特許 7363134 免疫グロブリン結合性タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-10

(45)【発行日】2023-10-18

(54)【発明の名称】免疫グロブリン結合性タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231011BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20231011BHJP

   C07K 14/31 20060101ALI20231011BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231011BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231011BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231011BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/31

C07K14/31

C07K16/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019124932

(22)【出願日】2019-07-04

(65)【公開番号】P2021010308

(43)【公開日】2021-02-04

【審査請求日】2022-06-23

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】長谷見 崇俊

(72)【発明者】

【氏名】山中 直紀

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【審査官】平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５１７７８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Protein Engineering，2003年，Vol.16, No.12，pp.1147-1152

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを四つ以上と、当該ポリペプチド間を連結させるためのリンカーとを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質であって、
前記リンカーが、配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返し単位３以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドであって、
ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインが、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、前記タンパク質：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１から５個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。

【請求項5】

宿主が大腸菌である、請求項４に記載の遺伝子組換え宿主。

【請求項6】

請求項４または５に記載の遺伝子組換え宿主を培養し請求項１に記載のタンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。

【請求項7】

不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１に記載のタンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。

【請求項8】

請求項７に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを多量体化したタンパク質であって、従来の多量体化したタンパク質に対してアルカリ安定性や抗体吸着量に優れたタンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。

【0003】

抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。

【0004】

精製工程では、抗体分子を特異的に認識するタンパク質（リガンド）を結合した不溶性担体からなる、アフィニティー吸着剤も用いられている。前記リガンドとして、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）や連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇなどが多く用いられている。ＳｐＡのうち黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｐＡは、Ｎ末端側からドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ、ドメインＣと、免疫グロブリン結合ドメインを五つ有していることが知られており、このうちドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定性を有したリガンド（特許文献１）や、ドメインＢ／ＺおよびドメインＣのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸残基が欠失したポリペプチドを含むリガンド（特許文献２）が開示されている。

【0005】

抗体医薬を製造する際、アフィニティー吸着剤は複数回使用され、かつ使用後は当該吸着剤に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物除去（洗浄）工程では、通常、水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を用いた定置洗浄を行ない、この工程によりアフィニティー吸着剤を再生させる。従って、前記吸着剤におけるリガンドには、前記洗浄工程を行なっても、抗体への結合性を維持できるだけの化学的安定性が必要となる。

【0006】

一方で、抗体医薬の生産性向上の観点から、アフィニティー吸着剤当たりの抗体吸着量の増加も求められている。抗体吸着量を向上させたリガンドとして、免疫グロブリン結合ドメインをタンデムに連結したポリペプチド（非特許文献１）や、リンカーを介して免疫グロブリン結合ドメインを二つ以上連結したポリペプチド（特許文献３）が開示されている。しかしながらＳｐＡについては、前記リンカーによる、アルカリ条件下での化学的安定性への影響を示した報告が極めて少ない（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特表２０１０－５０４７５４号公報

【文献】特開２０１２－２５４９８１号公報

【文献】ＷＯ２０１５／０５０１５３号

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｆｒｅｉｈｅｒｒ ｖｏｎ Ｒｏｍａｎ Ｍ他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，（１３４７），８０－８６，２０１４

【文献】Ｌｉｎｈｕｌｔ Ｍ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（１２），１１４７－５２，２００３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを多量体化したタンパク質であって、アルカリ安定性が高く、かつ抗体吸着量も高いタンパク質、および当該タンパク質を結合した不溶性担体からなる免疫グロブリン吸着剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、免疫グロブリン結合ドメイン間の結合に用いるリンカー配列を最適化することで、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
［１］
ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを二つ以上と、当該ポリペプチド間を連結させるためのリンカーとを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質であって、
前記リンカーが、以下の（１）から（３）のいずれかである、前記タンパク質：
（１）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返し単位１以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド；
（２）配列番号３１に記載のアミノ酸の繰り返し単位１以上からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含むオリゴヌクレオチド；
（３）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰り返し単位１以上からなるアミノ酸配列において、１もしくは数か所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチド。
［２］
前記リンカーが、以下の（４）から（６）のいずれかである、［１］に記載のタンパク質：
（４）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド；
（５）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むオリゴペプチド；
（６）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返し単位二以上からなるアミノ酸配列において１もしくは数か所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチド。
［３］
ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインが、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかである、［１］または［２］に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の部分配列を少なくとも含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１もしくは数箇所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド。
［４］
［１］から［３］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］
［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［６］
［４］に記載のポリヌクレオチド、または［５］に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。
［７］
宿主が大腸菌である、［６］に記載の遺伝子組換え宿主。
［８］
［６］または［７］に記載の遺伝子組換え宿主を培養し［１］から［３］のいずれかに記載のタンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。
［９］
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［３］のいずれかに記載のタンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
［１０］
［９］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。

【0012】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0013】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を構成する、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡ）の免疫グロブリン結合ドメインは、
（Ｉ）前記ドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよく、
（ＩＩ）免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前記ドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
さらに免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のポリペプチドにおいて、１もしくは数箇所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を含むポリペプチドであってもよいし、
（ＩＶ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい（以降、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載のポリペプチドをまとめて「改変体」とも表記する）。

【0014】

なお前記（ＩＩ）に関して、前記ドメインは３つのαヘリックスとそれらをつなぐループ部分で構成されている。三つのヘリックスのうちＮ末端側の二つのヘリックスが抗体結合部位であり、抗体結合部位以外のヘリックスやループを除いた場合でも抗体結合能を有していることが知られている（Ｊａｍｅｓ Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ他，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，（６２），８７－９１，１９９２）。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインの部分アミノ酸配列は、少なくとも前記抗体結合部位のアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。

【0015】

具体例として、ＳｐＡが黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６）である場合、Ｎ末端側からドメインＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基）、ドメインＤ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目までのアミノ酸残基）、ドメインＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目までのアミノ酸残基）、ドメインＢ／Ｚ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目までのアミノ酸残基）およびドメインＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基）と命名された免疫グロブリン結合ドメインを有している。この場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは、免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの全アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち、少なくともいずれか一つのドメインの部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体であってもよい。
つまり免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前述した五つのドメインのうち、いずれか一つのドメイン（例えば、ドメインＣ）の全長もしくは部分アミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその改変体でもよいし、
隣接した複数のドメインの全長（例えば、ドメインＢ／ＺとドメインＣ）もしくは部分アミノ酸配列（例えば、ドメインＢ／ＺのＣ末端側からドメインＣのＮ末端側までのアミノ酸残基）、またはその改変体であってもよいし、
前述した五つのドメインのうち任意の複数のドメインの全長（例えば、ドメインＡとドメインＣ）もしくは部分アミノ酸配列（例えば、ドメインＡの部分アミノ酸配列とドメインＣの部分アミノ酸配列）、またはその改変体であってもよい。

【0016】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインが、黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣ（配列番号１）の改変体である場合の好ましい態様として、以下（ｉ）から（ｉｖ）に示すポリペプチドが例示できる。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のメチオニンへの置換、２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸、バリン、グリシンまたはアスパラギン酸への置換、３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンまたはスレオニンへの置換、１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のリジンまたはチロシンへの置換、１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、および４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（ｉ）に記載のアミノ酸置換を少なくとも一つ有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチド
（ｉｖ）前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換のうち、少なくともいずれか一つのアミノ酸残基の置換を有するポリペプチド
なお本明細書において「１もしくは数個（数箇所）」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。前述したアミノ酸残基の置換以外の、アミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。

【0017】

また本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよい。「相同性」とは、特に、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。

【0018】

前記「１もしくは数個（数箇所）」、「相同性」の考えは、後述するリンカー配列においても適用できる。

【0019】

また本明細書において「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。特定のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は、配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換の場合、特定のアミノ酸配列における「配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における２番目のアスパラギン酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントにより特定できる。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して実施することができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、保存されていなくてもよい。

【0020】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を構成する、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインは、そのＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでもよい。前記他のアミノ酸配列は、免疫グロブリン結合活性を損なわない限り、特に制限されない。

【0021】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、前述したＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを二つ以上と、当該ドメイン間を連結させるためのリンカーとを含み、かつ前記リンカーが（１）配列番号３１（Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ）に記載のアミノ酸配列の繰返し単位１以上からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド、（２）配列番号３１に記載のアミノ酸の繰り返し単位１以上からなるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する配列を含むオリゴヌクレオチド、または（３）配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰り返し単位１以上からなるアミノ酸配列において、１もしくは数か所での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴としている。前記リンカー（オリゴペプチド）は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含み、かつＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインと二次構造を形成しない配列であってよい。具体的には、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を二つ以上繰返した配列からなるオリゴペプチドであってもよく、配列番号３１に記載のアミノ酸配列もしくは当該配列を二つ以上繰り返した配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に１もしくは数個のアミノ酸残基を付加した配列からなるオリゴペプチドであってもよい。さらに配列番号３１に記載のアミノ酸配列を二つ以上繰返す場合は、当該アミノ酸配列間に１もしくは数個のアミノ酸残基を挿入してもよい。ただし、リンカーの長さをＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインに対し長くしすぎると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を不溶性担体に固定化させてなる、本発明の吸着剤において、当該吸着剤あたりの前記タンパク質量（モル数）が減少し、免疫グロブリン結合能が低下する。そのため、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインが、ＳｐＡが有する免疫グロブリン結合ドメインのうち一つのドメインのみ（例えば、ドメインＣやその改変体）である場合、リンカーの長さは１０アミノ酸残基から２５アミノ酸残基まで（配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返しの場合は、繰返し単位が二つから五つまで）の間が好ましい。

【0022】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを前述したリンカーを介して二つ以上連結したタンパク質であるが、当該タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検出または分離する目的で有用なオリゴペプチドをさらに含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の不溶性担体に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる。

【0023】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に前述したオリゴペプチドをさらに含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造するには、あらかじめ前記オリゴペプチドを含む態様で製造してもよいし、前記オリゴペプチドを付加していない本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質に別途作製した前記オリゴペプチドを付加し製造してもよい。前者の方法で製造する場合、例えば、前記オリゴペプチドを含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主より発現させることで製造できる。前記ポリヌクレオチドの作製方法の一例として、前記オリゴペプチドを含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを直接合成し作成する方法や、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記オリゴペプチドを含まない本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを別途作製後、前記オリゴペプチドが本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側および／またはＣ末端側に付加されるように連結し作製する方法があげられる。

【0024】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のポリヌクレオチド」ともいう）は、例えば、化学合成法やＰＣＲ法等によるＤＮＡ増幅法により、取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列といった、増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型とし実施できる。鋳型とするポリヌクレオチドは、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが例示できる。

【0025】

本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用することができるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

【0026】

本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの全長を一括取得してもよく、当該ポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを取得後連結することで取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。

【0027】

なお本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと任意のタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。

【0028】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主（以下、単に「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう）を培養し前記タンパク質を発現させることで製造できる。本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することにより得られる。宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能なものであれば特に制限されない。宿主の例として、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。このうち動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が、昆虫細胞としては、Ｓｆ９、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４が、微生物としては、酵母や細菌が、それぞれ例示できる。さらに酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が、細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌としては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

【0029】

本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に保持されていればよい。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、前記宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。前記宿主が大腸菌の場合、宿主で機能するプロモーターの一例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。

【0030】

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」ともいう）で宿主を形質転換して本発明の遺伝子組換え宿主を作製してもよい。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入して得られる。なお、発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。前記宿主が大腸菌の場合、発現ベクターとしては、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターが例示できる。なお本発明の発現ベクターに、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。

【0031】

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ上に導入されてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が例示できる。

【0032】

本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なうことができる。例えば、宿主として大腸菌を選択した場合は、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等により形質転換すればよい。形質転換後に適切な方法で、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主をスクリーニングすることで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。

【0033】

なお各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報は、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」などの公知文献を利用し、取得すればよい。

【0034】

本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製できる。

【0035】

本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できる。また、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させ、発現した前記タンパク質を回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現された前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な条件に設定すればよい。培地は、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含む培地を使用できる。具体的には、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後である。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、例えば、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭである。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なえる。

【0036】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離し回収すればよい。なお、本明細書において「培養物」とは、培養により得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）などが挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作で分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収すればよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作で回収後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加して細胞を破砕し、当該破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収すればよい。前述した培養上清や細胞破砕物からの、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で実施できる。前記回収方法の一例として、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。

【0037】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用できる。前記目的で使用する際は、例えば、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む免疫グロブリン吸着剤（以下、単に「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう）の態様で使用できる。なお本明細書において、「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含む。不溶性担体は、水溶液に対して不溶性の担体であれば特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。

【0038】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。具体例として、不溶性担体が有する活性基を介して、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に前記タンパク質を固定化できる。すなわち、前記不溶性担体には、その表面などに活性基を有していてよい。前記活性基の一例として、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。

【0039】

担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。

【0040】

例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。

【0041】

また例えば、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。

【0042】

また例えば、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0043】

また例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

【0044】

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することにより活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。

【0045】

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

【0046】

本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施することができる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃である。

【0047】

本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、前記吸着剤を充填したカラムの態様にすることで、免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離できる。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお、免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱めることにより、溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。前記酸性側の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。

【0048】

前述した方法で免疫グロブリン（抗体）を分離することで、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、その一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含む画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常法により行なえばよい。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行なえばよい。

【発明の効果】

【0049】

本発明は、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドをリンカーを介して二つ以上連結した、免疫グロブリン結合性タンパク質であって、前記リンカーが、Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｓｅｒを少なくとも含むオリゴペプチドであることを特徴としている。

【0050】

本発明は、従来の免疫グロブリン結合性タンパク質と比較し、アルカリ安定性および抗体吸着量が向上しているため、当該タンパク質を結合した吸着剤により、試料中に含まれる免疫グロブリンを、高純度かつ高効率に取得できる。

【実施例】

【0051】

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0052】

実施例１
（１）免疫グロブリン結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる、天然型ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡ）のドメインＣ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基）に対し、アミノ酸置換を導入することで、免疫グロブリン結合活性を有したまま化学的安定性が向上したＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインである、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して四つ結合したポリペプチドを設計した（配列番号４）。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＳｐＡドメインＣに対し、Ｌｙｓ４Ａｒｇ（この表記は配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。また配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を三つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。さらに配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには、そのＣ末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）を付加している（配列番号４の２７８番目から２８０番目まで）。

【0053】

（１－２）（１－１）で設計した配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計した（配列番号６）。なお配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドのうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている領域（すなわち配列番号６の１番目から１７４番目まで、２２０番目から３９３番目まで、４３９番目から６１２番目まで、および６５８番目から８３１番目まで）のヌクレオチド配列（配列番号５）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列から大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）型コドンを用いて変換したヌクレオチド配列である。また配列番号３に記載のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際は、クローニングのしやすさから、各リンカーごとに異なるコドンを用いて変換した。変換したヌクレオチド配列は、Ｎ末端側から、配列番号７（配列番号６の１７５番目から２１９番目）、配列番号８（配列番号６の３９４番目から４３８番目）および配列番号９（配列番号６の６１３番目から６５７番目まで）である。さらにまた配列番号６の８３２番目から８４０番目までは、前述した不溶性担体へ固定化するためのタグ配列をコードするオリゴヌクレオチドである。

【0054】

（１－３）配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計した（配列番号１０から１７）。具体的には、配列番号６の１番目から２１９番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１０および１１に記載の配列からなるプライマーを、配列番号６の１９４番目から４３８番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１２および１３に記載の配列からなるプライマーを、配列番号６の４１４番目から６５７番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１４および１５に記載の配列からなるプライマーを、配列番号６の６３３番目から８４０番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配列番号１６および１７に記載の配列からなるプライマーを、それぞれ設計し、合成した。なお前述した各断片のうち、重複した領域（すなわち、配列番号６の１９４番目から２１９番目まで、４１４番目から４３９番目まで、および６３３番目から６５７番目まで）は、クローニングの際に複数のポリヌクレオチドを連結させるのりしろとしての役割をもつ。さらに制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａと連結できるよう、配列番号１０に記載の配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号１０の２０番目から２５番目）を、配列番号１７に記載の配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号１７の２０番目から２５番目）を、それぞれ付加している。

【0055】

（１－４）配列番号５に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１２および配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１４および配列番号１５の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号１６および配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とし、表１に示す組成からなる反応液を前記ＰＣＲプライマーセットごとに調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５８℃で３０秒間の第２ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。

【0056】

【表1】

【0057】

（１－５）得られた４種類のポリヌクレオチドをそれぞれ精製し、各ポリヌクレオチドが０．０５ｐｍｏｌ含まれている混合溶液を調製した。混合溶液に、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２８ａを０．０５ｐｍｏｌ加えた後、ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いたギブソンアッセンブリ反応により、４種のポリヌクレオチドの連結およびプラスミドｐＥＴ２８ａへのライゲーションを行なった。当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。

【0058】

（１－６）表２に示す組成からなる反応液を調製後、（１－５）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行なった。８００から１０００塩基対程度のＰＣＲ産物の増幅が確認できた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製で、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ４ＶＤＡＤＳ３と命名）を取得した。なお、配列番号１８（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）および配列番号１９（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、コロニーＰＣＲ用プライマーとして使用した。

【0059】

【表2】

【0060】

（１－７）（１－６）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ＶＤＡＤＳ３のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１８または配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ＶＤＡＤＳ３に、配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0061】

（２）免疫グロブリン結合性タンパク質の調製
（２－１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））２０ｍＬに、（１）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ４ＶＤＡＤＳ３を含む遺伝子組換え大腸菌を接種し、前培養した（３０℃、１６時間）
（２－２）前培養後の培養液１００ｍＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で２から３時間培養後、０．５ＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２００μＬ加えて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。

【0062】

（２－３）培養後の培養液を遠心分離し、湿重量８ｇの培養菌体を回収した。当該培養菌体のうち２ｇをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア社製）を用いて溶菌し、遠心分離により取得した上清をフィルターに通し、清澄化した。

【0063】

（２－４）あらかじめ０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．６）（以下、洗浄緩衝液と表記）により平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに、（２－３）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗浄後、０．１Ｍグリシン―塩酸緩衝液（ｐＨ ３．０）（以降、酸性溶液と表記）を通液し、免疫グロブリン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。

【0064】

（２－５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるタンパク質量を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、免疫グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。

【0065】

（３）免疫グロブリン吸着剤の作製
（３－１）（２）で調製した、精製免疫グロブリン結合性タンパク質を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮後、当該濃縮溶液の１０倍量のリン酸ナトリウム緩衝液を加えてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮することで、前記タンパク質溶液の濃縮および緩衝液置換を行なった。

【0066】

（３－２）活性基としてホルミル基を有した不溶性担体である、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｆｏｒｍｙｌ－６５０（東ソー社製）を純水に置換後、吸引ろ過で乾燥した。吸引濾過後のサクションドライゲルの含水率を含水率計（メトラートレド社製）で測定後、共栓付き三角フラスコに、ゲルとして０．５から３．０ｇ加えた。

【0067】

（３－３）サクションドライゲルが入った共栓付き三角フラスコに、０．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ホウ酸またはリン酸緩衝液）を加え、サクションドライゲルを膨潤させた。

【0068】

（３－４）（３－１）で調製した免疫グロブリン結合性タンパク質の濃縮液を、終濃度が５ｇ／Ｌとなるよう共栓付き三角フラスコに加え、室温で振とうすることで、当該フラスコ内に入っているゲルとタンパク質とをシッフ塩基形成により結合した。１５分から４時間後に共栓付き三角フラスコの上清を一部回収し、結合していない免疫グロブリン結合性タンパク質の割合から、前記タンパク質のゲルへの固定化量を算出した。

【0069】

（３－５）１Ｍ ＮａＢＨ_４水溶液を適量加え、室温で１５分から２時間振とうすることで、残存シッフ塩基を還元し、免疫グロブリン吸着剤を作製した。作製した吸着剤は水洗後、２０％（ｖ／ｖ）エタノールに置換し保存した。

【0070】

（４）免疫グロブリン吸着剤のアルカリ安定性評価
（４－１）（３）で作製した免疫グロブリン吸着剤を５０％（ｗ／ｖ）スラリーに調製し、当該スラリー１００μＬをミニバイオスピンカラム（ＢＩＯＲＡＤ社製）へ添加した。

【0071】

（４－２）酸性溶液および洗浄緩衝液を通液して洗浄後、洗浄緩衝液で希釈した免疫グロブリン溶液（日本血液製剤機構社製）（４３ｍｇ／ｍＬ）を添加し、恒温振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２５℃、１０００ｒｐｍで２時間振とうすることで、免疫グロブリンを不溶性担体に吸着させた。

【0072】

（４－３）洗浄緩衝液を通液することで未吸着の免疫グロブリンを洗浄後、酸性溶液を用いて吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出した。溶出液の吸光度（波長２８０ｎｍ）を分光光度計で測定し、当該溶出液に含まれる免疫グロブリンの量から、吸着剤の静的吸着量を算出した。また前記吸着量を本評価における１００％の残存活性とした。

【0073】

（４－４）（４－１）で作製した、免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムを、洗浄緩衝液で中和後、０．１Ｍ ＮａＯＨで液置換した。

【0074】

（４－５）液置換したカラムに１５０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨを添加し、カラムを密閉することで吸着剤をアルカリ溶液に浸漬した（２５℃で９６時間）。

【0075】

（４－６）浸漬後のカラムを洗浄緩衝液で中和し、（４－２）から（４－３）と同様な方法で静的吸着量を算出した。（４－３）で算出したアルカリ溶液浸漬前の静的吸着量を１００％として、浸漬前後の静的吸着量の比から残存活性を求めた。

【0076】

比較例１
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して四つ結合したポリペプチドを設計した（配列番号２１）。なお配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列（ＧＳリンカー）を三つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。さらに配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドには、そのＣ末端側に不溶性担体へ固定化するためのタグ配列（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）が付加されている（配列番号２１の２７８番目から２８０番目まで）。

【0077】

（２）（１）で設計した配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計し、当該ポリヌクレオチドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計した（配列番号２２から２６）。なお配列番号２２に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＮｃｏＩの制限酵素サイト（配列番号２２の４番目から９番目まで）を、配列番号２３および２５に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＢａｍＨＩの制限酵素サイト（配列番号２３および２５の４番目から９番目まで）を、配列番号２４に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＢｇｌＩＩの制限酵素サイト（配列番号２４の４番目から９番目まで）を、配列番号２６に記載のヌクレオチド配列からなるプライマーにはＸｈｏＩの制限酵素サイト（配列番号２６の４番目から９番目まで）を、それぞれ付加している。

【0078】

（３）配列番号６に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２２および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号２４および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号２５および配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、のうちいずれか一組をＰＣＲプライマーセット（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）とし、表１に示す組成からなる反応液を前記ＰＣＲプライマーセットごとに調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５８℃で３０秒間の第２ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにより、
ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２２および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、Ｎ末端側にある、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ末端側から数えて一つ目）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）が合成され、
ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２５および配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、Ｃ末端側にある、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ末端側から数えて四つ目）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）が合成され、
ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２４および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、Ｎ末端側とＣ末端側との間にある、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ末端側から数えて二つ目または三つ目）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）が合成される。

【0079】

（４）得られたＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２２および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで、ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２４および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで、ＰＣＲプライマーセットとして配列番号２５および配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで、それぞれ消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。当該ライゲーションにより、ＢａｍＨＩ消化で生じた突出末端同士（ポリヌクレオチドＣとポリヌクレオチドＢとの間）、ならびにＢａｍＨＩ消化で生じた突出末端とＢｇｌＩＩ消化で生じた突出末端（ポリヌクレオチドＡとポリヌクレオチドＣとの間、およびポリヌクレオチドＣ同士）とがそれぞれ連結して、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを四つ連結したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ－ポリヌクレオチドＣ－ポリヌクレオチドＣ－ポリヌクレオチドＢ）を合成し、かつ合成した前記ポリヌクレオチドに存在するＮｃｏＩ消化で生じた突出末端（ポリヌクレオチドＡ）およびＸｈｏＩ消化で生じた突出末端（ポリヌクレオチドＢ）により、前記制限酵素消化済プラスミドｐＥＴ－２８ａと連結する。

【0080】

（５）得られたライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。

【0081】

（６）実施例１（１－６）と同様の方法でコロニーＰＣＲを行ない、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ４ＧＧＧＧＳ３と命名）を含む遺伝子組換え大腸菌を取得し、当該大腸菌から発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ＧＧＧＧＳ３を取得した。

【0082】

（７）実施例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ＧＧＧＧＳ３に、配列番号２１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0083】

（８）実施例１（２）と同様な方法で、（７）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ４ＧＧＧＧＳ３を含む遺伝子組換え大腸菌から免疫グロブリン結合性タンパク質を調製し、実施例１（３）と同様な方法で、前記タンパク質を不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製し、実施例１（４）と同様な方法で前記吸着剤のアルカリ安定性を評価した。

【0084】

実施例１および比較例１における、不溶性担体への免疫グロブリン結合性タンパク質の固定化量、免疫グロブリン吸着剤が有する静的吸着量、およびアルカリ安定性評価結果（残存活性）を、まとめて表３に示す。なお表３においてリンカー長とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインのＣ末端とＮ末端との結合位置に挿入されるオリゴペプチドの長さである。したがって各ドメインの末端側配列の欠損や追加はリンカー長に含めない。

【0085】

ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメイン同士を連結させる際に用いるリンカーペプチドを、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（比較例１）から配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（実施例１）に換えることで、静的吸着量は向上（比較例１：３４．１ｇ／Ｌ、実施例１：３５．９ｇ／Ｌ）し、アルカリ処理（０．１Ｍ ＮａＯＨ、２５℃、９６時間）後の残存活性も向上（比較例１：８６．５％、実施例１：９２．１％）した。

【0086】

以上の結果から、ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドを二つ以上と、当該ポリペプチド間を連結させるためのリンカーとを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質において、前記リンカーを、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むオリゴペプチドを用いることで、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した前記タンパク質とを含む免疫グロブリン吸着剤における静的吸着量およびアルカリ安定性が向上することがわかる。

【0087】

【表3】

【0088】

比較例２
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインを、リンカーを介さず六つ連結したポリペプチドを設計した（配列番号２７）。

【0089】

（２）（１）で設計したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計した。なおコドンは大腸菌コドンを使用した。

【0090】

（３）ＰＣＲを用いて（２）で設計したポリヌクレオチドを合成し、プラスミドｐＥＴ２８ａへライゲーションした。

【0091】

（４）ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。

【0092】

（５）表２に示す組成からなる反応液を調製後、（４）で得られた形質転換体のコロニーＰＣＲを行なった。１２００塩基対程度のＰＣＲ産物の増幅が確認できた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製で、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ６と命名）を取得した。なお、配列番号１８および配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、コロニーＰＣＲ用プライマーとして使用した。

【0093】

（６）実施例１（１－７）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６に、配列番号２７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

【0094】

（７）実施例１（２）と同様な方法で、（６）で作製したｐＥＴ－ＳｐＡ６を含む遺伝子組換え大腸菌から免疫グロブリン結合性タンパク質を調製した。

【0095】

（８）実施例１（３－３）におけるサクションドライゲルの膨潤を、１ＭのＮａＣｌ溶液を含む緩衝液（ホウ酸またはリン酸緩衝液）で行なった他は、実施例１（３）と同様な方法で、前記タンパク質を不溶性担体に固定化した免疫グロブリン吸着剤を作製した。

【0096】

（９）実施例１（４－１）から（４－３）と同様な方法で前記吸着剤の静的吸着量を算出した。

【0097】

実施例２
免疫グロブリン結合性タンパク質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインを、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して六つ連結したポリペプチド（配列番号２８）を用いた他は、比較例２と同様な方法で、前記ポリペプチドを発現可能な遺伝子組み換え大腸菌の調製、免疫グロブリン吸着剤の作製、および当該吸着剤の静的吸着量の算出を行なった。

【0098】

実施例３
免疫グロブリン結合性タンパク質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＳｐＡ免疫グロブリン結合ドメインを、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるリンカーを介して六つ連結したポリペプチド（配列番号３０）を用いた他は、比較例２と同様な方法で、前記ポリペプチドを発現可能な遺伝子組み換え大腸菌の調製、免疫グロブリン吸着剤の作製、および当該吸着剤の静的吸着量の算出を行なった。なお配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を五つ繰返した配列からなるオリゴペプチドである。

【0099】

実施例２および３ならびに比較例２で作製した免疫グロブリン吸着剤の一覧を表４に示す。なお表４におけるリンカー長の定義は、表３のときと同じである。不溶性担体当たりの固定化重量はリンカーの長さに比例して増加したが、不溶性担体に固定化されたドメイン数に換算するとリンカー長に応じて減少した。

【0100】

【表4】

【0101】

実施例２および３ならびに比較例２で作製した免疫グロブリン吸着剤が有する静的吸着量を比較した結果を表５に示す。なお表５におけるリンカー長の定義は、表３のときと同じである。ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメイン同士を結合させる際、配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返しを二つ以上含むオリゴペプチドを介して連結させる（実施例２［配列番号２８］および実施例３［配列番号３０］）ことで、リンカーを介さずに連結させた場合（比較例２［配列番号２７］）と比較し、静的吸着量が向上した。

【0102】

以上の結果より、ＳｐＡの免疫グロブリン結合性ドメイン同士を、配列番号３１に記載のアミノ酸配列の繰返しを二つ以上含むオリゴペプチドを介して連結させることで、静的吸着量が向上することがわかる。

【0103】

【表5】

【配列表】

0007363134000001.app