特許 7374860 分子構造を決定するための方法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-27

(45)【発行日】2023-11-07

(54)【発明の名称】分子構造を決定するための方法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   G01N 23/20 20180101AFI20231030BHJP

   G01N 23/20058 20180101ALI20231030BHJP

   G01N 23/04 20180101ALI20231030BHJP

【ＦＩ】

G01N23/20 380

G01N23/20058

G01N23/04 330

【請求項の数】 14

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020107072

(22)【出願日】2020-06-22

(65)【公開番号】P2021001887

(43)【公開日】2021-01-07

【審査請求日】2023-05-30

(31)【優先権主張番号】16/450321

(32)【優先日】2019-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501233536

【氏名又は名称】エフ イー アイ カンパニ

【氏名又は名称原語表記】ＦＥＩ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100135079

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 修

(72)【発明者】

【氏名】バルト，ビュッセ

(72)【発明者】

【氏名】アバイ，コテチャ

【審査官】清水 靖記

(56)【参考文献】

【文献】特表２００４－５３１００９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－１４８１０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５０７７１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／００４９３６３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２７５６５５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００２／００２５０２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】HOVMOLLER, Sven，Crystal structure determiation from EM images and electron diffraction patterns，Advances in Imaging and Electron Physics，2002年01月01日，Vol. 123，Pages 257-289

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２３／００ － Ｇ０１Ｎ ２３／２２７６

Ｇ０１Ｎ ３３／００ － Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｇ０１Ｂ １５／００ － Ｇ０１Ｂ １５／０８

Ｇ１６Ｃ １０／００ － Ｇ１６Ｃ ９９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｏｐｕｓ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプルの分子構造を決定するための方法であって、
入射ビームに対して前記サンプルを傾斜させながら前記サンプルの複数の回折パターンを取得することと、
前記複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、
前記サンプルの第１の電子顕微鏡画像（第１のＥＭ画像）を取得することと、
前記第１のＥＭ画像を取得した後に、前記第１のＥＭ画像を取得するための電流密度より高い電流密度で第２のＥＭ画像を取得することと、
前記第１のＥＭ画像、前記第２のＥＭ画像および前記複数の回折パターンの前記回折ピークの前記強度に基づいて前記構造因子の位相を決定することと、
前記構造因子の前記振幅および前記構造因子の前記位相に基づいて前記サンプルの前記分子構造を決定することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記第２のＥＭ画像に基づいてコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）を決定することをさらに含み、前記第２のＥＭ画像に基づいて前記構造因子の前記位相を決定することが、前記ＣＴＦに基づいて前記構造因子の前記位相を決定すること、を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のＥＭ画像を取得することが、ある傾斜角で前記第１のＥＭ画像を取得することを含み、前記第１のＥＭ画像、前記第２のＥＭ画像および前記複数の回折パターンの前記回折ピークの前記強度に基づいて前記構造因子の前記位相を決定することが、前記第１のＥＭ画像および前記傾斜角での前記回折ピークの強度に基づいて前記傾斜角での前記構造因子の前記位相を決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記傾斜角での前記構造因子の前記位相が、前記回折ピークのフリーデル対の強度に基づいてさらに決定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記回折ピークの前記強度と前記回折ピークの前記フリーデル対の前記強度が異なる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記回折ピークの強度に基づいて前記構造因子の前記振幅を決定することが、特定の傾斜角での前記構造因子の前記振幅を、前記傾斜角での前記回折ピークの強度の平方根をとることにより計算することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

前記回折ピークの強度に基づいて前記構造因子の前記振幅を決定することが、前記回折ピークの前記強度を曲線にフィッティングさせることと、特定の傾斜角での前記構造因子の前記振幅を、前記傾斜角での前記曲線の強度の平方根をとることにより計算することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

前記複数の回折パターンを閾値処理することにより前記回折ピークを特定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項9】

前記複数の回折パターンの前記回折ピークの強度が非ゼロである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項10】

サンプルの分子構造を決定するためのシステムであって、
電子ビームを生成するための電子源と、
前記電子ビームに対して前記サンプルを傾斜させるためのサンプルホルダーと、
前記サンプルの回折パターンを取得するための第１の検出器と、
前記サンプルの電子顕微鏡（ＥＭ）画像を取得するための第２の検出器と、
非一時的な媒体に格納されたコンピュータ可読命令を備えたコントローラであって、
前記サンプルが前記サンプルホルダーを介して前記電子ビームに対して傾斜させながら、前記電子ビームを前記サンプルの第１の場所に向けて、前記第１の検出器を介して前記サンプルの複数の回折パターンを取得することと、
前記複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、
前記電子ビームを前記サンプルの第２の場所に向けて、前記第２の検出器を介して前記サンプルの低線量ＥＭ画像および高線量ＥＭ画像を取得することと、
前記低線量ＥＭ画像、高線量ＥＭ画像および前記回折ピークの前記強度に基づいて前記構造因子の位相を決定することと、
前記構造因子の前記振幅および前記構造因子の前記位相に基づいて前記サンプルの前記分子構造を決定することと、を行うように構成されたコントローラと、を備える、システム。

【請求項11】

前記コントローラが、
前記電子ビームを前記サンプルの前記第２の場所に向けて、前記低線量ＥＭ画像を取得する前に前記サンプルを第１の傾斜角に配置することと、
前記低線量ＥＭ画像を取得した後に、前記サンプルの前記第２の場所での高線量ＥＭ画像を取得することと、を行うようにさらに構成され、
前記低線量ＥＭ画像および前記回折ピークの前記強度に基づいて前記構造因子の前記位相を決定することが、前記低線量ＥＭ画像、前記回折ピークの前記強度、および前記高線量ＥＭ画像に基づいて前記第１の傾斜角での前記構造因子の前記位相を決定することを含む、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記コントローラが、２つの直交軸に沿って前記サンプルを傾斜させるようにさらに構成され、前記複数の回折パターンを取得することが、前記サンプルを前記２つの直交軸のうちの一方に沿って傾斜させながら第１の回折パターングループを取得することと、前記サンプルを前記２つの直交軸のうちの他方に沿って傾斜させながら第２の回折パターングループを取得することと、を含む、請求項１０または１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記コントローラが、
前記高線量ＥＭ画像を取得した後に前記サンプルを第２の傾斜角に配置することと、
前記電子ビームを前記第２の傾斜角で配置された前記サンプルの第３の場所に向けて、前記サンプルの第２の低線量ＥＭ画像および第２の高線量ＥＭ画像を順次取得することと、
前記第２の低線量ＥＭ画像、前記第２の高線量ＥＭ画像、および前記回折ピークの前記強度に基づいて前記第２の傾斜角での前記構造因子の前記位相を決定することと、を行うようにさらに構成され、
前記構造因子の前記振幅および前記構造因子の前記位相に基づいて前記分子構造を決定することが、前記構造因子の前記振幅、前記第１の傾斜角での前記構造因子の前記位相、および前記第２の傾斜角での前記構造因子の前記位相に基づいて前記分子構造を決定することを含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項14】

前記コントローラが、前記サンプルホルダーを介して前記サンプルを連続的に傾斜させながら前記複数の回折パターンを取得するように構成されている、請求項１０、１１および１３のいずれかに記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、概して、分子構造を決定するための方法およびシステムに関し、より具体的には、回折パターンおよび電子顕微鏡画像に基づいて分子構造を決定することに関する。

【背景技術】

【0002】

有機分子の分子構造は、その対応する構造因子によって決定されることがある。構造因子は、結晶の格子が入射放射線をどのように散乱させるかを示す。結晶を形成する分子の３Ｄ分子構造は、結晶の構造因子を決定することで解決することができることがある。結晶からの散乱波は互いに干渉し、２次元回折パターンを形成することがある。回折パターンにおける高強度は、散乱角がブラッグ条件を満たすときに強め合って形成される。構造因子には、振幅と位相が含まれる。構造因子の振幅は回折パターンから取得し得るが、位相情報は失われる。分子構造を解明するために、結晶の電子顕微鏡画像から位相情報を抽出することがある。特に、位相情報は、電子顕微鏡画像のフーリエ変換から読み取られることがある。

【発明の概要】

【0003】

一実施形態では、分子構造を決定するための方法は、傾斜角範囲でサンプルを傾斜させながらサンプルの複数の回折パターンを取得することと、複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、サンプルの電子顕微鏡（ＥＭ）画像を取得することと、ＥＭ画像および複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することと、構造因子の振幅および構造因子の位相に基づいてサンプルの分子構造を決定することと、を含む。このようにして、分子構造は、サンプルの回折パターンおよびＥＭ画像から解明され得る。サンプルは、マクロ結晶を粉砕することによって調製されたラメラであってもよい。

【0004】

上記の概要は、発明を実施するための形態でさらに説明される概念の選択を簡略化した形で紹介するために提供されていることを理解されたい。特許請求される主題の主要なまたは本質的な特徴を特定することを意味するものではなく、その範囲は、詳細な説明に続く特許請求の範囲によって一意に定義される。さらに、特許請求される主題は、上記または本開示の任意の部分で言及された任意の欠点を解決する実装に限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】例示的な実施形態による、分子構造を決定するためのシステムを示す。

【図2A】逆空間における３次元結晶とエワルド球の反射の位置の例を示す。

【図2B】図２Ａの条件で取得した回折パターンを示す。

【図3】回折パターンおよび電子顕微鏡画像に基づいて分子構造を決定する方法の例を示す高レベルのフローチャートである。

【図4】回折パターンおよび電子顕微鏡画像を取得するためのラメラの場所の例を示す。

【図5】さまざまな傾斜角でのラメラを示す。

【図6】回折傾斜系列を取得するサブルーチンの例である。

【図7A】複数の回折パターンでサンプリングされた回折ピークを示す。

【図7B】図７Ａの回折ピークに対して生成されたロッキングカーブを示す。

【図8】電子顕微鏡傾斜系列を取得するためのサブルーチンの例である。

【図9】構造因子の位相を決定するサブルーチンの例を示す。

【図10A】回折パターンの例を示す。

【図10B】図１０Ａと同じ傾斜角で取得された低線量電子顕微鏡画像のフーリエ変換を示す。

【0006】

同様の参照番号は、図面のいくつかの図を通して対応する部分を指す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

以下の説明は、サンプルの回折パターンおよび電子顕微鏡（ＥＭ）画像に基づいて分子構造を決定するためのシステムおよび方法に関する。一例では、回折パターンおよびＥＭ画像は、図１の電子顕微鏡システムなどの電子顕微鏡イメージングシステムから取得されてもよい。

【0008】

分子構造は、実空間のフーリエ変換である逆空間におけるその構造因子に基づいて解明されてもよい。構造因子には、振幅と位相が含まれる。構造因子の振幅と構造因子の位相の両方が、逆空間において画定された３次元（３Ｄ）データセットである。実空間の結晶格子面からの散乱波は、逆空間で反射を形成する。各反射には、逆空間の原点に対して中心対称に配置されたフリーデル対がある。反射とそのフリーデル対は、フリーデルペアを形成する。反射は、２Ｄ回折パターンを介してキャプチャまたはサンプリングし得る。図２Ａに示すように、回折パターンの回折ピークは、その対応する反射が、逆空間の湾曲したエワルド球と（またはそこからの閾値距離内で）重複する場合にのみ現れる。弱い位相物体の場合、回折パターン内の反射のフリーデルペアの振幅は同じ強度を持つ場合がある。しかしながら、エワルド球の曲率が原因で、単一の回折パターンでは反射のフリーデルペアの振幅をキャプチャすることができない場合がある。言い換えれば、図２Ｂの回折パターンに示されるように、回折パターンの回折ピークは中心対称でなくてもよい。回折パターンの回折ピークのフリーデルペアは、異なる強度を有する場合がある。したがって、構造因子のフリーデルペアの強度は異なる場合がある。さらに、ＥＭ画像に基づいて構造因子の位相を決定する場合、回折ピークのフリーデルペアの強度が等しくないために生じる追加の位相シフトを考慮する必要がある。

【0009】

図３は、サンプルの回折傾斜系列とＥＭ傾斜系列に基づいて３Ｄ結晶の分子構造を決定する方法の例を示す。回折傾斜系列には複数の傾斜角で取得された回折パターンが含まれ、ＥＭ傾斜系列には複数の傾斜角で取得されたＥＭ画像が含まれる。サンプルはラメラの形態であってもよい。構造因子の振幅は、回折傾斜系列の回折ピークの強度に基づいて決定されてもよい。構造因子の位相は、サンプルのＥＭ画像および回折傾斜系列からの回折ピークの強度に基づいて解明されてもよい。図４は、回折パターンおよびＥＭ画像を取得するためのラメラ上の場所の例を示す。図５は、異なる傾斜角でのラメラを示す。図６は、構造因子の振幅を決定するためのサブルーチンを示す。図７Ａおよび図７Ｂは、回折ピークのロッキングカーブを生成するプロセスを示す。図８は、ＥＭ傾斜系列を取得するためのサブルーチンを示す。図９は、構造因子の位相を決定するためのサブルーチンを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、同じ傾斜角で取得された低線量ＥＭ画像の回折パターンおよびフーリエ変換を示す。

【0010】

図１を参照すると、本開示の実施形態による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）システム１００が示されている。ＴＥＭシステム１００は、電子ビーム１１などの放出軸１１０に沿って荷電粒子をカラム１２に向かって放出する電子源１０を含む。電子源１０は、高エネルギー電子、すなわち、約１０ｋｅＶと１，０００ｋｅＶとの間の典型的なエネルギーを有する電子を生成してもよい。いくつかの実施形態では、カラム１２は、コンデンサレンズ１２０および１２１などの１つ以上のコンデンサレンズと、開口１２２などの１つ以上の開口とを含んでもよい。カラム１２は、電子源１０から生成された電子をコリメートし、電子ビームをサンプル１４上に向ける。サンプル１４は、サンプルホルダー１３によって保持され得る。サンプルホルダー１３は、サンプルを傾斜させるおよび／または並進させることによってサンプル位置を調整し得る。電子ビームがサンプルの選択された領域のみを照射することを可能にするために、コンデンサアパーチャ１５は任意選択でビーム経路に挿入されてもよい。

【0011】

ＴＥＭシステム１００は、サンプルの回折パターンとＥＭ画像の両方を取得するために使用されてもよい。回折撮像モードでは、実線で示すように、散乱電子は、サンプル１４を透過し、対物レンズ１２３、中間レンズ１２６、および投影レンズ１２７を順に進んだ後、検出器２５によって収集され得る。散乱されなかったビームは、ビームストッパ１７によって遮断され得る。収集された散乱電子は、選択領域電子回折（ＳＡＥＤ）パターンなどの電子回折パターンを形成するために使用され得る。ＥＭ撮像モードでは、ビームストッパ１７がビーム経路から取り外される。サンプル１４から送信された電子は、破線で示されるように、対物レンズ１２３、中間レンズ１２６、および投影レンズ１２７を順に進み、検出器２５上にサンプルのＴＥＭ画像を形成する。

【0012】

検出器２５は、受け取った電子を検出し、信号を画像プロセッサ２４に送って画像を形成し得る。検出器２５は、信号を画像プロセッサ２４に送る前に信号を増幅するための増幅器を含んでもよい。一例では、検出器２５は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラとしてもよい。いくつかの実施形態では、回折パターン取得およびＥＭ画像取得のために異なる検出器を使用してもよい。

【0013】

コントローラ３０は、オペレータの命令に応答して手動で、または非一時的メモリ（またはコンピュータ可読媒体）３２に格納されたコンピュータ可読命令に従って自動的にかのいずれかで、ＴＥＭシステム１００の動作を制御し得る。コントローラ３０は、プロセッサを含み、本明細書で説明する方法のいずれかを実施するために、コンピュータ可読命令を実行して、ＴＥＭシステム１００の様々な構成要素を制御するように構成されてもよい。例えば、コントローラは、選択された領域アパーチャ１５および対物絞り１２４の位置を調整することにより、ＳＡＥＤパターンまたはＥＭ画像を取得するように撮像モードを調整してもよい。コントローラ３０は、電流密度を調整することにより、サンプルに向けて照射される電子ビームの線量を調整してもよい。例えば、電流密度は、コンデンサ光学系（コンデンサレンズ１２０および１２１など）を調整することによって調整してもよい。コントローラ３０は、カラム１２の１つ以上のアパーチャおよび／またはレンズを調整することによって、入射ビームのプロファイルを調整し得る。コントローラ３０は、サンプルホルダー１３を調整することにより、入射ビームに対するサンプルの位置および／または向きを調整し得る。コントローラ３０は、サンプルの通知および／または画像を表示するためにディスプレイ３１にさらに結合されてもよい。コントローラ３０は、ユーザ入力デバイス３３からユーザ入力を受け取り得る。ユーザ入力デバイス３３は、キーボード、マウス、またはタッチスクリーンを含み得る。

【0014】

ＴＥＭシステムは例として説明されているが、回折パターンおよびＥＭ画像は他の顕微鏡システムで取得され得ることを理解されたい。一実施形態では、回折パターンおよびＥＭ画像は、異なる顕微鏡システムによって取得されてもよい。一例として、回折パターンは、Ｘ線回折システムから取得されたＸ線回折パターンであってもよい。別の例として、ＥＭ画像は、走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）システムから取得されてもよい。ＴＥＭシステムの本考察は、単に１つの好適な画像化モダリティの例として提供されている。

【0015】

図２Ａは、逆格子における３Ｄ結晶およびエワルド球の反射の例の位置を示す。図２Ｂは、図２Ａの条件下で取得された対応する回折パターンを示す。図２Ａでは、反射の位置は、逆空間のｋｘ－ｋｚ平面に示されている。逆空間は、軸ｋｘ、ｋｙ、およびｋｚによって画定される。３Ｄ結晶は、方向２１２に荷電粒子ビームで照射される。反射（２０１、２０２、２０３、２０４、および２０５）は、逆空間での３Ｄ結晶の反射のサブセットを表す。ここで、反射（２０１～２０５）は、ｋｘ－ｋｚ平面において破線２１０に沿って整列する。アーチ２１１は、エワルド球の一部である。反射のフリーデルペアは、同じ振幅を持ち得るが、エワルド球の曲率が原因で、回折ピークのフリーデルペアの強度が異なる場合がある。エワルド球に近い（すなわち、短い距離内の）反射は、回折パターンに高強度の回折ピークとして現れる。この例では、軸ｋｚの右側の反射（すなわち、ｋｘ＞０）は、軸ｋｚの左側の反射（すなわち、ｋｘ＜０）と比較して、エワルド球に近くなる。対応する回折パターン図２Ｂでは、回折ピーク（２２３、２２４、２２５、および２２６）は、逆空間のｋｘ－ｋｙ平面の線２２２に沿って整列している。ほとんどの回折ピークは、画像の右側、回折パターンの原点（すなわち、逆空間の原点）にあるビームストッパ２２１の右側に現れる。回折ピーク２２３と２２４はフリーデルペアである。回折ピーク２２５と２２６のフリーデル対は、回折パターンでキャプチャされない。言い換えれば、回折ピーク２２５と２２６のフリーデル対の強度は、それぞれ回折ピーク２２５と２２６の強度と比較してより低い。

【0016】

図３は、分子の分子構造を決定するための方法３００の例を示す。分子は、２Ｄ結晶または３Ｄ結晶の形態であり得る。分子構造は、その構造因子の振幅および位相を解明することによって決定し得る。構造因子の振幅は、回折傾斜系列に基づいて決定され得る。構造因子の位相は、回折傾斜系列およびＥＭ傾斜系列に基づいて決定され得る。

【0017】

３０２で、結晶サンプルを調製する。サンプルはラメラの形態であってもよい。ラメラは、マクロ結晶から粉砕されてもよい。例えば、ラメラは、集束イオンビームなどの荷電粒子ビームを使用してマクロ結晶を粉砕することによってマクロ結晶から形成されてもよい。マクロ結晶は、シッティングまたはハンギングドロップ蒸気拡散またはバッチ結晶化などの標準的なタンパク質結晶化法によって調製されてもよい。ラメラの厚さは、調査中の分子のタイプに基づいて決定され得る。例えば、分子構造が無傷であることを確実にするために、ラメラの厚さは、結晶の単位格子のサイズよりも大きくてもよい。ラメラの厚さは、３００ｎｍ未満であってもよい。ラメラが薄いほど、構造因子の振幅を決定する際の動的散乱の影響を減らし得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、複数のラメラを含み得る。

【0018】

図４は、集束イオンビームでマクロ結晶を粉砕することによって調製されたラメラ４０１の一例を示す。各ラメラについて、回折パターンおよびＥＭ画像を取得するために複数の場所を画像化し得る。例えば、図４では、ラメラの実線の四角はＥＭ画像の取得に使用される場所を示し、ラメラの破線の四角は回折パターンの取得に使用される場所を示す。回折パターンの撮像領域およびＥＭ画像は同じであってもよい。画像のピクセル解像度は、分子構造の所望の解像度に基づいて決定され得る。例えば、分子構造で５オングストロームの望ましい解像度では、ナイキスト条件を満たすために、ＥＭ画像で２．５オングストロームのピクセル解像度が必要になることがある。撮像領域は、結晶の放射線硬度によって決定され得る。一例では、撮像領域は、０．０１～１μｍ^２であり得る。

【0019】

３０３で、画像を取得するために、図１のイメージングシステムなどのイメージングシステムを設定する。イメージングシステムを設定することは、ラメラをシステムに読み込むことを含み得る。イメージングシステムを設定することは、サンプルを画像化する前にコマのない位置合わせを行うことを含み得る。

【0020】

３０４で、サンプルの回折傾斜系列を取得する。回折傾斜系列は、複数の２Ｄ回折パターンを含む３Ｄデータセットであ。回折パターンは、０．１ｅｌ／Ａ２未満の電流密度で取得された電子回折パターンであり得る。例えば、電流密度は０．０１ｅｌ／Ａ２である。

【0021】

一実施形態では、ラメラは、傾斜速度で傾斜軸を中心に連続的に傾斜させてもよい。傾斜軸は、入射ビームに対して直交してもよい。傾斜速度は、所望のサンプリング解像度および回折パターンの取得速度に基づいて決定されてもよい。傾斜角の差Δθごとにラメラを傾斜させると、回折パターンが形成され得る。言い換えれば、各回折パターンは、傾斜角差Δθにわたる。連続して取得された回折パターン間の傾斜角差Δθは、所望のサンプリング解像度に基づいて決定されてもよい。例えば、傾斜角差Δθは、所望のサンプリング解像度が増加するにつれて減少してもよい。さらに、傾斜角差Δθは、より細かいスライスを得るために、オーバーサンプリングレートに基づいて調整されてもよい。傾斜角差Δθは、オーバーサンプリングレートに反比例してもよい。一例では、傾斜角差Δθは３度であってもよい。すなわち、３度の角度傾斜ごとに１つの回折パターンが取得される。別の実施形態では、ラメラは個別に傾斜させられてもよい。例えば、ラメラは、最初に傾斜角差Δθだけ傾斜されてもよい。次に、荷電粒子ビームをサンプルに向けて照射して、サンプルがビームに対して静止しているときに回折パターンを取得する。

【0022】

図５は、軸ｘ、ｙ、およびｚによって画定される実空間における異なる傾斜角でのラメラの位置を示す。ラメラは、ｚ軸に沿って、矢印５０１によって示される荷電粒子ビームで照射され得る。ラメラは、入射ビームに直交する軸の周りに傾斜させられてもよい。例えば、ラメラは、矢印５１０によって示されるように、ｙ軸を中心に傾斜させられ、または回転されてもよい。ｙ軸は、サンプルホルダーの回転軸に対応し得る。傾斜角は、ラメラとｘ軸の間の角度によって画定されてもよい。例えば、位置５０２では、ラメラの傾斜角はゼロである。位置５０４では、ラメラは正の傾斜角５０５を有する。位置５０３では、ラメラは負の傾斜角５０６を有する。

【0023】

いくつかの実施形態では、傾斜角の範囲は、サンプルホルダーの最大回転範囲によって制限されてもよい。傾斜角の範囲は、サンプルホルダーの最大回転範囲と同じであってもよい。例えば、ラメラを－７０度～＋７０度に傾斜させながら、回折傾斜系列を取得してもよい。一実施形態では、全回折傾斜系列が、サンプルの同じ場所で取得されてもよい。別の実施形態では、回折傾斜系列は、サンプルの複数の場所から取得されてもよい。例えば、傾斜角が－７０度～０度の範囲の回折パターンをサンプルの第１の場所で取得し、傾斜角が０度～７０度の範囲の回折パターンをサンプルの第２の場所で取得してもよい。分子構造の損傷を回避するために、各場所で取得される回折パターンの数は、電子ビームの線量によって制限されてもよい。いくつかの実施形態では、回折傾斜系列は、３０２で調製された複数のラメラから取得されてもよい。

【0024】

いくつかの実施形態では、回折傾斜系列は、２つの直交軸に沿って傾斜させることによって取得される回折パターンを含んでもよい。例えば、図５に示すように、第１のグループの回折パターンをサンプルをｙ軸に沿って傾斜させることにより取得し、第２のグループの回折パターンをサンプルをｘ軸に沿って傾斜させることにより取得してもよい。２つの直交軸に沿って傾斜させながら取得した回折パターンを含めることにより、３Ｄ逆空間の回折ピークのより正確なプロファイルを取得し得る。さらに、構造因子の振幅の決定に対する動的散乱の影響を低減し得る。

【0025】

３０６で、構造因子の振幅を、回折傾斜系列に基づいて計算し得る。構造因子の振幅は、回折傾斜系列の回折ピークの強度に基づいて決定されてもよい。各回折ピークは、逆空間での反射に対応する。結晶のサイズおよび／またはビームの広がりが有限であるため、回折ピークは、デルタ関数ではない場合があるが、逆空間の体積を占める。言い換えれば、回折ピークの強度は、逆空間の体積内で広がる（すなわち、強度がゼロではない）。したがって、単一の回折パターンでは、回折ピークの完全な角度スポットプロファイルをキャプチャすることができず、複数の傾斜角での回折ピークの強度が構造因子の振幅を解明するために使用される。

【0026】

図６および図７Ａ～７Ｂは、構造因子の振幅計算を詳細に示す。構造因子の振幅は、回折ピークの強度が非ゼロである傾斜角のサブセットにわたる各回折ピークの角度スポットプロファイル（またはロッキングカーブ）に基づいて決定され得る。各ロッキングカーブは、複数の傾斜角にわたる回折ピークの強度をフィッティングすることによって生成される。

【0027】

６０１で、回折傾斜系列の各回折ピークの強度を決定する。回折ピークの強度を決定することは、特定の回折ピークに属する高強度スポットをグループ化することによって各回折ピークを特定することと、回折パターンの回折ピークの高強度スポットの合計強度に基づいて回折パターンの（または傾斜角での）回折ピークの強度を計算することと、を含んでもよい。

【0028】

６０２で、回折傾斜系列を閾値化してもよい。例えば、背景を削除した後、回折傾斜系列の低強度のデータポイント（またはピクセル）を、閾値処理によって除外する。背景は、非弾性散乱電子、試料支持フィルムから散乱した電子、または試料の非結晶部分によって生じ得る。一例では、背景は、ローパスフィルタリングを介して除去されてもよい。低強度のデータポイントを削除した後、閾値レベルより高い強度のデータポイントのみが保持される。一実施形態では、閾値レベルを事前に決定してもよい。別の実施形態では、閾値レベルを、回折傾斜系列の最大強度に基づいて決定してもよい。例えば、閾値レベルは、最大強度の１０％パーセントであってもよい。さらに別の実施形態では、閾値レベルは、イメージングシステムの感度によって決定されてもよい。例えば、閾値レベルは、回折傾斜系列のノイズレベルであってもよい。

【0029】

６０４で、回折傾斜系列の回折ピークを特定する。例えば、回折ピークを特定することは、各回折パターン内の高強度スポットを特定することと、回折ピークに属する高強度スポットを特定することと、を含んでもよい。高強度スポットは、高強度データポイント（またはピクセル）のグループを含む回折パターン内の領域である。高強度スポットを特定することは、高強度スポットの場所および合計強度を決定することを含んでもよい。高強度スポットは、互いに重ならなくてもよい。一実施形態では、高強度スポットを特定することは、各高強度スポットの境界を特定することを含んでもよい。各高強度スポットの合計強度は、高強度スポットの境界内のすべてのデータポイント（またはピクセル）の強度を平均または合計することによって計算してもよい。高強度スポットの場所は、逆空間における高強度スポット境界の幾何学的中心であってもよい。

【0030】

各回折ピークに属する高強度スポットを特定することは、その強度および場所に基づいて高強度スポットをグループ化することを含んでもよい。回折ピークは、複数の回折パターンでキャプチャされてもよい。一実施形態では、回折ピークに属する高強度スポットは、逆空間における高強度スポットの距離に基づいて特定されてもよい。例えば、逆空間において互いに閾値距離内にある高強度スポットは、１つの回折ピークに属すると決定される。高強度スポット間の距離は、回折パターン内の高強度スポットの場所および回折パターンの傾斜角に基づいて決定してもよい。各回折ピークの高強度スポットは、高強度スポットの合計強度に基づいてさらに特定されてもよい。例えば、傾斜角が大きくなると、合計強度は最初に増加し、次に減少する。

【0031】

６０６で、各回折パターンの回折ピークの強度を計算する。例えば、回折パターンの（または傾斜角での）回折ピークの強度は、回折パターン内の回折ピークの高強度スポットの合計強度である。

【0032】

図７Ａは、回折傾斜系列における回折ピークの例の強度を示す。図７Ａでは、回折傾斜系列７０１は、複数の傾斜角θで取得された複数の回折パターンを含む。高強度スポットの一例が、各回折パターン７１１、７１２、７１３、および７１４に示されている。回折パターン７１１～７１４の高強度スポットは、逆空間で互いに近くにあるため、同じ回折ピークに属すると判断される。高強度スポットのグレーレベルは、高強度スポットの合計強度、または回折パターンの回折ピークの強度を示す。高強度スポットは、合計強度が高くなるほど暗くなる。合計強度は最初に増加し、次に傾斜角の増加につれて減少する。

【0033】

６０８で、各回折ピークのロッキングカーブ（または角度スポットプロファイル）を、複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて生成してもよい。例えば、ロッキングカーブは、回折ピークの強度をガウス曲線などの曲線に適合させることによって生成されてもよい。

【0034】

図７Ｂは、図７Ａの傾斜角θ１～θ２からの回折ピークの強度に基づいて生成されたロッキングカーブ７２５の例を示す。図７Ｂにおいて、ｘ軸は傾斜角である。ｙ軸は、回折ピークの強度であり、矢印で示すように強度が増加する。この例では、ラメラを連続的に回転させながら回折パターンを取得しているため、各高強度スポットの合計強度は、傾斜角差Δθの幅を持つバー状になる。バー７２１、７２２、７２３、および７２４の高さは、それぞれ、回折パターン７１１、７１２、７１３、および７１４の高強度スポットの合計強度に対応する。回折ピークの強度は、傾斜角θ１～θ２のゼロより上であり、他の場所ではゼロである。ロッキングカーブは、回折ピークの強度を曲線でフィッティングすることによって生成されてもよい。例えば、高強度スポットの合計強度は、ガウス曲線でフィッティングされてもよい。

【数1】

ただし、Ｉ^ｍａｘは、回折ピークの最大強度であり、θ_０は、最大強度Ｉ^ｍａｘを有する傾斜角であり、σは、ガウス曲線の標準偏差である。標準偏差σは、回折ピークの強度をガウス曲線でフィッティングすることによって取得してもよい。逆空間における回折ピークの場所は、ロッキングカーブに基づいて決定されてもよい。例えば、逆空間における回折ピークの場所は、最大強度を有する傾斜角（図７Ｂのθ_０など）と回折パターンにおける最大強度を有する高強度のスポットの場所（図７Ａの回折パターン７１３の回折ピークの場所など）とに基づいて決定されてもよい。

【0035】

６１０で、ロッキングカーブに基づいて構造因子の振幅を決定してもよい。空間周波数ｋでの構造因子の振幅は、対応する傾斜角θ’でのロッキングカーブの平方根をとることによって計算されてもよい。
すなわち、

【数2】

ただし、Ｆ（ｋ）は、逆空間における空間周波数ｋ（すなわち、回折ピークの場所）での構造因子の振幅であり、Ｉ（θ’）は、傾斜角θでのロッキングカーブの強度である。傾斜角θ’は、空間周波数ｋに基づいて計算されてもよい。なお、絶対構造因子を決定するには、ロッキングカーブにわたるスケーリングの適切な積分が必要である。本発明では、フリーデル対に対応する構造因子の相対的強度のみが重要であり、したがって、積分およびスケーリングは必要とされない。

【0036】

このようにして、構造因子の振幅は、回折ピークのロッキングカーブに基づいて決定され得る。ロッキングカーブは、回折傾斜系列における回折ピークの強度にフィッティングすることによって生成される。逆空間における回折ピークの場所は、回折パターンにおける対応する高強度スポットの場所に基づいて決定されてもよい。特定の傾斜角での回折ピークの強度は、傾斜角での高強度スポットの合計強度であってもよい。

【0037】

図３に戻ると、３０８で、ＥＭ傾斜系列を取得する。ＥＭ傾斜系列には、複数の傾斜角でのサンプルの低線量と高線量の両方のＥＭ画像が含まれてもよい。例えば、各傾斜角で、サンプルの同じ場所で低線量と高線量のＥＭ画像が取得される。図８は、複数のＥＭ画像を取得するためのサブルーチン８００の例を示す。

【0038】

８０２で、複数のＥＭ画像の傾斜角を決定する。ＥＭ傾斜系列の傾斜角の範囲は、図３の３０４における回折傾斜系列の傾斜角の範囲と同じであってもよい。ＥＭ傾斜系列間の間隔、すなわち連続するＥＭ画像間の傾斜角差は、回折傾斜系列と異なってもよい。一実施形態では、ＥＭ撮像の傾斜角の間隔は、回折傾斜系列の傾斜角差Δθに基づいて決定されてもよい。傾斜角の間隔は、利用可能な撮像領域にさらに依存してもよい。

【0039】

８０４で、ラメラのサンプルを新しい場所にずらし、８０２で決定された傾斜角の１つに傾斜させてもよい。サンプルホルダーを操作することにより、ラメラをずらし、かつ傾斜させてもよい。いくつかの実施形態では、新しい場所は、異なるラメラ上の場所であってもよい。一実施形態では、ラメラは、回折傾斜系列と同じ傾斜軸の周りに傾斜してもよい。別の実施形態では、ラメラは、回折傾斜系列とは異なる傾斜軸の周りに傾斜してもよい。傾斜軸は、入射ビーム軸に直交してもよい。

【0040】

８０６で、サンプルの低線量率ＥＭ画像を取得してもよい。低線量ＥＭ画像は、低減された電流密度を使用して取得してもよい。例えば、低線量ＥＭ画像は、０．１ｅｌ／オングストローム２未満の電流密度で取得されもよい。低線量ＥＭ画像は、０．０１ｅｌ／オングストローム２の電流密度で取得されてもよい。低線量ＥＭ画像には、結晶格子からのブラッグ反射が含まれる。

【0041】

８０８で、低線量ＥＭ画像を取得した直後に、サンプルの場所を調整することなく、サンプルの高線量ＥＭ画像を取得してもよい。高線量ＥＭ画像は、低線量ＥＭ画像取得の電流密度を使用して取得されてもよい。例えば、高線量ＥＭ撮像の電流密度は、１０～１００μｇ／オングストローム２であってもよい。ラメラのサンプルの領域に高エネルギー電子を照射することにより、撮像領域内の分子構造が損傷する可能性がある。したがって、高線量ＥＭ画像には、結晶格子からのブラッグ反射は含まれない。高線量ＥＭ画像から、イメージングシステムの収差を反映するコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）を導出してもよい。図１０Ｂは、低線量ＥＭ画像のフーリエ変換を示す。図１０Ｂの中心の周りのトーンリングは、イメージングシステムの焦点外れ、球面収差および非点収差などの収差によって生じ得る。低線量のため、トーンリングは、低線量ＥＭ画像と同じ傾斜角で取得された図１０Ａの回折パターンと比較して、ＥＭ画像ではほとんど見えない。したがって、ＣＴＦの計算には高線量ＥＭ画像が必要である。図１０Ａの領域１００１の回折ピークは、図１０Ｂの領域１００２の高強度信号に対応する。

【0042】

８１０で、サブルーチン８００は、８０２で決定されたすべての傾斜角でのＥＭ画像が取得されるかどうかを決定する。すべての傾斜角が撮像されている場合、サブルーチン８００は終了する。それ以外の場合は、別の場所のＥＭ画像および傾斜角を取得する。

【0043】

一実施形態では、入射ビームに対してサンプルを連続的に傾斜させながら回折傾斜系列を取得し、サンプルが入射ビームに対して静止している間に複数のＥＭ画像の各ＥＭ画像を取得する。したがって、各回折パターンは傾斜角の範囲に対応し、各ＥＭ画像は離散的な傾斜角に対応する。ＥＭ取得中にサンプルを傾斜させると、ＥＭ画像の高解像度情報が不鮮明になり、フーリエ変換されたＥＭ画像の解像度が低下することがあるため、ＥＭ取得中のサンプルは静止したままである。

【0044】

図３に戻ると、３１０で、構造因子の位相は、３０８で取得されたＥＭ傾斜系列および回折パターン内の回折ピークの強度に基づいて決定されてもよい。図９は、構造因子の位相を決定するためのサブルーチン９００の例を示す。特に、傾斜角での２Ｄ構造因子位相は、低線量ＥＭ画像のフーリエ変換、傾斜角で果たされた高線量ＥＭ画像から導出されたＣＴＦ、および傾斜角での回折ピークのフリーデルペアの強度に基づいて解明してもよい。次に、複数の傾斜角での２Ｄ構造因子位相を、構造因子の位相の３Ｄデータセットに再構築してもよい。

【0045】

９０２で、ステップ３０８から選択された傾斜角で取得された高線量および低線量のＥＭ画像をメモリに読み込んでもよい。選択された角度は、図８の８０２で決定された傾斜角のうちの１つであってもよい。

【0046】

９０４で、ＣＴＦは、高線量ＥＭ画像から導出されてもよい。一実施形態では、ＣＴＦは、高線量ＥＭ画像のフーリエ変換に基づいて導出されてもよい。傾斜角に基づいてＣＴＦをさらに調整して、傾斜したサンプル（ラメラなど）の撮像領域にわたる不均一な焦点に対処してもよい。

【0047】

９０６では、選択された傾斜角での構造因子の位相（すなわち、２Ｄ構造位相）は、低線量ＥＭ画像のフーリエ変換、９０４で導出されたＣＴＦ、および選択した傾斜角での回折ピークのフリーデルペアの強度に基づいて計算されてもよい。

【0048】

例えば、低線量ＥＭ画像の単一のフーリエ成分は次のように表される。

【数3】

ただし、Ｉ_θ（ｘ）は傾斜角θで取得され、ｘは実空間における場所であり、ｋは逆空間における空間周波数であり、Ｆ（ｋ）およびＦ（－ｋ）は構造因子のフリーデルペアの振幅であり、γ（ｋ）は９０４で導出されたＣＴＦであり、αｋは空間周波数ｋでの構造因子の位相である。Ｆ（ｋ）およびＦ（－ｋ）は、回折パターンの回折ピークのフリーデルペアの強度の平方根に比例する。図２Ｂに示されているように、反射とエワルド球との間の距離は原点に対して中心対称ではないため、回折パターンの回折ピークのフリーデルペアの強度は異なり得る。したがって、構造因子のフリーデルペアの振幅Ｆ（ｋ）とＦ（－ｋ）は異なり得る。一実施形態では、所与の空間周波数での構造因子の振幅は、回折ピークのロッキングカーブに基づいて取得してもよい。例えば、図７Ｂに示されているように、構造因子の振幅Ｆ（ｋ’）は、ロッキングカーブＩ（θ’）の平方根であってもよい。別の実施形態では、ロッキングカーブを生成することなく、Ｆ（ｋ’）は、回折パターンの回折ピークの強度から直接得てもよい。例えば、図７Ｂでは、Ｆ（ｋ’）は、強度７３１の平方根に設定されてもよい。別の例では、回折パターンおよびＥＭ画像が同じ離散角θ’で撮像された場合、構造因子の振幅は、回折パターンの回折ピーク強度の平方根として設定されてもよい。

【0049】

式（１）は以下のようにさらに簡略化され得る。

【数4】

ただし、

【数5】

【数6】

【数7】

及び

【数8】

である。
このように、傾斜角θでの構造因子の位相α_ｋは、低線量ＥＭ画像Ｉ_θ（ｘ）のフーリエ変換、構造因子のフリーデルペアの強度、およびＣＴＦに基づいて解明し得る。構造因子のフリーデルペア（または回折ピークのフリーデルペア）の強度の違いにより、β（ｋ）＋π／２の追加の位相シフトが発生する。フリーデルペアの強度が等しい場合、すなわちＦ（ｋ’）＝Ｆ（－ｋ’）、β（ｋ’）＝－π／２の場合、追加の位相シフトは存在しない。

【0050】

９０８では、位相の原点が２Ｄ構造因子位相で確立される。特に、２Ｄ構造因子位相は、実空間の座標系の共通の原点に調整されるため、異なる傾斜角を持つ２Ｄ構造因子位相をマージして、構造因子の３Ｄ位相を取得し得る。一実施形態では、位相の原点は、同じ位相を持つ傾斜軸上の２Ｄ構造因子位相を要求することによって確立されてもよい。例えば、実空間のｙ軸を中心にサンプルを傾斜させることでＥＭ画像を取得する場合、２Ｄ構造因子位相を調整して、逆空間のｋｙ軸に沿った反射の位相が同じになるようにしてもよい。

【0051】

９１０で、サブルーチン９００は、すべてのＥＭ画像が処理されたかどうかをチェックする。言い換えると、サブルーチン９００は、ＥＭ撮像のすべての傾斜角が処理されたかどうかをチェックする。答えがいいえである場合、９１２で別の傾斜角が選択され、選択された傾斜角での構造因子の位相が計算される。そうでない場合、すべてのＥＭ画像が処理されると、さまざまな角度の２Ｄ構造因子に基づいて、構造因子の３Ｄ位相が９１４で構築されてもよい。構造因子位相を構築することは、結晶軸に対する傾斜角に基づいて２Ｄ構造因子位相をマージすることを含み得る。

【0052】

図３に戻ると、３１２で、分子構造は、３０６で決定された構造因子の振幅および３１０で決定された構造因子の位相に基づいて再構築されてもよい。分子構造は、実空間における結晶の原子座標を含んでもよい。一例では、分子構造は、３Ｄ構造因子振幅および３Ｄ構造因子位相の逆フーリエ変換に基づいて決定されてもよい。いくつかの実施形態では、分子構造は、取得された回折傾斜系列に基づいてさらに洗練されてもよい。例えば、分子構造内の原子の場所を微調整して、計算された回折パターンと観測された回折パターンとの差を最小限に抑えてもよい。計算された回折は、解明された分子構造のフーリエ変換、および回折傾斜系列からの観察された回折パターンによって決定されてもよい。

【0053】

いくつかの実施形態では、回折傾斜系列を取得する前に、ＥＭ傾斜系列を取得してもよい。いくつかの実施形態では、回折傾斜系列またはＥＭ傾斜系列の傾斜角度範囲は、結晶の既知の対称性に基づいて減少してもよい。例えば、第１の傾斜角範囲をカバーする第１の回折傾斜系列を取得してもよい。第１の傾斜角範囲よりも大きい第２の傾斜角範囲をカバーする第２の回折傾斜系列が、第１の回折傾斜系列および結晶の既知の対称性に基づいて構築されてもよい。

【0054】

このようにして、３Ｄ結晶の分子構造は、回折傾斜系列およびＥＭ傾斜系列に基づいて解明され得る。回折傾斜系列は、第１の範囲の傾斜角で取得された回折パターンを含み得、ＥＭ傾斜系列は、第２の範囲の傾斜角で取得された低線量および高線量のＥＭ画像を含んでもよい。３Ｄ構造因子振幅は、傾斜角にわたるロッキングカーブの積分に基づいて決定されてもよい。３Ｄ構造因子位相は、ＥＭ傾斜系列および３Ｄ構造因子振幅に基づいて解明されてもよい。分子構造は、構造因子の振幅と位相に基づいて取得されてもよい。

【0055】

回折パターンを取得することの技術的効果は、構造因子の振幅を取得することである。複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定する技術的効果は、回折ピークの合計強度をキャプチャすることである。回折パターンの回折ピークのフリーデルペアの強度に基づいて２Ｄ構造因子の位相を決定する技術的効果は、フリーデルペアの強度が等しくないために発生する追加の位相シフトを考慮し得ることである。各傾斜角での高線量ＥＭ画像および低線量ＥＭ画像を取得することの技術的効果は、低線量ＥＭ画像に対応するＣＴＦが高線量ＥＭ画像に基づいて決定され得ることである。

【0056】

一実施形態では、サンプルの分子構造を決定するための方法は、傾斜角範囲でサンプルを傾斜させながらサンプルの複数の回折パターンを取得することと、複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、サンプルの電子顕微鏡（ＥＭ）画像を取得することと、ＥＭ画像および複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することと、構造因子の振幅および構造因子の位相に基づいてサンプルの分子構造を決定することと、を含む。本方法の最初の例では、ＥＭ画像を取得した後、そのＥＭ画像を取得するための電流密度より高い電流密度でサンプルの第２のＥＭ画像を取得し、さらに第２のＥＭ画像に基づいて構造因子の位相を決定する。本方法の第２の例は、任意選択で第１の例を含み、第２のＥＭ画像に基づいてコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）を決定することをさらに含み、第２のＥＭ画像に基づいて構造因子の位相を決定することが、ＣＴＦに基づいて構造因子の位相を決定すること、をさらに含む。本方法の第３の例は、任意選択で第１および第２の例のうちの１つ以上を含み、ＥＭ画像を取得することが、傾斜角範囲内の傾斜角でＥＭ画像を取得することを含み、ＥＭ画像および複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することが、ＥＭ画像および傾斜角での回折ピークの強度に基づいて傾斜角での構造因子の位相を決定することを含むこと、をさらに含む。本方法の第４の例は、任意選択で第１～第３の例のうちの１つ以上を含み、傾斜角での構造因子の位相が、回折ピークのフリーデル対の強度に基づいてさらに決定されること、をさらに含む。本方法の第５の例は、任意選択で第１～第４の例のうちの１つ以上を含み、回折ピークの強度と回折ピークのフリーデル対の強度とが異なること、をさらに含む。方法の第６の例は、任意選択で第１～第５の例のうちの１つ以上を含み、回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することが、特定の傾斜角での構造因子の振幅を、その傾斜角での回折ピークの強度の平方根をとることにより計算することを含むこと、をさらに含む。本方法の第７の例は、任意選択で第１～第６の例のうちの１つ以上を含み、回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することが、回折ピークの強度を曲線にフィッティングさせることと、特定の傾斜角での構造因子の振幅を、その傾斜角での曲線の強度の平方根をとることにより計算することと、を含むこと、をさらに含む。本方法の第８の例は、任意選択で第１～第７の例のうちの１つ以上を含み、複数の回折パターンを閾値処理することによって回折ピークを特定すること、をさらに含む。本方法の第９の例は、任意選択で第１～第８の例のうちの１つ以上を含み、複数の回折パターンの回折ピークの強度が、非ゼロであること、をさらに含む。本方法の第１０の例は、任意選択で第１～第９の例のうちの１つ以上を含み、サンプルがラメラであること、をさらに含む。

【0057】

別の実施形態では、命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、命令は実行時に、傾斜角範囲でサンプルを傾斜させながらサンプルの複数の回折パターンを取得することと、複数の回折パターンの各回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、複数の傾斜角でのサンプルの電子顕微鏡（ＥＭ）画像を取得することと、複数のＥＭ画像および回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することと、構造因子の振幅および構造因子の位相に基づいてサンプルの分子構造を決定することと、をプロセッサに実行させる。第１の例では、複数のＥＭ画像および回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することが、複数のＥＭ画像および回折ピークのフリーデルペアの強度に基づいて構造因子の位相を決定することを含む。非一時的コンピュータ可読媒体の第２の例は、任意選択で第１の例を含み、複数のＥＭ画像および回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することが、回折ピークの強度に基づいて構造因子のフリーデルペアの強度を決定し、複数のＥＭ画像および構造因子のフリーデルペアの強度に基づいて構造因子の位相を決定すること、を含むこと、をさらに含む。非一時的コンピュータ可読媒体の第３の例は、任意選択で第１および第２の例のうちの１つ以上を含み、実行時に、サンプルの第１の場所での複数の回折パターンを取得することと、サンプルの第２の場所での複数のＥＭ画像を取得することと、をプロセッサに実行させる命令をさらに含む。

【0058】

さらに別の実施形態では、サンプルの分子構造を決定するためのシステムは、電子ビームを生成するための電子源と、電子ビームに対してサンプルを傾斜させるためのサンプルホルダーと、サンプルの回折パターンを取得するための第１の検出器と、サンプルの電子顕微鏡（ＥＭ）画像を取得するための第２の検出器と、非一時的な媒体に格納されたコンピュータ可読命令を備えたコントローラであって、サンプルホルダーを介してサンプルを傾斜角範囲内で傾斜させることと、電子ビームをサンプルの第１の場所に向けて、サンプルを傾斜させながら第１の検出器を介してサンプルの複数の電子回折パターンを取得することと、複数の回折パターンの回折ピークの強度に基づいて構造因子の振幅を決定することと、電子ビームをサンプルの第２の場所に向けて、第２の検出器を介してサンプルの低線量ＥＭ画像を取得することと、低線量ＥＭ画像および回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することと、構造因子の振幅および構造因子の位相に基づいてサンプルの分子構造を決定することと、を行うように構成されるコントローラと、を含む。システムの第１の例では、コントローラが、電子ビームをサンプルの第２の場所に向けて低線量ＥＭ画像を取得する前に、サンプルを第１の傾斜角に配置することと、低線量ＥＭ画像を取得した後に、サンプルの第２の場所での高線量ＥＭ画像を取得することと、を行うようにさらに構成され、低線量ＥＭ画像および回折ピークの強度に基づいて構造因子の位相を決定することが、低線量ＥＭ画像、回折ピークの強度、および高線量ＥＭ画像に基づいて第１の傾斜角での構造因子の位相を決定することを含む。システムの第２の例は、任意選択で第１の例を含み、コントローラが、２つの直交軸に沿ってサンプルを傾斜させるようにさらに構成され、複数の回折パターンを取得することが、サンプルを２つの直交軸のうちの一方に沿って傾斜させながら第１の回折パターングループを取得することと、２つの直交軸のうちの他方に沿ってサンプルを傾斜させながら第２の回折パターングループを取得することと、を含むこと、をさらに含む。システムの第３の例は、任意選択で第１および第２の例のうちの１つ以上を含み、コントローラが、高線量ＥＭ画像を取得した後にサンプルを第２の傾斜角に配置することと、電子ビームを第２の傾斜角で配置されたサンプルの第３の場所に向けて、サンプルの第２の低線量ＥＭ画像および第２の高線量ＥＭ画像を順次取得することと、第２の低線量ＥＭ画像、第２の高線量ＥＭ画像、および回折ピークの強度に基づいて第２の傾斜角での構造因子の位相を決定することと、を行うようにさらに構成され、構造因子の振幅および構造因子の位相に基づいて分子構造を決定することが、構造因子の振幅、第１の傾斜角での構造因子の位相、および第２の傾斜角での構造因子の位相に基づいて分子構造を決定することをさらに含む。システムの第４の例は、任意選択で第１および第３の例のうちの１つ以上を含み、コントローラが、サンプルホルダーを介してサンプルを連続的に傾斜させながら複数の回折パターンを取得するように構成されること、をさらに含む。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】