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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-07
(45)【発行日】2023-11-15
(54)【発明の名称】顕微鏡、及び、顕微鏡の設定方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20231108BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231108BHJP
G02B 21/00 20060101ALI20231108BHJP
C12Q 1/06 20060101ALN20231108BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 B
C12M1/00 A
C12M1/34 D
G02B21/00
C12Q1/06
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2019073404
(22)【出願日】2019-04-08
(65)【公開番号】P2020171198
(43)【公開日】2020-10-22
【審査請求日】2022-04-04
(73)【特許権者】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】100099793
【弁理士】
【氏名又は名称】川北 喜十郎
(74)【代理人】
【識別番号】100154586
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 正広
(72)【発明者】
【氏名】大川 潤也
(72)【発明者】
【氏名】中田 千枝子
(72)【発明者】
【氏名】坂本 ちか
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／１４３３７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０３４２８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－２２０６１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－９７２２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０１７５８２７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１３７０９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／３４
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｇ０２Ｂ ２１／００
Ｃ１２Ｑ １／０６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対物レンズを含み、光源からの照明光によって、走査部を介して、前記対物レンズの光軸方向に交差する面内において、細胞塊を走査して照射する照明光学系と、前記細胞塊からの光を、前記走査部を介して受光部へ集光する検出光学系と、
制御部と、を備え、
前記制御部は、前記光軸方向に沿って異なる複数の位置それぞれで、前記走査部により前記照明光を２次元走査して、２次元画像を取得する際、前過程として、前記複数の位置それぞれの画像取得条件を決定するために画像取得をすることなく、前記２次元画像を取得する過程において、前記細胞塊の第１の位置で取得された２次元画像に基づき、細胞の構造体の密度の情報、前記細胞の構造体の周囲長の情報、及び前記細胞の構造体の輝度と前記細胞の構造体以外の部分の輝度との比率情報のうち、少なくとも１つの情報を特定し、前記特定された情報に基づき、前記光軸方向に沿って、前記第１の位置とは異なる第２の位置における画像取得条件を決定する顕微鏡。
【請求項2】
前記制御部は、前記特定された情報が、適正範囲に収まるまで前記第２の位置の前記画像取得条件を変更する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項3】
前記細胞の構造体は、前記細胞の内部の構造又は前記細胞の表面の構造である請求項１又は２に記載の顕微鏡。
【請求項4】
前記細胞の内部の構造は、前記細胞の核である請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項5】
前記細胞の表面の構造は、表面突起である請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項6】
前記画像取得条件は、前記照明光の強度、前記走査部の走査速度、前記受光部への印加電圧、及び、前記第２の位置で取得される２次元画像のアベレージ回数の少なくとも１つを含む請求項１～５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項7】
前記制御部は、前記第１の位置で取得された２次元画像に含まれる前記細胞の構造体の密度が適正範囲に入るように前記画像取得条件を変更する請求項１～６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項8】
前記制御部は、前記第１の位置で取得される２次元画像に含まれる前記細胞の構造体の周囲長の分布が適正範囲に入るように前記画像取得条件を変更する請求項１～７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項9】
前記細胞塊は、保持部材に配置され、
前記第１の位置は、前記細胞塊と前記保持部材とが接する位置とは前記光軸方向に沿って異なる位置に設定される請求項１～８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項10】
前記第１の位置は、前記細胞塊と前記保持部材とが接する位置から前記光軸方向に沿って１０μｍ以内の位置に設定される、請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項11】
前記細胞塊は、組織切片を含む請求項１～１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項12】
対物レンズを含み、光源からの照明光によって、走査部を介して、前記対物レンズの光軸方向に交差する面内において、細胞塊を走査して照射する照明光学系と、
前記細胞塊からの光を、前記走査部を介して受光部へ集光する検出光学系と、
を備える顕微鏡において、
前記光軸方向に沿って異なる複数の位置それぞれで、前記走査部により前記照明光を２次元走査して、２次元画像を取得する際、前過程として、前記複数の位置それぞれの画像取得条件を決定するために画像取得をすることなく、前記２次元画像を取得する過程において、前記細胞塊の第１の位置で取得された２次元画像に基づき、細胞の構造体の密度の情報、前記細胞の構造体の周囲長の情報、及び前記細胞の構造体の輝度と前記細胞の構造体以外の部分の輝度との比率情報のうち、少なくとも１つの情報を特定することと、
前記特定された情報に基づき、前記光軸方向に沿って、前記第１の位置とは異なる第２の位置における画像取得条件を決定することと、を備える顕微鏡の設定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、顕微鏡、及び、顕微鏡の設定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞の塊を観察することが知られている。例えば、特許文献１もしくは特許文献２が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】ＵＳ２０１１１３３１５７９４Ａ
【文献】ＵＳ２０１２１３３６４９２８Ａ
【発明の概要】
【0004】
本実施形態の第１の態様に従えば、対物レンズを含み、によって、走査部を介して、前記対物レンズの光軸方向に交差する面内において、細胞塊を走査して照射する照明光学系と、前記細胞塊からの光を、前記走査部を介して受光部へ集光する検出光学系と、制御部と、を備え、前記制御部は、前記光軸方向に沿って異なる複数の位置それぞれで、前記走査部により前記照明光を２次元走査して、２次元画像を取得する際、前過程として、前記複数の位置それぞれの画像取得条件を決定するために画像取得をすることなく、前記２次元画像を取得する過程において、前記細胞塊の第１の位置で取得された２次元画像に基づき、細胞の構造体の密度の情報、前記細胞の構造体の周囲長の情報、及び前記細胞の構造体の輝度と前記細胞の構造体以外の部分の輝度との比率情報のうち、少なくとも１つの情報を特定し、前記特定された情報に基づき、前記光軸方向に沿って、前記第１の位置とは異なる第２の位置における画像取得条件を決定する顕微鏡が提供される。
【0005】
本実施形態の第２の態様に従えば、対物レンズを含み、光源からの照明光によって、走査部を介して、前記対物レンズの光軸方向に交差する面内において、細胞塊を走査して照射する照明光学系と、前記細胞塊からの光を、前記走査部を介して受光部へ集光する検出光学系と、を備える顕微鏡において、前記光軸方向に沿って異なる複数の位置それぞれで、前記走査部により前記照明光を２次元走査して、２次元画像を取得する際、前過程として、前記複数の位置それぞれの画像取得条件を決定するために画像取得をすることなく、前記２次元画像を取得する過程において、前記細胞塊の第１の位置で取得された２次元画像に基づき、細胞の構造体の密度の情報、前記細胞の構造体の周囲長の情報、及び前記細胞の構造体の輝度と前記細胞の構造体以外の部分の輝度との比率情報のうち、少なくとも１つの情報を特定することと、前記特定された情報に基づき、前記光軸方向に沿って、前記第１の位置とは異なる第２の位置における画像取得条件を決定することと、を備える顕微鏡の設定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下の記載においては、ＸＹＺ直交座標系を設定し、このＸＹＺ直交座標系に基づいて位置関係を説明している（図２参照）。Ｚ軸方向は、例えば鉛直方向に設定され、Ｘ軸方向及びＹ軸方向は、例えば、水平方向に平行で互いに直交する方向に設定される。
【0008】
本明細書において、図１に示す通り、複数の細胞が３次元的に凝集したものを細胞の塊と呼んでいる。細胞の塊の例としては、組織切片、細胞スフェロイド、オルガノイド等が挙げられる。なお、細胞スフェロイドとは、３次元培養された細胞の３次元的な塊であり、オルガノイドとは、臓器の特色の一部を備えている、小さくて単純化された細胞の集まりである。オルガノイドは、例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を原料として、細胞培養の条件を制御しつつ細胞を分化させることにより、３次元的に試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で作製することができる。また、細胞の塊には、２次元的に広がった細胞の層が２層以上にわたって積層されたもの（例えば、細胞シート）も含まれる。細胞シートは単層でもよいし、積層された複数の層であるものでも構わない。
【0009】
３次元培養は２次元培養と比較して、立体構造を持ったより複雑な系を構築することが可能であり、より生体内に類似した環境を構築することが可能である。細胞スフェロイドやオルガノイドのような３次元培養された細胞の塊や、組織切片のような細胞の塊を、基礎研究、創薬研究、再生医療などの分野において応用する際において、細胞の塊の中に含まれる細胞の数を正確に知りたいという要求がある。例えば、細胞の塊に薬剤を注入し、その薬剤が細胞の塊の中に含まれる細胞にどのくらい吸収されたかを調べる場合において、細胞の塊の中に含まれる細胞の数を正確に知ることにより、各細胞に吸収された薬剤の量を正しく評価することができる。
【0010】
図２を参照しつつ、本実施形態に係る、細胞の塊の内部に含まれる細胞の数を計数するための計数装置１について説明する。計数装置１は、顕微鏡装置１０と、制御部２０と、表示部３０と、入力部４０とを主に備えている。なお、細胞の数は、細胞情報の一例である。また、本実施形態においては、細胞に含まれる核の数を、細胞の数とすることができる。この場合に、例えば、細胞分裂中の細胞においては、細胞に複数の核が含まれる場合がある。この場合には、細胞の核の面積と細胞の面積に基づいて、計数する細胞の数を変更しても構わない。もちろん、細胞の数を計数する方法は、細胞の核の数の計数に限られない。例えば、細胞の輪郭情報から細胞の面積を算出し、算出された細胞の面積から細胞の数を計数しても構わない。また、細胞の核は、細胞の内部の構造の一例である。また、細胞の輪郭情報による細胞の外形構造は、細胞の構造体の一例である。
【0011】
顕微鏡装置１０は、照明部１００と、光学系１２０と、受光部１４０と、試料Ｓが置かれる可動ステージ１６０とを主に備えている。本実施形態の顕微鏡装置１０は、いわゆる共焦点レーザ顕微鏡と呼ばれる顕微鏡装置である。なお、顕微鏡装置１０は、光学検出装置の一例である。
【0012】
図２に示されるように、照明部１００は、３つのＣＷレーザ１０２と、音響光学可変フィルタ１０３（Ａｃｏｕｓｔｏ－Ｏｐｔｉｃｓ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ、以下ＡＯＴＦ１０３と呼ぶ）とを有している。ＣＷレーザ１０２は、それぞれ、波長４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍの連続波レーザであり、本実施形態では半導体レーザが用いられている。ＡＯＴＦ１０３は、電気的に制御可能な透過型のバンドパスフィルタであり、オン／オフ変調による高速スイッチング、及び、変調レベルの調整によるレーザ強度のコントロールが可能である。本実施形態の照明部１００においては、ＡＯＴＦ１０３により３つのＣＷレーザ１０２のオン／オフ制御及びレーザ強度の制御を行うことができる。なお、ＡＯＴＦ１０３に代えて、例えば音響光学変調器（ＡＯＭ）を用いることもできる。
【0013】
光学系１２０は、４つのレンズＬ１～Ｌ４と、ダイクロイックミラーＤＭと、ガルバノミラーＧＭと、２つのピンホールＰＨ１、ＰＨ２と、瞳投影レンズ１２２と、結像レンズ１２４と、対物レンズ１２６とを備える。なお、対物レンズ１２６には、駆動機構１２８が設けられており、対物レンズ１２６のＺ方向の位置を調整することができる。
【0014】
受光部１４０は、光電子増倍管ＰＭＴを有し、試料Ｓに含まれる細胞から発せられる蛍光の強度を計測する。
【0015】
可動ステージ１６０は、図２のＸＹ平面に平行な上面１６１Ｕを有するステージ１６１と、ステージ１６１をＸ方向及びＹ方向に移動させる移動機構１６２とを備えている。ステージ１６１の上面１６１Ｕには、試料Ｓが入ったウェルプレートＷＰが配置される。ウェルプレートＷＰは、透明な板状の部材であり、その表面には複数のくぼみ（ウェルＷ）が２次元的に配置されている。それぞれのウェルＷは、試験管またはシャーレとして利用することができる。移動機構１６２は、制御部２０の制御のもとで、ステージ１６１のＸ方向の位置、Ｙ方向の位置をそれぞれ調整することができる。これにより、ステージ１６１の上面１６１Ｕに置かれたウェルプレートＷＰの位置を調整することができ、ウェルプレートＷＰ内の所望のウェルＷに入れられた試料Ｓに対してレーザ光を照射することができる。
【0016】
制御部２０は、顕微鏡装置１０の各部（照明部１００、光学系１２０、受光部１４０、可動ステージ１６０）の動作を制御するための設定信号（調整信号）を顕微鏡装置１０に出力する調整部２１と、受光部１４０からの信号に基づいて後述の２次元画像を作製し、２次元画像に基づいて細胞の塊に含まれる細胞の数などの細胞情報を取得する取得部２２とを有する。後述の説明では、受光部１４０からの信号に基づく２次元画像を適宜、２次元マッピング画像と言い換えることができる。また、制御部２０は、入力部４０を通じて顕微鏡装置１０の各部に対する設定及び指示を受け付ける。制御部２０は顕微鏡装置１０の各部に対する設定及び指示を受け付けるための設定画面を表示部３０に表示させる。入力部４０は、各種指示情報を入力する不図示のマウス、キーボード、ジョイスティック、タッチパネルなどを有する。なお、入力部４０は、測定者による入力に限定されない。例えば、不図示の記憶部に入力部４０に入力する情報を記憶させておき、適宜記憶部の情報を各種指示情報として入力しても構わない。例えば、前回の基準位置での測定条件を記憶部に記憶させておき、適宜記憶部から調整部２１に入力するデータを作成させる構成が入力部４０にあっても構わない。したがって、マウスなどの指示情報を入力する構成も入力部４０に含まれるが記憶部も入力部４０に含まれても構わない。表示部３０は設定画面、指示画面、計測画面、計測結果などを表示する表示画面を有する。本実施形態において、入力部４０と、調整部２１を含む制御部２０とが協働して、顕微鏡装置１０の測定条件を設定する測定条件設定装置として機能する。
【0017】
制御部２０は、専用のハードウェアにより形成されていてもよく、パーソナルコンピュータに所定のプログラムを実装することにより形成されていてもよい。制御部２０と顕微鏡装置１０とは、必ずしも一体の装置として形成されていなくてもよい。例えば、制御部２０は、有線又は無線により顕微鏡装置１０に通信可能に接続されたコンピュータであってもよい。
【0018】
次に、顕微鏡装置１０のレーザ光の光路を説明する。３つのＣＷレーザ１０２から照射されたレーザ光は、いずれもＡＯＴＦ１０３に入射する。ＡＯＴＦ１０３は、所望の波長のレーザ光を選択的に透過させる。また、ＡＯＴＦ１０３は、レーザ光の強度（単に、レーザ強度ともいう）を調整する。ＡＯＴＦ１０３から照射されたレーザ光は、レンズＬ１に向かって直進する。レンズＬ１の焦点位置にはピンホールＰＨ１が配置されている。レンズＬ１及びピンホールＰＨ１を通過したレーザ光は、レンズＬ２を通った後、ダイクロイックミラーＤＭに入射する。ダイクロイックミラーＤＭは、ＣＷレーザ１０２からのレーザ光の波長帯域の光を反射し、それ以外の光を透過させる特性を有する。そのため、レーザ光はダイクロイックミラーＤＭで反射されて、ガルバノミラーＧＭに入射する。ガルバノミラーＧＭは、往復瑶動可能な走査ミラーであり、制御部２０により制御される。ガルバノミラーＧＭは、レーザ光を所定の１方向（例えば、Ｘ方向）に走査することができる。なお、図２においては、１つのガルバノミラーＧＭだけが図示されているが、２つのガルバノミラーを用いて、レーザ光を２方向（例えば、Ｘ－Ｙ方向）に走査することができる。また、ガルバノミラーに代えて、レゾナントスキャナを用いることもできる。
【0019】
ガルバノミラーＧＭを出たレーザ光は、瞳投影レンズ１２２、結像レンズ１２４を通った後、対物レンズ１２６に入射する。なお、ガルバノミラーＧＭは、対物レンズ１２６の瞳位置（出射瞳位置）と共役に配置される。対物レンズ１２６を出たレーザ光は可動ステージ１６０の上に置かれた試料Ｓに照射される。上述のように、試料Ｓは細胞の塊を含んでいる。試料Ｓに含まれる各細胞の核は、予め染料で染色されており、レーザ光が照射されることにより蛍光を発する。本実施形態においては、４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）により染色されている。なお、染色は細胞の核のみが染色されていても構わないし、細胞の核とそれ以外の構造が染色されていても構わない。また、細胞は染色されていない状態でも構わない。細胞が染色されていない状態では、例えば、細胞の内部の構造からの自家蛍光でも構わない。
【0020】
試料Ｓから戻ってきた蛍光は、対物レンズ１２６、結像レンズ１２４、瞳投影レンズ１２２、ガルバノミラーＧＭを逆にたどってダイクロイックミラーＤＭに入る。蛍光はダイクロイックミラーＤＭを透過して直進し、レンズＬ３に入射する。レンズＬ３の焦点位置にはピンホールＰＨ２が配置されている。ピンホールＰＨ２を通過した蛍光はレンズＬ４を通った後、受光部１４０に入って検出される。ここで、ピンホールＰＨ１、ＰＨ２は、対物レンズ１２６の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、ピンホールＰＨ２は、対物レンズ１２６の焦点位置からの光（蛍光、散乱光）のみを選択的に透過させることができる。これにより、ボケ像の原因となる光を遮断することができ、焦点位置からの光だけを検出することができる。
【0021】
制御部２０は、ガルバノミラーＧＭの駆動を制御することによってレーザ光の照射位置（焦点位置）をＸ－Ｙ方向に走査することができる。これにより、制御部２０は、レーザ光をＸ－Ｙ平面での各位置に照射したときに、各位置で受光部１４０で蛍光の強度を受光する。このため、Ｘ－Ｙ平面の強度分布を取得することができ、Ｘ－Ｙ平面の強度分布を２次元画像として取得することができる。さらに、制御部２０は、対物レンズ１２６に設けられた駆動機構１２８を制御することによって、対物レンズ１２６のＺ方向の位置を調整することができる。言い換えると、制御部２０は、レーザ光の焦点面のＺ方向の位置（以下、単にＺ位置という）を調整することができる。これにより、制御部２０は、レーザ光の焦点面のＺ位置を調整しつつ、各Ｚ位置において、Ｘ－Ｙ平面の蛍光の強度分布の２次元マッピングを取得することができる。以下の説明において、レーザ光の焦点面のＺ位置を設定し、そのＺ位置において、Ｘ－Ｙ平面の蛍光の強度分布の２次元マッピング画像を取得することを、Ｚスライスを実行すると呼ぶ。後述の説明においては、各Ｚ位置におけるＸ－Ｙ平面の２次元画像を、Ｚスライス画像と呼ぶ。また、レーザ光の焦点面のＺ位置を所定の範囲にわたって移動させつつ、複数のＺ位置においてＺスライスを実行することを、Ｚスタックを実行すると呼ぶ。したがって、Ｚスタックを実行すると、Ｚ位置の異なる複数枚のＺスライス画像を取得することができる。
【0022】
Ｚ方向において、細胞の塊全体をカバーするようにＺスタックを実行し、得られた複数枚のＺスライス画像から、後述のように、細胞の塊に含まれる細胞の数を計数することができる。各Ｚ位置におけるＺスライス画像から、細胞の数を正確に計数するためには、得られたＺスライス画像が各細胞の核を弁別できる程度に鮮明でなければならない。細胞の塊の内部において、入射する光の散乱が細胞の塊のＺ位置に応じて異なるために、Ｚ位置ごとに設定パラメータを調整していた。例えば、Ｚスライス画像を鮮明にするために、ユーザが各Ｚスライスを実行する毎に、レーザ強度、光電子増倍管ＰＭＴのゲインなどの顕微鏡装置１０の設定パラメータを調整していた。設定パラメータの詳細については後述する。しかしながら、各Ｚスライスを実行する毎に設定パラメータの調整を行うのは時間がかかる。また、Ｚスライス画像を調整する場合に、調整するための指標がないことから、ユーザの熟練度の差によっては、得られるＺスライス画像の鮮明さが大きく異なることがあり、解析結果の定量性が担保されないという問題があった。
【0023】
これに対して、本実施形態における計数装置１は、調整部２１及び取得部２２を有する制御部２０を備えているため、以下に示されるように、顕微鏡装置１０の設定パラメータを自動的に設定することができる。
【0024】
次に、計数装置１を用いて、細胞の塊に含まれる細胞の数を計数する方法について図３を参照しつつ説明する。ウェルＷに細胞の塊を入れたウェルプレートＷＰを、ステージ１６１に配置する（Ｓ１０１）。変数ｉを１に設定し（Ｓ１０２）、ｉ番目のウェルＷに入れられた細胞の塊を測定できるように、ステージ１６１のＸ位置及びＹ位置を調整する（Ｓ１０３）。変数ｉが１である場合（Ｓ１０４：Ｙｅｓ）、レーザ光の焦点面が以下に説明する基準面ＢＰと同じになるように、対物レンズ１２６のＺ位置を調整する（Ｓ１０５）。
【0025】
なお、図１に示されるように、細胞の塊のウェルＷと接触する部分は、ウェルＷに沿って外側に広がってしまう。そのため、細胞の塊は、ウェルＷと接触する部分よりも少し上側においてくびれた形状となる。本実施形態においては、後述のように、基準面ＢＰにおいて顕微鏡装置１０の可変パラメータＰｖの初期値を決定している。レーザ光の強度を確保する観点からは、対物レンズ１２６から最も近い位置である、細胞の塊のウェルＷと接触する部分に基準面ＢＰを設定することが考えられる。しかしながら、細胞の塊の、ウェルＷと接触する部分に含まれる細胞は、他の部分に含まれる細胞と比べて、細胞の状態が変わっている恐れがある。そこで、本実施形態においては、細胞の塊の、ウェルＷと接触する部分よりも少し上側の、くびれた形状の部分を通るように基準面ＢＰを設定する。基準面ＢＰは細胞の塊のウェルＷと接触する部分から例えば１０μｍより下側のＺ位置に設定される。基準面のＺ位置は１０μｍより下側に限られず、レーザ光の強度が確保できれば、それ以外のＺ位置でも構わない。また、基準面ＢＰは細胞の塊のウェルＷと接触する部分から例えば５μｍより離れた上側のＺ位置に設定される。また、細胞の塊のウェルＷと接触する部分の細部が他の部分に含まれる細胞の状態と変わっていない場合には、細胞の塊のウェルと接触する部分を基準面ＢＰとして設定しても構わない。また、細胞の核がより多く撮像できる位置を基準面ＢＰとして設定しても構わない。
【0026】
なお、基準面ＢＰを設定する際に、適宜の設定パラメータで、Ｚスタックを実行して、各Ｚ位置における細胞の塊の輪郭を取得し、細胞の塊の外形を求めてもよい。この場合においては、各Ｚ位置における細胞の塊の輪郭が取得できればよいため、必ずしも各細胞に含まれる核を弁別できる程度の鮮明なＺスライス画像が取得できなくても問題ない。また、測定できている輪郭から細胞の塊を推定し、その推定した細胞の塊から、細胞の基準面ＢＰを推定しても構わない。細胞の塊の輪郭は一部測定ができない場合があっても構わない。
【0027】
レーザ光の焦点面が基準面ＢＰと同じになるように、対物レンズ１２６のＺ位置を調整した後、後述の手順により顕微鏡装置１０の可変パラメータＰｖの初期値を決定する（Ｓ１０６）。次に、レーザ光の焦点面のＺ位置をＺスタックの開始位置に設定し（Ｓ１０７）、後述の手順により、ｉ番目のウェルＷに入れられた細胞の塊に対してＺスタックを実行する（Ｓ１０８）。Ｚスタックが終了したら、直前のＺスタックが最後のウェルＷに対して行われたかどうかを判定する（Ｓ１０９）。最後のウェルＷに対するＺスタックが終了していない場合には（Ｓ１０９：Ｎｏ）、変数ｉをインクリメントしてステップＳ１０３に戻る。なお、ステップＳ１０４において、変数ｉが１ではない場合には、ステップＳ１０５、Ｓ１０６を省略してステップＳ１０７に進む。ステップＳ１０９において、最後のウェルＷに対するＺスタックが終了したと判断された場合には（Ｓ１０９：Ｙｅｓ）、測定を終了する。
【0028】
次に、上述のステップＳ１０６の処理、すなわち、顕微鏡装置１０の可変パラメータＰｖの初期値を決定するための処理（以下、初期値決定処理という）について、図４、５を参照しつつ説明する。
【0029】
顕微鏡装置１０の設定パラメータとして、例えば、レーザ強度、撮影速度、アベレージ回数、ゲインなどが挙げられる。レーザ強度は、照明部１００から照射されるレーザ光の強度であり、上述のようにＡＯＴＦ１０３を用いて調整できる。レーザ強度を高くするほど蛍光が明るくなるため、得られるＺスライス画像が鮮明になる。しかしながら、レーザ強度を高く設定しすぎるとレーザ光を照射される細胞の塊に損傷を与える恐れがある。撮影速度は、ガルバノミラーＧＭの走査速度に対応する。ガルバノミラーＧＭの走査速度が低い場合には、所定の測定時間に光電子増倍管ＰＭＴに入射する光子の数（フォトン数）が多くなるため、得られるＺスライス画像が鮮明になる。しかしながら、撮影速度を低くすると、Ｚスライス（及びＺスタック）の実行にかかる時間が長くなってしまう。アベレージ回数は、１つのＺスライスにおいて平均化処理されるＺスライス画像の枚数である。アベレージ回数分のＺスライス画像を平均化処理することにより、得られるＺスライス画像を鮮明にすることができる。アベレージ回数を多くしすぎた場合にも、Ｚスライス（及びＺスタック）の実行にかかる時間が長くなってしまう。ゲインは光電子増倍管ＰＭＴの感度であり、光電子増倍管ＰＭＴに印加する印加電圧によって調整できる。ゲインを高くすれば蛍光強度が弱い場合（フォトン数が少ない時）であっても検出できるようになり、ゲインを低くすれば蛍光強度が強い場合であっても輝度の飽和を防ぐことができる。これらの設定パラメータは、調整部２１により設定される。なお、これらの設定パラメータの全てが調整部２１により設定されてもよく、これらの設定パラメータのうち、少なくとも１つが調整部２１により設定されてもよい。
【0030】
図４に示されるように、初期値決定処理においては、まず、調整部２１は、上述の設定パラメータの中から、可変パラメータＰｖを選択する（Ｓ２０１）。選択した可変パラメータＰｖ以外の設定パラメータについては、固定パラメータとし、適宜の値に設定する。以下の説明においては、可変パラメータＰｖとしてレーザ強度Ｉが選択されたものとする。
【0031】
次に、調整部２１は、選択された可変パラメータＰｖについて、その上限値、下限値及び変化幅Δを決定し（Ｓ２０２）、可変パラメータＰｖの値を下限値に設定する（Ｓ２０３）。ここで、調整部２１は、制御部２０の不図示のメモリに記憶されたテーブルに基づいて、選択された可変パラメータＰｖの上限値、下限値、変化幅Δを決定してもよい。あるいは、調整部２１は、入力部４０を通じて、ユーザが入力した値に基づいて、選択された可変パラメータＰｖの上限値、下限値、変化幅Δを決定してもよい。次に、調整部２１が顕微鏡装置１０にＺスライスを実行させて、取得部２２が基準面ＢＰにおけるＺスライス画像を取得する（Ｓ２０４）。そして、取得部２２は、取得したＺスライス画像に基づいて核の数をカウントする（Ｓ２０５）。例えば、取得部２２は、Ｚスライス画像において、輝度の等高線を作製し、一定の輝度以上の部分が核に対応すると判断することができ、核に対応する部分（以下、単に核部分と呼ぶ）の数を計数することで核の数をカウントすることができる。
【0032】
次に調整部２１は、可変パラメータＰｖの値を、変化幅Δだけ変化させて（Ｓ２０６）、可変パラメータＰｖの値が上限値以下であるかどうかを判定する（Ｓ２０７）。可変パラメータの値が上限値以下である場合（Ｓ２０７：ＹＥＳ）には、調整部２１は、ステップＳ２０６において変化幅Δだけ変化させた可変パラメータＰｖの値を用いて、顕微鏡装置１０にＺスライスを実行させ、取得部２２は基準面ＢＰにおけるＺスライス画像を再度取得する（Ｓ２０８）。そして、取得部２２は、取得したＺスライス画像に基づいて核の数をカウントする（Ｓ２０９）。次に、取得部２２は、前回のＺスライスに基づいて算出された核の数と、今回のＺスライスに基づいて算出された核の数とを比較して、これらの変化がゼロであるかどうかを判定する（Ｓ２１０）。なお、ユーザが別の方法により、予め核の数をカウントしている場合には、ステップＳ２１０の処理において、取得部２２は、ユーザがカウントした核の数と、今回のＺスタックに基づいて算出された核の数とが同じであるかどうかを判断してもよい。
【0033】
上述のように、ステップＳ２０１において、調整部２１はレーザ強度Ｉを可変パラメータＰｖとして選択している。この場合には、図５に示されるように、レーザ強度Ｉを増やしていくと、それに伴って、Ｚスライスに基づいて算出される核の数は一定値に収束する。これは、レーザ強度Ｉを増加させることによって、Ｚスライスによって取得されるＺスライス画像が鮮明になり、核の検出精度が上がるからである。しかしながら、レーザ強度Ｉが、Ｚスライス画像に含まれる全ての細胞の核が検出できる程度に強くなると、それ以上レーザ強度Ｉを増加させてもＺスライス画像において検出される核の数は一定となる。なお、必要以上に強いレーザ強度のレーザ光を細胞の塊に照射すると、細胞の塊に含まれる細胞が損傷する恐れがある。そこで、前回のＺスライスに基づいて算出された核の数と、今回のＺスライスに基づいて算出された核の数とを比較して、これらの変化がゼロである場合（Ｓ２１０：ＹＥＳ）には、調整部２１は前回のＺスライスを実行する際に用いた可変パラメータＰｖの値を、可変パラメータＰｖの初期値に決定して（Ｓ２１１）、初期値決定処理を終了する。
【0034】
なお、前回のＺスライスに基づいて算出された核の数と、今回のＺスライスに基づいて算出された核の数とを比較して、これらの変化がゼロでない場合（Ｓ２１０：ＮＯ）には、ステップＳ２０６の処理に戻り、調整部２１は可変パラメータＰｖの値を、変化幅Δだけ変化させる（Ｓ２０６）。そして、調整部２１は可変パラメータＰｖの値が上限値以下であるかどうかを再度判定する（Ｓ２０７）。可変パラメータの値が上限値を超える場合（Ｓ２０７：ＮＯ）には、ステップＳ２１１の処理に進み、調整部２１は前回の（最後の）Ｚスライスを実行する際に用いた可変パラメータＰｖの値を、可変パラメータＰｖの初期値に決定して（Ｓ２１１）、初期値決定処理を終了する。または、よりカウントの精度を上げるためには、ステップＳ２０２で決めた上限、下限、変化幅Δでパラメータを変化させて、複数枚画像を撮影して、図５下図の様なレーザ強度と核カウントの関係図を実際に作成して、そこから核カウント個数が一定になる最小のレーザ強度Ｉを初期値に決定して、初期値決定処理を終了してもよい。レーザ強度と核カウントの関係図を表示してユーザがレーザ強度を指定してもよい。
【0035】
このような初期値決定処理を実行することにより、ユーザの熟練度の差にかかわらず、可変パラメータＰｖの初期値が自動的に決定される。最後に、Ｐｖパラメータの初期値にて撮影したＢＰ面のＺスライス画像から、基準の核密度を計算する。核密度とは、Ｚスライス画像から算出した核の個数を同じＺスライス画像から算出した細胞の塊の断面積で割った数値である。一般的なスフェロイド、オルガノイドは核密度は場所に依らず一定であるので、基準の核密度から大きくズレた場合は、適切な画像が撮影できていないと判定をすることができる。Ｓ１０８に進む前に、核密度の適正範囲を決めておく。
【0036】
次に、上述のステップＳ１０８の処理（以下、Ｚスタック実行処理という）について、図６を参照しつつ説明する。まず、焦点面の位置がＺスタックの開始位置となるように、調整部２１は対物レンズ１２６のＺ位置を調整する（Ｓ３０１）。なお、Ｚスタックが実行される際には、調整部２１は、細胞の塊とウェルＷとの境界面（ウェルＷの上面）から離れる向きに焦点面のＺ位置をずらしていくので、調整部２１は、Ｚスタックの開始位置を、細胞の塊とウェルＷとの境界面近傍に設定する。
【0037】
次に、調整部２１が顕微鏡装置１０にＺスライスを実行させ、取得部２２は設定されたＺ位置におけるＺスライス画像を取得する（Ｓ３０２）。取得部２２は、取得されたＺスライス画像において輝度の等高線を作製して、核部分を弁別するとともに、核部分の輝度の平均値を算出する（Ｓ３０３）。調整部２１は、算出された核部分の輝度の平均値に基づいて、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを決定する（Ｓ３０４）。上述のように、可変パラメータＰｖの初期値は、細胞の塊とウェルＷとの境界面から大きく離れていない基準面ＢＰにおいて決定されている。１回目のＺスライスは、基準面ＢＰにおいて決定された可変パラメータＰｖの初期値を用いて実行されているので、得られたＺスライス画像における核部分の輝度の平均値は十分な大きさとなる。そこで、調整部２１は、２回目のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを、１回目のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉと同じ値に設定する。
【0038】
次に、取得部２２は、取得されたＺスライス画像に基づいて、核密度を算出し、算出された核密度が適正範囲内にあるかどうかを判定する（Ｓ３０５）。ここでも、１回目のＺスライスは、基準面ＢＰにおいて決定された可変パラメータＰｖの初期値を用いて実行されているので、算出された核密度は適正範囲内にある。算出された核密度が適正範囲内にある場合に（Ｓ３０５：ＹＥＳ）には、調整部２１は、前回行われたＺスライスが最後のＺ位置に対応するかどうかを判断する（Ｓ３０６）。前回行われたＺスライスが最後のＺ位置でない場合（Ｓ３０６：Ｎｏ）には、上述のステップＳ３０１に戻って、調整部２１は、次のＺ位置になるように対物レンズ１２６のＺ位置を調整する。そして、再び、調整部２１が顕微鏡装置１０にＺスライスを実行させ、取得部２２は設定されたＺ位置におけるＺスライス画像を取得する（Ｓ３０２）。そして、上述のように、取得部２２は、取得されたＺスライス画像において輝度の等高線を作製して、核部分を弁別するとともに、核部分の輝度の平均値を算出する（Ｓ３０３）。そして、調整部２１は、算出された核部分の輝度の平均値に基づいて、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを決定する（Ｓ３０４）。
【0039】
なお、図５において点線で示されるように、焦点面のＺ位置が細胞の塊とウェルＷとの境界面（ウェルＷの上面）から離れるにつれて、徐々に焦点面までレーザ光が届きにくくなり、それにつれて蛍光の輝度が小さくなる。そのため、取得されたＺスライス画像において、核部分の輝度の平均値が小さくなることがある。そこで、ステップＳ３０４の処理において、核部分の輝度の平均値が前回のＺスタックにおける核部分の輝度の平均値よりも一定割合以上小さくなっている場合には、調整部２１は、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを前回のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉよりも大きくすることができる。ここで、制御部２０は、核部分の輝度の平均値とレーザ強度Ｉとの相関に関する情報を、テーブルとして不図示のメモリに保持していてもよい。調整部２１は、制御部２０の不図示のメモリに記憶されたテーブルを参照して、核部分の輝度の平均値の落ち込みに基づいて、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを決定してもよい。あるいは、調整部２１は、入力部４０を通じて、ユーザが入力した値に基づいて、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを決定してもよい。
【0040】
そして、上述のように、取得部２２は、取得されたＺスライス画像に基づいて、核密度を算出し、算出された核密度が適正範囲内にあるかどうかを判定する（Ｓ３０５）。取得部２２は、算出された核密度が適正範囲内にある場合（Ｓ３０５：ＹＥＳ）には、取得されたＺスライス画像において、正常に核部分を弁別できていると判断して、上述のようにステップＳ３０６に進む。なお、取得部２２は、算出された核密度が適正範囲内にあると判断していても、ステップＳ３０３、Ｓ３０４において、調整部２１が、次のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉを前回のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉよりも大きくするように判断していることがある。この場合には、調整部２１は、レーザ強度Ｉを前回のＺスライスにおけるレーザ強度Ｉよりも大きくして、顕微鏡装置１０に次のＺスライスを実行させる。これにより、次のＺスライスにおいて、Ｚスライス画像における核部分の輝度の平均値を大きくすることができる。
【0041】
なお、Ｚスライス画像における核部分の輝度の平均値が十分でなく、正常に核部分を弁別することできなくなった場合には、算出される核密度の値が適正範囲から外れて、異常な値になってしまう。そこで、取得部２２が、算出された核密度が適正範囲内に無いと判断した場合（Ｓ３０５：Ｎｏ）には、調整部２１は、レーザ強度Ｉを次のＺスライスで設定する予定であるレーザ強度Ｉまで強くして、顕微鏡装置１０にＺスライスを再度実行させる。これにより、再度実行するＺスライスにおいて、Ｚスライス画像における核部分の輝度の平均値を大きくすることができる。
【0042】
上記実施形態にかかる計数装置１において、調整部２１及び取得部２２が初期値決定処理を実行するができる。これにより、ユーザの熟練度の差にかかわらず、可変パラメータＰｖの初期値を自動的に決定することができる。
【0043】
以上説明した実施形態は、あくまでも例示であって、請求の範囲に係る発明を限定するものではない。また、上記の実施形態の中で説明された特徴の組み合わせの全てが必須であるとは限らない。また、上記実施形態には種々の変更を加えることが可能である。以下に、実施形態の変更形態について説明する。
【0044】
上記説明においては、細胞の塊の、ウェルＷと接触する部分よりも少し上側の、くびれた形状の部分を通るように基準面ＢＰを設定していた。しかしながら本実施形態はそのような態様には限られず、核を弁別可能なＺスライス画像が得られる限りにおいて、基準面ＢＰを任意のＺ位置に設定しうる。
【0045】
以上の説明において、調整部２１は、可変パラメータＰｖとしてレーザ強度Ｉを選択していたが、他の設定パラメータを選択することもできる。例えば、アベレージ回数を可変パラメータＰｖとして設定した場合には、取得部２２は、１つのＺスライスにおいて、１、２、４、８、１６、３２回などの回数で取得したＺスライス画像をそれぞれ平均化処理し、各回数で取得された平均化処理されたＺスライス画像に基づいて核の数をカウントする（Ｓ２０４、Ｓ２０５）。そして、調整部２１は、核の数のカウントが一定となるアベレージ回数を取得することにより、可変パラメータＰｖの初期値を所得することができる（Ｓ２１０、Ｓ２１１）。
【0046】
上記説明において、照明部１００は、波長４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍの３つのＣＷレーザ１０２を備えていたが、ＣＷレーザの数、及び波長は上記実施形態の例には限られず、任意に設定しうる。また、顕微鏡装置１０は、光源としてレーザ光源を備えた共焦点レーザ顕微鏡であったが、本実施形態はこのような形態には限られず、例えば、多光子励起顕微鏡であってもよく、薄いシート状に成形した励起光を試料側面から照射する光シート顕微鏡であってもよい。また、例えば、ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：光干渉断層撮影）でも構わない。
【0047】
上記説明においては、Ｚスタック実行処理において、取得部２２は、取得されたＺスライス画像に基づいて、核密度を算出し、算出された核密度が適正範囲内にあるかどうかを判定していた。しかしながら、必ずしも核密度に基づいてステップＳ３０５の判断を行う必要はない。例えば、取得部２２は、核の周囲長の分布を算出し、その分布が想定される範囲を超えて異常な分布になっていないかどうかを判定してもよい。あるいは、核部分の輝度と、核以外の部分の輝度の比を算出し、輝度の比が一定値以上であるかどうかを判断してもよい。
さらに、上記の説明においては、細胞の構造体として細胞の核を例に挙げて説明してきたが、細胞の構造体は核に限られない。例えば、リソソーム、ゴルジ体、ミトコンドリアなどの細胞小器官（オルガネラ）や、タンパク質、セカンドメッセンジャー、ｍＲＮＡ、遺伝子などでも構わない。
さらに、上記の説明においては、細胞の構造体として細胞の核を例に挙げて説明してきたが、細胞の構造体は核に限られない。例えば、リソソーム、ゴルジ体、ミトコンドリアなどの細胞小器官（オルガネラ）や、タンパク質、セカンドメッセンジャー、ｍＲＮＡ、遺伝子などでも構わない。
【0048】
上記説明においては、細胞の塊のＺ軸方向において、異なる位置における顕微鏡装置１００の設定パラメータを調整したが、これに限られない。例えば、細胞の塊のＸ軸方向において、異なる位置における顕微鏡装置１００の設定パラメータを調整しても構わない。また、例えば、細胞の塊のＹ軸方向において、異なる位置における顕微鏡装置１００の設定パラメータを調整しても構わない。もちろん、これらのＸ軸方向、Ｙ軸方向、Ｚ軸方向を単独の軸方向において、設定パラメータを調整しても構わないし、Ｘ軸方向、Ｙ軸方向、Ｚ軸方向のそれぞれを適宜組み合わせても構わない。例えば、細胞塊の同じＺ位置のＸＹ平面の所定位置における設定パラメータを用い、所定位置とは異なる位置での設定パラメータの設定に用いても構わない。
【0049】
上記説明においては、試料Ｓとして、細胞が一様に分布した細胞の塊（図１参照）を例に挙げて説明してきたが、本実施形態において、測定対象となる試料は、細胞が一様に分布した細胞の塊には限られない。例えば、図７に示されるように、試料Ｓが、内部に血管を含んだ細胞の塊であってもよい。この場合においても、Ｚスタック実行処理において、取得部２２は、必ずしも核密度に基づいてステップＳ３０５の判断を行う必要はない。血管の分布に応じて、核密度が一定にはならないからである。そこで、取得部２２は、上述のように、核の周囲長の分布を算出し、その分布が想定される範囲を超えて異常な分布になっていないかどうかを判定してもよい。あるいは、核部分の輝度と、核以外の部分の輝度の比を算出し、輝度の比が一定値以上であるかどうかを判断してもよい。
【0050】
また、さらに、上記の説明においては、細胞の構造体として、細胞の内部の構造を例に挙げて説明したがこれに限られない。例えば、細胞情報の一例として、図８に示されているような、神経細胞における、細胞表面の細胞の構造体である樹状突起スパインの数が挙げられる。本実施形態にかかる計数装置１は、図８に示されているような、複数の樹状突起スパインを含む神経細胞を試料Ｓとして、樹状突起スパインの数をカウントすることにも適用することができる。なお、樹状突起スパインは、予め適当な染料により染色されている。この場合には、Ｚスタック実行処理において、取得部２２は、必ずしも樹状突起スパインの密度に基づいてステップＳ３０５の判断を行う必要はない。樹状突起スパインの、密度は必ずしも一定であるとは限らないからである。そこで、取得部２２は、上述の場合と同様に、樹状突起スパインの周囲長の分布を算出し、その分布が想定される範囲を超えて異常な分布になっていないかどうかを判定してもよい。あるいは、樹状突起スパインの輝度と、それ以外の部分の輝度の比を算出し、輝度の比が一定値以上であるかどうかを判断してもよい。
【0051】
なお、画像を測定する目的は、細胞の塊の中の細胞の数を測定する目的に限られない。細胞の塊の中の所定位置の画像を鮮明に取得する目的でも構わない。例えば、細胞の塊の中に所定の細胞の画像を解析することで、細胞の塊の中の細胞の状態を調べる場合において、細胞の塊の状態を適切に評価することできる。例えば、細胞の塊に注入された薬剤の、細胞の塊の内部での薬剤の細胞に対する効果を正しく評価することができる。
【0052】
上述の実施形態において、顕微鏡装置１０の各構成要素（照明部１００、光学系１２０、受光部１４０、可動ステージ１６０）の構造、配置等は適宜変更しうる。例えば、上記実施形態においては、光学系１２０について具体的な光学素子を示しつつ説明したが、本教示はこのような形態には限られず、光学系１２０を構成する光学素子の数、種類、配置等を適宜変更しうる。また、上記実施形態において、計数装置１は、顕微鏡装置１０と、顕微鏡装置１０の測定条件を設定する測定条件設定装置として機能する調整部２１及び入力部４０とを備えていた。そのため、上記実施形態においては、調整部２１及び入力部４０は、同じ計数装置１に含まれる顕微鏡装置１０の測定条件を設定する測定条件設定装置として機能していたが、そのような態様には限られない。例えば、調整部２１及び入力部４０が、独立に設けられた別の顕微鏡装置の測定条件を設定するように構成されていてもよい。
【0053】
以上、添付図面を参照しながら、本発明に係る好適な実施形態や変形例について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。前述の実施形態の各構成要素は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令が許容される限りにおいて、前述の各実施形態及び変形例などに関するすべての公開広報および米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。前述した実施形態に基づいて当業者等によりなされる他の実施形態及び運用技術等は、すべて本実施形態の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【0054】
１ 計数装置
１０ 顕微鏡装置
２０ 制御部
３０ 表示部
４０ 入力部
１００ 照明部
１２０ 光学系
１４０ 受光部
１６０ 可動ステージ
１０ 顕微鏡装置
２０ 制御部
３０ 表示部
４０ 入力部
１００ 照明部
１２０ 光学系
１４０ 受光部
１６０ 可動ステージ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】