特許7376013IP Force 特許公報全文掲載

技術分野

,単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のin vitroにおける培養方法または当該微生物感染症治療薬の評価方法など

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明により,単球又は樹状細胞を介在する感染症を引き起こす微生物の研究・評価が可能となる。例えば,ヒト献血由来の血球材料では培養・評価が難しく研究することが難しかった疾患に対しても,本発明を使用することで培養・評価が可能になり,感染症研究・抗感染症薬・ワクチン開発を行うことが可能となる。また,本発明の方法により,血液が関与する疾患の治療薬開発において,誤差の少ない薬剤スクリーニング評価が可能となる。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 作製した不死化ヒト単球細胞における表面マーカーCD11およびCD14の発現をフローサイトメーターにて分析した結果を示すプロット図である。使用抗体:FITCで反応する抗CD11抗体,抗CD14抗体。
【図2】 不死化ヒト単球細胞をIL4で刺激することにより誘導した樹状細胞様細胞をメイ-ギムザ染色した写真である。
【図3】 デングウイルス感染実験におけるプレートデザイン図である。96穴プレートの左半分に評価するヒト単球細胞もしくは樹状細胞を入れ,右半分にコントロール細胞であるK562細胞を播種した。ウェルの各行(1-12)に異なる希釈倍率のウイルス液を添加した。ウェルの列(A-H)毎に異なる種類のデングウイルス(DENV-1:デングウイルス1型,DENV-2:デングウイルス2型,DENV-3:デングウイルス3型,及び,DENV-4:デングウイルス4型を添加した。
【図4】 図3のプレートデザインを用い,実施例1において調整したヒト樹状様細胞と陽性対象であるK562細胞とを比較した結果を示す写真である。デングウイルス感染実験後に,ウイルス感染を染色により可視化した。
【図5】 図4のプレートの一部のウェルを拡大した写真である。(A)単球様細胞を用いた結果の写真である(ML:単球様細胞,K562:K562細胞株)。左から順に図4のA1,C1,E1,G1ウェル(上段),及び,図4のA7,C7,E7,G7ウェル(下段)の拡大写真である。(B)樹状様細胞を用いた評価結果の写真である(DC:樹状様細胞,K562:K562細胞株)。左から順に図4のA5,C5,E5,G5ウェル(上段),及び,図4のA7,C7,E7,G7ウェル(下段)の拡大写真である。なお,A1とは図4のプレートのA行1列目を指す。
【図6】 単球様細胞(A)及び樹状細胞様細胞(B)のウイルス放出量を測定した結果を示すグラフである。縦軸は,培養上清中へのウイルス放出量(log10 プラーク形成ユニット(PFU)/mL)を表す。横軸は左から順に,デングウイルス1型(DENV-1)(D1),2型(DENV-2)(D2),3型(DENV-3)(D3),4型(DENV-4)(D4)を示す。
【図7】 作成した不死化ヒト単球細胞(末梢血由来単球細胞:CD14-ML, iPS細胞由来単球細胞:iPS-ML)における物理的精製及び膜強度を測定するために,フィルター後の細胞をフローサイトメーターにて分析した結果を表すプロット図である。フィルターによる精製を行なっていない群を未フィルター群(Non filter)および格子穴12umのメッシュフィルターにて精製した群(12um)についてフローサイトメーターにて測定した。縦軸は側方散乱光の面積(SSC-A),横軸は前方散乱光(FSC-H)の検出結果を示す。精製度合いを可視化するために,便宜的に分割し,エリア1,2,それ以外の存在比について示す。評価における再現性確保のためエリア2の細胞数存在比を一定の範囲にすることで管理を志向する。
【図8】 図3のデングウイルス感染実験より,ウイルス希釈倍率を大きくしウイルス低濃度下での感染評価を行ったプレートデザイン図である。デングウイルス4型(DENV-4)を用いて行なった実験を元に記載する。各WellにAからDに記載の細胞を1x10^5個入れ,感染多重度(MOI)に従いウイルスを添加させる。例えば,A1(矢印ストライプ)では1個の末梢血由来不死化単球細胞(CD14-ML)に対し0.39(粒子)の割合でデングウイルス4型(DENV-4)を感染させている。
【図9】 プラークデングウイルス感染実験について,ウイルス希釈倍率をより大きくしたプレートデザイン図である。図8において感染評価後,上清中に含まれるウイルス量を可視化するために,Vero細胞に上清を播種し培養後,免疫染色させる。数字は図8に該当する。例えば,図8のA1の上清を10倍希釈して播種したのが左上のWellである。
【図10】 プラークデングウイルス感染実験結果について示した図である。末梢血由来樹状様細胞(CD14-DC:白矢印)及びiPS細胞由来樹状様細胞(iPS-DC:黒矢印)いずれも,ウイルス極めて低い濃度での存在下においてもウイルスを増殖させ放出していることを示す。
【図11】 プラークデングウイルス感染実験結果について示した図である。デングウイルス1型を使用し,ウイルス希釈を行いながら感染した図である。プラークが薄い斑点状(白矢印)のものが大きな斑点(黒矢印)にある濃度で変化しており,両者間ではウイルスが変異している可能性を示す。

代表図 図1本件の代表的な図

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