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特許7368804Ｌ－β－リジンホモポリマー及びその製造法並びに該ポリマーを含む抗菌剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-17
(45)【発行日】2023-10-25
(54)【発明の名称】Ｌ－β－リジンホモポリマー及びその製造法並びに該ポリマーを含む抗菌剤
(51)【国際特許分類】
C08H 1/00 20060101AFI20231018BHJP
A01N 63/20 20200101ALI20231018BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20231018BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20231018BHJP
【ＦＩ】
C08H1/00
A01N63/20
A01P3/00
C12P13/08 A
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019216422
(22)【出願日】2019-11-29
(65)【公開番号】P2021084995
(43)【公開日】2021-06-03
【審査請求日】2022-07-28
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和１年８月９日にｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｂｊ．ｏｒ．ｊｐ／２０１９／ａｂｓｔｒａｃｔ／にて発表 令和１年９月１８日に第７１回日本生物工学会大会にて発表
(73)【特許権者】
【識別番号】399030060
【氏名又は名称】学校法人 関西大学
(73)【特許権者】
【識別番号】311002067
【氏名又は名称】ＪＮＣ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山中 一也
(72)【発明者】
【氏名】福士 英明
【審査官】前田 直樹
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０３９５４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Isolation, structure elucidation and physicochemical properties of novel antibiotic polypeptide, ε-(L-β-lysine) polypeptide from Streptomyces sp. DWGS2，Journal of the Korean Magnetic Resonance Society，2002年，6，69-77
【文献】Antitumor effect of lysine-isopeptides，Cancer Cell International，2002年05月17日，2:4
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｈ
Ａ０１Ｎ
Ａ０１Ｐ
Ｃ１２Ｐ
Ｃ０８Ｇ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩であって、
【化1】
（式（I）中、nは任意の整数である）
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、若しくは配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し且つε-ポリ-L-β-リジン合成酵素としての活性を
有するアミノ酸配列を有する、ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素を用いて合成される、また
は（ｉｉ）前記ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素を発現する細菌を用いて合成される、
ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
【請求項2】
式（I）中、n=6～25である、請求項１に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
【請求項3】
式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を製造する方法であって、
【化2】
（式（I）中、nは任意の整数である）
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、若しくは配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し且つε-ポリ-L-β-リジン合成酵素としての活性を
有するアミノ酸配列を有する、ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素を導入した細胞を培養する
工程；または（ｉｉ）前記ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素を発現する細菌を培養する工程
、及び
培養液からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程を含む、方法。
【請求項4】
前記細菌が、Streptoalloteichus hindustanusである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
請求項１又は２に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を含む、抗菌剤。
【請求項6】
カビを抗菌対象とする、請求項５に記載の抗菌剤。
【請求項7】
式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を含む、抗菌剤であって、
【化3】
（式（I）中、nは任意の整数である）
Cladosporium属、Aspergillus属、Penicillium属及びAlternaria属からなる群から選択される何れかの属に属する菌を抗菌対象とする、抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、L-β-リジンホモポリマー（以下、ε-ポリ-L-β-リジンとも言う）及び／又はその塩、それらの製造法、並びに該ポリマー及び／又はその塩を有効成分とする抗菌剤に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、放線菌Streptomyces albulusが産生するε-ポリ-L-α-リジン（以下、EPLとも言う）が広く知られていた（特許文献１）。またEPLは、膜結合型の非リボソーム型ペプチド合成酵素（NRPS）様のペプチド合成酵素であるEPL合成酵素（Pls）によって生合成されることも知られており、リジンのε位アミノ基とα位カルボキシル基がペプチド結合によって繋がっている構造であることが知られていた。
また、EPLは、細菌が産生する物質であるため、生分解性があるアミノ酸ホモポリマーとしても広く知られていた。さらに、EPLは、これまでに抗菌剤として利用できることが明らかになっていた（特許文献２）。
また、EPLは、細菌が産生する物質であるため、生分解性があるアミノ酸ホモポリマーとしても広く知られていた。さらに、EPLは、これまでに抗菌剤として利用できることが明らかになっていた（特許文献２）。
【0003】
しかしながら、EPLの有する抗菌作用は、必ずしも全ての菌に対して十分な効果を発揮できるものではなかった。そのため、EPLの抗菌作用をさらに増強させることが望まれていた。
【0004】
また放線菌の一種であるStreptoalloteichus hindustanusは、抗菌活性を有するポリ-D-ジアミノブタン酸（Poly-D-Dab）を生産する事がこれまでに報告されているが（非特許文献１）、EPL又はPoly-D-Dab様の他のポリアミノ酸を生産するかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特公昭59-20359号公報
【文献】特開昭61-243010号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】The Journal of Antibiotics， 1988, 2, 3, 849-854
【文献】Chem. Sci., 2015, 6, 6385-6391
【文献】Anal. Chem.， 1997, 69, 5146-5151
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記に鑑み、新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を提供すること、及びその新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を含む、より優れた抗菌作用を有する抗菌剤を開発することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、EPL生産菌であるStreptomyces albulus以外の放線菌が、EPLとは異なるアミノ酸ホモポリマーを合成していることを見出した。
また、Pls様ペプチド合成酵素が、多様な未知のアミノ酸ホモポリマー合成酵素として他の微生物にも分布していることをゲノムマイニングにより見出し、放線菌の一種であるStreptoalloteichus hindustanusが新規のアミノ酸ホモポリマーであるε-ポリ-L-β-リジンを合成する事を見出した。
また、Pls様ペプチド合成酵素が、多様な未知のアミノ酸ホモポリマー合成酵素として他の微生物にも分布していることをゲノムマイニングにより見出し、放線菌の一種であるStreptoalloteichus hindustanusが新規のアミノ酸ホモポリマーであるε-ポリ-L-β-リジンを合成する事を見出した。
【0009】
さらに、ε-ポリ-L-β-リジンは、カチオン性ポリマーであって、細菌、酵母及びカビに対して優れた抗菌性を有していることを見出した。
【0010】
係る状況に鑑みて、新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を提供し、及びその新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を含む、より優れた抗菌作用を有する抗菌剤を開発した。
【0011】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
（式（I）中、nは任意の整数である）
［２］式（I）中、ｎ＝6～25である、［１］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
［３］Streptoalloteichus属に属する細菌を培養する工程、及び培養液からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程を含む、［１］又は［２］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を製造する方法。
［４］前記Streptoalloteichus属に属する細菌が、Streptoalloteichus hindustanusである、［３］に記載の方法。
［５］［１］又は［２］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を含む、抗菌剤。
［６］Cladosporium属、Aspergillus属、Penicillium属及びAlternaria属からなる群から選択される何れかの属に属する菌を抗菌対象とする、［５］に記載の抗菌剤。
［１］式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
【化1】
［２］式（I）中、ｎ＝6～25である、［１］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩。
［３］Streptoalloteichus属に属する細菌を培養する工程、及び培養液からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程を含む、［１］又は［２］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を製造する方法。
［４］前記Streptoalloteichus属に属する細菌が、Streptoalloteichus hindustanusである、［３］に記載の方法。
［５］［１］又は［２］に記載のε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を含む、抗菌剤。
［６］Cladosporium属、Aspergillus属、Penicillium属及びAlternaria属からなる群から選択される何れかの属に属する菌を抗菌対象とする、［５］に記載の抗菌剤。
【発明の効果】
【0012】
新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を提供し、及びその新規ポリアミノ酸及び／又はその塩を含む、最小発育阻止濃度（MIC）が低く、かつ、抗菌スペクトルが広い抗菌剤を開発した。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ε-ポリ-L-β-リジンの加水分解モノマーの立体異性体の構造を同定するために行った、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法の結果を表す。上図はε-ポリ-L-β-リジンへのD又はL-FDLAの標識化に関する反応模式図を表し、下図はHPLC法による測定結果のスペクトル図である。
【図2】ε-ポリ-L-β-リジンの抗菌活性を評価するための生存曲線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、式（I）の構造を有する、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を提供する。
（式（I）中、nは任意の整数である）
【化2】
【0015】
ε-ポリ-L-β-リジンの重合度は、特に限定されないが、8～27であること、すなわち式（I）においてn=6～25であることが好ましい。ε-ポリ-L-β-リジンは、本発明の効果を損なわない限り、任意の位置にアミノ酸置換を有していてもよい。
ε-ポリ-L-β-リジンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えばGPC-LALLS法により測定した場合、1000～4000の範囲であることが好ましい。
ε-ポリ-L-β-リジンは、EPLと同じくL-β-リジンのε位アミノ基とα位カルボキシル基がペプチド結合により結合した構造である。
ε-ポリ-L-β-リジンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えばGPC-LALLS法により測定した場合、1000～4000の範囲であることが好ましい。
ε-ポリ-L-β-リジンは、EPLと同じくL-β-リジンのε位アミノ基とα位カルボキシル基がペプチド結合により結合した構造である。
【0016】
ε-ポリ-L-β-リジンは、単離、精製及び／又は合成されたものであってよい。
本発明において、「単離」又は「精製」するとは、天然環境において通常混入される少なくとも1つの混入物から、本発明の目的のポリアミノ酸であるε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離すること、または本発明の目的のポリアミノ酸であるε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩の純度を上昇させることである。当業者に既知の任意の方法によって、「単離」又は「精製」することができる。
本発明において、「単離」又は「精製」するとは、天然環境において通常混入される少なくとも1つの混入物から、本発明の目的のポリアミノ酸であるε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離すること、または本発明の目的のポリアミノ酸であるε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩の純度を上昇させることである。当業者に既知の任意の方法によって、「単離」又は「精製」することができる。
【0017】
本発明において、「合成」するとは、ε-ポリ-L-β-リジンのモノマー単位を、当業者に既知の任意の化学合成法によってポリマー化することである。化学合成法としては、特に限定されないが、例えば、非特許文献２に記載される方法が挙げられる。具体的にはε-ポリ-L-β-リジンのモノマー単位のβ位アミノ基を保護基（ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基等）で保護した後、該モノマー単位を縮合剤によってポリマー化し、その後保護基を外す方法である。
【0018】
ε-ポリ-L-β-リジンの塩は、特に限定されないが、例えば、塩酸、硫酸、リン酸及び臭化水素酸から選ばれた少なくとも１種の無機酸の塩、または酢酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸及びクエン酸から選ばれた少なくとも１種の有機酸の塩が挙げられる。
【0019】
本明細書中において特に明示されていない場合であっても、ε-ポリ-L-β-リジンとの文言は、ε-ポリ-L-β-リジンの塩を含んでもよく、又はε-ポリ-L-β-リジンの塩自体であってもよい。
【0020】
ε-ポリ-L-β-リジンは、生分解性を有してもよく、好ましくは生分解性を有する。例えば、L-β-リジンのε位のアミノ基とα位のカルボキシル基がペプチド結合を分解できる菌によって分解することができる。
生分解性とは、微生物又は環境中での酸化や加水分解によって完全に分解され、自然的副産物（炭酸ガス、水、アミノ酸、メタン、バイオマスなど）のみを生じる性質のことである。生分解性の具体的な測定方法としては、例えば溶存有機体炭素量（DOC）法や生物化学的酸素消費量（BOD）法が挙げられる。生分解性を有するとは、上記方法により、ε-ポリ-L-β-リジンの50％以上が分解することである。
生分解性とは、微生物又は環境中での酸化や加水分解によって完全に分解され、自然的副産物（炭酸ガス、水、アミノ酸、メタン、バイオマスなど）のみを生じる性質のことである。生分解性の具体的な測定方法としては、例えば溶存有機体炭素量（DOC）法や生物化学的酸素消費量（BOD）法が挙げられる。生分解性を有するとは、上記方法により、ε-ポリ-L-β-リジンの50％以上が分解することである。
【0021】
本発明の他の態様は、Streptoalloteichus属に属する細菌を培養する工程、及び培養液
からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程を含む、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を製造する方法を提供する。
からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程を含む、ε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を製造する方法を提供する。
【0022】
Streptoalloteichus属に属する細菌は、ε-ポリ-L-β-リジンを生産することができる細菌である限り特に限定されない。好ましくはStreptoalloteichus hindustanusであり、より好ましくはStreptoalloteichus hindustanus NBRC15115であり、ε-ポリ-L-β-リジンを生産することができる。
【0023】
細菌の培養工程は、細菌を培養でき、該細菌がε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を生産でき、培養液中にε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を放出できる限り特に限定されず、当業者に既知の方法で行うことができる。
Streptoalloteichus属に属する細菌を培養するための培地組成は、例えば水1Lあたり、50g グルコース、5g 酵母抽出物、1g ポリペプトン、1.6g Na2HPO4、1.4g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.04g ZnSO4・7H2O、及び0.03g FeSO4・7H2Oであり、pH6.8である。培地組成成分は特に限定されず、任意で追加及び／又は変更することができ、各成分の配合量や培地のpHは特に限定されず、任意に増減することができる。
また、培養条件は、例えば次の条件で培養することができる。培地をオートクレーブ滅菌した後、室温まで放冷し、斜面培地で培養したStreptoalloteichus属に属する細菌を1白金耳、坂口フラスコ中の培地100mLに植菌し、30℃にて24時間振盪培養（振盪数200rpm）する。その後、坂口フラスコでの培養液全量を、ミニジャーファメンターの培地1L中に投入し、通気量3L/分、撹拌速度400rpm、30℃にて24時間培養し、さらに5% (NH4)2SO4を含む500mM MOPS-NaOH緩衝液(pH6.5)を培養液の1/4量添加し、24時間培養を継続するものである。培養条件（体積、温度、時間、振盪方法、通気量、撹拌速度）、培養に用いる器具や試薬は任意に変更することができる。
さらに、任意の培養条件、及び任意の培養器具や試薬によって、大規模スケールでの培養を行うこともできる。
培養後、培養液中に存在する細胞破砕物等の夾雑物は、当業者に既知の任意の方法によって取り除くことができる。
Streptoalloteichus属に属する細菌を培養するための培地組成は、例えば水1Lあたり、50g グルコース、5g 酵母抽出物、1g ポリペプトン、1.6g Na2HPO4、1.4g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.04g ZnSO4・7H2O、及び0.03g FeSO4・7H2Oであり、pH6.8である。培地組成成分は特に限定されず、任意で追加及び／又は変更することができ、各成分の配合量や培地のpHは特に限定されず、任意に増減することができる。
また、培養条件は、例えば次の条件で培養することができる。培地をオートクレーブ滅菌した後、室温まで放冷し、斜面培地で培養したStreptoalloteichus属に属する細菌を1白金耳、坂口フラスコ中の培地100mLに植菌し、30℃にて24時間振盪培養（振盪数200rpm）する。その後、坂口フラスコでの培養液全量を、ミニジャーファメンターの培地1L中に投入し、通気量3L/分、撹拌速度400rpm、30℃にて24時間培養し、さらに5% (NH4)2SO4を含む500mM MOPS-NaOH緩衝液(pH6.5)を培養液の1/4量添加し、24時間培養を継続するものである。培養条件（体積、温度、時間、振盪方法、通気量、撹拌速度）、培養に用いる器具や試薬は任意に変更することができる。
さらに、任意の培養条件、及び任意の培養器具や試薬によって、大規模スケールでの培養を行うこともできる。
培養後、培養液中に存在する細胞破砕物等の夾雑物は、当業者に既知の任意の方法によって取り除くことができる。
【0024】
上記工程によって培養液からε-ポリ-L-β-リジン及び／又はその塩を分離する工程は、ε-ポリ-L-β-リジンを分離できる限り特に限定されない。
例えば、以下の方法によって行うことができる。培養液上清にクエン酸を終濃度50mMになるように添加し、培養液上清の二倍量のアセトンとメタノールの混合液（アセトン：メタノール＝3：1）を添加して晶析させる。生じた沈殿物を遠心分離で回収し、50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）に溶解する。上記緩衝液で予め平衡化しておいたBioRex70（弱陽イオン交換体、Bio-Rad社製）に注入する。上記緩衝液で非吸着画分を洗い流し、さらに50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH9.2）を通液し、併産したPoly-D-Dabを溶出させる。その後、0.5M HClを通液し、ε-ポリ-L-β-リジンを溶出させ、メチルオレンジ法でε-ポリ-L-β-リジン含有フラクションを特定し、回収する。減圧下で乾燥させることでε-ポリ-L-β-リジン塩酸塩を得る。
例えば、以下の方法によって行うことができる。培養液上清にクエン酸を終濃度50mMになるように添加し、培養液上清の二倍量のアセトンとメタノールの混合液（アセトン：メタノール＝3：1）を添加して晶析させる。生じた沈殿物を遠心分離で回収し、50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）に溶解する。上記緩衝液で予め平衡化しておいたBioRex70（弱陽イオン交換体、Bio-Rad社製）に注入する。上記緩衝液で非吸着画分を洗い流し、さらに50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH9.2）を通液し、併産したPoly-D-Dabを溶出させる。その後、0.5M HClを通液し、ε-ポリ-L-β-リジンを溶出させ、メチルオレンジ法でε-ポリ-L-β-リジン含有フラクションを特定し、回収する。減圧下で乾燥させることでε-ポリ-L-β-リジン塩酸塩を得る。
【0025】
本発明のε-ポリ-L-β-リジンの他の製造方法として、Streptoalloteichus属に属する細菌、特にStreptoalloteichus hindustanusが有するε-ポリ-L-β-リジン合成酵素を用いる方法が挙げられる。
具体的には、当業者に既知の方法により行うことができるが、例えばε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列を、任意の細胞に任意の方法で導入することでその細胞にε-ポリ-L-β-リジンを発現させ、任意の方法でε-ポリ-L-β-リジンを回収及び分離することができる。ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列は、特に限定されないが、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列が挙げられる（Protein ID: WP_073484487.1）。またε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列は、その
機能を損なわない限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であるアミノ酸配列であってもよい。
具体的には、当業者に既知の方法により行うことができるが、例えばε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列を、任意の細胞に任意の方法で導入することでその細胞にε-ポリ-L-β-リジンを発現させ、任意の方法でε-ポリ-L-β-リジンを回収及び分離することができる。ε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列は、特に限定されないが、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列が挙げられる（Protein ID: WP_073484487.1）。またε-ポリ-L-β-リジン合成酵素をコードする配列は、その
機能を損なわない限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であるアミノ酸配列であってもよい。
【0026】
ε-ポリ-L-β-リジンの構造の同定は、当業者に既知の方法によって行うことができる。
例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を利用してε-ポリ-L-β-リジンの加水分解物の構造を同定することによって行うことができ、及び／又は核磁気共鳴分析（NMR）法を利用してε-ポリ-L-β-リジン誘導体の加水分解物の構造の同定を行うことによっても行うことができる。
例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を利用してε-ポリ-L-β-リジンの加水分解物の構造を同定することによって行うことができ、及び／又は核磁気共鳴分析（NMR）法を利用してε-ポリ-L-β-リジン誘導体の加水分解物の構造の同定を行うことによっても行うことができる。
【0027】
本発明の他の態様は、ε-ポリ-L-β-リジンを含む抗菌剤を提供することである。
【0028】
本発明の抗菌剤が対象とする菌は、細菌、酵母又はカビの何れでもよいが、好ましくはカビであり特に優れた抗菌作用を発揮する。本明細書において「抗菌」とは、菌を殺す殺菌、菌数を減らす減菌、及び菌の繁殖・生育を防止又は抑制する静菌、のいずれの意味をも指す。
【0029】
本発明の抗菌剤が細菌を対象とする場合、抗菌対象の細菌は、特に限定されないが、グラム陽性菌であるEscherichia属、Pseudomonas属及びSalmonella属からなる群から選択される何れかの属に属する細菌、又はグラム陰性菌であるBacillus属、Staphylococcus属及びListeria属からなる群から選択される何れかの属に属する細菌であることが好ましい。具体的な細菌の種類としては、例えば、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella enterica、Bacillus cereus、Staphylococcus aureus又はListeria monocytogenesが挙げられる。
なお、抗菌対象の細菌としては、ε-ポリ-L-β-リジンを合成する菌であるStreptoalloteichus属に属する細菌は含まず、特にStreptoalloteichus hindustanusは含まない。
なお、抗菌対象の細菌としては、ε-ポリ-L-β-リジンを合成する菌であるStreptoalloteichus属に属する細菌は含まず、特にStreptoalloteichus hindustanusは含まない。
【0030】
本発明の抗菌剤が酵母を対象とする場合、抗菌対象の酵母は、特に限定されないが、Candida属及びPichia属からなる群から選択される何れかの属に属する酵母であることが好ましい。具体的な酵母の種類としては、例えばCandida albicans又はPichia anomalaが挙げられる。
【0031】
本発明の抗菌剤がカビを対象とする場合、抗菌対象のカビは、特に限定されないが、Cladosporium属、Aspergillus属、Penicillium属及びAlternaria属からなる群から選択される何れかの属に属するカビであることが好ましい。具体的なカビの種類としては、例えば、Cladosporium cladosporioides、Aspergillus brasiliensis、Penicilium verrucosum又はAlternaria alternataが挙げられる。
【0032】
本発明の抗菌剤中におけるε-ポリ-L-β-リジンの含有量は、抗菌作用を発揮できる限り特に限定されることはない。例えば、ε-ポリ-L-β-リジンは、抗菌剤の体積を基準として、1～1000μg/mLの濃度で抗菌剤に含有することができる。
【0033】
本発明の抗菌剤の使用条件は、抗菌作用を発揮できる限り特に限定されず、任意の温度、湿度、適用量、時間、pHで使用することができる。
【0034】
抗菌作用の評価方法は、特に限定されないが、当業者に既知の方法で行うことができる。
例えば、本発明の抗菌剤の最小阻止濃度（MIC）を測定することや、抗菌剤投与後の細菌の生存率の測定することによって、抗菌作用を評価できる。
例えば、本発明の抗菌剤の最小阻止濃度（MIC）を測定することや、抗菌剤投与後の細菌の生存率の測定することによって、抗菌作用を評価できる。
【0035】
MICの測定によって抗菌作用を評価する方法は、例えば、ε-ポリ-L-β-リジンを用いた抗菌剤とその対照となるサンプル（EPL）等とを比較して、対照サンプルを使用した場合よりもMICが低いことによって抗菌作用が高いと評価することができる。
抗菌剤投与後の細菌の生存率を測定することによって抗菌作用を評価する方法は、例えば、ε-ポリ-L-β-リジンを用いた抗菌剤とその対照となるサンプル（EPL）等とを比較して、対照サンプルを使用した場合と比較して、菌の生存率が低下することによって抗菌作用が高いと評価することができる。
抗菌剤投与後の細菌の生存率を測定することによって抗菌作用を評価する方法は、例えば、ε-ポリ-L-β-リジンを用いた抗菌剤とその対照となるサンプル（EPL）等とを比較して、対照サンプルを使用した場合と比較して、菌の生存率が低下することによって抗菌作用が高いと評価することができる。
【実施例】
【0036】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【0037】
＜実施例１：ε-ポリ-L-β-リジン生産菌の培養及び培養液からのε-ポリ-L-β-リジン分離法＞
（ε-ポリ-L-β-リジン生産菌の培養）
ε-ポリ-L-β-リジン生産菌の培養培地を以下の組成により作成した。水1Lに対し、50g
グルコース、5g 酵母抽出物、1g ポリペプトン、1.6g Na2HPO4、1.4g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.04g ZnSO4・7H2O、及び0.03g FeSO4・7H2Oを添加し、培養培地をpH6.8とした。この培養培地をオートクレーブ滅菌した後、室温まで放冷し、斜面培地で培養したStreptoalloteichus hindustanus NBRC15115を1白金耳、坂口フラスコ中の培養培地100mLに植菌し、30℃にて24時間振盪培養（振盪数200rpm）した。その後、坂口フラスコで培養した培養液全量を、ミニジャーファメンターの培養培地1L中に投入し、通気量3L/分、撹拌速度400rpm、30℃にて24時間培養した。さらに5% (NH4)2SO4を含む500mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）-NaOH緩衝液(pH6.5)を培養液の1/4量添加し、24時間培養を継続して行った。
（ε-ポリ-L-β-リジン生産菌の培養）
ε-ポリ-L-β-リジン生産菌の培養培地を以下の組成により作成した。水1Lに対し、50g
グルコース、5g 酵母抽出物、1g ポリペプトン、1.6g Na2HPO4、1.4g KH2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.04g ZnSO4・7H2O、及び0.03g FeSO4・7H2Oを添加し、培養培地をpH6.8とした。この培養培地をオートクレーブ滅菌した後、室温まで放冷し、斜面培地で培養したStreptoalloteichus hindustanus NBRC15115を1白金耳、坂口フラスコ中の培養培地100mLに植菌し、30℃にて24時間振盪培養（振盪数200rpm）した。その後、坂口フラスコで培養した培養液全量を、ミニジャーファメンターの培養培地1L中に投入し、通気量3L/分、撹拌速度400rpm、30℃にて24時間培養した。さらに5% (NH4)2SO4を含む500mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）-NaOH緩衝液(pH6.5)を培養液の1/4量添加し、24時間培養を継続して行った。
【0038】
（ε-ポリ-L-β-リジン分離法）
上記で得た培養液上清にクエン酸を終濃度50mMになるように添加し、培養液上清の二倍量のアセトンとメタノールの混合液（アセトン：メタノール＝3：1）を添加して晶析させた。生じた沈殿物を遠心分離で回収し、50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）に溶解させた。上記緩衝液で予め平衡化しておいたBioRex（登録商標）70（弱陽イオン交換体、Bio-Rad社製）に注入した。上記緩衝液で非吸着画分を洗い流し、さらに50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH9.2）を通液し、併産したPoly-D-Dabを溶出させた。その後、0.5M HClを通液し、ε-ポリ-L-β-リジンを溶出させ、メチルオレンジ法でε-ポリ-L-β-リジン含有フラクションを特定し、ε-ポリ-L-β-リジンを回収した。減圧下で乾燥させることでε-ポリ-L-β-リジン塩酸塩約90mgを得た。
上記で得た培養液上清にクエン酸を終濃度50mMになるように添加し、培養液上清の二倍量のアセトンとメタノールの混合液（アセトン：メタノール＝3：1）を添加して晶析させた。生じた沈殿物を遠心分離で回収し、50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）に溶解させた。上記緩衝液で予め平衡化しておいたBioRex（登録商標）70（弱陽イオン交換体、Bio-Rad社製）に注入した。上記緩衝液で非吸着画分を洗い流し、さらに50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液（pH9.2）を通液し、併産したPoly-D-Dabを溶出させた。その後、0.5M HClを通液し、ε-ポリ-L-β-リジンを溶出させ、メチルオレンジ法でε-ポリ-L-β-リジン含有フラクションを特定し、ε-ポリ-L-β-リジンを回収した。減圧下で乾燥させることでε-ポリ-L-β-リジン塩酸塩約90mgを得た。
【0039】
＜実施例２：分離したポリアミノ酸（ε-ポリ-L-β-リジン）の構造決定＞
（構成アミノ酸残基の構造決定）
上記製造方法によって分離精製したポリアミノ酸の構成残基を、当業者に既知の方法であるMarfey法を用いて決定した。まず、非特許文献３に記載の方法に従い10mg/mlのポリアミノ酸精製物を6M HCl中に添加し、100℃で16時間加熱することで完全に加水分解することによりモノマーを得た。次に、このモノマーを、炭酸水素ナトリウム緩衝液中でL-FDLA（Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide）と37℃、1時間反応させることで誘導体化した（図１上図）。その後、以下の条件でHPLC分析を行った。
・HPLC分析条件
HPLC装置：Shimadzu Prominence HPLC System
カラム:SunShell C18 (株式会社クロマニック・テクノロジーズ、2.6μl、φ4.6×100)
カラム温度:40℃
Solvent A：MilliQ 中、0.1% TFA
Solvent B：アセトニトリル
流速:0.2 ml/min
グラジエント:25％-65％B
検出波長：A340
その結果、L-FDLAで誘導体化した加水分解物は、L-β-リジン標品のL-FDLA誘導体化物とよく一致する保持時間を示したことから、当該ポリアミノ酸がL体のβ-リジンを構成残基とするアミノ酸ホモポリマーであることを確認した（図１下図）。
（構成アミノ酸残基の構造決定）
上記製造方法によって分離精製したポリアミノ酸の構成残基を、当業者に既知の方法であるMarfey法を用いて決定した。まず、非特許文献３に記載の方法に従い10mg/mlのポリアミノ酸精製物を6M HCl中に添加し、100℃で16時間加熱することで完全に加水分解することによりモノマーを得た。次に、このモノマーを、炭酸水素ナトリウム緩衝液中でL-FDLA（Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide）と37℃、1時間反応させることで誘導体化した（図１上図）。その後、以下の条件でHPLC分析を行った。
・HPLC分析条件
HPLC装置：Shimadzu Prominence HPLC System
カラム:SunShell C18 (株式会社クロマニック・テクノロジーズ、2.6μl、φ4.6×100)
カラム温度:40℃
Solvent A：MilliQ 中、0.1% TFA
Solvent B：アセトニトリル
流速:0.2 ml/min
グラジエント:25％-65％B
検出波長：A340
その結果、L-FDLAで誘導体化した加水分解物は、L-β-リジン標品のL-FDLA誘導体化物とよく一致する保持時間を示したことから、当該ポリアミノ酸がL体のβ-リジンを構成残基とするアミノ酸ホモポリマーであることを確認した（図１下図）。
【0040】
（ポリマー構造の決定）
当該ポリアミノ酸におけるL-β-リジンの結合様式を以下の方法で決定した。70mgのL-β-リジンポリマーの精製品を、60％(v/v)エタノール及び1.6%(w/v)炭酸水素ナトリウム存在下で0.5mlの1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン（FDNB）と30℃で一晩反応させた。生じた黄色沈殿を、水、エタノール、及びアセトンで順次良く洗浄した後、6M HCl中、100℃で16時間加熱することで完全に加水分解した。この加水分解溶液7.5mlに、等量の酢酸エチルを加えてよく混合した後、回収した水層を真空下で蒸発乾固したものを少量のDimethyl Sulfoxide-d6に溶解して2次元NMR（H-C直接相関のHMQCスペクトル）解析に供した。
その結果、加水分解後の主生成物のアミノ基の化学シフト値(4.31ppm)に基づいて、導入したジニトロフェニル基がL-β-リジンの3位アミノ基に結合している、すなわち当該ポリアミノ酸は、L-β-リジンがEPLと同様にイソペプチド結合でつながったε-ポリ-L-β-リジンであることを確認した。
当該ポリアミノ酸におけるL-β-リジンの結合様式を以下の方法で決定した。70mgのL-β-リジンポリマーの精製品を、60％(v/v)エタノール及び1.6%(w/v)炭酸水素ナトリウム存在下で0.5mlの1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン（FDNB）と30℃で一晩反応させた。生じた黄色沈殿を、水、エタノール、及びアセトンで順次良く洗浄した後、6M HCl中、100℃で16時間加熱することで完全に加水分解した。この加水分解溶液7.5mlに、等量の酢酸エチルを加えてよく混合した後、回収した水層を真空下で蒸発乾固したものを少量のDimethyl Sulfoxide-d6に溶解して2次元NMR（H-C直接相関のHMQCスペクトル）解析に供した。
その結果、加水分解後の主生成物のアミノ基の化学シフト値(4.31ppm)に基づいて、導入したジニトロフェニル基がL-β-リジンの3位アミノ基に結合している、すなわち当該ポリアミノ酸は、L-β-リジンがEPLと同様にイソペプチド結合でつながったε-ポリ-L-β-リジンであることを確認した。
【0041】
＜実施例３＞
抗菌作用を評価するために、最小阻止濃度（MIC）を測定した（表１）。
ε-ポリ-L-β-リジン（表中、Poly-L-β-Lysと表記）（重合度8～27）を含む栄養培地
にグラム陽性菌（Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa又はSalmonella enterica）又はグラム陰性菌（Bacillus cereus、Staphylococcus aureus又はListeria monocytogenes）をそれぞれ播種し、30℃で48時間培養した。またε-ポリ-L-β-リジン（重合度8～27）を含むYPD培地に酵母（Candida albicans又はPichia anomala）又はカビ（Cladosporium cladosporioides、Aspergillus brasiliensis、Penicilium verrucosum又はAlternaria alternata）を播種し、30℃で72間培養した。対照としてEPL（表中、Poly-L-Lysと表記）（重合度25～35）を用いた。ε-ポリ-L-β-リジン濃度を段階希釈していき、菌の培養が阻止された時におけるε-ポリ-L-β-リジンの最小濃度をMICとした。
その結果、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母は何れの菌においても、ε-ポリ-L-β-リジンは対照として用いたEPLと同程度のMICであり、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母に対してEPLと同程度の抗菌作用を示した。
さらに、カビは何れの菌においても、ε-ポリ-L-β-リジンは対照として用いたEPLよりもMICが低い値であった。すなわちε-ポリ-L-β-リジンは、特にカビに対してEPLよりも優れた抗菌作用を示した。
抗菌作用を評価するために、最小阻止濃度（MIC）を測定した（表１）。
【表1】
にグラム陽性菌（Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa又はSalmonella enterica）又はグラム陰性菌（Bacillus cereus、Staphylococcus aureus又はListeria monocytogenes）をそれぞれ播種し、30℃で48時間培養した。またε-ポリ-L-β-リジン（重合度8～27）を含むYPD培地に酵母（Candida albicans又はPichia anomala）又はカビ（Cladosporium cladosporioides、Aspergillus brasiliensis、Penicilium verrucosum又はAlternaria alternata）を播種し、30℃で72間培養した。対照としてEPL（表中、Poly-L-Lysと表記）（重合度25～35）を用いた。ε-ポリ-L-β-リジン濃度を段階希釈していき、菌の培養が阻止された時におけるε-ポリ-L-β-リジンの最小濃度をMICとした。
その結果、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母は何れの菌においても、ε-ポリ-L-β-リジンは対照として用いたEPLと同程度のMICであり、グラム陽性菌、グラム陰性菌及び酵母に対してEPLと同程度の抗菌作用を示した。
さらに、カビは何れの菌においても、ε-ポリ-L-β-リジンは対照として用いたEPLよりもMICが低い値であった。すなわちε-ポリ-L-β-リジンは、特にカビに対してEPLよりも優れた抗菌作用を示した。
【0042】
＜実施例４＞
抗菌作用を評価するために、抗菌剤投与後の細菌の生存率を測定した（図２）。
10ｍM HEPES-NaOH (pH7.0)において、細胞数1×107個のEscherichia coli NBRC3301を、本発明のアミノ酸ホモポリマーであるε-ポリ-L-β-リジン（図中、Poly-L-β-Lysと表記）（重合度8～27）10 μg/mlと混合した。対照のアミノ酸ホモポリマーとしては、EPL（図中、Poly-L-Lysと表記）（重合度25～35）を用いた。
10分後、20分後及び30分後にそれぞれのアミノ酸ホモポリマーに曝露したEscherichia coliの生菌数を数えた。その結果、20分後には対照として用いたEPLよりも、ε-ポリ-L-β-リジンを用いた場合の方が、Escherichia coliの生菌数が少ないことが示された。すなわち、ε-ポリ-L-β-リジンは、EPLよりも優れた抗菌作用を示した。
抗菌作用を評価するために、抗菌剤投与後の細菌の生存率を測定した（図２）。
10ｍM HEPES-NaOH (pH7.0)において、細胞数1×107個のEscherichia coli NBRC3301を、本発明のアミノ酸ホモポリマーであるε-ポリ-L-β-リジン（図中、Poly-L-β-Lysと表記）（重合度8～27）10 μg/mlと混合した。対照のアミノ酸ホモポリマーとしては、EPL（図中、Poly-L-Lysと表記）（重合度25～35）を用いた。
10分後、20分後及び30分後にそれぞれのアミノ酸ホモポリマーに曝露したEscherichia coliの生菌数を数えた。その結果、20分後には対照として用いたEPLよりも、ε-ポリ-L-β-リジンを用いた場合の方が、Escherichia coliの生菌数が少ないことが示された。すなわち、ε-ポリ-L-β-リジンは、EPLよりも優れた抗菌作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【0043】
本発明のε-ポリ-L-β-リジンは、食品分野やその他の分野において抗菌性物質として利用でき、産業上非常に有用である。
【図1】
【図2】
【配列表】