸残基からなり、これらのアミノ酸同一率は８３％であった。ＢＬＡＳＴ検索の結果、両ＢｃＢｒｙ１は既知レクチンのみならず、既知タンパク質と相同性を示さなかった。すなわち、極めて新規性の高いタンパク質一次構造を有することが明らかとなった。
【0050】
［実施例２：ＢｃＢｒｙ１－１の大腸菌発現系の構築］
＜方法＞
（発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1の作製）
大腸菌コドンに最適化したＢｃＢｒｙ１－１をコードするＤＮＡを設計・合成し、これを鋳型にＨｉｓタグ及びＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列を付加するように設計したプライマー BcBry1-1_pCold_F（５’－ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＴＣ－３’；配列番号１４）、及びBcBry1-1_pCold_R（５’－ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣＣＣＡＴＧ－３’；配列番号１５）、並びにＤＮＡポリメラーゼとしてPlatinum Pfx DNA polymerase（Invitrogen）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物につき、In-FusionAdvantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用い、制限酵素ＸｂａI及びＮｄｅI切断により直鎖化したpCold II DNA（タカラバイオ）に挿入し、塩基配列を確認することで、発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を構築した。
＜方法＞
（発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1の作製）
大腸菌コドンに最適化したＢｃＢｒｙ１－１をコードするＤＮＡを設計・合成し、これを鋳型にＨｉｓタグ及びＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列を付加するように設計したプライマー BcBry1-1_pCold_F（５’－ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＣＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＴＣ－３’；配列番号１４）、及びBcBry1-1_pCold_R（５’－ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣＣＣＡＴＧ－３’；配列番号１５）、並びにＤＮＡポリメラーゼとしてPlatinum Pfx DNA polymerase（Invitrogen）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物につき、In-FusionAdvantage PCR Cloning Kit（Clontech）を用い、制限酵素ＸｂａI及びＮｄｅI切断により直鎖化したpCold II DNA（タカラバイオ）に挿入し、塩基配列を確認することで、発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を構築した。
【0051】
（Ｈｉｓ－ｒＢｃＢｒｙ１－１の調製）
上記発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を用いて大腸菌株SHuffle Expressを形質転換して組換えＢｃＢｒｙ１－１発現株（SHuffle Express/pCold-BcBry1-1）とした。同発現株につき３ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ＋液体培地に１／２０容を加え、３７℃で対数増殖期中期まで振とう培養した。ＯＤ６００が０．５に達したところで培養液を１５℃で３０分静置後、終濃度が０．１ｍＭになるようにIＰＴＧを加え、１５℃で２４時間振とう培養し、発現誘導した。発現誘導後、培養液を遠心（２０４００×ｇ、５分、４℃）し、菌体を回収して、培養液に対して１／２０容の超音波破砕用緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理した。これを再び遠心（２０４００×ｇ、２０分、４℃）し、上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分とした。可溶性画分についてはニッケルキレートビーズ MagExtractor（登録商標）His-tag（Toyobo）を用いてHis-rBcBry1-1を精製し、これをＨｉｓタグ精製標品とした。
上記発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を用いて大腸菌株SHuffle Expressを形質転換して組換えＢｃＢｒｙ１－１発現株（SHuffle Express/pCold-BcBry1-1）とした。同発現株につき３ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ＋液体培地に１／２０容を加え、３７℃で対数増殖期中期まで振とう培養した。ＯＤ６００が０．５に達したところで培養液を１５℃で３０分静置後、終濃度が０．１ｍＭになるようにIＰＴＧを加え、１５℃で２４時間振とう培養し、発現誘導した。発現誘導後、培養液を遠心（２０４００×ｇ、５分、４℃）し、菌体を回収して、培養液に対して１／２０容の超音波破砕用緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理した。これを再び遠心（２０４００×ｇ、２０分、４℃）し、上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分とした。可溶性画分についてはニッケルキレートビーズ MagExtractor（登録商標）His-tag（Toyobo）を用いてHis-rBcBry1-1を精製し、これをＨｉｓタグ精製標品とした。
【0052】
（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａによる酵素消化条件の検討）
Ｈｉｓタグ融合タンパク質His-rBcBry1-1からｒＢｃＢｒｙ１－１を調製するために、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａによる酵素消化を行った。まず、精製標品His-rBcBry1-1を透析用緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に対して十分に透析した。この透析内液を遠心（２０４００×ｇ、２０分、４ ℃）し、得られた上清His-rBcBry1-1を回収した。この上清から酵素反応の至適条件を決定するため、酵素添加量及び反応時間を検討した。酵素反応液５０μｌ（１０μｇのHis-rBcBry1-1、５μｌの１０×Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理用緩衝液、１μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａ（０．１、０．２、０．５Ｕ）、２４μｌ滅菌水）を調製し、２０℃及び３７℃で酵素処理し、３７℃条件下では 酵素添加量をＦａｃｔｏｒ Ｘａ（０．１Ｕ、０．２Ｕ）で行った。また、両温度条件下でＦａｃｔｏｒ Ｘａ未添加のものを調製して同様の処理を行いネガティブコントロールとした。この反応液から経時的（２、４、８、１６時間）に１０μｌずつ回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。
Ｈｉｓタグ融合タンパク質His-rBcBry1-1からｒＢｃＢｒｙ１－１を調製するために、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａによる酵素消化を行った。まず、精製標品His-rBcBry1-1を透析用緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に対して十分に透析した。この透析内液を遠心（２０４００×ｇ、２０分、４ ℃）し、得られた上清His-rBcBry1-1を回収した。この上清から酵素反応の至適条件を決定するため、酵素添加量及び反応時間を検討した。酵素反応液５０μｌ（１０μｇのHis-rBcBry1-1、５μｌの１０×Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理用緩衝液、１μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａ（０．１、０．２、０．５Ｕ）、２４μｌ滅菌水）を調製し、２０℃及び３７℃で酵素処理し、３７℃条件下では 酵素添加量をＦａｃｔｏｒ Ｘａ（０．１Ｕ、０．２Ｕ）で行った。また、両温度条件下でＦａｃｔｏｒ Ｘａ未添加のものを調製して同様の処理を行いネガティブコントロールとした。この反応液から経時的（２、４、８、１６時間）に１０μｌずつ回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。
【0053】
（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによるHis-rBcBry1-1の検出）
調製したHis-rBcBry1-1を糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor（登録商標）647（医学生物学研究所）を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、精製His-rBcBry1-1及びポジティブコントロールとして当研究室で保存されていたＮ末端側にＨｉｓタグを有する組換えKappaphycus alvarezii agglutinin 1（Ｈｉｓ－ｒＫＡＡ１）、ネガティブコントロールとしてＨｉｓ－ｒＫＡＡ１からＨｉｓタグを除いたｒＫＡＡを用い、各試料を５μｇ相当となるように調製し非還元下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色したものとは異なる泳動ゲルを、ウェット式トランスファー装置Mini Trans-Brot Cell Module（Bio-Rad）を用いＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。転写後メンブレンに対し５％ブロッキング緩衝液（５％スキムミルク、ＴＢＳ－Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０））に浸し室温にて１時間緩やかに振とうした。次いでＴＢＳ－Ｔで２回リンスし、またＴＢＳ－Ｔにて１５分間振とうする操作を１回、５分間振とうする操作を２回繰り返し洗浄した。洗浄後、２．５％ブロッキング緩衝液（２．５％スキムミルク、ＴＢＳ－Ｔ）で１μｇ／ｍｌに希釈したAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を３ｍｌ加え、室温にて１時間振とうし、抗体を反応させた。反応完了後、ＴＢＳ－Ｔにて１０分間振とうする操作を３回繰り返し洗浄した。メンブレンを風乾後、検出器Typhoon FLA 7000（ＧＥヘルスケア）を用い６３３ｎｍの励起波長で抗Ｈｉｓタグ抗体による検出の有無を調べた。
調製したHis-rBcBry1-1を糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor（登録商標）647（医学生物学研究所）を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、精製His-rBcBry1-1及びポジティブコントロールとして当研究室で保存されていたＮ末端側にＨｉｓタグを有する組換えKappaphycus alvarezii agglutinin 1（Ｈｉｓ－ｒＫＡＡ１）、ネガティブコントロールとしてＨｉｓ－ｒＫＡＡ１からＨｉｓタグを除いたｒＫＡＡを用い、各試料を５μｇ相当となるように調製し非還元下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色したものとは異なる泳動ゲルを、ウェット式トランスファー装置Mini Trans-Brot Cell Module（Bio-Rad）を用いＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。転写後メンブレンに対し５％ブロッキング緩衝液（５％スキムミルク、ＴＢＳ－Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０））に浸し室温にて１時間緩やかに振とうした。次いでＴＢＳ－Ｔで２回リンスし、またＴＢＳ－Ｔにて１５分間振とうする操作を１回、５分間振とうする操作を２回繰り返し洗浄した。洗浄後、２．５％ブロッキング緩衝液（２．５％スキムミルク、ＴＢＳ－Ｔ）で１μｇ／ｍｌに希釈したAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を３ｍｌ加え、室温にて１時間振とうし、抗体を反応させた。反応完了後、ＴＢＳ－Ｔにて１０分間振とうする操作を３回繰り返し洗浄した。メンブレンを風乾後、検出器Typhoon FLA 7000（ＧＥヘルスケア）を用い６３３ｎｍの励起波長で抗Ｈｉｓタグ抗体による検出の有無を調べた。
【0054】
＜結果＞
（His-rBcBry1-1の発現及び調製）
大腸菌株の可溶性画分につき約４５０μｌ、精製標品につき約２００μｌの液量が得られ、可溶性画分及びＨｉｓタグ精製標品につき明瞭な赤血球凝集活性を検出した。なお、赤血球凝集活性の評価は、９６ウェルプレートの各ウェルに対して２５μＬずつ生理食塩水による系列２倍希釈でそれぞれの画分を分注し、それらに等量の２％赤血球懸濁液を加えた後、混合液を緩やかに振とうし、室温で６０分間インキュベートし、赤血球凝集活性を肉眼で観察することで行った。また、Ｈｉｓタグ精製標品は非還元及び還元下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて予想した分子量の位置に単一のバンドを与え、His-rBcBry1-1の発現を確認した（図３）。なお、図３において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１は発現誘導前菌体破砕液、レーン２は発現誘導後菌体破砕液、レーン３は可溶性画分、レーン４は不溶性画分、レーン５は非吸着画分、レーン６及びレーン７は洗浄液、レーン８はＨｉｓタグ精製標品（還元）、レーン９はＨｉｓタグ精製標品（非還元）である。また、His-rBcBry1-1の収量は培地９ｍｌ当たり４０μｇで、最小凝集濃度は１．５５μｇ／ｍｌであった。また、別途、スケールアップして発現誘導を行ったところ、培養液２００ｍｌあたりHis-rBcBry1-1は２４０μｇ得られた。
（His-rBcBry1-1の発現及び調製）
大腸菌株の可溶性画分につき約４５０μｌ、精製標品につき約２００μｌの液量が得られ、可溶性画分及びＨｉｓタグ精製標品につき明瞭な赤血球凝集活性を検出した。なお、赤血球凝集活性の評価は、９６ウェルプレートの各ウェルに対して２５μＬずつ生理食塩水による系列２倍希釈でそれぞれの画分を分注し、それらに等量の２％赤血球懸濁液を加えた後、混合液を緩やかに振とうし、室温で６０分間インキュベートし、赤血球凝集活性を肉眼で観察することで行った。また、Ｈｉｓタグ精製標品は非還元及び還元下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて予想した分子量の位置に単一のバンドを与え、His-rBcBry1-1の発現を確認した（図３）。なお、図３において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１は発現誘導前菌体破砕液、レーン２は発現誘導後菌体破砕液、レーン３は可溶性画分、レーン４は不溶性画分、レーン５は非吸着画分、レーン６及びレーン７は洗浄液、レーン８はＨｉｓタグ精製標品（還元）、レーン９はＨｉｓタグ精製標品（非還元）である。また、His-rBcBry1-1の収量は培地９ｍｌ当たり４０μｇで、最小凝集濃度は１．５５μｇ／ｍｌであった。また、別途、スケールアップして発現誘導を行ったところ、培養液２００ｍｌあたりHis-rBcBry1-1は２４０μｇ得られた。
【0055】
（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａによる酵素消化条件の検討）
His-rBcBry1-1のＨｉｓタグ部分を除去するため、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を試みたところ、２０℃ではどの条件でも全く切断されなかった（図４の（ａ）～（ｄ））。なお、図４において、（ａ）は２０℃でＦａｃｔｏｒ Ｘａを未処理、（ｂ）は２０℃で０．１Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｃ）は２０℃で０．２Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｄ）は２０℃で０．５Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｅ）は３７℃で０．２Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｆ）は３７℃で０．５Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理した条件の結果である。さらに、反応温度条件を３７℃で酵素処理を行ったが、２０℃と同様に融合タンパク質部分は切断されないことがわかった（図４の（ｅ）、（ｆ））。融合タンパク質部分が切断されなかった原因として、His-rBcBry1-1に存在するＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列が立体干渉により認識・接触できない状態にある可能性が考えられた。
His-rBcBry1-1のＨｉｓタグ部分を除去するため、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ処理を試みたところ、２０℃ではどの条件でも全く切断されなかった（図４の（ａ）～（ｄ））。なお、図４において、（ａ）は２０℃でＦａｃｔｏｒ Ｘａを未処理、（ｂ）は２０℃で０．１Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｃ）は２０℃で０．２Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｄ）は２０℃で０．５Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｅ）は３７℃で０．２Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理、（ｆ）は３７℃で０．５Ｕ／５０μｌのＦａｃｔｏｒ Ｘａを処理した条件の結果である。さらに、反応温度条件を３７℃で酵素処理を行ったが、２０℃と同様に融合タンパク質部分は切断されないことがわかった（図４の（ｅ）、（ｆ））。融合タンパク質部分が切断されなかった原因として、His-rBcBry1-1に存在するＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列が立体干渉により認識・接触できない状態にある可能性が考えられた。
【0056】
（抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによるHis-rBcBry1-1の検出）
His-rBcBry1-1はレクチンコード領域のＮ末端にＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列、さらに上流にＨｉｓタグが融合されていることから、蛍光標識抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて同組換え体を検出可能と予想された。そこでウェスタンブロッティングによりHis-rBry1-1と抗Ｈｉｓタグ抗体との反応性を調べたが、ポジティブコントロールとして用いたＨｉｓ－ｒＫＡＡ１で明瞭なシグナルが得られたものの、ネガティブコントロールとして用いたｒＫＡＡ１と同様、His-rBcBry1-1においてはシグナルが得られなかった（図５）。なお、図５において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１はHis-rBcBry1-1、レーン２はｒＫＡＡ１、レーン３はＨｉｓ－ｒＫＡＡ１である。前述のＦａｃｔｏｒ Ｘａによるタグ切断が不可であった結果と合わせて、酵素・抗体がそれぞれの認識部位との接触に難がある可能性が考えられた。
His-rBcBry1-1はレクチンコード領域のＮ末端にＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列、さらに上流にＨｉｓタグが融合されていることから、蛍光標識抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて同組換え体を検出可能と予想された。そこでウェスタンブロッティングによりHis-rBry1-1と抗Ｈｉｓタグ抗体との反応性を調べたが、ポジティブコントロールとして用いたＨｉｓ－ｒＫＡＡ１で明瞭なシグナルが得られたものの、ネガティブコントロールとして用いたｒＫＡＡ１と同様、His-rBcBry1-1においてはシグナルが得られなかった（図５）。なお、図５において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１はHis-rBcBry1-1、レーン２はｒＫＡＡ１、レーン３はＨｉｓ－ｒＫＡＡ１である。前述のＦａｃｔｏｒ Ｘａによるタグ切断が不可であった結果と合わせて、酵素・抗体がそれぞれの認識部位との接触に難がある可能性が考えられた。
【0057】
［実施例３：Ｈｉｓタグ融合位置の異なるＢｃＢｒｙ１－１の大腸菌発現系構築］
＜方法＞
（発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cの作製）
上述の結果を踏まえ、タグ切断酵素及びタグ認識抗体がそれぞれの認識部位と接触可能となるよう、Ｎ末端のＨｉｓタグとレクチン領域間にリンカーを挿入したHis-rBcBry1-1N、及びＨｉｓタグ融合位置をＣ末端側にしたHis-rBcBry1-1Cの調製を試みた。まず、前述の大腸菌用コドンに最適化したＢｃＢｒｙ１－１のコード合成ＤＮＡを鋳型に、下記プライマーペアを用いてｒＢｃＢｒｙ１－１のコード領域を増幅した。すなわち、Ｈｉｓ－ｒＢｃＢｒｙ１－１Ｎ発現用にはpET_rBcBry1-1_F（５’－ ＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴ －３’；配列番号１６）及びpET_rBcBry1-1_R（５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＴＴＡＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧ－３’；配列番号１７）を、His-rBcBry1-1C発現用には、pET_rBcBry1-1_CF（５’－ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴ－３’；配列番号１８）及びｐＥＴ＿ｒＢｃＢｒｙ１－１＿ＣＲ（５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＴ －３’；配列番号１９）を用いＰＣＲにより増幅を行った。次に、発現ベクターpET28a（Novagen）を対象に、His-rBcBry1-1N発現コンストラクト用に制限酵素ＮｄｅI及びＸｈｏIで処理、またHis-rBcBry1-1C発現コンストラクト用に制限酵素ＮｃｏI及びＸｈｏIで処理し、これら直鎖化pET28a及び上述の各ＢｃＢｒｙ１－１のコード領域を含むＰＣＲ増幅産物を用いてIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて、発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cを作製した。
＜方法＞
（発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cの作製）
上述の結果を踏まえ、タグ切断酵素及びタグ認識抗体がそれぞれの認識部位と接触可能となるよう、Ｎ末端のＨｉｓタグとレクチン領域間にリンカーを挿入したHis-rBcBry1-1N、及びＨｉｓタグ融合位置をＣ末端側にしたHis-rBcBry1-1Cの調製を試みた。まず、前述の大腸菌用コドンに最適化したＢｃＢｒｙ１－１のコード合成ＤＮＡを鋳型に、下記プライマーペアを用いてｒＢｃＢｒｙ１－１のコード領域を増幅した。すなわち、Ｈｉｓ－ｒＢｃＢｒｙ１－１Ｎ発現用にはpET_rBcBry1-1_F（５’－ ＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴ －３’；配列番号１６）及びpET_rBcBry1-1_R（５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＴＴＡＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧ－３’；配列番号１７）を、His-rBcBry1-1C発現用には、pET_rBcBry1-1_CF（５’－ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴ－３’；配列番号１８）及びｐＥＴ＿ｒＢｃＢｒｙ１－１＿ＣＲ（５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＴ －３’；配列番号１９）を用いＰＣＲにより増幅を行った。次に、発現ベクターpET28a（Novagen）を対象に、His-rBcBry1-1N発現コンストラクト用に制限酵素ＮｄｅI及びＸｈｏIで処理、またHis-rBcBry1-1C発現コンストラクト用に制限酵素ＮｃｏI及びＸｈｏIで処理し、これら直鎖化pET28a及び上述の各ＢｃＢｒｙ１－１のコード領域を含むＰＣＲ増幅産物を用いてIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて、発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cを作製した。
【0058】
（His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cの発現大腸菌株の調製）
構築した発現用コンストラクトを用いて大腸菌株SHuffle T7 Expressを形質転換した。形質転換体をＬＢ／Ｋａｎ＋寒天培地に適量塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを対象にインサートチェック及びシーケンシングによりインサートが正しく挿入されていることを確認した。該当クローンをＬＢ／Ｋａｎ＋液体培地で培養しHis-rBcBry1-1発現株SHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1Cとし、１／２容の４０％グリセロールを加え（終濃度２０％）、使用するまで－８０℃で保存した。
構築した発現用コンストラクトを用いて大腸菌株SHuffle T7 Expressを形質転換した。形質転換体をＬＢ／Ｋａｎ＋寒天培地に適量塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを対象にインサートチェック及びシーケンシングによりインサートが正しく挿入されていることを確認した。該当クローンをＬＢ／Ｋａｎ＋液体培地で培養しHis-rBcBry1-1発現株SHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1Cとし、１／２容の４０％グリセロールを加え（終濃度２０％）、使用するまで－８０℃で保存した。
【0059】
（His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cの大量発現）
上述のSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1C発現株をＬＢ／Ｋａｎ＋液体培地１Ｌに植菌し３７℃で対数増殖期中期になるまで振とう培養した。ＯＤ６００が０．５から０．８の間に入るまで培養し、終濃度が０．５ｍＭとなるようにIＰＴＧを添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１２時間振とう培養した。培養後、遠心（１００００×ｇ、４℃、１０分）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に懸濁した後、超音波破砕を行った。超音波処理後、遠心（１００００×ｇ、４℃、３０分）し上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分として回収した。
上述のSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1C発現株をＬＢ／Ｋａｎ＋液体培地１Ｌに植菌し３７℃で対数増殖期中期になるまで振とう培養した。ＯＤ６００が０．５から０．８の間に入るまで培養し、終濃度が０．５ｍＭとなるようにIＰＴＧを添加することで発現誘導を開始し、２０℃で１２時間振とう培養した。培養後、遠心（１００００×ｇ、４℃、１０分）により集菌し、培養液に対し１／２０容の超音波破砕用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に懸濁した後、超音波破砕を行った。超音波処理後、遠心（１００００×ｇ、４℃、３０分）し上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分として回収した。
【0060】
（ニッケルキレートカラムによる精製）
先に調製した可溶性画分に含まれるＨｉｓタグ融合組換え体を、ニッケルキレートカラムHis Gravi Trap（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス）により精製した。カラムを平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）にて十分平衡化後、可溶性画分を添加し、カラム担体とHis-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを結合させた。カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄後、溶出用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を添加し組換え体を溶出した。溶出画分に対し緩衝液（３００ｍＭアルギニン塩酸塩、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で十分透析し、精製標品とした。
先に調製した可溶性画分に含まれるＨｉｓタグ融合組換え体を、ニッケルキレートカラムHis Gravi Trap（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス）により精製した。カラムを平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）にて十分平衡化後、可溶性画分を添加し、カラム担体とHis-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを結合させた。カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄後、溶出用緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を添加し組換え体を溶出した。溶出画分に対し緩衝液（３００ｍＭアルギニン塩酸塩、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で十分透析し、精製標品とした。
【0061】
＜結果＞
（精製漂品の収量及びその赤血球凝集活性）
SHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1Cをそれぞれ１ＬのＬＢ／Ｋａｎ＋で発現誘導を行い、超音波破砕後、可溶性画分についてニッケルキレートカラムに供し精製後透析を行うことで精製標品を獲得した。精製標品のタンパク質収量及び赤血球凝集活性を測定したところ、rBcBry1-1Nでは０．９６ｍｇ、５１２のＨＡ活性が確認されrBcBry1-1Cでは２．５２ｍｇ、１２８のＨＡ活性が確認された（表１）。なお、タンパク質収量は、ＵＶ２８０ｎｍに対する吸光度を測定することにより決定した。具体的に、２８０ｎｍの吸光度が１．０の場合にタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬと推定し、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標品として用いて、Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo FisherScientific, IL, USA）により測定し、赤血球凝集活性は、上記と同様に測定した。当結果を、前述のSHuffle Express/pCold-rBcBry1-1株を発現させ獲得したHis-rBcBry1-1の収量（培養液２００ｍｌあたり２４０μｇ）と比較した時、ｐＥＴシステム及び大腸菌株SHuffle T7 Expressを用いたことによる劇的な収量の増大は認められなかった。
（精製漂品の収量及びその赤血球凝集活性）
SHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1Cをそれぞれ１ＬのＬＢ／Ｋａｎ＋で発現誘導を行い、超音波破砕後、可溶性画分についてニッケルキレートカラムに供し精製後透析を行うことで精製標品を獲得した。精製標品のタンパク質収量及び赤血球凝集活性を測定したところ、rBcBry1-1Nでは０．９６ｍｇ、５１２のＨＡ活性が確認されrBcBry1-1Cでは２．５２ｍｇ、１２８のＨＡ活性が確認された（表１）。なお、タンパク質収量は、ＵＶ２８０ｎｍに対する吸光度を測定することにより決定した。具体的に、２８０ｎｍの吸光度が１．０の場合にタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬと推定し、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標品として用いて、Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo FisherScientific, IL, USA）により測定し、赤血球凝集活性は、上記と同様に測定した。当結果を、前述のSHuffle Express/pCold-rBcBry1-1株を発現させ獲得したHis-rBcBry1-1の収量（培養液２００ｍｌあたり２４０μｇ）と比較した時、ｐＥＴシステム及び大腸菌株SHuffle T7 Expressを用いたことによる劇的な収量の増大は認められなかった。
【0062】
【表1】
【0063】
［実施例４：糖鎖固定化アレイによるＢｃＢｒｙ１－１の糖鎖結合特異性解析］
＜方法＞
（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによる検出）
調製したHis-rBcBry1-1N又はHis-rBry1-1Cを糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647（医学生物学研究所）を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを対象とし、ポジティブコントロールとしてＨｉｓ－ｒＫＡＡ、ネガティブコントロールとしてｒＫＡＡを用いた。各試料を５μｇ相当となるように調製し非還元下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロッティングは上述の方法と同様にして行った。
＜方法＞
（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによる検出）
調製したHis-rBcBry1-1N又はHis-rBry1-1Cを糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647（医学生物学研究所）を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを対象とし、ポジティブコントロールとしてＨｉｓ－ｒＫＡＡ、ネガティブコントロールとしてｒＫＡＡを用いた。各試料を５μｇ相当となるように調製し非還元下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロッティングは上述の方法と同様にして行った。
【0064】
（糖鎖固定化アレイ）
His-rBcBry1-1CにつきＮ－ｇｌｙｃａｎを７種、Ｏ－ｇｌｙｃａｎを２ 種、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を５種、ルイス型を４種、Ｌａｃを７種及びＡＢＯ型を３種、計２８種類を固定化した糖鎖固定化アレイ（図６、住友ベークライト）に供し、検出試薬として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647（医学生物学研究所）を用いた。すなわちrBcBry1-1Cを反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し（終濃度８３．９μｇ／ｍｌ）、検出プレートに適量滴下した。カバーを被せ室温にて２時間インキュベートした後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて１分間緩やかに洗浄する操作を２回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。Anti-His-tag-Alexa Fluor 647を１μｇ／ｍｌとなるように反応用バッファーで希釈し、検出プレートに適量滴下し室温にて１時間インキュベートし抗体を反応させた。反応完了後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー中で１分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて１分間緩やかに洗浄する操作を２回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。蛍光検出及びデータ解析は住友ベークライトに委託した。
His-rBcBry1-1CにつきＮ－ｇｌｙｃａｎを７種、Ｏ－ｇｌｙｃａｎを２ 種、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を５種、ルイス型を４種、Ｌａｃを７種及びＡＢＯ型を３種、計２８種類を固定化した糖鎖固定化アレイ（図６、住友ベークライト）に供し、検出試薬として抗Ｈｉｓタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647（医学生物学研究所）を用いた。すなわちrBcBry1-1Cを反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し（終濃度８３．９μｇ／ｍｌ）、検出プレートに適量滴下した。カバーを被せ室温にて２時間インキュベートした後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて１分間緩やかに洗浄する操作を２回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。Anti-His-tag-Alexa Fluor 647を１μｇ／ｍｌとなるように反応用バッファーで希釈し、検出プレートに適量滴下し室温にて１時間インキュベートし抗体を反応させた。反応完了後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー中で１分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて１分間緩やかに洗浄する操作を２回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。蛍光検出及びデータ解析は住友ベークライトに委託した。
【0065】
＜結果＞
（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによるHis-rBcBry1-1N及びCの検出）
（抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによるHis-rBcBry1-1N及びCの検出）
【0066】
His-rBcBry1-1N又はCを糖鎖固定化アレイに供した際、検出抗体としてAnti-His-tag-AlexaFluor 647を用いることが出来るか、ウェスタンブロッティングにより確認した。検出結果を図７に示す。なお、図７において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１はHis-rBcBry1-1N、レーン２はHis-rBcBry1-1C、レーン３はＨｉｓ－ｒＫＡＡ、レーン４はｒＫＡＡである。図７に示すように、ネガティブコントロールとして用いたｒＫＡＡの検出は確認されず、ポジティブコントロールとして用いたＨｉｓ－ｒＫＡＡ、His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cからの検出が確認出来た。したがってHis-rBcBry1-1N及びCの検出にAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を用いることが可能であることが示された。また、等量のタンパク質を添加しているもののHis-rBcBry1-1Nに比べHis-rBcBry1-1Cの方が強く検出されており、Ｎ末端側にＨｉｓタグを融合したHis-rBcBry1-1（pColdベクターを用いて発現）で検出出来なかったことを考慮し、糖鎖固定化アレイ試験にはHis-rBcBry1-1Cを採用することとした。
【0067】
（糖鎖固定化アレイ試験）
検出試薬としてAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を用いHis-rBcBry1-1Cを糖鎖固定化アレイ（住友ベークライト）に供した。結果を図８に示す。図８に示すようにヘパリンにおいて有意なシグナルが認められ、De2S Hep、De6S Hep、DeNS/AcHepにおいても弱いシグナルが観測された。すなわちＧＡＧにおいてのみ結合がみられ、特に硫酸基脱離によりシグナルが減退する傾向を示したことから、ｒＢｃＢｒｙ１－１はＧＡＧの硫酸基部分を認識することが示唆された。
検出試薬としてAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を用いHis-rBcBry1-1Cを糖鎖固定化アレイ（住友ベークライト）に供した。結果を図８に示す。図８に示すようにヘパリンにおいて有意なシグナルが認められ、De2S Hep、De6S Hep、DeNS/AcHepにおいても弱いシグナルが観測された。すなわちＧＡＧにおいてのみ結合がみられ、特に硫酸基脱離によりシグナルが減退する傾向を示したことから、ｒＢｃＢｒｙ１－１はＧＡＧの硫酸基部分を認識することが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】