特許 7372647 α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-24

(45)【発行日】2023-11-01

(54)【発明の名称】α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20231025BHJP

   C12P 7/6427 20220101ALI20231025BHJP

   A23L 33/14 20160101ALI20231025BHJP

   A23L 33/12 20160101ALI20231025BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20231025BHJP

   C12N 15/81 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19 ZNA

C12P7/6427

A23L33/14

A23L33/12

A23K10/16

C12N15/81 Z

C12N15/53

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019120571

(22)【出願日】2019-06-27

(65)【公開番号】P2021006015

(43)【公開日】2021-01-21

【審査請求日】2022-05-24

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110002147

【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】真野 潤一

(72)【発明者】

【氏名】小竹 英一

(72)【発明者】

【氏名】都築 和香子

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 聡

(72)【発明者】

【氏名】楠本 憲一

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５０７４７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－０５５１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／００５０８３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Yeast，2006年，Vol.23，pp.605-612

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、α－リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物であって、
ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母がクリベロマイセス属酵母であり、
同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
酵母またはその培養物。

【請求項2】

ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、リノール酸の産生量に対するα－リノレン酸の産生量の比率が向上した酵母またはその培養物であって、
ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母がクリベロマイセス属酵母であり、
同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
酵母またはその培養物。

【請求項3】

酵母が、食品安全性または飼料安全性を有する酵母である、請求項１または２記載の酵母またはその培養物。

【請求項4】

酵母が、クリベロマイセス・ラクティスである、請求項１～３のいずれか一項記載の酵母またはその培養物。

【請求項5】

脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の酵母またはその培養物。

【請求項6】

高発現プロモーターが、ＬＡＣ４プロモーターである、請求項１～５のいずれか一項記載の酵母またはその培養物。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物を含む、食品または飼料。

【請求項8】

請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。

【請求項9】

以下を含む、α－リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：
（ｉ）食用性物質と、請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物もしくは請求項８記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。

【請求項10】

食用性物質が、乳、乳加工物、またはそれらの廃棄物である、請求項９記載の方法。

【請求項11】

食用性物質が、ラクトースを含む、請求項９または１０記載の方法。

【請求項12】

食用性物質が、ホエイを含む、請求項９～１１のいずれか一項記載の方法。

【請求項13】

以下を含む、α－リノレン酸の製造方法：
（ｉ）ラクトース供給源と、請求項１～６のいずれか一項記載の酵母またはその培養物もしくは請求項８記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。

【請求項14】

請求項７記載の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα－リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子組換え技術を利用してヤロウィア属の微生物を改良し、α‐リノレン酸を生産する技術が報告されている（特許文献１）。また、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサッカロマイセス属微生物に導入して、α‐リノレン酸を生産する方法が報告されている（非特許文献１）。クリベロマイセス属酵母を飼料として利用できることが報告されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特許第４９１６８８６号公報

【文献】国際公開第２０１７／０３６２９４号

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｋａｉｎｏｕ Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ ２３， ６０５－６１２， ２００６．

【文献】Ｄｊｏｕｓｓｅ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．４５，３６８－３７３，２００５．

【文献】矢澤一良 食品科学工学会誌、４３、１、１２３１－１２３７、１９９６年

【文献】Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ Ａ．Ｐ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、５６、８、３６５－３７９、２００２．

【文献】Ｋｉｒｕｂａｋａｒａｎ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ． ９０，１，１４７－１５６，２０１１．

【文献】Ｃｏｒｉｎｏ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｍｅａｔ Ｓｃｉ．９８，４，６７９－６８８，２０１４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

近年、国際的に環境問題への関心が高まっており、資源循環型社会の実現に期待が寄せられている。乳製品製造後に大量に排出されるホエイなどの廃棄物の有効活用が求められている。一方、オメガ３脂肪酸の健康機能性が注目されており、その一つであるα‐リノレン酸を多く含む飼料や食品の生産が求められている。食品や飼料に使用した経験のある微生物で、ホエイの主要成分であるラクトースから直接、α‐リノレン酸を効率よく生産できる微生物の報告はない。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、飼料または食品として使用することができるクリベロマイセス属酵母のα‐リノレン酸生産能力をセルフクローニングで大幅に高められることを明らかにした。セルフクローニングとは、宿主と同属同種の微生物のＤＮＡをそのまま、もしくは、複数を組み合わせて、宿主の細胞に導入することである。セルフクローニングで改良した微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要はないことから、費用をかけることなく速やかに産業利用することが可能である。クリベロマイセス属などの酵母のセルフクローニング株をラクトースを含む廃棄物を用いて培養することで、廃棄物を有効活用し、かつ、α‐リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を生産することができる。このα－リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を飼料として用いることで、α‐リノレン酸を多く含む健康機能性の高い畜産物または水産物を生産することができる。また、α‐リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を直接、健康機能性の高い食品として利用することもできる。

【0007】

すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物。
〔２〕ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、リノール酸の産生量に対するα‐リノレン酸の産生量の比率が向上した酵母またはその培養物。
〔３〕酵母が、食品安全性または飼料安全性を有する酵母である、〔１〕または〔２〕の酵母またはその培養物。
〔４〕酵母が、クリベロマイセス属酵母である、〔１〕～〔３〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔５〕脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔６〕高発現プロモーターが、ＬＡＣ４プロモーターである、〔１〕～〔５〕のいずれかの酵母またはその培養物。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物を含む、食品または飼料。
〔８〕〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。
〔９〕以下を含む、α‐リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：
（ｉ）食用性物質と、〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物もしくは〔８〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
〔１０〕食用性物質が、乳、乳加工物、またはそれらの廃棄物である、〔９〕の方法。
〔１１〕食用性物質が、ラクトースを含む、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕食用性物質が、ホエイを含む、〔９〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕以下を含む、α‐リノレン酸の製造方法：
（ｉ）ラクトース供給源と、〔１〕～〔６〕のいずれかの酵母またはその培養物もしくは〔８〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。
〔１４〕〔７〕の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα‐リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、飼料または食品として安全に使用できるα‐リノレン酸高含有微生物菌体またはその培養物を生産することができる。ラクトースもしくはそれを含むホエイからα‐リノレン酸高含有微生物菌体を生産し、飼料または食品として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、ラクトースで培養したクリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の菌体の脂肪酸組成を分析したガスクロマトグラフである。

【図2】図２は、ホエイで培養したクリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の菌体の脂肪酸組成を分析したガスクロマトグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0011】

本発明は、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母（以下、「微生物」と呼ぶこともある）またはその培養物に関する。このような微生物を培養すると、α‐リノレン酸の含有量が多い微生物菌体を製造することができる。より具体的には、本発明の微生物またはその培養物は、ラクトース代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む酵母において、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターで制御される、α‐リノレン酸産生能が向上した酵母またはその培養物である。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（例、その微生物のゲノム中に存在する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）である。

【0012】

本発明において、α‐リノレン酸を生産するために用いる微生物（酵母）は、食品安全性または飼料安全性を有する酵母であることが好ましい。食品安全性または飼料安全性を有する酵母としては、例えば、食品または飼料として安全に使用された経験がある酵母が挙げられる。このような酵母としては、クリベロマイセス属の酵母が挙げられる。クリベロマイセス属の酵母として、より具体的には、例えば、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）が挙げられる。

【0013】

酵母、特に、クリベロマイセス属の酵母は、一般的にα－リノレン酸生産能力が高い種類の微生物ではないので、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が存在していても、その発現量は一般的に低い。そこで、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現プロモーターで制御されるように微生物を改変することで、微生物が元来もつα‐リノレン酸生産能力が大幅に高められる。高発現プロモーターとしては、同属同種の微生物由来の高発現プロモーターを用いる。このことにより、改変微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要がなく、食品または飼料の用途に用いることができる。同属同種の微生物由来のゲノム領域（例、プロモーター、コード領域、３’非翻訳領域）での微生物の改変を「セルフクローニング」と呼ぶことがある。

【0014】

本発明におけるセルフクローニングとは、宿主（組換えＤＮＡ技術において，ＤＮＡが移入される生細胞をいう。以下同じ。）と分類学上同一の種に属する微生物のＤＮＡのみを用いて宿主の性質を変化させることである。遺伝子組換え生物の飼料や食品としての利用や環境放出に関する安全性審査のためには、入念かつ大量に実験データを用意する必要があるとともに、審査に長期間を要することから、莫大なコストが必要である。しかし、法令等〔（１）組換えＤＮＡ技術応用食品及び添加物の安全性審査の手続（抄）（平成１２年厚生省告示第２３３号）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０６－Ｓｅｉｓａｋｕｊｏｕｈｏｕ－１１１３０５００－Ｓｈｏｋｕｈｉｎａｎｚｅｎｂｕ／１＿１１．ｐｄｆ、（２）飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｍｉｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｆｉｓ／ｆｅｅｄ／ｈｏｕｒｅｉ／ｓｕｂ１＿ｓｅｉｂｕｎｋｉｋａｋｕ．ｈｔｍｌ、（３）遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律施行規則（平成１５年財務省、文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第１号）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｖ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｆｉｌｅｓ／ｊｐ／１０８４５８．ｐｄｆ〕に示されているように、セルフクローニングで改良された微生物は、遺伝子組換え生物の安全性審査を受けることなく、産業利用することが可能であり、安全性審査のためのコストを必要としない。また、遺伝子組換え微生物を産業利用する場合には、培養後に入念に滅菌処理を行う必要があり、そのために多大なコストを要する。一方、セルフクローニングで改良された微生物は、非遺伝子組換えの微生物として扱うことができるため、滅菌処理のコストを必要としない。

【0015】

セルフクローニングとしては、例えば、微生物ゲノム上の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のプロモーター領域の同属同種の微生物に由来する高発現プロモーターでの置換または挿入、微生物ゲノム上の高発現プロモーター下流領域への脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の置換または挿入、宿主と同属同種の微生物に由来する高発現プロモーターと宿主と同属同種の微生物に由来する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み合わせた遺伝子発現カセット（選抜マーカー遺伝子が結合されていてもよい）の微生物（例、クリベロマイセス属酵母）の細胞への導入が挙げられる。セルフクローニングの手段としては、例えば、相同組換え、ゲノム編集（例、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）、ベクター導入が挙げられる。

【0016】

脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、ＦＡＤ３、Ｄ１５Ｄ等のω‐３デサチュラーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。このような同一性は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、用いる微生物の種に対応する脂肪酸不飽和化酵素（例、ＦＡＤ３タンパク質）をコードする遺伝子であってもよい。脂肪酸不飽和化活性としては、例えば、リノール酸（Ｃ１８：２）をα‐リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換する活性が挙げられる。

【0017】

本発明におけるセルフクローニングによる改良は、例えば、宿主と同属同種の生物に由来する高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とを組み合わせた遺伝子発現カセットを細胞内に存在させることで達成することができる。例えば、発現プロモーターは、クリベロマイセス属の場合、ＬＡＣ４プロモーターを使用してもよい。発現カセットが細胞内に導入された株を選抜するために、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主と同属同種の生物に由来するマーカー遺伝子を接続して、宿主に導入してもよい。例えば、マーカー遺伝子には、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子）を用いてもよい。また、クリベロマイセス属以外に由来するマーカー遺伝子を用いる場合には、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主に導入したのちに、相同組換えやＣｒｅリコンビナーゼによって導入したマーカー遺伝子をゲノムから除去してもよい。

【0018】

本発明におけるα‐リノレン酸とは、９，１２，１５－オクタデカトリエン酸のことであり、細胞内に含まれる形態は、トリアシルグリセロールやリン脂質に含まれるエステル体、もしくは、遊離脂肪酸であってもよい。

【0019】

本発明の微生物は、ラクトース代謝経路および脂肪酸合成経路を含むので、乳関連物（例、ホエイ）等のラクトース含む物質の存在下で培養することにより、ラクトースを代謝して、α‐リノレン酸の前駆物質であるＣ１８脂肪酸（例、リノール酸（Ｃ１８：２））を産生する。そして、セルフクローニングにより強化された脂肪酸不飽和化酵素の作用により、リノール酸（Ｃ１８：２）がα‐リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換され、α‐リノレン酸が微生物中に高含有量で蓄積される。

【0020】

本発明の酵母を培養することで、α－リノレン酸の含量が高い微生物菌体を調製することができる。特に、廃棄物、より好ましくは、ラクトースを含むホエイなどの廃棄物からα－リノレン酸の含量が多いクリベロマイセス属酵母菌体を製造することができる。

【0021】

本発明においてセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母は、好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が１５％以上を占めることができる。より好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が２０％以上を占めることができる。より好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα‐リノレン酸が３０％以上を占めることができる。

【0022】

本発明の酵母が、クリベロマイセス属酵母である場合、クリベロマイセス属酵母の菌株は、クリベロマイセス属微生物の公知の培養条件に従って培養することができる。また、ラクトースを含む食品廃棄物を栄養源として培養することができる。培養にあたり、培地は液体であっても固体であってもよい。

【0023】

α‐リノレン酸を生産する目的でクリベロマイセス属の酵母を培養するために用いる培地は、炭素源を含む。炭素源としては、以下に限定されないが、グルコース、スクロース、ラクトース、セロビオース、アラビノース、マルトース、グリセロール、トリアシルグリセロール、遊離脂肪酸を含むことができる。また、ラクトース、もしくは、それを含むホエイなどの廃棄物を、直接、もしくは、ほかの物質と混合することで培地として利用することができる。

【0024】

上記培地は、炭素源に加えて、通常は窒素源及び無機塩類を含み、さらに必要に応じてビタミン類、アミノ酸、微量元素等を含んでもよい。無機塩類としては、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を使用することができる。好ましい一実施形態では、上記培地は、ラクトース、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、硫酸アンモニウムを少なくとも含む。但し培地組成は、微生物の培養に適切なものであれば特に限定されない。

【0025】

培養は、本発明の酵母（例、クリベロマイセス属酵母）の通常の培養条件で行うことができる。例えば、クリベロマイセス属の酵母は、４℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃で培養することができる。クリベロマイセス属の酵母を培養する培地のｐＨは３～１０が好ましい。

【0026】

α‐リノレン酸の生産のためには、本発明の酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）の培養は、培養液中で通気攪拌しながら培養することが好ましく、典型的には数時間～１０日、好ましくは２４時間以上である。

【0027】

上記のようにして本発明の酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）を培養することにより、上記α‐リノレン酸が生成され菌体中に蓄積される。

【0028】

本発明はまた、上述した酵母またはその培養物を含む、食品または飼料を提供する。本発明の食品または飼料の種類は、特に限定されず、α‐リノレン酸の高含有化による付加価値を付与したい食品または飼料を広く対象とすることができる。

【0029】

本発明はまた、上述した酵母またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物を提供する。本発明の食用性物質発酵用組成物を食用性物質に適用させて発酵することにより、α‐リノレン酸を多く含む食品または飼料を製造することができる。
食用性物質発酵用組成物は、上述した酵母またはその培養物を含めばよく、任意成分（例えば、保存剤、発酵促進剤等）をさらに含んでもよい。酵母は、乾燥酵母であってもよい。食用性物質発酵用組成物の製造方法は、特に限定されないが、従来の製造方法によればよい。

【0030】

食用性物質は、酵母（例、クリベロマイセス属の酵母）の発酵原料となり得るものであればよく、例えば、乳関連物（乳、乳加工物、またはそれらの廃棄物）であり、例えば、ラクトースを含み、例えば、ホエイを含むが、特に限定されない。ラクトースを多く含み、かつ乳または乳加工物の廃棄物として供給量が豊富である観点から、ホエイが好ましい。

【0031】

本発明はまた、α‐リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）食用性物質と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。

【0032】

工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）で行う発酵を行うための環境を準備する工程である。食用性物質と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる方法としては、例えば、食用性物質と微生物またはその培養物とを容器に同時に又は順次添加し、必要に応じて撹拌、混合する方法が挙げられるが、特に限定されない。食用性物質については上述のとおりである。食用性物質と酵母またはその培養物のそれぞれの使用量は、発酵が可能な量であればよく、特に限定されない。食用性物質は、１種類の食用性物質でもよいし、２種以上の食用性物質の組み合わせでもよい。

【0033】

工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で準備した発酵環境の下、発酵を行う工程である。発酵条件は、特に限定されないが、使用する微生物が発酵を行いα‐リノレン酸を生産できる条件が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα‐リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望のα‐リノレン酸を含む食品または飼料を得ることができる。

【0034】

本発明はまた、α‐リノレン酸の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）ラクトース供給源と、上述した酵母またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）ラクトース供給源を発酵させる工程。

【0035】

（ｉ）、（ｉｉ）とも、食用性物質の代わりにラクトース供給源を用いること、生産物がα‐リノレン酸であることのほかは、上述の食品または飼料の製造方法と同様である。ラクトース供給源とは、ラクトースを含む物質であればよく、上述した食用性物質が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα‐リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望の純度のα‐リノレン酸を得ることができる。

【0036】

本発明の方法では、好ましくは、このようにして生成されたクリベロマイセス属の酵母菌体を遠心分離やろ過によって回収し、それを飼料や食品として利用することができる。例えば、クリベロマイセス属酵母は、食用酵素の製造に利用されており、食品として利用できる安全な微生物である。上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属微生物もこのように食品の一部として利用することができる。また、クリベロマイセス属酵母は飼料の生産にも利用されている（特許文献２）。上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母も、このように飼料として利用することができる。

【0037】

クリベロマイセス属の酵母菌体内のα‐リノレン酸は菌体から抽出して使用してもよい。また、培養物（例、培養液）から菌体を分離することなく、培養物全体を飼料や食品として利用することもできる。

【0038】

α‐リノレン酸を含む食品を摂取することで、高血圧の抑制効果が期待できる（非特許文献２）。また、α‐リノレン酸を人が食品として摂取した場合、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸の前駆体として働くことから、これらの脂肪酸の健康効果として知られている血中の中性脂肪の低減効果なども期待できる（非特許文献３）。こうしたオメガ３脂肪酸の健康効果は、リノール酸に代表されるオメガ６脂肪酸とα‐リノレン酸に代表されるオメガ３脂肪酸の摂取比率に依存していることが報告されている（非特許文献４）。また、α‐リノレン酸を多く含む飼料を動物に与えることで、畜産物にα‐リノレン酸が蓄積されることが明らかとなっている（非特許文献５、６）。すでに、α‐リノレン酸を飼料として用いて動物を生育させることで、α‐リノレン酸高含有畜産物が実際に販売されている。これと同様に、上記のセルフクローニングで改良されたクリベロマイセス属の酵母を飼料として利用することで、α‐リノレン酸が動物の組織内に移行し、健康機能性が高い畜産物、水産物（畜産・水産利用品（加工肉、乳製品）を含む）を生産することができる。

【実施例】

【0039】

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0040】

［実施例１］α‐リノレン酸の生産に関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の選定
クリベロマイセス属微生物としてＫ．ｌａｃｔｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）に含まれているＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９株を使用した。ＧＧ７９９株のゲノムの塩基配列情報はＧｅｎｂａｎｋに登録されている。この情報の中から、α‐リノレン酸の生合成に直接関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が配列番号１の塩基配列を有すると推定した。この遺伝子のコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示した。

【0041】

［実施例２］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ断片の調製
（クリベロマイセス属微生物培養用培地の組成）
酵母エキス（粉末；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２％、Ｄ－グルコース（和光純薬工業）２％を純水に溶かしたものをＹＰＤ培地とした。

【0042】

（クリベロマイセス属微生物由来脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の調製）
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、ＧＧ７９９株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４および５のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を増幅した。これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これらを脂肪酸不飽和化酵素遺伝子精製断片とした。

【0043】

（ベクター断片の調製）
また、クリベロマイセス用形質転換ベクターにはｐＫＬＡＣ２（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いた。ｐＫＬＡＣ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＫＬＡＣ２ベクター精製断片とした。

【0044】

（発現カセット作成用培地の組成）
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％含む培地をＬＢ培地とし、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬで含むアンピシリン入りＬＢ寒天培地を調製した。

【0045】

（発現カセットを含むベクターの作成）
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子精製断片、ｐＫＬＡＣ２ベクター精製断片の２つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。

【0046】

形質転換処理された大腸菌を、アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＬＡＣ４プロモーター３’領域と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーターからなる発現カセットがｐＫＬＡＣ２ベクターの中に挿入されていることを確認した。なお、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とＬＡＣ４ターミネーターの間には、ｐＫＬＡＣ２ベクターにもともと存在しているクリベロマイセス・ラクティスに由来するα‐ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅが存在したが、この配列は翻訳されず、機能していない。

【0047】

このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む発現カセットの配列が所望の配列になっており、このベクターＤＮＡが所望の発現カセットを含むベクターになっていることを塩基配列解析およびＰＣＲにより確認した。

【0048】

（同種微生物由来選択マーカーを含むベクターの作成）
続いて、ｐＫＬＡＣ２ベクターにはもともと選択マーカーとして、アスペルギルス属由来のアセトアミダーゼ遺伝子が存在している。セルフクローニングを行うためには、クリベロマイセス・ラクティス由来の配列を用いる必要があることから、クリベロマイセス・ラクティスのオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下ＵＲＡ３遺伝子）で置換することを試みた。

【0049】

ＧＧ７９９株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＵＲＡ３遺伝子およびその周辺領域を増幅した。これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これをＵＲＡ３遺伝子精製断片とした。上記の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入したｐＫＬＡＣ２ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）とＰｓｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＫＬＡＣ２－ＦＡＤベクター精製断片とした。

【0050】

ＵＲＡ３遺伝子精製断片とｐＫＬＡＣ２－ＦＡＤベクター精製断片の２つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液をＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＵＲＡ３遺伝子とその周辺領域からなるウラシル生合成マーカー遺伝子がアスペルギルス由来のアセトアミダーゼ遺伝子と置換されていることを確認した。

【0051】

このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入したウラシル生合成マーカー遺伝子の配列が所望の配列になっており、このベクターＤＮＡが所望の同種微生物由来選択マーカーを含むベクターになっていることを塩基配列解析およびＰＣＲにより確認した。

【0052】

（発現カセットを含むＤＮＡ断片の作成）
さらに、発現カセットを含むベクターを、制限酵素ＳａｃＩＩを用いて、ＬＡＣ４プロモーター３’領域、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル生合成マーカー遺伝子、ＬＡＣ４プロモーター５’領域からなるＤＮＡ断片へと切断した。この試料をアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製し、発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片を得た。この発現カセットを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号３である。

【0053】

［実施例３］クリベロマイセス属微生物のウラシル要求性変異株の取得
（クリベロマイセス属微生物変異株取得用培地の組成）
グルコース２％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ０．１７％、硫酸アンモニウム０．５％を含む培地をＹＮＢ培地とした。

【0054】

（選択培地を用いたクリベロマイセス属微生物変異株の取得）
ＹＮＢ培地に５－フルオロオロチン酸を１２５ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌで添加したものをＹＮＢ／ＦＯＡ／ＵＲＡ培地（選択培地）とした。ＹＮＢ／ＦＯＡ／ＵＲＡ寒天培地に、ＧＧ７９９株を塗布し、３０℃で生育させた。得られたコロニーをＧＧ７９９ウラシル要求性変異株とした。

【0055】

［実施例４］ クリベロマイセス属微生物ゲノムへの発現カセットの導入
ウラシル要求性変異株の培養細胞を水１４０μＬに混合し、そこに、ＮＥＢ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を３１０μＬ添加した。実施例２で調製したＤＮＡ断片を混合し、Ｋ． ｌａｃｔｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのマニュアルに従って、ＧＧ７９９株に導入した。最終的に、ＹＮＢ寒天培地で培養し、ウラシル要求性がウラシル生合成マーカー遺伝子で相補され、ウラシル非要求性になったコロニーを選抜した。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＬＡＣ４プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル要求性遺伝子がゲノム内に相同組換えで導入されていることをＰＣＲで確認した。導入したＤＮＡは、すべて宿主と同じクリベロマイセス・ラクティス由来のものであることから、この遺伝的改変はセルフクローニングとみなすことができる。

【0056】

［実施例５］ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のラクトースからの培養
ラクトース５％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ０．１７％、硫酸アンモニウム０．２２％を含む培地をＹＮＢ－Ｌａｃ培地とした。ＹＰＤ培地でＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株（以下、セルフクローニング株）をそれぞれ培養し、菌体を回収して、洗浄した。ＹＮＢ－Ｌａｃ培地３０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の菌体のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．１になるようにＹＮＢ－Ｌａｃ培地に接種した。３０℃、１２０ｒ．ｐ．ｍで３日間振とう培養し、培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収した。

【0057】

［実施例６］ラクトースで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例５で回収した菌体をプラスチックチューブに入れて、遠心分離で水分を除去した後、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ１７：０）のヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。

【0058】

ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のガスクロマトグラフは図１に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のα‐リノレン酸の含量が表１であることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα‐リノレン酸の比率が、ＧＧ７９９株に比べて約６倍に増加していることが分かった。

【0059】

α‐リノレン酸を含む脂質を食品や飼料として利用する場合に、オメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸の摂取比率が健康効果を得るための重要な指標となることが報告されている（非特許文献４）。非特許文献４では、西洋型の食事におけるオメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸の比率は１５～１６．７：１で、α‐リノレン酸をはじめとするオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで様々な健康効果が得られることについて報告されている。例えば、４：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで循環器疾患による死亡率の低減に効果があるとされる。２．５：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで大腸がんの細胞増殖を抑制に効果があるとされる。２～３：１までオメガ３脂肪酸の摂取比率を高めることで関節リウマチによる炎症を低減する効果があるとされる。クリベロマイセス属微生物の持つ主要な脂肪酸の中では、オメガ６脂肪酸とオメガ３脂肪酸はそれぞれリノール酸とα‐リノレン酸に相当する。、ＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株における両脂肪酸の比率を評価したところ、表２の結果となった。ＧＧ７９９株は、上記の健康効果を得るための目安をクリアしていなかったが、一方、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株には、健康効果が期待できる比率でα‐リノレン酸が含まれていた。非特許文献１では、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をサッカロマイセス属微生物に導入し、α‐リノレン酸産生能をサッカロマイセス属微生物に新たに付与している。この方法では、リノール酸とα‐リノレン酸の比率は最大でも４．５：１であり、健康効果が期待できる比率には及ばなかった。一方、本発明では、クリベロマイセス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子をセルフクローニングでクリベロマイセス属微生物に導入することで、リノール酸とα‐リノレン酸の比率は０．０６７：１まで大幅に改善されており、この脂質もしくはそれを含む微生物菌体を摂取することで健康効果が十分期待できることが明らかとなった。

【0060】

【表1】

【0061】

【表2】

【0062】

［実施例７］ 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のホエイからの培養
国産ホエイパウダー（株式会社自然健康社）５％、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ０．１７％、硫酸アンモニウム０．２２％を含む培地をホエイ培地とした。ＹＰＤ培地でＧＧ７９９株と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株（以下、セルフクローニング株）をそれぞれ培養し、菌体を回収して、洗浄した。ホエイ培地３０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の菌体のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．１になるようにホエイ培地に接種した。３０℃，１２０ｒ．ｐ．ｍで3日間振とう培養し、培養液の一部から遠心分離によって菌体を回収した。

【0063】

［実施例８］ホエイで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例７で回収した菌体をプラスチックチューブに入れて、遠心分離で水分を除去した後、脂肪酸組成分析試料とした。脂肪酸組成の分析は、実施例６に記載の方法を用いた。

【0064】

ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のガスクロマトグラフは図２に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＧＧ７９９株菌体とセルフクローニング株のα‐リノレン酸の含量が表３であることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα‐リノレン酸の比率が、ＧＧ７９９株に比べて約６倍に増加していることが分かった。また、表４に示した通り、ＧＧ７９９株のリノール酸とα‐リノレン酸の比率は、実施例６に記載した健康効果が得られる水準を満たしていなかった。一方、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株では、健康効果が十分に期待できる比率でα‐リノレン酸が含まれていた。

【0065】

【表3】

【0066】

【表4】

【産業上の利用可能性】

【0067】

本発明は、飼料や食品として安全に利用できるα‐リノレン酸高含有微生物菌体の生産に用いることができる。

【配列表フリーテキスト】

【0068】

配列番号１：クリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号２：クリベロマイセス・ラクティスＧＧ７９９株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号３：クリベロマイセス・ラクティス由来のＬＡＣ４プロモーター３’領域、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＬＡＣ４ターミネーター、ウラシル生合成マーカー遺伝子、ＬＡＣ４プロモーター５’領域を含む導入ＤＮＡ断片。
配列番号４および５：クリベロマイセス・ラクティスの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子領域を増幅するためのプライマー。

【図1】

【図2】

【配列表】

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