ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人 東京大学
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-27
(45)【発行日】2023-11-07
(54)【発明の名称】新規光増感剤
(51)【国際特許分類】
C07D 311/82 20060101AFI20231030BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20231030BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20231030BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231030BHJP
C09K 3/00 20060101ALI20231030BHJP
【ＦＩ】
C07D311/82
A61K31/352
A61K41/00
A61P43/00
A61P43/00 105
C09K3/00 T
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2022501985
(86)(22)【出願日】2021-02-18
(86)【国際出願番号】 JP2021006211
(87)【国際公開番号】W WO2021167022
(87)【国際公開日】2021-08-26
【審査請求日】2022-08-03
(31)【優先権主張番号】P 2020026324
(32)【優先日】2020-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１） 公開１ ▲１▼発行日： 平成３１年（２０１９年）２月２０日 ▲２▼刊行物： 平成３１年３月修士課程修了予定者 東京大学大学院薬学系研究科修士論文発表要旨集 東京大学大学院薬学系研究科 ▲３▼公開者： 高木太尊 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊が、平成３１年３月修士課程修了予定者 東京大学大学院薬学系研究科修士論文発表要旨集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （２） 公開２ ▲１▼開催日： 平成３１年（２０１９年）２月２７日 ▲２▼集会名、開催場所： 平成３１年３月東京大学大学院薬学系研究科修士課程修了予定者論文発表会 東京大学薬学部講堂（東京都文京区本郷七丁目３番１号） ▲３▼公開者： 高木太尊 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊が、平成３１年３月東京大学大学院薬学系研究科修士課程修了予定者論文発表会にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （３） 公開３ ▲１▼ウェブサイトの掲載日： 平成３１年（２０１９年）３月１日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｃｓｊ．ｊｐ／Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ／？ｙｅａｒ＝２０１９ ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、上記アドレスのウェブサイトで公開されている日本化学会第９９春季年会予稿集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （４） 公開４ ▲１▼開催日 ： 平成３１年（２０１９年）３月１８日 ▲２▼集会名、開催場所： 日本化学会 第９９春季年会、甲南大学 岡本キャンパス（兵庫県神戸市東灘区岡本８－９－１） ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、日本化学会第９９春季年会にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （５） 公開５ （その１） ▲１▼ウェブサイトの掲載日： 令和１年（２０１９年）９月２日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｏｒｇａｎｉｚｅｒ／ｊｂｓ／ｊｂｓ２０１９／ｓｕｂｊｅｃｔ／２Ｓ０７ｍ－０５／ｓｅａｒｃｈ？ｓｅａｒｃｈＴｙｐｅ＝ｏｎｌｙ＆ｉｎｉｔＦｌＧ＝ｆａｌｓｅ＆ｑｕｅｒｙ＝＆ｔｉｔｌｅ＝＆ａｕｔｈｏｒ＝％Ｅ５％８Ｃ％Ａ１＆ａｆｆｉｌｉａｔｉｏｎ＝ ▲３▼公開者： 上野匡 ▲４▼公開された発明の内容： 上野匡が、上記アドレスのウェブサイトで公開された第９２回日本生化学会大会要旨集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （その２） ▲１▼発行日： 令和１年（２０１９年）９月２日 ▲２▼刊行物： 第９２回日本生化学会大会要旨集プログラム検索・要旨閲覧アプリケーション ▲３▼公開者： 上野匡 ▲４▼公開された発明の内容： 上野匡が、プログラム検索・要旨閲覧アプリケーションで公開された第９２回日本生化学会大会要旨集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （６） 公開６ ▲１▼開催日： 令和１年（２０１９年）９月１９日 ▲２▼集会名、開催場所： 第９２回日本生化学会大会 パシフィコ横浜（神奈川県横浜市西区みなとみらい１丁目１－１） ▲３▼公開者： 上野匡 ▲４▼公開された発明の内容： 上野匡が、第９２回日本生化学会大会にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （７） 公開７ ▲１▼発行日： 令和１年（２０１９年）９月４日 ▲２▼刊行物： 第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９講演要旨集第１４０頁 第１３回バイオ関連化学シンポジウム事務局 ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９講演要旨集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （８） 公開８ ▲１▼開催日：令和１年（２０１９年）９月４日 ▲２▼集会名、開催場所：第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９ 東北大学サイエンスキャンパスホール（宮城県仙台市青葉区荒巻青葉６－６） ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （９） 公開９ ▲１▼発行日： 令和１年（２０１９年）９月１２日 ▲２▼刊行物： 第５７回日本生物物理学会年会予稿集プログラム検索・予稿閲覧アプリ ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐及び浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐及び浦野泰照が、プログラム検索・予稿閲覧アプリで公開された第５７回日本生物物理学会年会予稿集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （１０） 公開１０ ▲１▼開催日： 令和１年（２０１９年）９月２４日 ▲２▼集会名、開催場所： 第５７回日本生物物理学会年会 シーガイアコンベンションセンター（宮崎県宮崎市山崎町浜山） ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐及び浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐及び浦野泰照が、第５７回日本生物物理学会年会にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１１） 公開１１ ▲１▼発行日：令和１年（２０１９年）１１月１９日 ▲２▼刊行物： 第４２回日本分子生物学会年会抄録集 電子抄録アプリ ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、電子抄録アプリで公開された第４２回日本分子生物学会年会抄録集にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （１２） 公開１２ ▲１▼開催日： 令和１年（２０１９年）１２月６日 ▲２▼集会名、開催場所： 第４２回日本分子生物学会年会 マリンメッセ福岡（福岡県福岡市博多区沖浜町７－１） ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊、上野匡、野村悠介、浅沼大祐、浦野泰照が、第４２回日本分子生物学会年会にて、浦野泰照、上野匡、高木太尊、及び浅沼大祐が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （１３） 公開１３ ▲１▼ウェブサイトの掲載日： 令和２年（２０２０年）５月８日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｅｎｇａｇｅ／ｃｈｅｍｒｘｉｖ／ａｒｔｉｃｌｅ－ｄｅｔａｉｌｓ／６０ｃ７４ａｅｂ４ｃ８９１９６６９４ａｄ３３３２ ▲３▼公開者： 高木太尊、上野匡、浅沼大祐、浦野泰照、井川敬介、野村悠祐、宇野真之介、小松徹、神谷真子、花岡健二郎、沖村千夏、岩楯好昭、廣瀬謙造、長野哲雄、杉村薫 ▲４▼公開された発明の内容： 高木太尊らが、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＣｈｅｍＲｉｘｉｖにて、高木太尊、上野匡、浅沼大祐及び浦野泰照が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１４） 公開１４ ▲１▼ウェブサイトの掲載日：令和２年（２０２０年）１０月２３日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ－ｍｍｄｓ．ｓｉｇｍａｔｈ．ｅｓ．ｏｓａｋａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｐｅｒｓｏｎａｌ／ｓｕｚｕｋｉ／ｊｓｐｓ／ｐｒｏｇｒａｍ＿ａｂｓｔｒａｃｔ．ｈｔｍｌ ▲３▼公開者：上野匡 ▲４▼公開された発明の内容： 上野匡が、上記アドレスのウェブサイトで公開されている日本学術振興会 研究拠点形成事業 国際シンポジウム「数理腫瘍学国際研究ネットワークの構築」要旨集にて、高木太尊、上野匡、浅沼大祐及び浦野泰照が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。 （１５） 公開１５ ▲１▼開催日： 令和２年（２０２０年）１０月２６日 ▲２▼開催場所：ＷＥＢ開催（日本学術振興会 研究拠点形成事業 国際シンポジウム「数理腫瘍学 国際研究ネットワークの構築」 ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ０２ｗｅｂ．ｚｏｏｍ．ｕｓ／ｗ／８２７６８３５７９７７？ｔｋ＝ＩＴ４ｑＯＫＺＸｆｌＶ＿ＩＫｇＳＢＸＸ７Ｂ＿ＦｘＮ８０ｉＵＩｕＲｑＢｕｕＬｄｙＴＸＳ４．ＤＱＩＡＡＡＡＴＲＷＤｑＷＲＹ０ＲｍＪ２ｅｍ９ＭｄＦＭｘＳ１ＲｆｂｌＩ３Ｙ１ＱｔＭ１ｌｎＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＆ｐｗｄ＝ＭｋｘＲＲ２ｌｘＬ３Ｑｖｃ２４ｚＳＤＪ１ＶＶＢＮＳｌＡ５ＱＴ０９ ▲３▼公開者： 上野匡▲４▼公開された発明の内容： 上野匡が、オンラインで開催された日本学術振興会 研究拠点形成事業 国際シンポジウム「数理腫瘍学 国際研究ネットワークの構築」にて、高木太尊、上野匡、浅沼大祐及び浦野泰照が発明した新規光増感剤に関する研究の一部について公開した。
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】浦野 泰照
(72)【発明者】
【氏名】上野 匡
(72)【発明者】
【氏名】高木 太尊
(72)【発明者】
【氏名】浅沼 大祐
【審査官】長谷川 莉慧霞
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１００８２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】TAKEMOTO, Kiwamu et al.，Chromophore-Assisted Light Inactivation of Halo Tag Fusion Proteins Labeled with Eosin in Living Cel，ACS Chemical Biology，日本，2011年01月12日，Vol. 6，pp. 401-406，https://doi.org/10.1021/cb100431e
【文献】WANG, Yu-li et al.，Probing the Dynamic Equilibrium of Actin Polymerization by Fluorescence Energy Transfer，Cell，1981年10月15日，Volume 27, Issue 3, Part 2，pp. 429-436
【文献】LIU, Chaohong et al.，Analyzing actin dynamics during the activation of the B cell receptor in live B cells，Biochemical and Biophysical Research Communications，2012年09月17日，Vol. 427，pp. 202-206，https://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.09.046
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ０９Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し、
当該一価の置換基は、ハロゲン又は置換されていてもよい炭素数１～６個アルキル基であって、該アルキル基は、直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなり；
Ｒ２は、臭素原子又はヨウ素原子であり；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～２の整数である。）
【請求項2】
請求項１に記載の化合物又はその塩を含む、光増感剤。
【請求項3】
請求項１に記載の化合物又はその塩を含む、アクチン繊維の破壊を誘導するために用いられるプローブ。
【請求項4】
細胞又は組織内のアクチン繊維の破壊を誘導する方法であって、（ａ）請求項１に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の全部又は一部にレーザーを照射する工程、を含む該方法。
【請求項5】
当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の一部にレーザーを照射する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞又は組織を蛍光標識で染色すること、及び、蛍光イメージング手段を用いて、蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を観測することを含む、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な光増感剤に関する。より詳細には、本発明は、光照射依存的にアクチン繊維の局所的破壊を誘導する新規な機能性プローブに関する。
【背景技術】
【0002】
アクチンは真核細胞に最も豊富に存在するタンパク質の１つであり、球状の単量体アクチン（Ｇアクチン）は分子量約４２ｋＤａのタンパク質である。４つのサブドメインにより構成されており、その中心にはＡＴＰ－ＡＤＰ結合部位が存在し、アクチン１分子に対して１分子のＡＴＰあるいはＡＤＰが結合する（非特許文献１）。
【0003】
単量体アクチンは生理的条件下で自発的に重合して、二重らせん状のアクチンフィラメント（Ｆアクチン）を形成する。アクチンフィラメントは微小管、中間系フィラメントと並ぶ細胞骨格の主成分であり、細胞の遊走、接着、分裂及び形状の制御など、多数に基本的な細胞機能において必要不可欠の役割を果たしている（例えば、非特許文献２）。
例えば細胞遊走において、アクチン単量体の重合により生じる力は細胞の形を変化させ、移動方向の前端に突起を作り出す。これに続きアクチンの核化促進因子であるArp2/3複合体のはたらきによって、突起周辺に枝分かれ構造のアクチンフィラメントのネットワークが張り巡らされ、細胞に動力を与える（非特許文献１）。
例えば細胞遊走において、アクチン単量体の重合により生じる力は細胞の形を変化させ、移動方向の前端に突起を作り出す。これに続きアクチンの核化促進因子であるArp2/3複合体のはたらきによって、突起周辺に枝分かれ構造のアクチンフィラメントのネットワークが張り巡らされ、細胞に動力を与える（非特許文献１）。
【0004】
このように、アクチン繊維は複雑な三次元構造を形成することにより力を伴う多くの機能を発生している。さらに、アクチン繊維が発生する力は細胞単体のみでなく、上皮組織中の複数細胞の間にも働く。
【0005】
また、近年、上皮組織における隣接細胞同士が互いに及ぼしあう力が、形態形成のシグナルとして中心的に機能する可能性が示唆され、注目を集めている（非特許文献３及び４）。
これらの結果は、アクチンが形態形成におけるシグナルとして働く、すなわちアクチンの発現、重合脱重合の調節により細胞同士が押し合い圧し合う力の大きさが変化し、それらが生化学シグナルへと変換されることで上皮組織における細胞配列が協調的に規定されている可能性を示唆している。
これらの結果は、アクチンが形態形成におけるシグナルとして働く、すなわちアクチンの発現、重合脱重合の調節により細胞同士が押し合い圧し合う力の大きさが変化し、それらが生化学シグナルへと変換されることで上皮組織における細胞配列が協調的に規定されている可能性を示唆している。
【0006】
このように、現状形態形成におけるアクチンの役割の解明は、組織における細胞配列に対して力学モデルを用いた数理解析により行われている。一方で、形態形成のシグナルとしてのアクチン繊維が発生する力の役割を正確に理解するためには、組織・生体中の一部の細胞集団のアクチン繊維を狙ったタイミング・形状で操作し、力の伝搬及び形態の変化を観察することが必要である。
【0007】
アクチン繊維操作の最も一般的な手法は重合阻害剤の添加であり、その中でもCytochalasin D及びLatrunculin Bが汎用される。
これらのアクチン重合阻害剤は，薬剤を添加する系全体の細胞において阻害することを目的に用いられており，「生物において細胞集団の任意の時空間でアクチン繊維を操作する」ことに対して利用するためには、生物の特定部位において阻害作用を発揮するよう，なにかしらの工夫が必要である。一般に薬物を組織・生物の一部に局所投与をしたとしても、速やかに拡散してしまうため、局所投与部位のみで阻害を維持させることは困難である。
これらのアクチン重合阻害剤は，薬剤を添加する系全体の細胞において阻害することを目的に用いられており，「生物において細胞集団の任意の時空間でアクチン繊維を操作する」ことに対して利用するためには、生物の特定部位において阻害作用を発揮するよう，なにかしらの工夫が必要である。一般に薬物を組織・生物の一部に局所投与をしたとしても、速やかに拡散してしまうため、局所投与部位のみで阻害を維持させることは困難である。
【0008】
他方、条件依存的なアクチン繊維の破壊を誘導することができる手法として汎用されるのは、レーザーによる切断であり、薬剤添加を伴わずにキイロショウジョウバエなどの動物のアクチン繊維の破壊を誘導することが可能である。しかしながら、実際に組織に対し高エネルギーのレーザーを照射した場合には、照射部位周辺に加熱由来と考えられる気泡が形成されることが知られている。また、レーザー光の照射直径は～１μｍ程度と非常に小さいことから、組織の形態形成に影響を及ぼすような広範囲へのレーザー照射を行うためには、多くの時間がかかるとともに、周辺分子への影響が非常に大きくなってしまう。
【0009】
また、標的特異性の高い手法としては、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒTMシステム （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の利用が存在する。この方法は、標的タンパク質とdestabilization domain（ＤＤ）と融合したキメラタンパク質を用いる手法で，薬剤非添加条件ではプロテアソームによる分解を受ける一方で、ＤＤ結合性をもつ小分子Ｓｈｉｅｌｄ１を共添加することで，ＤＤの構造が安定化され，キメラタンパク質の分解を抑制可能である（非特許文献５）。
しかしながら、本手法を「生物において一部の細胞集団のアクチン繊維を非侵襲的に任意の時空間で操作する」ことに利用するためには、ＤＤ－ａｃｔｉｎを遺伝的に生物に導入した上で、成長過程で必要量のＳｈｉｅｌｄ１を添加し続け、ある段階で体内の一部のみからＳｈｉｌｅｄ１を除去する必要性が生じる。また特に，局所的にアクチン繊維を破壊することは，局所的に薬剤を取り除くことが必要となり非現実的である。
しかしながら、本手法を「生物において一部の細胞集団のアクチン繊維を非侵襲的に任意の時空間で操作する」ことに利用するためには、ＤＤ－ａｃｔｉｎを遺伝的に生物に導入した上で、成長過程で必要量のＳｈｉｅｌｄ１を添加し続け、ある段階で体内の一部のみからＳｈｉｌｅｄ１を除去する必要性が生じる。また特に，局所的にアクチン繊維を破壊することは，局所的に薬剤を取り除くことが必要となり非現実的である。
【0010】
上記したように、形態形成におけるアクチンの役割の解明のために、「生物において任意の領域のアクチン繊維を非侵襲的に任意の時空間で操作する」ことを可能とするような手法が強く望まれているが、既存の技術は，生物への適用の自由度が十分には高くないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【文献】Pollard, T. D. & Cooper, J. A. Actin, a Central Player in Cell Shape and Movement. Science 326, 1208-1212, doi:10.1126/science.1175862 (2009).
【文献】Dominguez, R. & Holmes, K. C. Actin structure and function. Annual review of biophysics 40, 169-186, doi:10.1146/annurev-biophys-042910-155359 (2011).
【文献】Sugimura, K. & Ishihara, S. The mechanical anisotropy in a tissue promotes ordering in hexagonal cell packing. Development 140, 4091-4101, doi:10.1242/dev.094060 (2013).
【文献】Ishihara, S. & Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology 313, 201-211, doi:10.1016/j.jtbi.2012.08.017 (2012).
【文献】Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. & Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell 126, 995-1004, doi:10.1016/j.cell.2006.07.025 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、時空間選択的にアクチン繊維の破壊を誘導可能なプローブ、及びこれを用いた方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
一般に、生物の特定の器官、あるいは細胞のみに薬剤によって摂動を与えることを目指す場合には、拡散による標的部位以外への影響が大きな問題になる。特に今回の研究において応用を想定しているショウジョバエ幼虫の組織は非常に小さいため、仮に細胞系で利用されるような阻害剤を標的周辺に投与したとしても、短いタイムスケールで拡散することでアクチン繊維の意図せぬ操作、広範囲の形態形成異常、さらには生存率の低下を引き起こしてしまうことが予測される。
そこで、本発明者らは、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして、光に着目した。
次に、光照射依存的なアクチン繊維の破壊を誘導可能な有機小分子を開発するにあたり、本発明者らの研究室において見出された新規Ｆアクチン結合性小分子であるＨＭＲｅｆに着目した。
更に、本発明者らは、アクチン繊維の破壊機構として、chromophore-assisted light inactivation（ＣＡＬＩ）を採用することとした。ＣＡＬＩとは、標的タンパク質のリガンドと光増感剤を結合した複合分子を利用し、光照射した部位のみで一重項酸素を発生させることで、光照射部位の標的タンパク質特異的な機能不全を誘導する手法である。そこで、ＨＭＲｅｆに光増感能を付与することを種々検討した結果、アクチン繊維結合性と光増感能を有する小分子ＣＡＬＩプローブを得ることができ、本発明を完成した。
そこで、本発明者らは、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして、光に着目した。
次に、光照射依存的なアクチン繊維の破壊を誘導可能な有機小分子を開発するにあたり、本発明者らの研究室において見出された新規Ｆアクチン結合性小分子であるＨＭＲｅｆに着目した。
更に、本発明者らは、アクチン繊維の破壊機構として、chromophore-assisted light inactivation（ＣＡＬＩ）を採用することとした。ＣＡＬＩとは、標的タンパク質のリガンドと光増感剤を結合した複合分子を利用し、光照射した部位のみで一重項酸素を発生させることで、光照射部位の標的タンパク質特異的な機能不全を誘導する手法である。そこで、ＨＭＲｅｆに光増感能を付与することを種々検討した結果、アクチン繊維結合性と光増感能を有する小分子ＣＡＬＩプローブを得ることができ、本発明を完成した。
【0014】
即ち、本発明は、
［１］以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、臭素原子又はヨウ素原子であり；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～２の整数である。）
［２］［１］に記載の化合物又はその塩を含む、光増感剤。
［３］［１］に記載の化合物又はその塩を含む、アクチン繊維の破壊を誘導するために用いられるプローブ。
［４］細胞又は組織内のアクチン繊維の破壊を誘導する方法であって、（ａ）［１］に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の全部又は一部にレーザーを照射する工程、を含む該方法。
［５］当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の一部にレーザーを照射する、［４］に記載の方法。
［６］前記細胞又は組織を蛍光標識で染色すること、及び、蛍光イメージング手段を用いて、蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を観測することを含む、［４］又は［５］に記載の方法。
を提供するものである。
［１］以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、臭素原子又はヨウ素原子であり；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～２の整数である。）
［２］［１］に記載の化合物又はその塩を含む、光増感剤。
［３］［１］に記載の化合物又はその塩を含む、アクチン繊維の破壊を誘導するために用いられるプローブ。
［４］細胞又は組織内のアクチン繊維の破壊を誘導する方法であって、（ａ）［１］に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の全部又は一部にレーザーを照射する工程、を含む該方法。
［５］当該化合物又はその塩が導入された細胞又は組織の一部にレーザーを照射する、［４］に記載の方法。
［６］前記細胞又は組織を蛍光標識で染色すること、及び、蛍光イメージング手段を用いて、蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を観測することを含む、［４］又は［５］に記載の方法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【0015】
本発明により、時空間選択的にアクチン繊維の破壊を誘導可能な新規な光増感剤を提供することができる。
特に本発明においては、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして光を利用して、本発明の化合物又はその塩を導入した細胞又は組織内のアクチン繊維を特異的に破壊することが可能である。
特に本発明においては、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして光を利用して、本発明の化合物又はその塩を導入した細胞又は組織内のアクチン繊維を特異的に破壊することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明の方法の基本的な概念図を示す。
【図2】本発明の方法の基本的な概念図を示す。
【図3】ＨＭＲＩｅｆの光学特性の測定結果を示す。
【図4】ピレン標識アクチンによるアクチン脱重合アッセイの結果を示す。
【図5】ＨｅＬａ細胞をＨＭＲｅｆ及びＨＭＲＩｅｆで染色し、共焦点イメージングを取得した結果を示す。
【図6】光照射条件下における１２８０ｎｍの発光強度により一重項酸素生成能を評価した結果を示す。
【図7】ＧＬＩＦｉｎ（ＨＭＲＩｅｆ）及び種々の色素を用いて、生細胞系における光照射依存的なアクチン繊維の破壊を調べた結果を示す。
【図8】ＧＬＩＦｉｎ媒介光不活性化のＦ－アクチン断片化の時間依存性の評価結果を示す。
【図9】ＧＬＩＦｉｎ（ＨＭＲＩｅｆ）を用いて、光照射依存的なアクチン繊維の破壊を行った後、十分時間経過後のアクチン繊維の回復を調べた結果を示す。
【図10】ＧＬＩＦｉｎで不活性化したＦ－アクチンの回復の時間依存性を調べた結果を示す。
【図11】光増感剤および照射を伴うまたは伴わないＣＣＫ８アッセイの結果を示す。
【図12】ＧＬＩＦｉｎ添加及び光照射による微小管への影響を調べた結果を示す。
【図13】実施例７の（１）の試験方法とプロトコルを示す。
【図14】ＧＬＩＦｉｎで染色し、緑色光で照射した融合細胞を用いた内皮細胞スクラッチアッセイ後のＭＤＣＫ細胞のイメージングの結果を示す
【図15】左図は、スクラッチの幅の時間依存性を示す。右図は、照射後１２時間までの移動速度を示す。
【図16】実施例７の（２）の実験のプロトコルを示す
【図17】ＧＬＩＦｉｎを用いたＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙの結果を示す。
【図18】上皮単層細胞上でのＧＬｉＦｉｎ介在「アクチン落書き」を作製した結果を示す。
【図19】ショウジョウバエの翅原基での、ＧＬｉＦｉｎ光刺激で誘導される細胞拡大及びファロイジンシグナルの消失の評価結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
【0018】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくは臭素、又はヨウ素原子である。
【0019】
本発明の１つの実施態様は、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
【0020】
本発明においては、新規アクチン繊維結合性小分子であるＨＭＲｅｆの骨格に、Ｒ２として臭素原子又はヨウ素原子を導入することが重要である。これにより、本発明の化合物は、アクチン繊維結合性を有し、かつ、光増感剤として機能することができる。
【0021】
光増感剤とは、光励起され吸収したエネルギーを周辺分子へ移動することで、活性分子種を発生する化合物の総称であり、多くの光増感剤は酸素分子へのエネルギー移動を引き起こすことで、一重項酸素１Ｏ２などの活性酸素種ＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）を発生する。ＲＯＳは周辺のタンパク質やＤＮＡを損傷する性質を有し、なおかつその寿命は非常に短く発生箇所周辺において速やかに消費されることから、光増感剤を添加した細胞・組織の一部に光照射を行うことにより、光照射部位の細胞のみで選択的に毒性を発揮させることが可能である。
そして、光増感剤に標的分子結合性を付与することで、損傷範囲を限局したのがＣＡＬＩである。本発明者らは、アクチン繊維の破壊機構として、ＣＡＬＩの手法に着目した。そして、ＨＭＲｅｆに光増感能を付与することを種々検討した結果、ＨＭＲｅｆの骨格の特定の部位に臭素原子又はヨウ素原子を導入することにより、アクチン繊維結合性と光増感能を有する小分子ＣＡＬＩプローブを得ることができることを見出した。
そして、光増感剤に標的分子結合性を付与することで、損傷範囲を限局したのがＣＡＬＩである。本発明者らは、アクチン繊維の破壊機構として、ＣＡＬＩの手法に着目した。そして、ＨＭＲｅｆに光増感能を付与することを種々検討した結果、ＨＭＲｅｆの骨格の特定の部位に臭素原子又はヨウ素原子を導入することにより、アクチン繊維結合性と光増感能を有する小分子ＣＡＬＩプローブを得ることができることを見出した。
【0022】
式（Ｉ）において、Ｒ１は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
【0023】
ｍは、０～４の整数である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ１存在せずに無置換のベンゼン環である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ１存在せずに無置換のベンゼン環である。
【0024】
式（Ｉ）において、Ｒ２は、臭素原子又はヨウ素原子であり、好ましくはヨウ素原子である。
【0025】
ｎは、１～２の整数である。好ましくは、ｎは１である。
【0026】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【0027】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【0028】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【0029】
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、光増感剤である。
【0030】
本発明のもう１つに態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、アクチン繊維の破壊を誘導するために用いられるプローブである。
【0031】
また、本発明のプローブの１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、時空間選択的にアクチン繊維の破壊を誘導するために用いられるプローブである。
【0032】
本発明のもう１つの態様は、細胞又は組織内のアクチン繊維の破壊を誘導する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該細胞又は組織の全部又は一部にレーザーを照射する工程、を含む方法である。好ましくは、当該細胞又は組織の一部にレーザーを照射する。
【0033】
また、本発明の方法の１つの側面においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を導入した細胞又は組織の一部にレーザーを照射して、レーザー励起により発生する一重項酸素（１Ｏ２）により当該一部の細胞又は組織内のアクチン繊維を特異的に破壊することができる。
即ち、本発明においては、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして、光に着目し、これを利用して、本発明の化合物又はその塩を導入した細胞又は組織内のアクチン繊維を光照射領域特異的に破壊するものである。図１及び２に本発明の方法の基本的な概念図を示す。
即ち、本発明においては、生物に適用可能な時空間選択的スイッチとして、光に着目し、これを利用して、本発明の化合物又はその塩を導入した細胞又は組織内のアクチン繊維を光照射領域特異的に破壊するものである。図１及び２に本発明の方法の基本的な概念図を示す。
【0034】
本発明の方法で用いるレーザーの波長としては、５１４ｎｍを用いることができる。照射時間は、レーザーの強度や細胞の方の機能によって任意に決定できる。目安としては１～２分程度である。
【0035】
また、本発明の方法においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入した後、通常、０．５～１時間経過後に、当該細胞又は組織の全部又は一部にレーザーを照射する。これにより本発明の化合物又はその塩がアクチン繊維へ十分結合し、アクチン繊維の破壊誘導を有効に行うことができる。
【0036】
本発明の方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて、蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を観測することを含むことができる。
アクチン繊維を蛍光標識するには、細胞又は組織を蛍光標識ファロイジン、蛍光標識抗アクチン抗体，ＨＭＲｅf で染色することができる。例えば、細胞を％ホルムアルデヒド、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ等の条件で固定・透過処理した後、上記の蛍光標識試薬で染色することにより、その蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を評価することができる。
蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、アクチン繊維の形態を瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。
アクチン繊維を蛍光標識するには、細胞又は組織を蛍光標識ファロイジン、蛍光標識抗アクチン抗体，ＨＭＲｅf で染色することができる。例えば、細胞を％ホルムアルデヒド、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ等の条件で固定・透過処理した後、上記の蛍光標識試薬で染色することにより、その蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を評価することができる。
蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、アクチン繊維の形態を瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。
【0037】
本発明の光増感剤又はプローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、当該細胞又は組織にレーザーを照射すればよい。本発明の光増感剤又はプローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【0038】
本発明の光増感剤及びプローブを上記の添加物と組み合わせて組成物の形態で用いる場合においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、好ましくは１００～３００ｎＭ含有する。
【0039】
上記工程（ａ）における測定対象である細胞又は組織の試料は、アクチン繊維を有する細胞又は組織であることができるが、例えば、細胞種としてはＨｅＬｅ細胞，ＭＤＣＫ細胞，組織としてはショウジョウバエ幼虫のｗｉｎｇ ｄｉｃｓ（翅原基）が挙げられる。
【0040】
本発明の方法においては、アクチン繊維への摂動を観測する際に、上記光増感剤又はプローブを含む検出用キットを用いることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【0041】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【実施例】
【0042】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0043】
材料
一般化学品は、アルドリッチ・ケミカル (株)、東京化成工業、富士フィルム和光純化学 (株) から供給された最高グレードの入手可能なものを、精製することなく使用した。
一般化学品は、アルドリッチ・ケミカル (株)、東京化成工業、富士フィルム和光純化学 (株) から供給された最高グレードの入手可能なものを、精製することなく使用した。
【0044】
測定機器
ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＬＡ４００装置を用いて、１Ｈ ＮＭＲについては４００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲについては１００ＭＨｚで測定し、または、ＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＥＣＺ４００Ｓ装置を用いて、１Ｈ ＮＭＲについては４００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲについては１００ＭＨｚで測定した。すべての化学シフト（δ）は、内部標準テトラメチルシラン（δ＝０．０ｐｐｍ）に対するｐｐｍで、または残留溶媒ＣＤＣｌ３（１Ｈは７．２６ｐｐｍ、１３Ｃは７７．１６ｐｐｍ）のシグナルに対するｐｐｍで、ＣＤ３ＯＤ（１Ｈは３．３１ｐｐｍ、１３Ｃは４９．００ｐｐｍ）およびカップリング定数はＨｚで与えられる。
質量スペクトル（ＭＳ）をＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ ＡｃｃｕＴｏＦ（ＥＳＩ）で測定した。
分取ＨＰＬＣは、ポンプ（ＰＵ－２０８０、ＪＡＳＣＯ）および検出器（（ＭＤ－２０１５又はＦＰ－２０２５、ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて、Ｉｎｔｅｒｓｉｌ ＯＤＳ－３（１０．０×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行うか、あるいは、ＩｓｏｌｅｒａＴＭ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いたＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ２５ｇ（Ｂｉｏｔａｇｅ）で行った。
ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＬＡ４００装置を用いて、１Ｈ ＮＭＲについては４００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲについては１００ＭＨｚで測定し、または、ＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＥＣＺ４００Ｓ装置を用いて、１Ｈ ＮＭＲについては４００ＭＨｚで、１３Ｃ ＮＭＲについては１００ＭＨｚで測定した。すべての化学シフト（δ）は、内部標準テトラメチルシラン（δ＝０．０ｐｐｍ）に対するｐｐｍで、または残留溶媒ＣＤＣｌ３（１Ｈは７．２６ｐｐｍ、１３Ｃは７７．１６ｐｐｍ）のシグナルに対するｐｐｍで、ＣＤ３ＯＤ（１Ｈは３．３１ｐｐｍ、１３Ｃは４９．００ｐｐｍ）およびカップリング定数はＨｚで与えられる。
質量スペクトル（ＭＳ）をＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ ＡｃｃｕＴｏＦ（ＥＳＩ）で測定した。
分取ＨＰＬＣは、ポンプ（ＰＵ－２０８０、ＪＡＳＣＯ）および検出器（（ＭＤ－２０１５又はＦＰ－２０２５、ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて、Ｉｎｔｅｒｓｉｌ ＯＤＳ－３（１０．０×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で行うか、あるいは、ＩｓｏｌｅｒａＴＭ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いたＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ２５ｇ（Ｂｉｏｔａｇｅ）で行った。
【0045】
紫外可視吸収分光法及び蛍光分光法
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００でＵＶ－可視スペクトルを得た。Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ７０００で蛍光分光試験を行った。
蛍光測定におけるスリット幅は励起、発光とも１ｎｍであった。光電子増倍管電圧は４００Ｖであった。試験試料の発光スペクトル下の面積と標準試料のスペクトル化面積を決定し次式により計算することで相対的な蛍光量子収率（Φfl）を求めた。
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００でＵＶ－可視スペクトルを得た。Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ７０００で蛍光分光試験を行った。
蛍光測定におけるスリット幅は励起、発光とも１ｎｍであった。光電子増倍管電圧は４００Ｖであった。試験試料の発光スペクトル下の面積と標準試料のスペクトル化面積を決定し次式により計算することで相対的な蛍光量子収率（Φfl）を求めた。
【0046】
【数1】
【0047】
式中、st=standard；ｘ＝サンプル；Ａ＝励起波長における吸光度；ｎ＝屈折率；Ｄ＝エネルギースケールでの蛍光スペクトル下の面積、である。
共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でプローブ（１μＭ）の光学特性を調べた。
共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でプローブ（１μＭ）の光学特性を調べた。
【0048】
近赤外分光法による一重項酸素検出
一重項酸素は、近赤外発光分光計（Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３、Ｈｏｒｉｂａ、日本）を用いてレーザー照射による１２７０ｎｍ付近の１Ｏ２発光を測定することにより検出した。色素を、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、波長５０８ｎｍの光を照射した。１Ｏ２量子収率を計算するために、発光シグナルを各波長に対して７秒間積分した。一重項酸素生成量子収率は参照としてＰＢＳ中のローズベンガル（Ｒｏｓｅ ｂｅｎｇａｌ）（０．７５）（DeRosa, M. C. & Crutchley, R. J. Photosensitized singlet oxygen and its applications. Coordination Chemistry Reviews 233-234, 351-371, doi:10.1016/S0010-8545(02)00034-6 (2002)）を用いて計算した。
一重項酸素は、近赤外発光分光計（Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３、Ｈｏｒｉｂａ、日本）を用いてレーザー照射による１２７０ｎｍ付近の１Ｏ２発光を測定することにより検出した。色素を、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、波長５０８ｎｍの光を照射した。１Ｏ２量子収率を計算するために、発光シグナルを各波長に対して７秒間積分した。一重項酸素生成量子収率は参照としてＰＢＳ中のローズベンガル（Ｒｏｓｅ ｂｅｎｇａｌ）（０．７５）（DeRosa, M. C. & Crutchley, R. J. Photosensitized singlet oxygen and its applications. Coordination Chemistry Reviews 233-234, 351-371, doi:10.1016/S0010-8545(02)00034-6 (2002)）を用いて計算した。
【0049】
細胞培養
ＨｅＬａ及びＭＤＣＫ細胞は、細胞株供給機関（ＡＴＣＣ）から入手した。全ての細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）中で増殖させ、５％二酸化炭素を含有する空気中、３７℃に維持した。
ＨｅＬａ及びＭＤＣＫ細胞は、細胞株供給機関（ＡＴＣＣ）から入手した。全ての細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）中で増殖させ、５％二酸化炭素を含有する空気中、３７℃に維持した。
【0050】
ＨＭＲｅｆ誘導体を用いた生細胞イメージング
細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート（Ｉｂｉｄｉ、８０８２６）上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に一日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ及び指示された濃度のプローブを加えた。細胞を１時間インキュベートし、アルゴンレーザーと対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ １．２５ ｘ／４０ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）により、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）と蛍光画像を得た。
細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート（Ｉｂｉｄｉ、８０８２６）上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に一日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ及び指示された濃度のプローブを加えた。細胞を１時間インキュベートし、アルゴンレーザーと対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ １．２５ ｘ／４０ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）により、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）と蛍光画像を得た。
【0051】
ピレンアクチン脱重合法
１０μＬのアクチン重合緩衝液（Ｐ緩衝液、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＢＳＡ０２）及びＨ２Ｏ中２０ｎｍｏｌ ＡＴＰを、１０μＭのピレン標識アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＡＰ０５）を含有する１００μＬの一般的なアクチン緩衝液（Ｇ緩衝液、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＢＳＡ０１）に添加した。希釈剤を氷上で９０分間インキュベートした。Ｆ－アクチン溶液を黒色の３８４マイクロウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、７８４９００）にピペットで分注した（２μＬ／ウェル）。プローブ（最終濃度：１０μＭ）を含有するＧ緩衝液を各ウェルに添加した（１０μＬ／ウェル）。蛍光強度は、プレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）Ｅｘ：３５０ｎｍ／Ｅｍ：４０５ｎｍで測定した。
１０μＬのアクチン重合緩衝液（Ｐ緩衝液、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＢＳＡ０２）及びＨ２Ｏ中２０ｎｍｏｌ ＡＴＰを、１０μＭのピレン標識アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＡＰ０５）を含有する１００μＬの一般的なアクチン緩衝液（Ｇ緩衝液、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃ＢＳＡ０１）に添加した。希釈剤を氷上で９０分間インキュベートした。Ｆ－アクチン溶液を黒色の３８４マイクロウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、７８４９００）にピペットで分注した（２μＬ／ウェル）。プローブ（最終濃度：１０μＭ）を含有するＧ緩衝液を各ウェルに添加した（１０μＬ／ウェル）。蛍光強度は、プレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）Ｅｘ：３５０ｎｍ／Ｅｍ：４０５ｎｍで測定した。
【0052】
照射後の固定細胞のＦ－アクチン画像
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）をガラス底８－チャンバープレート上にプレートし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に１日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ、及び任意の濃度の光増感剤を添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１５～５６９ｎｍ（２７．０ｍＷ／ｃｍ２）にてＸｅ光源ＭＡＸ３０１（朝日分光（株））からのロッドスコープを介して１分間照射し、１時間インキュベートし＊、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ ＨＣＨＯ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで１０分間固定した。ＰＢＳを除去した後、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．６６％ ＭｅＯＨおよび２Ｕ／ｍＬ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ、Ａ２２２８７）を含有するＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。蛍光画像は、アルゴンレーザーおよび対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ４０ｘ／１．２５ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を備えた共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した。
＊：（２４時間インキュベーションのみ）培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２３時間インキュベートした。
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）をガラス底８－チャンバープレート上にプレートし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に１日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ、及び任意の濃度の光増感剤を添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１５～５６９ｎｍ（２７．０ｍＷ／ｃｍ２）にてＸｅ光源ＭＡＸ３０１（朝日分光（株））からのロッドスコープを介して１分間照射し、１時間インキュベートし＊、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ ＨＣＨＯ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで１０分間固定した。ＰＢＳを除去した後、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．６６％ ＭｅＯＨおよび２Ｕ／ｍＬ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ、Ａ２２２８７）を含有するＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。蛍光画像は、アルゴンレーザーおよび対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ４０ｘ／１．２５ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を備えた共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した。
＊：（２４時間インキュベーションのみ）培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２３時間インキュベートした。
【0053】
ＣＣＫ－８アッセイ
ＨｅＬａ細胞を播種し、プラスチック底部９６－ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、６５５０９０）中で培養し、次いで、培地を光増感剤を含む新鮮な培地に適切な濃度（１０ｍＭ ＤＭＳＯ原液を希釈して調整する）で交換し、細胞に光増感剤を負荷し、細胞を１時間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｘｅ光源ＭＡＸ３０１からのロッドスコープを介して５１５～５６９ｎｍ（２２．０ｍＷ／ｃｍ２）で１分間照射し、培地を各ウェルにおいて２００μＬの新鮮な培地と交換し、照射した細胞を２０時間培養した。次いで、それらを５％細胞計数キット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４）を含有する培地中でインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定し、細胞生存率を決定した。光増感剤なし及び光照射なしの細胞を含むウェルからの値は、１００％生細胞を表すものとし、細胞なしのウェルからの値は、１００％死細胞を表すものとした。
ＨｅＬａ細胞を播種し、プラスチック底部９６－ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、６５５０９０）中で培養し、次いで、培地を光増感剤を含む新鮮な培地に適切な濃度（１０ｍＭ ＤＭＳＯ原液を希釈して調整する）で交換し、細胞に光増感剤を負荷し、細胞を１時間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｘｅ光源ＭＡＸ３０１からのロッドスコープを介して５１５～５６９ｎｍ（２２．０ｍＷ／ｃｍ２）で１分間照射し、培地を各ウェルにおいて２００μＬの新鮮な培地と交換し、照射した細胞を２０時間培養した。次いで、それらを５％細胞計数キット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ０４）を含有する培地中でインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定し、細胞生存率を決定した。光増感剤なし及び光照射なしの細胞を含むウェルからの値は、１００％生細胞を表すものとし、細胞なしのウェルからの値は、１００％死細胞を表すものとした。
【0054】
生細胞・死細胞染色
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと共に一日培養した。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ、及び任意の濃度の光増感剤を添加した。細胞を１時間インキュベートし、Ｘｅ光源ＭＡＸ３０１からロドスコープを通して５１５～５６９ｎｍ（１３．０ｍＷ／ｃｍ２）で１分間照射し、１時間インキュベートした。その後培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で置換した後に、２３時間インキュベートした。ＤＭＥＭを除去した後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、生細胞の標識のための０．１５％ＤＭＳＯ、２μＭカルセイン－ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３２２４）、死細胞の標識のための２μＭエチジウムホモダイマー－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３２２４）、および核染色試薬のための２μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ１３０６）を含有するＰＢＳ中でインキュベートした。蛍光画像はアルゴンレーザーと対物レンズ（１０ｘ／０．４０ ｄｒｙ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した。
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと共に一日培養した。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ、及び任意の濃度の光増感剤を添加した。細胞を１時間インキュベートし、Ｘｅ光源ＭＡＸ３０１からロドスコープを通して５１５～５６９ｎｍ（１３．０ｍＷ／ｃｍ２）で１分間照射し、１時間インキュベートした。その後培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で置換した後に、２３時間インキュベートした。ＤＭＥＭを除去した後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、生細胞の標識のための０．１５％ＤＭＳＯ、２μＭカルセイン－ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３２２４）、死細胞の標識のための２μＭエチジウムホモダイマー－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３２２４）、および核染色試薬のための２μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ１３０６）を含有するＰＢＳ中でインキュベートした。蛍光画像はアルゴンレーザーと対物レンズ（１０ｘ／０．４０ ｄｒｙ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した。
【0055】
照射後の固定細胞のＦアクチン及びマイクロチューブイメージング
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと共に一日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、及び２００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎを含有するＤＭＥＭを添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１５～５６９ｎｍ（２７．０ｍＷ／ｃｍ２）でＸｅ光源ＭＡＸ３０１を介して１分間照射し、１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ＨＣＨＯおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで１０分間固定した。固定液を除去した後、固定細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で３０分間インキュベートし，ブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、固定細胞を１％ＢＳＡ、０．６６％ＭｅＯＨ、２Ｕ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ６４７ファロイジン、ＦＩＴＣと結合した３μｇ／ｍＬ抗αＴｕｂｕｌｉｎ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ６４５０３）、および３μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ中で６０分間インキュベートした。アルゴンおよび対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ４０ｘ／１．２５ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で蛍光画像を取得した。
ＨｅＬａ細胞（４×１０４細胞／ｍＬ）を８－チャンバープレート上に平板培養し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと共に一日インキュベートした。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、及び２００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎを含有するＤＭＥＭを添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１５～５６９ｎｍ（２７．０ｍＷ／ｃｍ２）でＸｅ光源ＭＡＸ３０１を介して１分間照射し、１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、４％ＨＣＨＯおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで１０分間固定した。固定液を除去した後、固定細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で３０分間インキュベートし，ブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、固定細胞を１％ＢＳＡ、０．６６％ＭｅＯＨ、２Ｕ／ｍＬ Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ６４７ファロイジン、ＦＩＴＣと結合した３μｇ／ｍＬ抗αＴｕｂｕｌｉｎ抗体（ａｂｃａｍ，ａｂ６４５０３）、および３μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ中で６０分間インキュベートした。アルゴンおよび対物レンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ４０ｘ／１．２５ Ｏｉｌ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で蛍光画像を取得した。
【0056】
シート移動アッセイ
ＭＤＣＫ細胞（２×１０５個／ｍＬ）を２５培養－インサート２ウェル（Ｉｂｉｄｉ、８０２０９）で分離した８－チャンバープレートの両側に播種し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に３７℃、５％ＣＯ２で１日培養した。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、及び３００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎを含有するＤＭＥＭを添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１４ｎｍ（ＳＰ８アルゴンレーザー、出力：８０％、強度：５０％）で１分間照射し、更に１時間インキュベートした。培地を取り除いた後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを加えた。蛍光画像はアルゴンレーザーと対物レンズ（１０ｘ／０．４０ ｄｒｙ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した＊。細胞を再び３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。実験場の必要に応じて，細胞は染色処理または固定染色処理を施し，アルゴンレーザーと対物レンズを装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で蛍光画像を得た。
＊を６回繰り返した。
ＭＤＣＫ細胞（２×１０５個／ｍＬ）を２５培養－インサート２ウェル（Ｉｂｉｄｉ、８０２０９）で分離した８－チャンバープレートの両側に播種し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に３７℃、５％ＣＯ２で１日培養した。培地を除去し、１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、及び３００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎを含有するＤＭＥＭを添加した。細胞を１時間インキュベートし、５１４ｎｍ（ＳＰ８アルゴンレーザー、出力：８０％、強度：５０％）で１分間照射し、更に１時間インキュベートした。培地を取り除いた後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを加えた。蛍光画像はアルゴンレーザーと対物レンズ（１０ｘ／０．４０ ｄｒｙ、Ｌｅｉｃａ）を装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で取得した＊。細胞を再び３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。実験場の必要に応じて，細胞は染色処理または固定染色処理を施し，アルゴンレーザーと対物レンズを装備した共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）で蛍光画像を得た。
＊を６回繰り返した。
【0057】
ショウジョウバエの翅原基のＨＭＲｅｆ低速度撮影イメージング
Ｅ－カドヘリン－ｍＴａｇＲＦＰ２１を発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ幼虫を、５％ＦＢＳ（生物検定、ｓ１８１０）を含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地（サーモフィッシャー２１７２００２４）で解剖した。翅原基を５００ｎＭのＨＭＲｅｆの存在下で３５ｍｍガラスベースの皿（Iwaki ３９１１－０３５）上でＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地中で培養した。１時間のインキュベーション後、６０×／ＮＡ １．２ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ水浸対物レンズを装着した反転共焦点顕微鏡（Ａ１Ｒ；ニコン）により、時間経過イメージングを行った。励起及び発光波長は、ＨＭＲｅｆでは４８８ｎｍ／５００～５５０ｎｍ、Ｅ－カドヘリン－ｍＴａｇＲＦＰでは５６１ｎｍ／５７０～６２０ｎｍであり、５分間隔で６５分間、～２５℃で撮影した。画像処理はＩｍａｇｅＪを用いて行った。簡単に述べると、被着体接合面上のＨＭＲｅｆとＥ－カドヘリン信号を抽出した。ＨＭＲｅｆ画像に対して「Subtract Background」コマンド（ｒ＝５０）を使用して背景信号を減算した。
Ｅ－カドヘリン－ｍＴａｇＲＦＰ２１を発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ幼虫を、５％ＦＢＳ（生物検定、ｓ１８１０）を含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地（サーモフィッシャー２１７２００２４）で解剖した。翅原基を５００ｎＭのＨＭＲｅｆの存在下で３５ｍｍガラスベースの皿（Iwaki ３９１１－０３５）上でＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地中で培養した。１時間のインキュベーション後、６０×／ＮＡ １．２ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ水浸対物レンズを装着した反転共焦点顕微鏡（Ａ１Ｒ；ニコン）により、時間経過イメージングを行った。励起及び発光波長は、ＨＭＲｅｆでは４８８ｎｍ／５００～５５０ｎｍ、Ｅ－カドヘリン－ｍＴａｇＲＦＰでは５６１ｎｍ／５７０～６２０ｎｍであり、５分間隔で６５分間、～２５℃で撮影した。画像処理はＩｍａｇｅＪを用いて行った。簡単に述べると、被着体接合面上のＨＭＲｅｆとＥ－カドヘリン信号を抽出した。ＨＭＲｅｆ画像に対して「Subtract Background」コマンド（ｒ＝５０）を使用して背景信号を減算した。
【0058】
ショウジョウバエ翅細胞のＧＬＩＦｉｎ操作
翅原基を上記のように切開してマウントし、光照射の前に１μＭ ＧＬＩＦｉｎおよび５％ＦＢＳを含有するＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地で１時間インキュベートした。光媒介不活性化実験を行うために、翅原基を１．５分間４８８ ｎｍのレーザーで５％のパワーで照射した。非照射翅原基をコントロールとして用いた。コントロールと照射した翅原基を照射の５分前と３．５時間後に観察した。
Ｆ－アクチン強度に及ぼすＧＬＩＦｉｎ操作の影響を調べるために、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で翅原基を室温で３０分間固定した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで洗浄した後、これらの調製物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン（１／１０００、サーモフィッシャーＡ２２２８７）と共に一晩インキュベートした。被着体接合面上のＥ－カドヘリンおよびファロイジン信号を上記のように抽出した。
翅原基を上記のように切開してマウントし、光照射の前に１μＭ ＧＬＩＦｉｎおよび５％ＦＢＳを含有するＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地で１時間インキュベートした。光媒介不活性化実験を行うために、翅原基を１．５分間４８８ ｎｍのレーザーで５％のパワーで照射した。非照射翅原基をコントロールとして用いた。コントロールと照射した翅原基を照射の５分前と３．５時間後に観察した。
Ｆ－アクチン強度に及ぼすＧＬＩＦｉｎ操作の影響を調べるために、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で翅原基を室温で３０分間固定した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで洗浄した後、これらの調製物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン（１／１０００、サーモフィッシャーＡ２２２８７）と共に一晩インキュベートした。被着体接合面上のＥ－カドヘリンおよびファロイジン信号を上記のように抽出した。
【0059】
上皮細胞シート移動アッセイ
ＭＤＣＫ細胞（４．０×１０５細胞／ｍＬ）を、２５培養挿入２ウェル（Ｉｂｉｄｉ（８０２０９））で分離した８チャンバープレート（Ｉｂｉｄｉ、８０８２６または８０２０６－Ｇ５００）の両側にプレーティングし、増殖培地中で一日インキュベートした。細胞から培地を除去した後、Ｆ－アクチンのＧＬｉＦｉｎ媒介光不活性化を行った。ＤＩＣ画像を共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ）で撮影した。蛍光画像を上記のように取得した。
ＭＤＣＫ細胞（４．０×１０５細胞／ｍＬ）を、２５培養挿入２ウェル（Ｉｂｉｄｉ（８０２０９））で分離した８チャンバープレート（Ｉｂｉｄｉ、８０８２６または８０２０６－Ｇ５００）の両側にプレーティングし、増殖培地中で一日インキュベートした。細胞から培地を除去した後、Ｆ－アクチンのＧＬｉＦｉｎ媒介光不活性化を行った。ＤＩＣ画像を共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、ライカ）で撮影した。蛍光画像を上記のように取得した。
【0060】
［合成実施例１］
化合物１（ＨＭＲＩｅｆ）の合成
以下の合成スキームにより化合物１を合成した。
化合物１（ＨＭＲＩｅｆ）の合成
以下の合成スキームにより化合物１を合成した。
【0061】
【0062】
ＨＭＲｅｆ（４ｍＬ）とヨウ素（２２．０ｍｇ、０．０８６６ｍｍｏｌ）をエタノール（３１．２ｍｇ、０．０７８０ｍｍｏｌ）に溶解した。撹拌している溶液に、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のヨウ素酸（１１．７ｍｇ、０．０６６５ｍｍｏｌ）を、周囲温度で１０分間滴下し、１０分間撹拌し、反応混合物を、酢酸エチル（４５ｍＬ）で希釈し、ブライン（５０ｍＬ×３回）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ×２回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。粗残渣をＨＰＬＣ（グラジエント溶離液、２０％アセトニトリル／０．０８％ トリフルオロ酢酸水溶液～１００％アセトニトリル）で精製し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｖａｃ ３５ｃｃ（１０ｇ）Ｃ１８Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｗａｔｅｒｓ）で脱塩し、カラムからメタノールで溶出した後、減圧下で濃縮して、赤色固体としてＨＭＲＩｅｆ（１２．５ｍｇ、３１％）を得た。
【0063】
1H-NMR (400 MHz, METHANOL-D4) δ 7.35 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 7.25 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.43 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.30-5.13 (2H), 3.82 (q, J = 9.3 Hz, 2H) 13C-NMR (100 MHz, METHANOL-D4) δ 168.6 152.4 150.7 148.6 144.8 139.2 129.4 128.5 127.9 127.6 123.8 120.3 114.3 114.1 109.9 109.0 98.4 85.6 78.9 70.4 44.7(q, J = 33.4 Hz) HRMS (ESI+) m/z Calcd. for C22H16F3INO3
+ [M+H]+ , 526.01270; found, 526.01273 (+0.06 ppm)
【0064】
［実施例１］
ＨＭＲｅｆの光学特性の測定
ＨＭＲｅｆなどのヒドロキシメチルロドール誘導体は、分子内スピロ環化反応を含む酸塩基平衡特性を有しており、以下に示すように、ヒドロキシメチル基を有しキサンテン環部位に共役系がつながった構造である「開環体」と、エーテルを含む５員環を有する構造である「閉環体」が平衡として存在する。
ＨＭＲｅｆの光学特性の測定
ＨＭＲｅｆなどのヒドロキシメチルロドール誘導体は、分子内スピロ環化反応を含む酸塩基平衡特性を有しており、以下に示すように、ヒドロキシメチル基を有しキサンテン環部位に共役系がつながった構造である「開環体」と、エーテルを含む５員環を有する構造である「閉環体」が平衡として存在する。
【0065】
【0066】
よって、ＨＭＲｅｆのキサンテン環部位にヨウ素を導入したＨＭＲＩｅｆについても、同様の平衡に置かれることが予想される。ＨＭＲＩｅｆが生細胞中で光増感剤として機能するためには、ｐＨ７．４の生理的条件下で５００ｎｍ付近に吸収体を持つ開環体で存在する必要がある。そこで、光学特性を取得することで、生理的条件下において開環体として存在するかの検討を行った。また、蛍光スペクトルも併せて測定した。結果を図３に示す。
【0067】
図３（ａ）は、ＨＭＲＩｅｆの化学構造とその光学特性を示す。図３（ｂ）は、ＨＭＲＩｅｆの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果を示す（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液中で測定した。色素濃度：１μＭ（吸収）又は１０μＭ（蛍光））。図３（ｃ）は、共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有する種々のｐＨの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で測定した吸収スペクトルの測定結果を示す（色素濃度：１μＭ）。図３（ｄ）は、５０８ｎｍでの吸収とｐＨとの相関関係を示す。
【0068】
図３から、ＨＭＲＩｅｆは生理的条件下のｐＨ７．４付近のリン酸緩衝液中において５００ｎｍ付近にピークトップをもつ開環体で存在することが明らかとなった。
【0069】
［実施例２］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＭＲＩｅｆのＦアクチン結合性評価
次に、ＨＭＲＩｅｆがアクチン繊維結合性を有するかを検討した。ここで、ＨＭＲｅｆはΦｆｌ＝０．７８の強蛍光性物質であることから細胞染色像によりアクチン繊維結合性を検討可能であったのに対し、ＨＭＲＩｅｆはΦｆｌ＜０．０２と生理的条件下においてほぼ無蛍光性であることから、蛍光像による細胞内局在の追跡は不可能である。
そこで、ＨＭＲＩｅｆのアクチン繊維への結合性については、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアクチン繊維の伸張反応を定量可能な手法であるｐｙｒｅｎｅ ａｃｔｉｎ ａｓｓａｙと、生細胞における局在を担保するためにヨウ素化前のＨＭＲｅｆの蛍光の追い出し実験の複合により、評価した。以下のプロトコルに基づいて実験を行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＭＲＩｅｆのＦアクチン結合性評価
次に、ＨＭＲＩｅｆがアクチン繊維結合性を有するかを検討した。ここで、ＨＭＲｅｆはΦｆｌ＝０．７８の強蛍光性物質であることから細胞染色像によりアクチン繊維結合性を検討可能であったのに対し、ＨＭＲＩｅｆはΦｆｌ＜０．０２と生理的条件下においてほぼ無蛍光性であることから、蛍光像による細胞内局在の追跡は不可能である。
そこで、ＨＭＲＩｅｆのアクチン繊維への結合性については、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアクチン繊維の伸張反応を定量可能な手法であるｐｙｒｅｎｅ ａｃｔｉｎ ａｓｓａｙと、生細胞における局在を担保するためにヨウ素化前のＨＭＲｅｆの蛍光の追い出し実験の複合により、評価した。以下のプロトコルに基づいて実験を行った。
【0070】
＜プロトコル＞
・１０μＬのアクチン重合緩衝液（Ｐ緩衝液）およびＨ２Ｏ中の２０ｎｍｏｌ ＡＴＰを、１０μＭのピレン標識アクチンを含有する１００μＬの一般的なアクチン緩衝液（Ｇ緩衝液）に添加した。
↓
・希釈剤を氷上で９０分間インキュベートした。
↓
・調整したＦ－アクチン溶液を黒色の３８４マイクロウェルプレート（２μＬ／ウェル）に分注した。
↓
・プローブ（最終濃度：１０μＭ）を含有するＧ緩衝液を各ウェルに添加した（１０μＬ／ウェル）。
↓
・蛍光強度はプレートリーダー（励起：３５０ｎｍ／蛍光：４０５ｎｍ）で測定した。
・１０μＬのアクチン重合緩衝液（Ｐ緩衝液）およびＨ２Ｏ中の２０ｎｍｏｌ ＡＴＰを、１０μＭのピレン標識アクチンを含有する１００μＬの一般的なアクチン緩衝液（Ｇ緩衝液）に添加した。
↓
・希釈剤を氷上で９０分間インキュベートした。
↓
・調整したＦ－アクチン溶液を黒色の３８４マイクロウェルプレート（２μＬ／ウェル）に分注した。
↓
・プローブ（最終濃度：１０μＭ）を含有するＧ緩衝液を各ウェルに添加した（１０μＬ／ウェル）。
↓
・蛍光強度はプレートリーダー（励起：３５０ｎｍ／蛍光：４０５ｎｍ）で測定した。
【0071】
フィッティング値を以下の式で評価した。
【数2】
【0072】
図４にピレン標識アクチンによるアクチン脱重合アッセイの結果（色素濃度１０μＭ）を示す。図４の左図は、ピレンアクチン脱重合アッセイの代表的な実験結果である。蛍光強度は０分で正規化した。図４の右図に、安定アクチンについて得られた定常値をまとめた。
データは２回もしくは３回の独立した実験の平均値±標準誤差として示した。
データは２回もしくは３回の独立した実験の平均値±標準誤差として示した。
【0073】
結果として、ＨＭＲｅｆを添加した場合と比較すると、同濃度でＨＭＲＩｅｆを添加した場合にも，より強い脱重合の阻害が見られたことから、キサンテン環へのヨウ素の導入によりアクチン繊維への親和性が向上するという結果が示唆された。
【0074】
［実施例３］
ＨＭＲｅｆの追い出しに基づく、ＨＭＲＩｅｆの細胞骨格アクチン結合性評価
実施例２においてＨＭＲＩｅｆがアクチン繊維への高い親和性を持つ可能性が示唆された。続いて，ＨＭＲＩｅｆが生細胞系においてもアクチン骨格に結合可能であるかを検証した。
生細胞系においてヨウ素化前の蛍光色素であるＨＭＲｅｆとの競合が見られるか、さらにその濃度範囲がＨＭＲｅｆの濃度とどのような関係となるかを検討することにより、生細胞におけるアクチン細胞骨格への局在の有無が確認可能であると考え、検討を行った。
ＨＭＲｅｆの追い出しに基づく、ＨＭＲＩｅｆの細胞骨格アクチン結合性評価
実施例２においてＨＭＲＩｅｆがアクチン繊維への高い親和性を持つ可能性が示唆された。続いて，ＨＭＲＩｅｆが生細胞系においてもアクチン骨格に結合可能であるかを検証した。
生細胞系においてヨウ素化前の蛍光色素であるＨＭＲｅｆとの競合が見られるか、さらにその濃度範囲がＨＭＲｅｆの濃度とどのような関係となるかを検討することにより、生細胞におけるアクチン細胞骨格への局在の有無が確認可能であると考え、検討を行った。
【0075】
ＨｅＬａ細胞をＨＭＲｅｆ及びＨＭＲＩｅｆで染色し、共焦点イメージングをＳＰ８で取得した。その結果を図５に示す。
イメージング緩衝液：１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、５００ｎＭ ＨＭＲｅｆ 及び指示された濃度のＨＭＲＩｅｆを含有するＤＭＥＭ
イメージングセッティング：励起：４８８ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：５１０－５５０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：１００））、オフセット：－０．０１％、ＬＵＴ：０－２５５
スケールバー：１０μｍ．
イメージング緩衝液：１０％ＦＢＳ、０．１％ＤＭＳＯ、５００ｎＭ ＨＭＲｅｆ 及び指示された濃度のＨＭＲＩｅｆを含有するＤＭＥＭ
イメージングセッティング：励起：４８８ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：５１０－５５０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：１００））、オフセット：－０．０１％、ＬＵＴ：０－２５５
スケールバー：１０μｍ．
【0076】
ＨＭＲＩｅｆ添加濃度依存的にＨＭＲｅｆ由来の蛍光強度の低下が見られたことから、ＨＭＲＩｅｆは生細胞においてもアクチン繊維にＨＭＲｅｆと競合的に結合することができ、なおかつ５００ｎＭのＨＭＲｅｆを２００ｎＭ程度のＨＭＲＩｅｆ添加により優位に追い出すことが可能であることから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検証結果と矛盾せず，ＨＭＲｅｆよりも高い親和性でアクチン繊維に結合することが強く示唆された。
【0077】
［実施例４］
光増感能の評価＜赤外光発光スペクトル＞
ＨＭＲＩｅｆについて、光増感能を有するかを検討した。検討にあたっては、光励起されたプローブから酸素分子へのエネルギー移動によって生じる一重項酸素（１Ｏ２）が１２７０ｎｍ付近にピークトップを持つ近赤外発光をする性質を利用し、光照射条件下における１２８０ｎｍの発光強度により一重項酸素生成能を評価した。結果を図６に示す。
光増感能の評価＜赤外光発光スペクトル＞
ＨＭＲＩｅｆについて、光増感能を有するかを検討した。検討にあたっては、光励起されたプローブから酸素分子へのエネルギー移動によって生じる一重項酸素（１Ｏ２）が１２７０ｎｍ付近にピークトップを持つ近赤外発光をする性質を利用し、光照射条件下における１２８０ｎｍの発光強度により一重項酸素生成能を評価した。結果を図６に示す。
【0078】
図６の左図は、０．１％ＤＭＳＯ共溶媒を含むｐＨ７．４のＰＢＳ中のＨＭＲｅｆとＨＭＲＩｅｆの吸収スペクトルを示す（色素濃度：１μＭ）。
図６の右図は、５０８ｎｍレーザー励起による１Ｏ２の発光スペクトルを示す。破線をバックグラウンドとした。スペクトルは共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含むｐＨ ７．４のＰＢＳ中で測定した（色素濃度：１μＭ）。
図６の右図は、５０８ｎｍレーザー励起による１Ｏ２の発光スペクトルを示す。破線をバックグラウンドとした。スペクトルは共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含むｐＨ ７．４のＰＢＳ中で測定した（色素濃度：１μＭ）。
【0079】
以下の式を用いて一重項酸素生成量子収率を算出した。
【数3】
【0080】
１Ｏ２からの発光領域には，蛍光の倍光がノイズとして観測されることから，発光量を見積もる際には、蛍光スペクトルの倍光の裾付近の形状はほぼ直線に近似可能であるとみなし、１２２０ｎｍ及び１３４０ｎｍにおける発光強度の相加平均値をバックグラウンドとして扱うことで，誤差を補正することとした。
図６から、ＨＭＲｅｆ及びＨＭＲＩｅｆの一重項酸素発生量子収率はそれぞれ０．０５±０．１４、０．４１±０．０３（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）と算出され、キサンテン環へのヨウ素の導入により一重項酸素の生成能が向上したことが示された。
以上から、ＨＭＲＩｅｆはアクチン繊維結合性と光増感能を有することが明らかとなり、本発明の目的である「光照射依存的にアクチン繊維の破壊を誘導することができる有機小分子の開発」に合致する可能性のある小分子として見出された。
なお、以降の実験では呼称をヨウ素化前のＨＭＲｅｆと明確に区別すべく、本分子をＨＭＲＩｅｆではなく、機能由来の慣用名として、ＧＬＩＦｉｎ （Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｆ－ａｃｔｉｎ）と呼ぶこととする。
図６から、ＨＭＲｅｆ及びＨＭＲＩｅｆの一重項酸素発生量子収率はそれぞれ０．０５±０．１４、０．４１±０．０３（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）と算出され、キサンテン環へのヨウ素の導入により一重項酸素の生成能が向上したことが示された。
以上から、ＨＭＲＩｅｆはアクチン繊維結合性と光増感能を有することが明らかとなり、本発明の目的である「光照射依存的にアクチン繊維の破壊を誘導することができる有機小分子の開発」に合致する可能性のある小分子として見出された。
なお、以降の実験では呼称をヨウ素化前のＨＭＲｅｆと明確に区別すべく、本分子をＨＭＲＩｅｆではなく、機能由来の慣用名として、ＧＬＩＦｉｎ （Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｆ－ａｃｔｉｎ）と呼ぶこととする。
【0081】
［実施例５］
アクチン繊維破壊能の評価
（１）生細胞系における光照射依存的なアクチン繊維の破壊検討
ＧＬＩＦｉｎについて、細胞系においてＣＡＬＩプローブとして利用可能であるかを評価すべく、まず標的タンパクであるＦアクチンの破壊を誘導可能であるかを検討した。具体的には，培養細胞にプローブを添加後、１時間インキュベートしアクチン繊維にプローブを結合させた上で、光照射後１時間に固定処理を行い、評価した。また、細胞を４％ホルムアルデヒド、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ条件で固定・膜透過処理した後、蛍光標識ファロイジンで染色することにより、その蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を評価した。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
アクチン繊維破壊能の評価
（１）生細胞系における光照射依存的なアクチン繊維の破壊検討
ＧＬＩＦｉｎについて、細胞系においてＣＡＬＩプローブとして利用可能であるかを評価すべく、まず標的タンパクであるＦアクチンの破壊を誘導可能であるかを検討した。具体的には，培養細胞にプローブを添加後、１時間インキュベートしアクチン繊維にプローブを結合させた上で、光照射後１時間に固定処理を行い、評価した。また、細胞を４％ホルムアルデヒド、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ条件で固定・膜透過処理した後、蛍光標識ファロイジンで染色することにより、その蛍光像の形態変化及び蛍光強度変化からアクチン繊維への摂動を評価した。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
【0082】
【0083】
光増感剤有り又は無しで染色したＨｅＬａ細胞を緑色光（５１０ｎｍで２７．０ｍＷ／ｃｍ２）で照射し、４％ＨＣＨＯおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで固定透過処理を施した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジンで染色した。得られたイメージングの結果を図７に示す。
光増感剤濃度：表示の通りである。色素濃度：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。イメージング設定：励起：６３３ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：６６０～７２０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：２５）、Ｏｆｆｓｅｔ：－０．０１％、ＬＵＴ：０～２５５、スケールバー：１０μｍ
光増感剤濃度：表示の通りである。色素濃度：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。イメージング設定：励起：６３３ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：６６０～７２０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：２５）、Ｏｆｆｓｅｔ：－０．０１％、ＬＵＴ：０～２５５、スケールバー：１０μｍ
【0084】
ＧＬＩＦｉｎ濃度依存的なアクチン繊維の断片化及び蛍光標識ファロイジン由来の蛍光強度の減少が見られ、なおかつこれらが同濃度のＧＬＩＦｉｎ添加時の光未照射条件、及びアクチン繊維結合性を持たない光増感剤であるＥｏｓｉｎＹ ＤＡ添加時の光照射条件においては見られなかったことから、アクチン繊維に結合したＧＬＩＦｉｎが，繊維近傍に一重項酸素を発生させ、アクチン繊維の破壊が誘導されたことが強く示唆された。
【0085】
（２）ＧＬＩＦｉｎ媒介光不活性化のＦ－アクチン断片化の時間依存性の評価
次に、ＧＬＩＦｉｎ媒介光不活性化のＦ－アクチン断片化の時間依存性を調べた。図８のａにＦアクチン操作のプロトコルの模式図を示す。
図８のｂは、２Ｕ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジンで可視化したＨｅＬａＦ－アクチンの共焦点画像を示す。ＨｅＬａ細胞を増殖培地中で３００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎの存在下又は非存在下で１時間インキュベートし、次いで１分間照射（５１５－５６９ｎｍで１８．９ｍＷ／ｃｍ２）し、インキュベートし、同図に示された時点で固定し、透過処理した。
図８のｃは、図８のｂの各画像中の四角枠で囲まれた部分の拡大図を示す。
次に、ＧＬＩＦｉｎ媒介光不活性化のＦ－アクチン断片化の時間依存性を調べた。図８のａにＦアクチン操作のプロトコルの模式図を示す。
図８のｂは、２Ｕ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジンで可視化したＨｅＬａＦ－アクチンの共焦点画像を示す。ＨｅＬａ細胞を増殖培地中で３００ｎＭ ＧＬＩＦｉｎの存在下又は非存在下で１時間インキュベートし、次いで１分間照射（５１５－５６９ｎｍで１８．９ｍＷ／ｃｍ２）し、インキュベートし、同図に示された時点で固定し、透過処理した。
図８のｃは、図８のｂの各画像中の四角枠で囲まれた部分の拡大図を示す。
【0086】
一般的なＣＡＬＩ法による分子の不活化は、光照射により生じる活性種による急性的な標的分子の機能阻害が特徴であるが、その一方で、ＧＬＩＦｉｎを用いたＣＡＬＩでは、アクチン繊維の断片化が分～時間のスケールと比較的緩やかに起こっていく様子が観測された。断片化が急速に断片化していないことから、活性種によりアクチン分子が酸化されるが、この酸化自体は繊維の断片化の直接的な原因とはなっていないことが示唆され、緩やかな繊維の断片化は、酸化されたアクチン分子が細胞内の他のアクチン結合分子に認識されることで繊維の断片化が引き起こされる可能性や酸化されたアクチン分子が繊維の再構築に利用できない等の機構が考えられ、これらは不活化効果が長時間持続するための要因ともなっている。
【0087】
（３）十分時間経過後のアクチン繊維回復検討
細胞中においてタンパク質は、転写・翻訳による生成とユビキチンプロテアソーム系などによる分解の平衡状態に置かれていることから、特定のタンパク質のみに生命の危機に瀕しない程度の不可逆的な不活化が与えられた場合にも、一定時間経過後には不活化をうけたタンパク質、新たに翻訳されたタンパク質に入れ替わることによって機能が回復すると考えられる。よって、（１）で見られたアクチン繊維の損傷が繊維周辺における一過的な一重項酸素の発生に起因し、選択性高く繊維を不活化するならば、転写，翻訳といった細胞機能には影響を与えず，十分時間経過後にはタンパク質が入れ替わることで，繊維の損傷が回復するはずである。
そこで、（１）と同様の条件で摂動を与えた細胞を２４時間インキュベートすることで、アクチン繊維の断片化及び蛍光標識ファロイジン由来の蛍光強度減少から回復するかを検討した。なお、生物中において光照射数時間後にはプローブが代謝され排出されると考えられることから、光照射１時間後にプローブを含む培地から含まない培地へと交換し、２３時間のインキュベーションを行っている。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
細胞中においてタンパク質は、転写・翻訳による生成とユビキチンプロテアソーム系などによる分解の平衡状態に置かれていることから、特定のタンパク質のみに生命の危機に瀕しない程度の不可逆的な不活化が与えられた場合にも、一定時間経過後には不活化をうけたタンパク質、新たに翻訳されたタンパク質に入れ替わることによって機能が回復すると考えられる。よって、（１）で見られたアクチン繊維の損傷が繊維周辺における一過的な一重項酸素の発生に起因し、選択性高く繊維を不活化するならば、転写，翻訳といった細胞機能には影響を与えず，十分時間経過後にはタンパク質が入れ替わることで，繊維の損傷が回復するはずである。
そこで、（１）と同様の条件で摂動を与えた細胞を２４時間インキュベートすることで、アクチン繊維の断片化及び蛍光標識ファロイジン由来の蛍光強度減少から回復するかを検討した。なお、生物中において光照射数時間後にはプローブが代謝され排出されると考えられることから、光照射１時間後にプローブを含む培地から含まない培地へと交換し、２３時間のインキュベーションを行っている。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
【0088】
【0089】
光増感剤有り又は無しで染色したＨｅＬａ細胞に緑色光（５１０ｎｍ，２７．０ｍＷ／ｃｍ２）を照射し、１時間または２４時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで固定・透過した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色した。得られたイメージングの結果を図９に示す。
光増感剤濃度：表示の通りである。色素濃度：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。イメージング設定：励起：６３３ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：６６０～７２０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：２５）、Ｏｆｆｓｅｔ：－０．０１％、ＬＵＴ：０～２５５、スケールバー：１０μｍ。
光増感剤濃度：表示の通りである。色素濃度：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。イメージング設定：励起：６３３ｎｍ（強度：１．０００５％）、蛍光：６６０～７２０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：２５）、Ｏｆｆｓｅｔ：－０．０１％、ＬＵＴ：０～２５５、スケールバー：１０μｍ。
【0090】
光照射１時間後にはアクチン繊維の断片化と蛍光標識ファロイジン由来の蛍光強度減少が観測されるが、２４時間のインキュベーションによってアクチン繊維が回復することから、ＧＬＩＦｉｎ添加条件における光照射は、転写・翻訳・アクチン繊維形成・分解という細胞機能に修復不可能な摂動を与えないことが示された。
以上により、ＧＬＩＦｉｎは適切な濃度・照射光強度を選択することで光照射に伴うアクチン繊維の優位な形態変化を誘導することができ、なおかつその摂動が十分時間後に回復することが明らかとなったことから、細胞機能に致命的な影響を与えずにアクチン繊維を高選択的に光操作可能であることが示唆された。
以上により、ＧＬＩＦｉｎは適切な濃度・照射光強度を選択することで光照射に伴うアクチン繊維の優位な形態変化を誘導することができ、なおかつその摂動が十分時間後に回復することが明らかとなったことから、細胞機能に致命的な影響を与えずにアクチン繊維を高選択的に光操作可能であることが示唆された。
【0091】
更に、ＧＬＩＦｉｎで不活性化したＦ－アクチンの回復の時間依存性を調べた。３００ｎＭＧＬＩＦｉｎを含む増殖培地で細胞を１時間インキュベートした後、緑色光（２２．６、２３．５ｍＷ／ｃｍ２、５１４ｎｍ、１分）を照射し、次にインキュベートし、固定し、指定された時点で光を繰り返し照射した（図１０の上部の時間的経過を参照）。Ｆ－アクチンはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）６４７で可視化した。得られた共焦点画像を図１０に示す（スケールバー：２０μｍ）。画像中の数字は、図の上部の時間的経過の数字に対応する。
【0092】
ＧＬＩＦｉｎによるアクチン繊維の不活化効果は時間スケールで持続するものの、細胞の培養を続けることで、元通り繊維が形成されていく様子が確認された。また、この断片化と再形成は，繰り返し引き起こすことが可能であった。以上より、ＧＬＩＦｉｎによる不活性化処置によって、アクチン分子は不活性化されるものの、細胞の持つ遺伝子発現やタンパク質翻訳といった基本的な機能は損なわれておらず、再び新たなアクチン分子が転写・翻訳され、不活性化されたアクチンと入れ替わることにより、繊維が形成されたと考えられる。
【0093】
［実施例６］
アクチン繊維以外への影響の検討
（１）細胞毒性
ＧＬＩＦｉｎによる摂動がアクチン繊維以外にも及ぶかを検討するため、細胞毒性について調べた。
細胞にプローブを添加、光照射後、通常の光増感剤の細胞毒性指標として用いられる２４時間インキュベーション後の細胞生存率により評価した。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
なお、細胞生存率はＣＣＫ８アッセイにより、プローブ未添加、光未照射群の生存率を１００％として以下の式から算出した。
アクチン繊維以外への影響の検討
（１）細胞毒性
ＧＬＩＦｉｎによる摂動がアクチン繊維以外にも及ぶかを検討するため、細胞毒性について調べた。
細胞にプローブを添加、光照射後、通常の光増感剤の細胞毒性指標として用いられる２４時間インキュベーション後の細胞生存率により評価した。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
なお、細胞生存率はＣＣＫ８アッセイにより、プローブ未添加、光未照射群の生存率を１００％として以下の式から算出した。
【0094】
【0095】
【数4】
【0096】
光増感剤および照射を伴うまたは伴わないＣＣＫ８アッセイの結果を図９に示す。
プローブ濃度：３００ｎＭ。光強度：５１０ｎｍで２２．０ｍＷ／ｃｍ２。
図１１の左図は、４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率をＤＭＳＯと非照射対照の吸光度によって正規化した。データは平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝４）として示した。同様の結果が２回得られた。
図１１の右図は、Ｋｉｌｌ ｃｕｒｖｅ ｏｆ‘ＧＬＩＦｉｎ ｌｉｇｈｔ（＋）’を示す。５０％生存濃度＝１．５μＭ。
プローブ濃度：３００ｎＭ。光強度：５１０ｎｍで２２．０ｍＷ／ｃｍ２。
図１１の左図は、４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率をＤＭＳＯと非照射対照の吸光度によって正規化した。データは平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝４）として示した。同様の結果が２回得られた。
図１１の右図は、Ｋｉｌｌ ｃｕｒｖｅ ｏｆ‘ＧＬＩＦｉｎ ｌｉｇｈｔ（＋）’を示す。５０％生存濃度＝１．５μＭ。
【0097】
まず、培養細胞で使用した濃度である～３００ｎＭにおいては優位な細胞生存率の減少は見られなかったことから、アクチン繊維の破壊が細胞死誘導シグナルの活性化により引き起こされたものではないことが支持されるとともに、細胞系使用濃度域においては細胞毒性を持たないことが示された。２２．０ｍＷ／ｃｍ２の照射光強度における５０％生存濃度は１．５μＭと算出された。
以上の結果により、ＧＬＩＦｉｎは少なくとも～３００ｎＭでは細胞毒性を十分無視できることが示された。
以上の結果により、ＧＬＩＦｉｎは少なくとも～３００ｎＭでは細胞毒性を十分無視できることが示された。
【0098】
（２）微小管への影響
アクチン繊維以外への酸化ストレスの有無を評価するために、微小管の形態変化を検討した。微小管はアクチン繊維と並ぶ細胞骨格の主成分であり、細胞の遊走や形態形成においては微小管とアクチンはＭＡＰ２ｃなどの微小管安定化因子やキネシン・ダイニンなどのモータータンパク質を介して結合し、互いに相互作用する。
アクチン繊維の近傍に存在する微小管はＧＬＩＦｉｎを用いてアクチン繊維の破壊を誘導する上で副次的に酸化ストレスに曝されやすいと考えられることから、ＧＬＩＦｉｎ添加及び光照射による形態の変化が見られるかを検討することとした。
なお、本研究の微小管染色は、固定処理後に１％ ＢＳＡ溶液でブロッキングしたのち、蛍光標識されたチューブリン抗体（Anti-alpha Tubulin antibody conjugated with FITC、abcam）により行った。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
アクチン繊維以外への酸化ストレスの有無を評価するために、微小管の形態変化を検討した。微小管はアクチン繊維と並ぶ細胞骨格の主成分であり、細胞の遊走や形態形成においては微小管とアクチンはＭＡＰ２ｃなどの微小管安定化因子やキネシン・ダイニンなどのモータータンパク質を介して結合し、互いに相互作用する。
アクチン繊維の近傍に存在する微小管はＧＬＩＦｉｎを用いてアクチン繊維の破壊を誘導する上で副次的に酸化ストレスに曝されやすいと考えられることから、ＧＬＩＦｉｎ添加及び光照射による形態の変化が見られるかを検討することとした。
なお、本研究の微小管染色は、固定処理後に１％ ＢＳＡ溶液でブロッキングしたのち、蛍光標識されたチューブリン抗体（Anti-alpha Tubulin antibody conjugated with FITC、abcam）により行った。以下に試験の時間的経過（Time course）を示す。
【0099】
【0100】
光増感剤有り又は無しで染色したＨｅＬａ細胞を緑色光（５１０ｎｍで２７．０ ｍＷ／ｃｍ２）で照射し、４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで固定透過処理を施し、１％ＢＳＡでブロックした後、プローブおよび蛍光標識抗体で染色した。得られたイメージング画像を図１２に示す。
光増感剤濃度：２００ｎＭ色素濃度；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。
チューブリン抗体－ＦＩＴＣ：３Ｕ／ｍＬ、ＤＡＰＩ：３μｇ／ｍＬ、画像設定；励起：４０５ｎｍ（強度：０．３９９７％）、蛍光：４３０～４６５ｎｍ（ＰＭＴ、ゲイン：８００Ｖ、オフセット：０％、ＬＵＴ：０－２５５）／励起：４８８ｎｍ（強度：２．４９９９％）、蛍光：５１０～５５０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：３００％、オフセット：－０．０１％、ＬＵＴ：０－２５５）／励起：６３３ｎｍ（強度：２．０００１％）、蛍光：６６１～７５０ｎｍ（ＰＭＴ、Ｇａｉｎ：６５０Ｖ、オフセット：０％、ＬＵＴ：０－２５５）。
スケールバー：２０μｍ。
同様の結果を３×４回（Ｎ＝４、ｎ＝３）得た。
光増感剤濃度：２００ｎＭ色素濃度；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジン：２Ｕ／ｍＬ。
チューブリン抗体－ＦＩＴＣ：３Ｕ／ｍＬ、ＤＡＰＩ：３μｇ／ｍＬ、画像設定；励起：４０５ｎｍ（強度：０．３９９７％）、蛍光：４３０～４６５ｎｍ（ＰＭＴ、ゲイン：８００Ｖ、オフセット：０％、ＬＵＴ：０－２５５）／励起：４８８ｎｍ（強度：２．４９９９％）、蛍光：５１０～５５０ｎｍ（ＨｙＤ、Ｇａｉｎ：３００％、オフセット：－０．０１％、ＬＵＴ：０－２５５）／励起：６３３ｎｍ（強度：２．０００１％）、蛍光：６６１～７５０ｎｍ（ＰＭＴ、Ｇａｉｎ：６５０Ｖ、オフセット：０％、ＬＵＴ：０－２５５）。
スケールバー：２０μｍ。
同様の結果を３×４回（Ｎ＝４、ｎ＝３）得た。
【0101】
プローブ添加・光照射条件においてアクチン繊維に見られる繊維の断片化が微小管では見られなかったことから、ＧＬＩＦｉｎは微小管に影響を及ぼさないことが示唆された。
以上により、ＧＬＩＦｉｎは細胞に無作為に酸化ストレスを与えているのではなく、アクチン繊維周辺に対して選択性高く破壊を誘導していることが強く示唆された。
以上により、ＧＬＩＦｉｎは細胞に無作為に酸化ストレスを与えているのではなく、アクチン繊維周辺に対して選択性高く破壊を誘導していることが強く示唆された。
【0102】
［実施例７］
上皮細胞シートの遊走能への摂動の検討
（１）遊走能の光照射・プローブ濃度依存性の検討
ＧＬＩＦｉｎを用いることで隣接細胞間力が及ぼし合う力をアクチン繊維の操作により調節可能であるかを検討すべく、モデル細胞系において検討した。
ＭＤＣＫ細胞はイヌ腎臓由来の上皮様接着細胞であり、コンフルエントの状態において上皮組織様の細胞シートを形成する、すなわち隣接細胞同士がａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎを介して接着することから、組織における膜張力や引張力の伝搬モデルとして、メカノバイオロジーの領域において汎用される。そこで、上皮シートを形成したＭＤＣＫ細胞について、ＧＬＩＦｉｎ添加及び光照射の有無により細胞遊走・増殖能に差異が生じるかによってアクチン繊維への摂動及び力の発生能を評価可能であると考えた。
なお、細胞遊走能はＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｔｃｈ Ａｓｓａｙにより評価することとした。Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｔｃｈ Ａｓｓａｙとは、２つの上皮細胞のシートを細胞の存在しない領域（傷）を挟んで形成し、その傷が埋まるのにかかる時間により細胞遊走能を評価する手法である。傷の形成には、２ウェルのＣｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔ（Ｉｂｉｄｉ）を用いることとした。図１３に試験方法とプロトコルを示す。
上皮細胞シートの遊走能への摂動の検討
（１）遊走能の光照射・プローブ濃度依存性の検討
ＧＬＩＦｉｎを用いることで隣接細胞間力が及ぼし合う力をアクチン繊維の操作により調節可能であるかを検討すべく、モデル細胞系において検討した。
ＭＤＣＫ細胞はイヌ腎臓由来の上皮様接着細胞であり、コンフルエントの状態において上皮組織様の細胞シートを形成する、すなわち隣接細胞同士がａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎを介して接着することから、組織における膜張力や引張力の伝搬モデルとして、メカノバイオロジーの領域において汎用される。そこで、上皮シートを形成したＭＤＣＫ細胞について、ＧＬＩＦｉｎ添加及び光照射の有無により細胞遊走・増殖能に差異が生じるかによってアクチン繊維への摂動及び力の発生能を評価可能であると考えた。
なお、細胞遊走能はＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｔｃｈ Ａｓｓａｙにより評価することとした。Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｔｃｈ Ａｓｓａｙとは、２つの上皮細胞のシートを細胞の存在しない領域（傷）を挟んで形成し、その傷が埋まるのにかかる時間により細胞遊走能を評価する手法である。傷の形成には、２ウェルのＣｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔ（Ｉｂｉｄｉ）を用いることとした。図１３に試験方法とプロトコルを示す。
【0103】
図１４に、ＧＬＩＦｉｎで染色し、緑色光で照射した融合細胞を用いた内皮細胞スクラッチアッセイ後のＭＤＣＫ細胞のイメージングの結果を示す。
また、図１５の左図は、スクラッチの幅の時間依存性を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝３）で示した。図１５の右図は、照射後１２時間までの移動速度を示す。比率は加重最小二乗法により計算した。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）で示した。
また、図１５の左図は、スクラッチの幅の時間依存性を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝３）で示した。図１５の右図は、照射後１２時間までの移動速度を示す。比率は加重最小二乗法により計算した。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）で示した。
【0104】
結果として、ＧＬＩＦｉｎ未添加、光未照射群（図１４の左図、左側の上下段）と比較すると、ＧＬＩＦｉｎ添加、光照射条件においては（図１４の左図、中央の上下段）にＳｃｒａｔｃｈの幅が狭まらなくなる様子が見られ、光未照射かつＧＬＩＦｉｎ添加群（図１４の左図、右側の上下段）においては見られなかったことから、ＧＬＩＦｉｎが光照射依存的にアクチン繊維の崩壊を誘導することにより、細胞シートの遊走能が低下したことが示唆された。特にＧＬＩＦｉｎ ３００ｎＭ存在下光照射条件において、他の群と比較して顕著な遊走速度の低下が見られた（図１５の左図参照）。
【0105】
（２）光照射によるアクチン繊維の部分的な破壊検討
次に、本プローブが「光照射を行う空間依存的にアクチン繊維の破壊を誘導する」ことに利用可能であるかを検討すべく、（１）で見られた遊走能の低下を光照射依存的に部分的に誘導することを試みた。図１６にプロトコルを示す。
次に、本プローブが「光照射を行う空間依存的にアクチン繊維の破壊を誘導する」ことに利用可能であるかを検討すべく、（１）で見られた遊走能の低下を光照射依存的に部分的に誘導することを試みた。図１６にプロトコルを示す。
【0106】
図１７にＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙの結果を示す。
【0107】
光未照射領域においてはＣｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔを除去して数時間後から細胞シートの遊走が見られたのに対し、光照射を行った観察視野右上（破線領域）においては１０時間経過頃までほぼ遊走が見られず、単一組織内において光照射を行った特定部位のみにアクチン繊維への摂動を与えることに成功した。
【0108】
（３）上皮単層細胞上でのＧＬｉＦｉｎ介在「アクチン落書き」の作製
図１８ａで示すプロトコル概略図により「アクチン落書き」を作製した。ＭＤＣＫ細胞にＧＬｉＦｉｎを適用し、その後、ＭＤＣＫ細胞の一部領域（図１８の真中の図に示す薄色の領域）に、予備配置されたマスクを介して１分間にわたって光を照射（２４．１ｍＷ／ｃｍ２）した。スケールバー：２００μｍ。
照射後、細胞を４．５時間インキュベートし、固定し、透過処理し、次いで２Ｕ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジンで染色した。得られた「アクチン落書き」（「顔面」パターン）を図１８ｂに示す。
同様にして得られたその他の例：「再生」、「停止」、「一時停止」、「早送り」パターンを図１８ｃに示す。
図１８ａで示すプロトコル概略図により「アクチン落書き」を作製した。ＭＤＣＫ細胞にＧＬｉＦｉｎを適用し、その後、ＭＤＣＫ細胞の一部領域（図１８の真中の図に示す薄色の領域）に、予備配置されたマスクを介して１分間にわたって光を照射（２４．１ｍＷ／ｃｍ２）した。スケールバー：２００μｍ。
照射後、細胞を４．５時間インキュベートし、固定し、透過処理し、次いで２Ｕ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ファロイジンで染色した。得られた「アクチン落書き」（「顔面」パターン）を図１８ｂに示す。
同様にして得られたその他の例：「再生」、「停止」、「一時停止」、「早送り」パターンを図１８ｃに示す。
【0109】
［実施例８］
ショウジョウバエの翅原基での、ＧＬｉＦｉｎ光刺激で誘導される細胞拡大及びファロイジンシグナルの消失の評価
次に、ＧＬＩＦｉｎ媒介不活性化のｉｎ ｖｉｖｏモデルであるショウジョウバエ幼虫の翅原基への適用性を確認した。
図１９ａは、Ｅ－ｃａｄ－ｍＴａｇＲＦＰを発現する翅原基についての光非照射及び照射（夫々、同図の上段及び下段）における、照射前５分と照射後３．５時間でのライブ画像を示す。同図の右下の画像は、光により誘導されたＧＬＩＦｉｎの活性化により、細胞領域の拡大が生じたことを示す。
図１９ｂは、非照射及び照射した翅原基（夫々、同図の上段及び下段）の固定画像を示す。左図はＥ－ｃａｄ－ｍＴａｇＲＦＰの画像を、右図はファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）の画像を示す。照射した翅原基ではファロイジンシグナルは検出限界未満であった。スケールバー：１０μｍ
ショウジョウバエの翅原基での、ＧＬｉＦｉｎ光刺激で誘導される細胞拡大及びファロイジンシグナルの消失の評価
次に、ＧＬＩＦｉｎ媒介不活性化のｉｎ ｖｉｖｏモデルであるショウジョウバエ幼虫の翅原基への適用性を確認した。
図１９ａは、Ｅ－ｃａｄ－ｍＴａｇＲＦＰを発現する翅原基についての光非照射及び照射（夫々、同図の上段及び下段）における、照射前５分と照射後３．５時間でのライブ画像を示す。同図の右下の画像は、光により誘導されたＧＬＩＦｉｎの活性化により、細胞領域の拡大が生じたことを示す。
図１９ｂは、非照射及び照射した翅原基（夫々、同図の上段及び下段）の固定画像を示す。左図はＥ－ｃａｄ－ｍＴａｇＲＦＰの画像を、右図はファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）の画像を示す。照射した翅原基ではファロイジンシグナルは検出限界未満であった。スケールバー：１０μｍ
【0110】
ＧＬＩＦｉｎの存在下、光照射を行った翅原基ではファロイジン染色像がみられないことからアクチン繊維の消失が起こっており、ＧＬＩＦｉｎによるアクチン繊維の不活性化は、昆虫から哺乳類細胞まで幅広い生物種に対して適用可能であることが確認された。またこの時、Ｅ－ｃａｄ－ｍＴａｇＲＦＰによる細胞膜像から、それぞれの細胞の大きさが不規則に拡張していることも確認された。以上より、アクチン骨格の消失が細胞がお互いを押し合う力の減弱へとつながり、効果的な細胞のパッキングが起こらなくなっていると考えられる。
【0111】
以上により、ＧＬＩＦｉｎは単一組織内においても光照射を行う領域内の細胞のみのアクチン繊維の破壊を誘導することが可能であり、細胞間接着による力の伝搬に摂動を与えるためのケミカルツールとして有用であることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】