特許 7364184 アルコール性肝疾患予防又は治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-10

(45)【発行日】2023-10-18

(54)【発明の名称】アルコール性肝疾患予防又は治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/23 20060101AFI20231011BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231011BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20231011BHJP

【ＦＩ】

A61K36/23

A61P1/16

A23L33/105 ZNA

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2019110425

(22)【出願日】2019-06-13

(65)【公開番号】P2020200292

(43)【公開日】2020-12-17

【審査請求日】2022-05-30

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発行日 ２０１９年４月２２日 刊行物 第７３回日本栄養・食糧学会大会 講演要旨集

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日 ２０１９年５月１７日から２０１９年５月１９日 集会名、開催場所 第７３回日本栄養・食糧学会大会 静岡県立大学（静岡県静岡市駿河区谷田５２－１）

(73)【特許権者】

【識別番号】391045392

【氏名又は名称】甲南化工株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】湯浅 明子

(72)【発明者】

【氏名】湯浅 勲

(72)【発明者】

【氏名】亀澤 誠

(72)【発明者】

【氏名】嶋川 博己

【審査官】伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１０－０１３３１０７（ＫＲ，Ａ）

【文献】LIN W.T. et al.，Cell Biochem Funct，2009年，Vol. 27, No. 6，pp. 344-350

【文献】JIANG, Z. et al.，J Nat Med，2016年，Vol. 70, No. 1，pp. 45-53

【文献】LU, H.Z. et al.，食品工業科技，2012年，Vol. 33, No. 16，pp. 347-349

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／００

Ａ２３Ｌ ３３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

黒ニンジン抽出組成物を含有するアルコール性肝疾患予防又は治療用組成物であって、
前記黒ニンジン抽出組成物が、水、エタノール、又はこれらの混合液による抽出組成物を、更にクロロホルム、酢酸エチル及びブタノールの１つ以上の有機溶媒による抽出工程に供して得られるものである、組成物。

【請求項2】

前記黒ニンジン抽出組成物が、水、エタノール、又はこれらの混合液による抽出組成物を、更にクロロホルム抽出工程、酢酸エチル抽出工程及びブタノール抽出工程に、この順に供して得られるものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

アルコール性肝疾患が、アルコール摂取による脂肪肝、肝炎、肝線維症、又は肝硬変である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

経口組成物である、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。

【請求項5】

医薬組成物または食品組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、アルコール性肝疾患を予防又は治療するための組成物等に関する。

【背景技術】

【0002】

アルコール性肝疾患は、大量かつ常習的なアルコールの摂取を要因とした生活習慣病である。初期症状として脂肪肝を呈し、肝炎、肝線維症・肝硬変さらには肝ガンへと進展する。このため、肝炎などの初期症状でのアルコール性肝疾患の予防は極めて重要である。

【0003】

アルコールは通常、アルコール脱水素酵素 （Ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ： ＡＤＨ） によってアセトアルデヒドへと分解され、アルデヒド脱水素酵素（Ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ： ＡＬＤＨ） によってアセトアルデヒドは酢酸へと分解される。しかし、多量のアルコールを摂取するとこの経路だけでは処理しきれなくなるため、ミクロソームエタノール酸化系 （Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｅｔｈａｎｏｌ－ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：ＭＥＯＳ） によってアルコールはアセトアルデヒドへと分解される。この経路では薬物を解毒するシトクロムＰ４５０ ２Ｅ１（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｅ１：ＣＹＰ２Ｅ１）が主にアルコールの代謝に関わっており、それに伴い細胞障害を誘導する活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ） が過剰に産生される。アルコール性肝疾患の進展には、主としてＣＹＰ２Ｅ１によって産生されるＲＯＳが主に関与していると考えられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１７－０５５６６５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、アルコール性肝疾患に有効な成分を見出し、アルコール性肝疾患を予防又は治療可能な手段を提供することを目的に検討を行った。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、黒ニンジン抽出物がアルコール性肝疾患に有効である可能性を見出し、さらに改良を重ねた。

【0007】

本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
黒ニンジン抽出物を含有するアルコール性肝疾患予防又は治療用組成物。
項２．
黒ニンジン抽出物が、水、エタノール、又はこれらの混合液による抽出物である、項１に記載の組成物。
項３．
アルコール性肝疾患が、アルコール摂取による脂肪肝、肝炎、肝線維症、又は肝硬変である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
経口組成物である、項１～３のいずれかに記載の組成物。
項５．
医薬組成物または食品組成物である、項１～４のいずれかに記載の組成物。

【発明の効果】

【0008】

アルコール性肝疾患の予防又は治療のための新規手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】黒ニンジンの５０％エタノール抽出物（ＢＣＥ）を更に各種有機溶媒で分画する手順の概要を示す。

【図2】エタノールにより低下した細胞生存率に、黒ニンジン抽出物が与える影響を検討した結果を示す。黒ニンジン抽出物により、細胞生存率が回復することが分かる。

【図3】エタノールにより亢進した細胞内ＲＯＳ生産量に、黒ニンジン抽出物が与える影響を検討した結果を示す。黒ニンジン抽出物により、亢進した細胞内ＲＯＳ生産量が抑制されることが分かる。

【図4】アルコール代謝関連酵素ＣＹＰ２Ｅ１の活性に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ－ＢｕＯＨ）が与える影響の検討結果を示す。

【図5a】アルコール代謝関連酵素ＡＤＨの活性に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ－ＢｕＯＨ）が与える影響の検討結果を示す。

【図5b】アルコール代謝関連酵素ＡＤＨの活性に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ－ＢｕＯＨ）が与える影響の検討結果を示す。

【図6】アルコール代謝関連酵素ＡＬＤＨの活性に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ－ＢｕＯＨ）が与える影響の検討結果を示す。

【図7】アルコール代謝関連酵素ＡＤＨの発現量に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ－ＢｕＯＨ）が与える影響の検討結果を示す。

【図8】アルコール性肝疾患モデルラット作製手順の概要を示す。

【図9】アルコール性肝疾患モデルラットの肝臓に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ）が与える影響の検討結果（具体的にはＡＬＳ及びＡＬＴ活性の測定結果）を示す。

【図10a】アルコール性肝疾患モデルラットの肝臓に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ）が与える影響の検討結果（具体的には、肝臓のＨＥ染色画像）を示す。

【図10b】アルコール性肝疾患モデルラットの肝臓に黒ニンジン抽出物（ＢＣＥ）が与える影響の検討結果（具体的には、肝臓のＥＶＧ染色画像）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本開示は、黒ニンジン抽出物を含有するアルコール性肝疾患を予防又は治療するための組成物（アルコール性肝疾患予防又は治療用組成物）等、黒ニンジン抽出物を用いたアルコール性肝疾患の予防又は治療方法等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。

【0011】

本開示に包含されるアルコール性肝疾患予防又は治療用組成物は、黒ニンジン抽出物を含有する。以下、本開示に包含される当該組成物を「本開示の組成物」ということがある。

【0012】

黒ニンジンは、アフガニスタンやトルコなど中央アジア原産のニンジンの一品種である。通常のニンジンにはあまり含まれていないポリフェノールやアントシアニンが豊富に含まれており、日本でも例えば沖縄において長寿食品として栽培されている。

【0013】

なお、通常のニンジンと黒ニンジンはセリ科ニンジン属ニンジンで、科・属・種までは同じであり、どちらもニンジンの学名はDaucus carota L.であるが、さらに亜種まで区分されるとニンジンはDaucus carota L. ssp. sativus、黒ニンジンはDaucus carota L. ssp. sativus var. atrorubens Alef.である。また、Black carrot (Daucus carota L.) やBlack carrot (Daucus carota L. ssp. sativus)等と記載されることもある。

【0014】

本開示の組成物に含まれる黒ニンジン抽出物は、黒ニンジンから水、エタノール、又はこれらの混合液により抽出されて得られる抽出物であることが好ましい。また、このようにして得られた抽出物（第一抽出物ということがある）に対して、さらに１種または２種以上の有機溶媒を用いて分画を行ってもよい。当該分画のための有機溶媒としては、例えばクロロホルム、酢酸エチル、ブタノール等が例示される。また、当該分画は２種以上の有機溶媒を用いて連続して行われてもよい。例えば、第一抽出物に対して、クロロホルム分画を行い、得られた抽出物に対して更に酢酸エチル分画を行い、得られた抽出物に更にブタノール分画を行って抽出物を得る等してもよい。また、抽出物は、濃縮または乾燥させたものであってもよい。例えば、減圧濃縮、凍結乾燥などにより濃縮または乾燥を行うことができる。

【0015】

本開示の組成物に含まれる黒ニンジン抽出物量は、アルコール性肝疾患予防又は治療効果が得られる範囲であれば特に制限はされず、例えば０．１～１００質量％、１～９９質量％、２～５０質量％、５～２０質量％程度等が例示される。

【0016】

また、黒ニンジン抽出物の摂取量についても、アルコール性肝疾患予防又は治療効果が得られる範囲であれば特に制限はされず、例えば成人一日当たり１０～１０００ｍｇ程度が例示でき、また、２０～８００ｍｇ、３０～５００ｍｇ、４０～３００ｍｇ、又は５０～２００ｍｇ程度が好ましく例示できる。

【0017】

本開示の組成物には、黒ニンジン抽出物以外にも、特に医薬分野または食品分野で公知の成分を含有することができる。例えば、薬学的に許容される担体、食品衛生学的に許容される担体等が挙げられるが、特に制限はされない。また、特に健康食品分野で公知の成分、例えば公知の抗酸化成分、抗疲労成分等を含有してもよい。

【0018】

アルコール性肝疾患としては、アルコールの摂取に起因する肝疾患であれば特に制限はされないが、例えば脂肪肝、肝炎、肝線維症、又は肝硬変等が挙げられる。特にアルコール性肝疾患の初期症状である脂肪肝または肝炎であることが好ましい。

【0019】

本開示の組成物は、ヒトに対してはもちろん、ヒト以外の哺乳動物にも有効である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどが例示される。また、アルコール性肝疾患の対象はもちろん、非飲酒対象、あるいは日常的に若しくはときどきアルコールを摂取するが肝疾患は患っていない対象であってもアルコール性肝疾患予防のために好ましく用いることができる。特に、アルコール脱水素酵素あるいはアルデヒド脱水素酵素の働きが強くない対象、（より具体的には、例えば飲酒により皮膚が赤くなりやすい、若しくは赤ら顔になりやすいような対象）には好適である。

【0020】

また、本開示の組成物の投与（摂取）方法は、アルコール性肝疾患予防又は治療効果が得られる限り特に制限はされないが、経口投与、経血管（特に静脈）投与、皮下投与等が好ましく例示される。中でも経口摂取が好ましい。

【0021】

また、本開示組成物は、医薬組成物または食品組成物であることが好ましい。

【0022】

医薬組成物である場合、本開示の組成物は、黒ニンジン抽出物そのものであってもよいし、これと他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等）等が必要に応じて配合され、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤等の医薬製剤に調製されたものでもよい。当該調製は、常法に従って行うことが出来る。このような本発明に係る医薬組成物は、上述したように、特に経口投与又は経血管投与により、アルコール性肝疾患の予防又は治療のために好ましく用いることができる。つまり、例えば、経口剤、注射剤、点滴剤等として好ましく用いることができる。

【0023】

食品組成物である場合、黒ニンジン抽出物と、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものが好ましい。例えば、黒ニンジン抽出物を含む、アルコール性肝疾患予防用の加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等が例示できる。具体的な形態としては、タブレット剤、カプセル剤、ドリンク剤等が例示される。なお、特に健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、又はサプリメントとして調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態で調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、錠剤の形態が摂取の簡便さの点からは好ましい。ただし、特にこれらに限定されるものではない。顆粒、カプセル、錠剤等の形態の食品組成物は、薬学的及び／又は食品衛生学的に許容される担体等を用いて、常法に従って適宜調製することができる。また、他の形態への調製も、従来の方法に従って行うことができる。

【0024】

本開示は、アルコール性肝疾患患者に対し、黒ニンジン抽出物（好ましくは本開示の組成物）を投与又は摂取することを特徴とするアルコール性肝疾患の治療方法をも包含する。また、本開示は、非アルコール性肝炎患者（例えば、健常者、日常的に若しくはときどきアルコールを摂取するが肝疾患は患っていない者等）に対し、黒ニンジン抽出物（好ましくは本開示の組成物）を投与又は摂取することを特徴とするアルコール性肝疾患の予防方法をも提供する。当該方法における、黒ニンジン抽出物や本開示の組成物等の各条件は前述の通りである。

【0025】

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。

【0026】

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。

【実施例】

【0027】

以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。なお、結果を図に棒グラフ若しくは折れ線グラフで表した際、グラフに表記される小文字アルファベットは、異なる当該アルファベット間において有意差があることを示す。

【0028】

黒ニンジン抽出物の調製
沖縄産黒ニンジンを５０％エタノール（ＥｔＯＨ）で抽出した。さらにＢＣＥを各種有機溶媒で分画し、分画物（抽出物）を得た。

【0029】

より具体的には、黒にんじんを粉砕し、当該粉砕物を室温で５０％エタノールを用いて抽出し、エバポレーターで溶媒を蒸発させてから一晩凍結乾燥し、完全に溶媒が除去し抽出物を得た。なお、以下、このようにして得られた抽出物をＢＣＥ（Ｂｌａｃｋ Ｃａｒｒｏｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）と呼ぶことがある。

【0030】

また、ＢＣＥをクロロホルム抽出操作、酢酸エチル抽出操作、及びブタノール抽出操作にこの順に供し、画分を得た。当該操作の概要を図１に示す。また、得られた画分を以下ＢＣＥ－ＢｕＯＨと呼ぶことがある。

【0031】

肝細胞の分離及び培養
９～１５週齢（３００～３５０ｇ体重）のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ＳＬＣ株式会社）からｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ灌流法を用いて肝細胞を分離した。細胞数が１．５ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ 培地で２４時間前培養した。

【0032】

細胞生存率及びＲＯＳ産生量に黒ニンジン抽出物が与える影響の検討
前培養後、本培養として培地交換と共に終濃度１００ｍＭ エタノール（ＥｔＯＨ）を添加し、２４時間培養した。なお、ＥｔＯＨ添加と同時に、検討サンプル（ＢＣＥ又はＢＣＥ－ＢｕＯＨ）を添加する検討、並びに、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ（ＰＫＡ）阻害剤であるＨ－８９（5-Isoquinolinesulfonamide）もＥｔＯＨ及び検討サンプルと同時に添加する検討も実施した。また、検討サンプル等の代わりに滅菌水のみを添加する検討（コントロール）、及びＨ－８９のみを添加する検討も実施した。

【0033】

培養後、細胞生存率をＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ法で、細胞内ＲＯＳ（活性酸素）産生量をＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）法で、それぞれ求めた。

【0034】

細胞生存率は具体的には次のようにして求めた。本培養終了後、培地を除去して０．００５％ Ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ色素液を１ｍｌ添加し、インキュベーター内（３７℃、５％ ＣＯ_２）で２時間培養した。Ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ色素液を除去し、細胞を１％Ｆｏｅｍａｌｄｅｈｙｄｅ／１％ＣａＣｌ_２（１～２ｍｌ）で１回洗浄し、１％ＣＨ_３ＣＯＯＨ／５０％ ＥｔＯＨを１ｍｌ添加し、室温で３０分間放置した。上清を１％ ＣＨ３ＣＯＯＨ／５０％ ＥｔＯＨで３～５倍希釈し（吸光度が１を超えない程度に適宜希釈）、分光光度計（Ｖ－５３０、ＪＡＳＣＯ）で５４０ｎｍの吸光度で測定した。

【0035】

また、ＲＯＳ産生量は具体的には次のようにして求めた。本培養終了３０分前に培地（２ｍｌ）中に２．４ｍＭ ＤＣＦＨ－ＤＡ液を５μｌ添加し、本培養終了後、培地を取り除き、ＰＢＳ（－）で洗浄（氷上で行う）した。カバーガラス（２４ｍｍ×２４ｍｍ）に超純水を少量つけて貼り付け、余分な水分を濾紙で吸い取り、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＬＳＣ１０１）下で観察した。

【0036】

以上のようにして求めた細胞生存率を図２に、ＲＯＳ生産量を図３に、それぞれ示す。

【0037】

アルコール代謝関連酵素活性に黒ニンジン抽出物が与える影響の検討
また、黒ニンジン抽出物の、アルコール代謝関連酵素、具体的にはＣＹＰ２Ｅ１（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｅ１）、ＡＤＨ、及びＡＬＤＨの活性に与える影響についても検討した。

【0038】

前培養後、本培養として培地交換と共に終濃度１００ｍＭ エタノール（ＥｔＯＨ）を添加し、９時間培養した。１００ｍＭのＥｔＯＨと同時にＢＣＥ－ＢｕＯＨを４００μｇ／ｍｌの濃度となるよう添加した。Ｈ－８９、ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ） を添加する場合は、ＤＭＳＯに溶解させたうえで、培地中に１０μＭとなるように、ＥｔＯＨおよびＢＣＥと同時に添加した。なお、コントロールには滅菌水のみを添加した。

【0039】

＜ＣＹＰ２Ｅ１＞
ＣＹＰ２Ｅ１特異的基質であるｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＮＰ）は、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＡＤＰＨ）存在下においてｐ－ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌに水酸化される。この性質を利用し、ｐ－ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌの産生量をＣＹＰ２Ｅ１の酵素活性として測定した。また、色素結合法でタンパク定量を行い、タンパク量あたりのＣＹＰ２Ｅ１活性を算出した。当該タンパク定量は、具体的には次のようにして行った、細胞懸濁液（超音波破砕済み）５μｌもしくは標準溶液０～２０μｌとタンパク色素液（０．０１％ Ｓｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ 溶液）２．９ｍｌを混合し、紫外可視分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＵＶｍｉｎｉ－１２４０）を用いて波長５９５ｎｍで吸光度を測定した。

【0040】

当該検討結果（ｐ－ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌの産生量（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）を、タンパク定量の結果に基づいてｎｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎへと変換した結果）を図４に示す。ＣＹＰ２Ｅ１活性は、エタノールにより上昇するところ、黒ニンジン抽出物により当該上昇が抑制されることが確認できた。

【0041】

＜ＡＤＨ＞
ＡＤＨはアルコールを分解する過程で、基質にＮＡＤ^＋を使用してＮＡＤＨに酸化する。この反応を利用して、本実験ではＵＶ法を用いてＮＡＤＨの増加量を測定し、細胞中のＡＤＨ活性（Ｕ／Ｖ）を測定した。細胞懸濁液をＮＡＤ^＋溶液と混合し、１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度の増加量（＝Ｅ／ｍｉｎ）を測定し、以下の式からＡＤＨ活性を算出した。なお、Ｖ：最終反応溶液（ｍｌ）、ｖ：検体量（ｍｌ）、ｄ：光路長（ｃｍ）および３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数を６２２０（Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）とした。今実験では、光路長１ｃｍのものを用いた。また、サンプルを色素結合法でタンパク定量を行い、タンパク量あたりのＡＤＨ活性を算出した。タンパク定量は、上記と同様の方法で行った。

【0042】

ＡＤＨ活性（μｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）＝
Ｅ／ｍｉｎ×Ｖ×１０６／（６２２０×ｖ×ｄ）／ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ（ｍｇ／１００μｌ）

【0043】

当該検討結果を図５ａ及び５ｂに示す。なお、図５ｂは、本培養０時間、２時間、又は４時間の時点で細胞を回収して行った検討結果である。

【0044】

＜ＡＬＤＨ＞
ＡＬＤＨはＮＡＤ^＋依存性酵素であるため、アセトアルデヒドを代謝する過程でＮＡＤ^＋を基質としてアセトアルデヒドを酸化し、ＮＡＤＨを産生する。本実験ではこの反応を利用して、測定用ＢｕｆｆｅｒにＡＤＨ阻害剤である４－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｏｌｅ（４ＭＰ）を添加し、ＡＤＨ活性と同様の方法でＡＬＤＨの活性を測定した。すなわち、細胞懸濁液をＮＤＡ^＋溶液と混合し、１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度の増加量（＝Ｅ／ｍｉｎ）を測定し、以下の式からＡＬＤＨ活性を算出した。なお、Ｖ：最終反応溶液（ｍｌ）、ｖ：検体量（ｍｌ）、ｄ：光路長（ｃｍ）および３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数を６２２０（Ｌ／ｍｏｌ／ｃｍ）とした。今実験では、光路長１ｃｍのものを用いた。また、サンプルを色素結合法でタンパク定量を行い、タンパク量あたりのＡＤＨ活性を算出した。タンパク定量は、上記と同様の方法で行った。

【0045】

ＡＬＤＨ活性（μｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）＝
Ｅ／ｍｉｎ×Ｖ×１０^６／（６２２０×ｖ×ｄ）／ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ（ｍｇ／１００μｌ）

【0046】

当該結果を図６に示す。なお、図６は、本培養０時間、２時間、又は４時間の時点で細胞を回収して行った検討結果である。

【0047】

以上の結果から、黒ニンジン抽出物は、ＣＹＰ２Ｅ１活性を有意に低下させる一方で、ＡＤＨ及びＡＬＤＨ活性を亢進させ得ることが確認できた。

【0048】

アルコール代謝関連酵素の発現に黒ニンジン抽出物が与える影響の検討
前培養後、本培養として培地交換と共に終濃度１００ｍＭ エタノール（ＥｔＯＨ）を添加し、４時間培養した。１００ｍＭのＥｔＯＨと同時にＢＣＥ－ＢｕＯＨを４００μｇ／ｍｌの濃度になるよう添加した。なお、コントロールには滅菌水のみを添加した。

【0049】

培養後に回収した細胞からＲＮＡを抽出し、下記塩基配列のプライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲにより、ＡＤＨ（Ａｄｈ１）の発現量を解析した。結果を図７に示す。
フォワード：ＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡ
リバース：ＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡ

【0050】

アルコール性肝疾患モデルラットを用いた黒ニンジン抽出物の効果の検討
アルコール性肝疾患モデルラットを、５％ＥｔＯＨと四塩化炭素（ＣＣｌ_４）の併用によって作製した。具体的には、次のようにして作製した。Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを１４日間予備飼育した後、
（ｉ）Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）群（ｎ＝５）、
（ｉｉ）５％ＥｔＯＨ＋ＣＣｌ_４（ＥＴ）群（ｎ＝６）、
（ｉｉｉ）ＣＣｌ_４（Ｔ）群（ｎ＝６）、
（ｉｖ）０．４８％ＢＣＥ＋５％ＥｔＯＨ＋ＣＣｌ_４（Ｂ）群（ｎ＝５）、
に群分けした。飼料と飲水は自由摂取させた。誘導剤としてＣＣｌ_４（０．４ｍｌ／ｋｇ 体重）をｏｌｉｖｅ ｏｉｌと１：３（ｖ／ｖ）の割合で混合して週２回腹腔内に投与し、Ｃ群にはｏｌｉｖｅ ｏｉｌ（０．４ｍｌ／ｋｇ 体重）を同様に投与して、２１日間飼育した。当該モデルラット作製の概要を図８に示す。

【0051】

飼育１週間ごとにＣＣｌ_４投与４８時間後の血液を尾外側静脈より採血した。最終回のＣＣｌ_４投与から４８時間後に解剖した。下大静脈から採血した後、各臓器を摘出した。臓器を生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ溶液）で洗浄した後、重量を測定し、肝臓のみを液体窒素で凍結させた。血液は、採取後３０分以上室温において凝固させた後、１５００×ｇで１０分遠心分離し、血清を回収した。血清および肝臓は測定時まで－８０℃で保存した。

【0052】

回収した血清を用いて、血中のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）及びアスパラギンアミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の活性を測定した。当該測定は、ＰＯＰ・ＴＯＯＳ法を用いた測定キット（トランスアミラーゼＣＩＩ－テストワコー：富士フイルム和光純薬株式会社）により行った。なお、これらの酵素は、肝細胞が障害されると血中に漏出することから、肝障害の指標となる。測定結果を図９に示す。ＡＳＴ及びＡＬＴの活性は、ＥＴ群で経週的に有意に上昇する（つまり、アルコール性肝疾患モデルラットが作製された）が、黒ニンジン抽出物を摂食することによってコントロールレベルにまで低下することが確認できた。

【0053】

また、回収した各群のラット由来の肝臓を病理組織学的に解析した。具体的には、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、及びエラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）染色を行った。それぞれの染色の結果を図１０ａ及び１０ｂに示す。黒ニンジン抽出物は、肝細胞障害および肝線維化を著しく改善できることが確認できた。

【0054】

以上のことから、黒ニンジン抽出物は、アルコール性肝疾患の予防及び治療効果を有することが分かった。また、そのメカニズムとしては、ｃＡＭＰ－ＰＫＡ経路を介したアルコール代謝関連酵素の調節が関与していることが示唆された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【配列表】

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