知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許7380906顕微鏡装置、顕微鏡装置の試料屈折率測定方法、および顕微鏡装置の試料屈折率測定プログラム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-07
(45)【発行日】2023-11-15
(54)【発明の名称】顕微鏡装置、顕微鏡装置の試料屈折率測定方法、および顕微鏡装置の試料屈折率測定プログラム
(51)【国際特許分類】
G02B 21/00 20060101AFI20231108BHJP
G02B 21/36 20060101ALI20231108BHJP
G02B 21/06 20060101ALI20231108BHJP
【ＦＩ】
G02B21/00
G02B21/36
G02B21/06
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022553548
(86)(22)【出願日】2021-08-25
(86)【国際出願番号】 JP2021031109
(87)【国際公開番号】W WO2022070689
(87)【国際公開日】2022-04-07
【審査請求日】2022-12-05
(31)【優先権主張番号】P 2020165984
(32)【優先日】2020-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】100092897
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 正悟
(74)【代理人】
【識別番号】100157417
【弁理士】
【氏名又は名称】並木 敏章
(72)【発明者】
【氏名】新谷 大和
【審査官】瀬戸 息吹
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－０２６６６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０１８０４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０９７５８７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０２Ｂ １９／００ － ２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、
前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、
前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、
前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、
前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する演算制御部と、を備える顕微鏡装置。
【請求項2】
前記演算制御部は、前記試料の屈折率と、前記照明光学系及び前記検出光学系の少なくとも一方の光軸に沿った前記試料の深さ位置の変化量に対する前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量の変化量の比との関係を示す第１の情報を特定し、
前記試料の深さ方向の複数の深さ位置それぞれにおける、前記部材を第１の状態から第２状態に変更した際の前記ずれ量を示す第２の情報を、前記検出光に基づいて求め、
前記第２の情報に基づき、前記深さの変化量と前記ずれ量の変化量との比を示す第３の情報を算出し、
前記第１の情報と前記第３の情報とに基づき、前記試料の屈折率を算出する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項3】
前記演算制御部は、前記試料の深さ方向に、前記試料を分割し、前記分割した領域ごとに前記屈折率を算出する請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項4】
前記検出光学系は、対物レンズを含み、前記対物レンズを含む光学系の収差を補正する収差補正部を備え、
前記演算制御部は、
前記試料の屈折率と、前記深さ位置の変化量に対する前記収差補正部の補正量の変化量の比との関係を示す第４の情報を特定し、
前記試料の深さ方向の第１の位置における、前記収差補正部の補正量を示す第５の情報を、前記検出光に基づいて求め、
前記試料の深さ方向の第２の位置における、前記収差補正部の最適補正量を示す第６の情報を、前記第４の情報及び前記第５の情報、前記分割した領域ごとの屈折率、および前記分割した領域の各境界面位置に関する情報に基づき算出する請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項5】
前記試料と前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸に沿って相対移動させることが可能な駆動部を備え、前記演算制御部は、
前記第６の情報に基づき前記収差補正部を制御し、前記駆動部を制御して、前記試料の深さ方向の１以上の深さ位置での前記試料の画像を、前記検出光に基づいて生成する請求項４に記載の顕微鏡装置。
【請求項6】
前記検出光学系は、対物レンズを含み、前記対物レンズを含む光学系の収差を補正する収差補正部を備え、
前記演算制御部は、
前記収差補正部を制御し、前記対物レンズの光軸に沿った前記試料の深さ方向の第１の深さ位置における前記収差を補正し、
前記試料の屈折率と、前記深さ位置の変化量に対する前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量の変化量の比との関係を示す第７の情報を特定し、
前記試料の深さ方向の前記第１の深さ位置とは異なる第２の深さ位置における、前記部材が挿脱又は制御された際の前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量を示す第８の情報を、前記検出光に基づいて求め、
前記第８の情報と、前記第１の深さ位置に関する情報と、前記第２の深さ位置に関する情報とに基づき、前記深さ位置の変化量と前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量の変化量との比を示す第９の情報を算出し、
前記第７の情報と前記第９の情報とに基づき、前記試料の屈折率を算出する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項7】
前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量が、前記照明光学系及び前記検出光学系の少なくとも一方の光軸方向のずれ量である請求項１～６のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項8】
前記集光位置及び前記結像位置の少なくとも一方のずれ量が、前記照明光学系及び前記検出光学系の少なくとも一方の光軸と垂直な方向のずれ量である請求項１～６のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項9】
前記演算制御部は、
前記部材が第１の状態にあるときにおける、前記試料の深さ方向の所定の複数の位置での前記試料の画像である第１の画像群を、前記検出光に基づいて生成し、
前記部材が第２の状態にあるときにおける、前記所定の複数の位置での前記試料の画像である第２の画像群を、前記検出光に基づいて生成し、
前記第１の画像群と前記第２の画像群との間の前記深さ方向の倍率に基づき、前記試料の屈折率を算出する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項10】
光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、演算制御部とを備える顕微鏡装置での試料屈折率測定方法であって、前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する顕微鏡装置の試料屈折率測定方法。
【請求項11】
光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、演算制御部とを備える顕微鏡装置での試料屈折率測定プログラムであって、コンピュータに、前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する処理を実行させる顕微鏡装置の試料屈折率測定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、顕微鏡装置、顕微鏡装置の試料屈折率測定方法、および顕微鏡装置の試料屈折率測定プログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
球面収差を補正する補正装置を用いて、試料の任意の部位の屈折率を算出する技術が知られている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１７－０２６６６５号公報（対応ＵＳ２０１７／０１７０７１）
【発明の概要】
【0004】
第１の態様に係る顕微鏡装置は、光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する演算制御部と、を備える。
【0005】
第２の態様に係る顕微鏡装置の試料屈折率測定方法は、光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、演算制御部とを備える顕微鏡装置での試料屈折率測定方法であって、前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する。
【0006】
第３の態様に係る顕微鏡装置の試料屈折率測定プログラムは、光源からの照明光を試料に導く照明光学系と、前記試料からの検出光を検出する検出部と、前記試料からの前記検出光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方に設けられる部材と、前記部材を挿脱又は制御することにより、前記照明光学系の光軸に交わる面内における前記照明光の断面形状及び前記検出光学系の光軸に交わる面内における前記検出光の断面形状の少なくとも一方を変化させる切替部と、演算制御部とを備える顕微鏡装置での試料屈折率測定プログラムであって、コンピュータに、前記切替部による前記部材の挿脱又は制御に伴う、前記照明光の集光位置及び前記検出光の結像位置の少なくとも一方のずれ量に関する情報を算出し、前記ずれ量に関する情報に基づき、前記試料の屈折率を算出する処理を実行させる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】第１実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図2】第１実施形態に係る対物レンズの位置の変化に対する観察深さの変化を示す説明図である。
【図3】第１実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。
【図4】第１実施形態に係る２つのマスクパターンを示す模式図である。
【図5】マスクパターンと励起光（照明光）の集光位置のずれ量との関係を説明する模式図である。
【図6】第１実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図7】第１実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。
【図8】試料屈折率ごとの、対物レンズz位置とマスクパターンを切り替えたときの励起光（照明光）の集光位置および蛍光（検出光）の結像位置の少なくとも一方のずれ量との関係を示す模式図である。
【図9】観察深さ等を設定する際に用いられるＧＵＩの一例を示す模式図である。
【図10】第１実施形態に係るマスクパターンＭＰ１のときの所定の対物レンズz位置での試料画像と、マスクパターンＭＰ２のときの複数の対物レンズz位置での試料画像の一例を示す模式図である。
【図11】第１実施形態に係る対物レンズz位置と相関値との関係を示すグラフである。
【図12】第１実施形態に係る対物レンズz位置とｚ方向のフォーカス位置のずれ量との関係を示すグラフである。
【図13】第２実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図14】第２実施形態に係る共焦点顕微鏡における収差補正部の拡大図である。
【図15】第２実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。
【図16】第２実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図17】第２実施形態に係る対物レンズz位置とｚ方向のフォーカス位置のずれ量との関係を示すグラフである。
【図18】第２実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。
【図19】第２実施形態に係る補正環位置決定処理における評価値の一例を示すグラフである。
【図20】第３実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図21】第３実施形態に係る対物レンズz位置とｚ方向のフォーカス位置のずれ量との関係を示すグラフである。
【図22】第３実施形態に係る対物レンズz位置と試料屈折率との関係を示す図である。
【図23】第４実施形態に係る２つのマスクパターンを示す模式図である。
【図24】球面収差を有する波面の形状と、波面をｘ方向に微分したときの形状を示す模式図である。
【図25】第４実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図26】第４実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。
【図27】第４実施形態に係る対物レンズz位置とｘｙ方向の励起光（照明光）の集光位置および蛍光（検出光）の結像位置の少なくとも一方のずれ量との関係を示すグラフである。
【図28】第５実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図29】第５実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。
【図30】第５実施形態に係る２つのマスクパターンそれぞれに対応するｘｚ断面画像を示す模式図である。
【図31】第６実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。
【図32】第６実施形態に係る（Ａ）は観察深さと補正環の最適な回転位置との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は観察深さと対物レンズの最適な位置との関係を示すグラフであり、（Ｃ）は補正環の回転位置が一定の場合における観察深さと対物レンズの位置との関係を示すグラフである。
【図33】観察深さと、補正環の最適な回転位置と、対物レンズの最適な位置との関係を示す説明図である。
【図34】観察深さと、補正環の最適な回転位置と、補正環の回転位置が一定の場合における対物レンズの位置との関係を示す説明図である。
【図35】第６実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。
【図36】第６実施形態に係る対物レンズの焦点が、補正環の最適補正環位置を実験的に求める観察深さの位置にある状態を示す模式図である。
【図37】第６実施形態に係る画像取得パラメータ等を入力する際に用いられるＧＵＩの一例を示す図である。
【図38】第６実施形態に係るパラメータリストを示す模式図である。
【図39】第６実施形態に係る観察深さと補正環位置と対物レンズｚ位置との関係を示すグラフである。
【図40】第７実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図41】第７実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。
【図42】第８実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図43】第８実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
［第１実施形態］
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を示す図である。この顕微鏡装置１は、共焦点顕微鏡１０と、情報処理装置９０とを主体に構成される。共焦点顕微鏡１０と情報処理装置９０とは、互いにデータの送受信が可能に構成されている。以降の説明において、共焦点顕微鏡１０の対物レンズ３０の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。また、このｚ軸と垂直な面内において互いに直交する方向に延びる座標軸をそれぞれｘ軸およびｙ軸とする。
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を示す図である。この顕微鏡装置１は、共焦点顕微鏡１０と、情報処理装置９０とを主体に構成される。共焦点顕微鏡１０と情報処理装置９０とは、互いにデータの送受信が可能に構成されている。以降の説明において、共焦点顕微鏡１０の対物レンズ３０の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。また、このｚ軸と垂直な面内において互いに直交する方向に延びる座標軸をそれぞれｘ軸およびｙ軸とする。
【0009】
共焦点顕微鏡１０は、ステージ１１と、光源ユニット１６と、照明光学系２０と、検出光学系４０と、検出部５１と、顕微鏡制御部８０とを備える。ステージ１１は、図２に示すように、中央に開口部を有する板状に形成される。ステージ１１は、観察対象である試料ＴＰが載置されたカバーガラスＣＧを支持する（図２を参照）。試料ＴＰの例として、例えば、生体試料（図示せず）やビーズ（図示せず）等がある。生体試料は、蛍光染色された細胞等の厚みがある試料である。ビーズは、蛍光標識されたポリスチレン製の（例えば、直径０．２μｍ程度の）微小な球体である。
【0010】
図１に示すように、ステージ１１には、ステージ駆動部１２が設けられる。ステージ駆動部１２は、ステージ１１をｚ軸（対物レンズ３０の光軸ＡＸ）と垂直な面内で移動させる。ステージ駆動部１２によりステージ１１をｚ軸と垂直な面内で移動させることで、カバーガラスＣＧを介してステージ１１に支持された、試料ＴＰにおける広範囲の画像を取得することが可能である。なお、ステージ駆動部１２は、ステージ１１をｚ軸（対物レンズ３０の光軸ＡＸ）に沿って移動させてもよい。
【0011】
光源ユニット１６は、試料ＴＰに含まれる蛍光物質を励起するための励起光を射出させる。光源ユニット１６は、光源１７と、シャッタ１８と、音響光学素子１９とを有する。光源１７として、例えば、所定の波長域のレーザー光（励起光）を射出させることが可能なレーザー光源等が用いられる。
【0012】
照明光学系２０は、光源ユニット１６から射出された励起光で試料ＴＰを照明する。照明光学系２０は、光源ユニット１６側から順に、照明用レンズ２１と、励起フィルタ２２と、ダイクロイックミラー２３と、スキャナ２４と、リレーレンズ２５，２６と、マスク２７と、対物レンズ３０とを有する。照明用レンズ２１は、光源ユニット１６から射出された励起光を平行光にするためのコリメーターレンズである。励起フィルタ２２は、光源ユニット１６からの励起光が透過し、他の波長の光（例えば、外光、迷光）の少なくとも一部を遮る特性を有する。ダイクロイックミラー２３は、光源ユニット１６から射出された励起光が反射し、ステージ１１上の試料ＴＰで発生した光のうち所定の波長帯の光（例えば、蛍光）が透過する特性を有する。スキャナ２４は、ｘ方向とｙ方向との２方向において、光源ユニット１６からの励起光で試料ＴＰを走査する。スキャナ２４として、例えば、ガルバノスキャナや、レゾナントスキャナ等が用いられる。リレーレンズ２５，２６は、スキャナ２４と対物レンズ３０との間で光をリレーする。マスク２７（詳細後述）には、マスク切替部２８が設けられる。
【0013】
対物レンズ３０は、ステージ１１の下方近傍に配置される。対物レンズ３０は、ステージ１１の開口部およびカバーガラスＣＧ（図２を参照）を介して、ステージ１１上の試料ＴＰと対向する。対物レンズ３０とカバーガラスＣＧとの間隙部は、浸液ＩＭ（図２を参照）で満たされるようになっている。なお、対物レンズ３０とカバーガラスＣＧとの間隙部は、浸液ＩＭに限らず、空気等の気体で満たされていてもよい。
【0014】
対物レンズ３０には、対物ｚ位置駆動部６２が設けられる。対物ｚ位置駆動部６２は、例えば電動モータ（図示せず）を用いて構成される。対物ｚ位置駆動部６２は、レボルバ（不図示）とともに対物レンズ３０をｚ方向に上下移動させる。図２に示すように、対物ｚ位置駆動部６２により対物レンズ３０がｚ方向に移動すると、試料ＴＰに対する対物レンズ３０の相対位置が変化し、試料ＴＰに対する対物レンズ３０の焦点ＰＦの位置がｚ方向に変化する。対物ｚ位置駆動部６２により対物レンズ３０の焦点ＰＦの位置をｚ方向に変位させることで、ｚ方向（対物レンズ３０の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面（観察面ＴＡ）の画像を取得することが可能である。以降、ｚ方向の位置が異なる複数の試料ＴＰの断面の画像を、試料ＴＰのｚスタック画像と称することがある。
【0015】
検出光学系４０は、試料ＴＰで発生した蛍光を検出部へ導く。検出光学系４０は、試料ＴＰ側から順に、対物レンズ３０と、マスク２７と、リレーレンズ２６，２５と、スキャナ２４と、ダイクロイックミラー２３とを含む。さらに、検出光学系４０は、ダイクロイックミラー２３側から順に、蛍光フィルタ４４と、集光レンズ４５とを有する。蛍光フィルタ４４は、試料ＴＰからの光のうち所定の波長帯の光（例えば、蛍光）が透過する特性を有する。蛍光フィルタ４４は、例えば、試料ＴＰで反射した励起光、外光、迷光などの少なくとも一部を遮断する。集光レンズ４５は、試料ＴＰの微小領域（対物レンズの回折限界）から発せられた蛍光を集光する。検出部５１は、検出光学系４０を介して、試料ＴＰで発生した蛍光を検出する。検出部５１として、例えば、光電子増倍管が用いられる。
【0016】
検出光学系４０と検出部５１との間における検出部５１の近傍に、ピンホール４６が設けられる。ピンホール４６は、対物レンズ３０の試料ＴＰ側の焦点位置と共役な位置に配置される。ピンホール４６は、対物レンズ３０の焦点面（対物レンズ３０の焦点位置を通る対物レンズ３０の光軸ＡＸと垂直な面）または、当該焦点面から所定のずれ許容範囲内で光軸方向にずれた面からの光のみを通過させ、他の光を遮光する。ピンホール４６には、ピンホール駆動部４７が設けられる。ピンホール駆動部４７は、ピンホール４６の大きさを拡大若しくは縮小させる。ピンホール駆動部４７により、ピンホール４６の大きさを拡大若しくは縮小させることで、上述した所定のずれ許容範囲を変えることができる。
【0017】
顕微鏡制御部８０は、ステージ駆動部１２、ピンホール駆動部４７、検出部５１等を制御する。また、顕微鏡制御部８０は、試料ＴＰの画像の取得条件として、例えば、光源ユニット１６から射出される励起光の光強度、ピンホール４６の大きさ、試料ＴＰに対する励起光の走査速度等を設定する。
【0018】
光源ユニット１６から射出された励起光は、照明光学系２０の照明用レンズ２１を透過して略平行光になる。照明用レンズ２１を透過した励起光は、励起フィルタ２２を通ってダイクロイックミラー２３に入射する。ダイクロイックミラー２３に入射した励起光は、ダイクロイックミラー２３で反射してスキャナ２４に入射する。スキャナ２４は、ｘ方向とｙ方向との２方向において、スキャナ２４に入射した励起光で試料ＴＰを走査する。スキャナ２４に入射した励起光は、スキャナ２４を通って対物レンズ３０を透過し、対物レンズ３０の焦点面に集光される。試料ＴＰにおいて励起光が集光される部分（すなわち、対物レンズ３０の焦点面と重なる部分）は、スキャナ２４によりｘ方向とｙ方向との２方向において２次元的に走査される。
【0019】
試料ＴＰにおいて励起光が集光される部分に含まれる蛍光物質から、蛍光が発光する。試料ＴＰで発した蛍光は、検出光学系４０としての対物レンズ３０に入射する。対物レンズ３０に入射した蛍光は、対物レンズ３０を透過し、スキャナ２４を通ってダイクロイックミラー２３に入射する。ダイクロイックミラー２３に入射した蛍光は、励起光と波長が異なるため、ダイクロイックミラー２３を透過して蛍光フィルタ４４に達する。蛍光フィルタ４４に達した蛍光は、蛍光フィルタ４４を通って集光レンズ４５を透過し、対物レンズ３０の焦点位置と共役な位置に集光される。対物レンズ３０の焦点位置と共役な位置に集光された蛍光は、ピンホール４６を通過して検出部５１に入射する。
【0020】
検出部５１は、検出部５１に入射した光（蛍光）の光電変換を行い、光の検出信号として、その光の光量（明るさ）に対応するデータを生成する。検出部５１は、生成したデータを顕微鏡制御部８０の検出制御部８２（図３を参照）へ出力する。情報処理装置９０の演算装置９１（図３を参照）は、検出制御部８２から入力されたデータを１画素分のデータとして、これをスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、複数画素分のデータが２次元で（２方向で）並ぶ１つの画像データを生成し、ＲＡＭなどの記憶部９２（図３を参照）に記憶させる。このようにして、演算装置９１は、試料ＴＰの画像を取得する。
【0021】
マスク２７は、光源ユニット１６から射出された励起光と試料ＴＰから発せられた蛍光のどちらか一方または両方の光束の一部を透過させ一部を遮光する。マスク２７は、照明光学系２０または検出光学系４０または２つの光学系の共通光路における、励起光または試料ＴＰ中の１点から発せられた蛍光が略平行光となっている範囲内に配置される。マスク２７には光の一部を遮光し一部を透過させる板状部材を用いてもよく、このような板状部材以外に、例えばＤＭＤ(デジタルミラーデバイス)や液晶ＳＬＭ(空間変調器)を用いてもよい。ＤＭＤを用いる場合、例えば、ＤＭＤ上の光を遮光する領域のミラーをオフ状態、透過させる領域のミラーをオン状態にすることで、光の一部を遮光し一部を透過させることが可能である。液晶ＳＬＭを用いる場合、例えば、液晶ＳＬＭ上の光を遮光する領域には光を試料または検出器に入射しない方向へ回折させる位相パターンを作成し、透過させる領域には位相変調を加えないことで、光の一部を遮光し一部を透過させることが可能である。
【0022】
マスク切替部２８は、マスク２７における光を透過させる領域と遮断する領域の大きさや形状、配置等に関するマスクパターンを変更する。例えば、互いに異なるマスクパターンが形成された複数のマスクを切り替えてマスク設置位置に抜き差しすることでマスクパターンを変更してもよいし、複数のマスクパターンを形成した板状部材を回転または平行移動することでマスクパターンを変更してもよい。また、マスク２７としてＤＭＤや液晶ＳＬＭを用いる場合、マスク切替部２８はＤＭＤや液晶ＳＬＭの空間的なパターンを変更する。なお、本発明におけるマスクの切り替えは自動での切り替えに限らない。例えば、ユーザーが手動でマスクを挿脱してマスクパターンを変更してもよい。
【0023】
図３は、第１実施形態に係る共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部８０と情報処理装置９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０は、本発明に係る演算制御部を構成する。顕微鏡制御部８０は、光源制御部８１、検出制御部８２、ピンホール径制御部８３、スキャナ制御部８４、対物ｚ位置制御部８５、ステージ位置制御部８６、およびマスク制御部８７を有する。
【0024】
光源制御部８１は、光源ユニット１６と電気的に接続され光源ユニット１６を制御する。検出制御部８２は、検出部５１と電気的に接続され検出部５１を制御する。ピンホール径制御部８３は、ピンホール駆動部４７と電気的に接続されピンホール駆動部４７を制御する。スキャナ制御部８４は、スキャナ２４と電気的に接続されスキャナ２４を制御する。対物ｚ位置制御部８５は、対物ｚ位置駆動部６２と電気的に接続され対物ｚ位置駆動部６２を制御する。ステージ位置制御部８６は、ステージ駆動部１２と電気的に接続されステージ駆動部１２を制御する。マスク制御部８７は、マスク切替部２８と電気的に接続されマスク切替部２８を制御する。
【0025】
情報処理装置９０は、演算装置９１および記憶部９２を有する。演算装置９１は、顕微鏡制御部８０の各制御部８１～８７と電気的に接続されている。演算装置９１は、記憶部９２に保持されている処理内容（プログラム）に従い処理を行い、接続されている各制御部８１～８７を制御する。記憶部９２は、ＲＡＭ等のメモリやハードディスク等を用いて構成される。記憶部９２は、演算装置９１が実行する処理内容や演算装置９１から入力される各種データを記憶する。入力部９４は、ユーザーが操作可能な入力インターフェースである。入力部９４は、例えば、マウス、キーボード、タッチパッド、トラックボール等のうち少なくとも１つを含む。入力部９４は、ユーザーによる操作を検出し、その検出結果をユーザーが入力した入力データとして情報処理装置９０の演算装置９１へ出力する。表示部９５は、例えば、液晶ディスプレイ等である。情報処理装置９０の演算装置９１は、共焦点顕微鏡１０の操作に必要なＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェース）や、共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部８０から出力された試料ＴＰの画像、算出した試料屈折率を表示部９５に表示させる。
【0026】
次に、試料ＴＰの屈折率を算出するための方法（以降、試料屈折率測定方法と称する）について説明する。光学系に収差が存在するとき、照明光学系に配置されたマスクパターンを変更すると、励起光（照明光）の集光位置が変化する。検出光学系に配置されたマスクパターンを変更すると、試料のある微小領域（対物レンズの回折限界）から発せられた蛍光（検出光）の結像位置が変化する。照明光学系と検出光学系の共通光路に配置されたマスクパターンを変更すると、励起光（照明光）の集光位置および蛍光（検出光）の結像位置の両方が変化する。以後、励起光（照明光）の集光位置および蛍光（検出光）の結像位置の少なくとの一方について、「フォーカス位置」と称する。第１実施形態に係る試料屈折率測定方法では、複数の観察深さ位置（後述する対物レンズｚ位置）において、マスク２７のマスクパターンを変更した際に生じる、対物レンズ３０を含む光学系のｚ方向のフォーカス位置のずれ量を求め、求めたフォーカス位置のずれ量に基づき試料ＴＰの屈折率を算出する。図４は、本実施形態で用いるマスク２７における２つのマスクパターンを示している。マスクパターンＭＰ１は、円環状（２つの同心円によって囲まれた領域）の光通過領域（白色で示す領域）を有し、マスク２７に入射した光束のうち、この光通過領域に入射した光束のみを通過（透過）させて、他の部分（光通過領域以外）に入射した光を遮断するマスクパターンである。マスクパターンＭＰ２は、円形状（例えば、マスクパターンＭＰ１の円環の内径に相当するが、これに限定しない）の光通過領域（白色で示す領域）を有し、マスク２７に入射した光束のうち、この光通過領域に入射した光束（光束内の中心近傍の部分）のみを通過させて、他の部分（光通過領域以外）に入射した光を遮断するマスクパターンである。なお、本発明におけるマスクパターンは上記に限るものではない。マスクパターンＭＰ１、またはマスクパターンＭＰ２のどちらか一方のみを用い、光路にマスクを入れた状態とマスクを入れていない状態でのフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率の算出を行っていてもよい。また、３つ以上の異なるマスクパターンを用い、それぞれのマスクパターン間での複数のフォーカス位置のずれ量に基づいて試料屈折率を算出してもよい。
【0027】
例えば、試料ＴＰの屈折率と浸液ＩＭの屈折率とが異なるといった理由により、試料ＴＰを含む光学系に球面収差が生じることがある。球面収差が存在するときには、図５に示すように、円環状の光束（例えば、マスクパターンＭＰ１を通過した光）が光学系により集光され形成される集光位置ＦＰ１と、光束の中央部分（例えば、円環の内径に相当するが、これに限定しない）の光（例えば、マスクパターンＭＰ２を通過した光）が光学系により集光され形成される集光位置ＦＰ２とは、ｚ方向（レンズの光軸方向）に位置がずれる。この集光位置のずれ量ΔＬは、球面収差量が大きいほど大きくなる。
【0028】
図６は、第１実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。図６に示す各ステップの処理は、顕微鏡制御部８０または情報処理装置９０の演算装置９１により、所定の制御プログラムに従って実行される。まず、ステップＳＴ１０１において、試料屈折率ｎとＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃとの関係を表す設定用データテーブルＤＢ１（本発明に係る第1の情報に相当する）を予め作成しておく（図７を参照）。Ｌ－ΔＬ変化比ｍｆｃとは、対物レンズｚ位置Ｌと、マスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際のｚ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＬとの比である。対物レンズｚ位置Ｌとは、所定の基準位置Ｌ０を原点位置とした、対物レンズ３０のｚ方向の位置である（図２を参照）。対物レンズｚ位置Ｌが変わることにより、観察深さｄ（対物レンズ３０の焦点ＰＦが位置するｚ方向の位置）が変化する（図２を参照）。対物レンズｚ位置は、例えば、対物レンズ３０をｚ方向に駆動させるギアの角度の基準位置からの変化量で検出できる。
【0029】
試料屈折率ｎとＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃとの関係は、例えば、光学シミュレーションを行うことにより求めることが可能である。具体的には、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、光学系の収差、試料中の観察深さを設定し、例えば、公知のＰＳＦ（点像分布関数）の最大強度比（以降、ストレール比と称する）が最大となる対物レンズのｚ位置ＬＴを求める。例えば、光路中にいずれのマスクパターンも設置されていない状態で前記ストレール比が最大となる対物レンズｚ位置をＬＴ０、光路中にマスクパターンＭＰ１を設置した状態で前記ストレール比が最大となる対物レンズのｚ位置をＬＴ１、光路中にマスクパターンＭＰ２を設置した状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置をＬＴ２とする。この場合、マスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を切り替えた際のフォーカス位置のずれ量ΔＬＴは、下記の式（１）で求められる。
【0030】
【数1】
【0031】
例えば、複数の観察深さにおいて、対物レンズｚ位置ＬＴ０とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとを求め、ＬＴ０とΔＬＴとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして作成した散布図におけるプロットを例えば直線でフィッティングし、この直線の傾きを、Ｌ－ΔＬ変化比ｍｆｃとして求める。複数の試料屈折率を設定し、それぞれの試料屈折率に応じてＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃを求めることで、設定用データテーブルＤＢ１を作成することが可能である。作成した設定用データテーブルＤＢ１は記憶部９２で保持する。なお、データテーブルは複数の波長や温度等の条件ごとに作成し保持しておき、観察条件に応じて使い分けてもよい。
【0032】
試料屈折率ｎとＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃとの関係は、例えば、屈折率が既知の試料を用いて、実験的に求めてもよい。このとき、屈折率が既知の試料に対して、後述するステップＳＴ１０２からステップＳＴ１０９の処理を行ったあと、対物レンズｚ位置Ｌと実験的に求めたフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを１本の直線でフィッティングし、その直線の傾きからＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃを算出する。複数の屈折率が既知の試料に対して、それぞれの試料屈折率に応じてＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃを求めることで、設定用データテーブルＤＢ１を作成することが可能である。
【0033】
図８は、試料屈折率ごとの、対物レンズz位置ＬＴ０と、マスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を切り替えたときのフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの関係を例示する図である。ここで、対物レンズz位置ＬＴ０が０となる対物レンズz位置の定義は任意であり、例えば試料とカバーガラスの境界面にフォーカス位置が存在するときの対物レンズz位置等を設定してもよい。図８に示すように、例えば、試料屈折率がｎ１の場合における対物レンズz位置ＬＴ０とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの関係は直線ｆΔＬＴｎ１で表すことができる。試料屈折率がｎ２の場合における対物レンズz位置ＬＴ０とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの関係は直線ｆΔＬＴｎ２で表すことができる。試料屈折率がｎ３の場合における対物レンズz位置ＬＴ０とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの関係は直線ｆΔＬＴｎ３で表すことができる。このとき、試料屈折率がｎ１の場合におけるＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃは、直線ｆΔＬＴｎ１の傾きとして求まる。試料屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃは、直線ｆΔＬＴｎ２の傾きとして求まる。試料屈折率がｎ３の場合におけるＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃは、直線ｆΔＬＴｎ３の傾きとして求まる。図８に示す例では、試料屈折率がｎ１、ｎ２、ｎ３の順で浸液屈折率との差が大きく、Ｌ－ΔＬ変化比ｍｆｃも大きい。
【0034】
ステップＳＴ１０２において、屈折率を求める試料のｘｙ方向位置およびフォーカス位置のずれ量を求める複数の対物レンズｚ位置Ｌを設定する。図９に示すように、ユーザーは表示部９５に表示されるＧＵＩを利用して、試料画像ＴＩ（マスクパターンが設定されていない状態で撮影された試料画像）を見ながら観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９４に対して行い、観察領域ＲＯＩを設定することができる。ユーザーが、対物レンズｚ位置Ｌを入力する操作や、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９４に対して行うと、入力部９４は、これらの操作に対応する入力データを、演算装置９１を介して顕微鏡制御部８０の対物z位置制御部８５およびステージ位置制御部８６へ出力する。
【0035】
ユーザーはＧＵＩを利用して対物レンズｚ位置Ｌを変更しつつ、その変更に応じて変化する試料画像の状態を見て判断することで、フォーカス位置のずれ量ΔＬを算出する複数の対物レンズz位置（以降、フォーカス位置ずれ量算出ｚ位置と称する）を決定し、ＧＵＩを利用して入力欄に入力する。図９では、複数のフォーカス位置ずれ量算出ｚ位置として、１０、３０、５０．５μｍの３位置を例示している。なお、フォーカス位置ずれ量算出ｚ位置は自動的に設定されてもよい。この場合、例えば予め定めておいた対物レンズｚ位置の範囲内で等間隔に予め定めておいた所定の数のフォーカス位置ずれ量算出ｚ位置を設定する方法がある。ユーザーがＧＵＩ上で、屈折率算出の開始ボタンを操作することで、ステップＳＴ１０３以降のステップへ進む。
【0036】
ステップＳＴ１０３において、ステップＳＴ１０２で設定した複数のフォーカス位置ずれ量算出ｚ位置の中から１つを選択し、選択したフォーカス位置ずれ量算出ｚ位置（対物レンズz位置Ｌｃと称する）に、対物レンズ３０を移動させる。ステップＳＴ１０４において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ１に設定する。
【0037】
ステップＳＴ１０５において、試料画像を取得する。具体的には、顕微鏡制御部８０は、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）をマスクパターンＭＰ１のマスク２７および対物レンズ３０を介して試料ＴＰに照射する。検出部５１は、試料ＴＰから対物レンズ３０およびマスクパターンＭＰ１のマスク２７を通過した光（蛍光）を検出し、その検出信号を顕微鏡制御部８０へ出力する。この検出信号は、顕微鏡制御部８０を介して演算装置９１に出力される。演算装置９１は、顕微鏡制御部８０から入力された検出信号をスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、マスクパターンＭＰ１のときの対物レンズz位置Ｌｃでの試料画像を生成する。生成した試料画像は、記憶部９２に保持する。
【0038】
ステップＳＴ１０６において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ２に変更する。ステップＳＴ１０７において、対物レンズｚ位置Ｌｃを中心とする複数の対物レンズｚ位置での試料画像（試料ＴＰのｚスタック画像）を取得する。具体的には、顕微鏡制御部８０は、対物レンズ３０が対物レンズｚ位置Ｌｃに移動している状態において、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）をマスクパターンＭＰ２のマスク２７および対物レンズ３０を介して試料ＴＰに照射する。検出部５１は、試料ＴＰから対物レンズ３０およびマスクパターンＭＰ２のマスク２７を通過した光（蛍光）を検出し、その検出信号を顕微鏡制御部８０へ出力する。この検出信号は、顕微鏡制御部８０を介して演算装置９１に出力される。演算装置９１は、顕微鏡制御部８０から入力された検出信号をスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、マスクパターンＭＰ２のときの対物レンズz位置Ｌｃでの試料画像を生成する。
【0039】
その後、対物レンズ３０を他の対物レンズｚ位置に順次移動させ、移動させるごとに、上記と同様にして、マスクパターンＭＰ２のときの各対物レンズz位置での試料画像（ｚスタック画像）を生成する。生成したｚスタック画像は、記憶部９２に保持する。ｚスタック画像を取得するためのｚ方向の範囲は、想定される観察条件の中で発生するフォーカス位置のずれ量ΔＬの最大値の２倍よりも大きい範囲を設定する。図１０は、マスクパターンＭＰ１のときの対物レンズz位置Ｌｃでの試料画像と、マスクパターンＭＰ２のときの複数の対物レンズz位置（Ｌｃ＋２、Ｌｃ＋１、Ｌｃ、Ｌｃ－１、Ｌｃ－２）での試料画像（ｚスタック画像）を例示している。
【0040】
ステップＳＴ１０８において、ステップＳＴ１０５で撮影したマスクパターンＭＰ１のときの対物レンズz位置Ｌｃでの試料画像と、ステップＳＴ１０７で撮影したマスクパターンＭＰ２のときのｚスタック画像とからフォーカス位置のずれ量（本発明に係る第２の情報に相当する）を算出する。例えば、ステップＳＴ１０５で撮影したマスクパターンＭＰ１のときの対物レンズz位置Ｌｃでの試料画像と、ステップＳＴ１０７のマスクパターンＭＰ２のときの各対物レンズz位置（Ｌｃ＋２、Ｌｃ＋１、Ｌｃ、Ｌｃ－１、Ｌｃ－２）で撮影した複数の試料画像それぞれとの間の相関値を計算する。そして、図１１に示すように、各対物レンズz位置（Ｌｃ＋２、Ｌｃ＋１、Ｌｃ、Ｌｃ－１、Ｌｃ－２）と、計算した相関値との対応点をプロットした散布図を作成する。この散布図のプロットを補間または関数近似を行った上で、相関値が最大となる対物レンズｚ位置をＬｍａｘとする。補間を行う方法としては、例えば、対物レンズｚ位置に対する相関値のプロットに対しラグランジュ補間やスプライン補間をする方法がある。関数近似を行う方法としては、例えば、最小二乗法により、対物レンズｚ位置に対する相関値のプロットを二次曲線やガウス関数によりフィッティングする方法がある。フォーカス位置のずれ量をΔＬＴＥとするとき、ΔＬＴＥは、下記の式（２）により算出できる。算出したフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥは、ステップＳＴ１０３で選択した対物レンズｚ位置Ｌｃと共に記憶部９２に保持する。
【0041】
【数2】
【0042】
ステップＳＴ１０９において、ステップＳＴ１０２で設定した全ての対物レンズｚ位置についてフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥを算出したかどうか判断する。全てに対して算出済みでない場合（ステップＳＴ１０９：Ｎｏ）、はステップＳＴ１０３へ戻り、対物レンズｚ位置を次の位置へ移動させる。全てに対して算出済みの場合（ステップＳＴ１０９：Ｙｅｓ）はステップＳＴ１１０に進む。
【0043】
ステップＳＴ１１０において、試料屈折率値を算出する。この試料屈折率値の算出は、例えば、次のように行う。まず、図１２に示すように、ステップＳＴ１０２で設定した各対物レンズｚ位置Ｌと、それぞれの対物レンズｚ位置Ｌにおいて算出したフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを１本の直線ｆΔＬＴＥでフィッティングし、その直線ｆΔＬＴＥの傾きｍｆｃＥ（本発明に係る第３の情報に相当する）を算出する。この算出した傾きｍｆｃＥをステップＳＴ１０１で作成しておいた設定用データテーブルＤＢ１（図７を参照）と照らし合わせることで、試料屈折率を求める。例えば、算出した傾きｍｆｃＥと最も値が近い設定用データテーブルＤＢ１上のＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃを選択し、その選択したＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃに対応する屈折率ｎの値を試料屈折率としてもよい。また、例えば設定用データテーブルＤＢ１上の屈折率ｎとＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃとの関係を補間し、算出した傾きｍｆｃＥに対応する屈折率を算出してもよい。
【0044】
ステップＳＴ１１１において、ステップＳＴ１１０で算出した試料屈折率を表示部９５に表示されるＧＵＩ上に表示することでユーザーに提示する。算出した試料屈折率値は記憶部９２に保持しておき、別の処理に用いてもよい。
【0045】
なお、上述の説明ではステップＳＴ１０５で１枚の試料画像を取得し、ステップＳＴ１０７でｚスタック画像を取得するとしたが、ＳＴ１０５でｚスタック画像を取得し、ステップＳＴ１０７で１枚の試料画像を取得してもよい。また、ステップＳＴ１０５とステップＳＴ１０７の両方でｚスタック画像を取得し、ステップＳＴ１０８ではぞれぞれのzスタック画像の中の複数の画像間の相関値に基づいてフォーカス位置のずれ量を算出してもよい。
【0046】
第１実施形態によれば、複数の対物レンズｚ位置においてマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際に生じるｚ方向のフォーカス位置のずれ量に基づき試料ＴＰの屈折率を求めることができる。求めた試料屈折率は、顕微鏡装置１における装置パラメータを最適化するために利用することができる。
【0047】
［第２実施形態］
第２実施形態について説明する。図１３は、第２実施形態に係る顕微鏡装置１Ａの構成を示す図である。この顕微鏡装置１Ａは、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と類似した構成であり、上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じまたは類似の符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。顕微鏡装置１Ａは、収差補正部６０や顕微鏡制御部８０Ａを有する共焦点顕微鏡１０Ａを備えており、この点において、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と相違している。
第２実施形態について説明する。図１３は、第２実施形態に係る顕微鏡装置１Ａの構成を示す図である。この顕微鏡装置１Ａは、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と類似した構成であり、上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じまたは類似の符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。顕微鏡装置１Ａは、収差補正部６０や顕微鏡制御部８０Ａを有する共焦点顕微鏡１０Ａを備えており、この点において、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と相違している。
【0048】
図１４は、共焦点顕微鏡１０Ａにおける収差補正部６０の拡大図である。収差補正部６０は、対物レンズ３０Ａの先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び試料中の観察深さなどに起因する球面収差を補正する。対物レンズ３０Ａは、レボルバ（図示せず）によりステージ１１の下方近傍で保持される。対物レンズ３０Ａは、収差補正レンズ３１と、補正環３２とを有する。収差補正レンズ３１は、対物レンズ３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動することで、対物レンズ３０Ａの球面収差を変化させることが可能である。補正環３２は、対物レンズ３０Ａの鏡筒部に、対物レンズ３０Ａの光軸ＡＸを中心に回転自在に設けられる。補正環３２の回転に応じて、収差補正レンズ３１が対物レンズ３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動する。例えば、カム構造等を利用して、収差補正レンズ３１が対物レンズ３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動するように構成されてもよい。
【0049】
収差補正部６０は、対物レンズ３０Ａの収差補正レンズ３１および補正環３２と、検出部５１とを含む。さらに、収差補正部６０は、補正環駆動部６３と、対物ｚ位置駆動部６２とを含む。補正環駆動部６３は、例えば電動モータ（図示せず）を用いて構成される。補正環駆動部６３は、補正環３２を回転駆動し、補正環３２の回転位置Ｃを変化させ、収差補正レンズ３１を対物レンズ３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動させる。補正環駆動部６３は、補正環３２の回転位置Ｃを変化させて、収差補正レンズ３１の光軸上の位置を変化させることにより、対物レンズ３０Ａの球面収差を変化させる。対物ｚ位置駆動部６２は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１のものと同様の構成および機能を有する。
【0050】
図１５は、共焦点顕微鏡１０Ａの顕微鏡制御部８０Ａと情報処理装置９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。顕微鏡制御部８０Ａおよび情報処理装置９０は、本発明に係る演算制御部を構成する。第２実施形態に係る顕微鏡制御部８０Ａは、第１実施形態に係る顕微鏡制御部８０の構成に加えて補正環制御部８８を備えており、この点において、第１実施形態に係る顕微鏡制御部８０と相違している。補正環制御部８８は、補正環駆動部６３と電気的に接続され補正環駆動部６３を制御する。
【0051】
次に、第２実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第２実施形態に係る試料屈折率測定方法では、２つの対物レンズｚ位置を設定し、一方の対物レンズｚ位置で補正環３２を最適位置に調整した上で、もう一方の対物レンズｚ位置でマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際のｚ方向のフォーカス位置のずれ量を求め、求めたフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を算出する。
【0052】
図１６は、第２実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。図１６に示す各ステップの処理は、顕微鏡制御部８０Ａまたは情報処理装置９０の演算装置９１により、所定の制御プログラムに従って実行される。まず、ステップＳＴ２０１において、第１実施形態におけるステップＳＴ１０１と同様に、データテーブルを予め作成しておく。データテーブルとして、第１実施形態と同様の設定用データテーブルＤＢ１（図７を参照）が用いられる。第２実施形態においても、予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の試料屈折率ｎについてＬ－ΔＬ変化比ｍｆｃとの関係を求めることで、設定用データテーブルＤＢ１（本発明に係る第７の情報に相当する）を作成することが可能である。
【0053】
ステップＳＴ２０２において、第１実施形態におけるステップＳＴ１０２と同様に、屈折率を求める試料のｘｙ方向位置およびフォーカス位置のずれ量を求める複数（本実施形態では２つ）の対物レンズｚ位置Ｌを設定する。第１実施形態と同様にユーザーは、表示部９５に表示されるＧＵＩを利用して、観察領域ＲＯＩを設定するとともに、２つの対物レンズｚ位置（Ｌ２_１とＬ２_２と称する）を設定することができる。なお、２つの対物レンズｚ位置は予め定めておいてもよい。
【0054】
ステップＳＴ２０３において、対物レンズ３０ＡをステップＳＴ２０２で定めた第１の対物レンズｚ位置Ｌ２_１へ移動させる。
【0055】
ステップＳＴ２０４において、詳細を後述する補正環位置自動調整処理を行う。これにより、第１の対物レンズｚ位置Ｌ２_１において、補正環位置が最適となり、球面収差量が最小となる。そのため、仮にこの状態でマスク２７のマスクパターンを２つのマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２の間で変更してもフォーカス位置のずれは略生じない。なお、補正環位置を変えたときに、フォーカス位置も変化する場合は、Ｌ２_１を後述のステップＳＴ２２７で算出するＬＰＳへ置き換え、Ｌ２_２を、Ｌ２_２－(ＬＰＳ-Ｌ２_１)へ置き換える。
【0056】
ステップＳＴ２０５において、対物レンズ３０ＡをステップＳＴ２０２で定めた第２の対物レンズｚ位置Ｌ２_２へ移動させる。
【0057】
ステップＳＴ２０６～ステップＳＴ２１０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１０４～ステップＳＴ１０８と同様の処理が行われる。これにより、第２の対物レンズｚ位置Ｌ２_２におけるフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥ（本発明に係る第８の情報に相当する）が算出される。
【0058】
ステップＳＴ２１１において、試料屈折率値を算出する。この試料屈折率値の算出は、例えば、次のように行う。まず、図１７に示すように、対物レンズｚ位置Ｌを横軸にとり、フォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥを縦軸にとった座標図において、第１の対物レンズｚ位置Ｌ２_１とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥ（＝０）との対応点と、第２の対物レンズｚ位置Ｌ２_２とフォーカス位置のずれ量ΔＬＴＥとの対応点とをプロットする。そして、プロットした２つの対応点を結ぶ直線ｆΔＬＴＥ２を求め、その直線ｆΔＬＴＥの傾きｍｆｃＥ（本発明に係る第９の情報に相当する）を算出する。上述したように第１の対物レンズｚ位置でのフォーカス位置のずれ量は略無いので、傾きｍｆｃＥは、下記の式（３）により算出することができる。
【0059】
【数3】
【0060】
この算出した傾きｍｆｃＥをステップＳＴ２０１で作成しておいた設定用データテーブルＤＢ１（図７を参照）と照らし合わせることで、試料屈折率を算出する。算出した試料屈折率は、ステップＳＴ２１２において、第１実施形態におけるステップＳＴ１１１と同様に、ユーザーに提示される。
【0061】
ここで、補正環位置自動調整処理の詳細について説明する。図１８は、補正環位置自動調整処理の詳細を示すフローチャートである。ステップＳＴ２２１において、顕微鏡制御部８０Ａは、試料ＴＰの画像を取得する。このステップＳＴ２２１で取得する試料ＴＰの画像を、試料ＴＰの基準画像とする。以降、基準画像取得時の補正環３２の回転位置を基準補正環位置ＣＡと称し、対物レンズ３０Ａの位置を基準対物レンズｚ位置ＬＡと称することがある。顕微鏡制御部８０Ａは、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部８０Ａの検出制御部８２は、検出部５１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部５１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を、検出制御部８２を介して情報処理装置９０の演算装置９１へ出力する。情報処理装置９０の演算装置９１は、検出部５１から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの基準画像を生成する。情報処理装置９０の演算装置９１は、生成した試料ＴＰの基準画像データを記憶部９２へ出力する。
【0062】
ステップＳＴ２２２において、顕微鏡制御部８０Ａの補正環制御部８８は、補正環３２を初期状態の回転位置へ回転移動させ、対物ｚ位置制御部８５は、対物レンズ３０Ａを初期状態の位置へｚ方向に移動させる。以降、初期状態の補正環３２の回転位置を初期状態の補正環位置ＣＡ０と称し、初期状態の対物レンズ３０Ａの位置を初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０と称することがある。その後、顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２の回転位置Ｃを初期状態の補正環位置ＣＡ０から所定の回転移動量ずつ変化させ、対物レンズ３０Ａの位置Ｌを初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０から所定の移動量ずつ変化させた、試料ＴＰの複数種類の評価用画像を取得する。なお、各補正環３２の回転位置Ｃおよび対物レンズ３０Ａの位置Ｌにおいて評価用画像を、１回取得してもよく、複数回取得してもよい。このとき、顕微鏡制御部８０Ａの補正環制御部８８は、補正環駆動部６３へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部６３は、補正環３２を初期状態の補正環位置ＣＡ０から所定の回転移動量ずつ回転移動させる。顕微鏡制御部８０Ａの対物ｚ位置制御部８５は、対物ｚ位置駆動部６２へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物ｚ位置駆動部６２は、対物レンズ３０Ａを初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０から所定の移動量ずつｚ方向に移動させる。それぞれの補正環３２の回転位置および対物レンズ３０Ａの位置において、顕微鏡制御部８０Ａは、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部８０Ａの検出制御部８２は、検出部５１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部５１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部８０Ａの検出制御部８２を介して情報処理装置９０の演算装置９１へ出力する。情報処理装置９０の演算装置９１は、検出制御部８２から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの評価用画像を生成する。演算装置９１は、生成した試料ＴＰの評価用画像データを記憶部９２へ出力する。
【0063】
ステップＳＴ２２３において、情報処理装置９０の演算装置９１は、記憶部９２に記憶された試料ＴＰの基準画像データと、ステップＳＴ２２２で生成した試料ＴＰの複数種類の評価用画像データとの相関値をそれぞれ求める。演算装置９１は、補正環３２の回転位置が同じで対物レンズ３０Ａの位置Ｌが異なる試料ＴＰの評価用画像のうち、試料ＴＰの基準画像データとの相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置での評価用画像を、補正環３２の各回転位置での評価用画像として選択する。演算装置９１は、補正環３２の各回転位置について、選択した試料ＴＰの評価用画像データに基づいて、評価値ｖを求める。演算装置９１は、求めた評価値ｖのデータおよび、このときの補正環３２の回転位置Ｃのデータを記憶部９２に記憶させて保持する。評価値ｖとして、例えば、画像のコントラストや、画像の信号強度（輝度）の積算値、画像の信号強度をフーリエ変換して得られる周波数成分の所定の周波数領域における積算値等を用いることができる。また、評価値ｖとして、同じ補正環３２の回転位置Ｃおよび対物レンズ３０Ａの位置Ｌの条件で複数回取得した画像間の相関値を用いてもよい。
【0064】
図１９は、補正環３２の回転位置Ｃを変えて求まる評価値ｖの一例を示すグラフである。図１９に示すように、補正環３２の回転位置Ｃを変える規定回数を初期状態の補正環位置ＣＡ０から４回とした場合、まず、顕微鏡制御部８０Ａは、試料ＴＰの基準画像ＴＩ（ＣＡ）を取得する。これに加え、顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２を基準補正環位置ＣＡから所定の初期回転量だけ回転移動させた初期状態の補正環位置ＣＡ０において、対物レンズ３０Ａの位置を初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０および４つの位置ＬＡ１～ＬＡ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。情報処理装置９０の演算装置９１は、これらの評価用画像のうち、図１９の左側から１番目の△印で示した、相関値が最大となる初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０での評価用画像を、初期状態の補正環位置ＣＡ０での評価用画像ＴＩ（ＣＡ０）として選択する。
【0065】
顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２を初期状態の補正環位置ＣＡ０から第１の回転量だけ回転移動させた回転位置ＣＡ１において、対物レンズ３０Ａの位置を初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０および４つの位置ＬＡ１～ＬＡ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。情報処理装置９０の演算装置９１は、これらの評価用画像のうち、図１９の左側から２番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置ＬＡ１での評価用画像を、補正環３２の回転位置ＣＡ１での評価用画像ＴＩ（ＣＡ１）として選択する。顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２を初期状態の補正環位置ＣＡ０から第２の回転量だけ回転移動させた回転位置ＣＡ２において、対物レンズ３０Ａの位置Ｌを初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０および４つの位置ＬＡ１～ＬＡ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。情報処理装置９０の演算装置９１は、これらの評価用画像のうち、図１９の左側から３番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置ＬＡ２での評価用画像を、補正環３２の回転位置ＣＡ２での評価用画像ＴＩ（ＣＡ２）として選択する。
【0066】
顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２を初期状態の補正環位置ＣＡ０から第３の回転量だけ回転移動させた回転位置ＣＡ３において、対物レンズ３０Ａの位置Ｌを初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０および４つの位置ＬＡ１～ＬＡ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。情報処理装置９０の演算装置９１は、これらの評価用画像のうち、図１９の左側から４番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置ＬＡ３での評価用画像を、補正環３２の回転位置ＣＡ３での評価用画像ＴＩ（ＣＡ３）として選択する。顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２を初期状態の補正環位置ＣＡ０から第４の回転量だけ回転移動させた回転位置ＣＡ４において、対物レンズ３０Ａの位置Ｌを初期状態の対物レンズｚ位置ＬＡ０および４つの位置ＬＡ１～ＬＡ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。情報処理装置９０の演算装置９１は、これらの評価用画像のうち、図１９の左側から５番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置ＬＡ４での評価用画像を、補正環３２の回転位置ＣＡ４での評価用画像ＴＩ（ＣＡ４）として選択する。情報処理装置９０の演算装置９１は、選択した評価用画像データに基づいて、初期状態の補正環位置ＣＡ０および、初期状態の補正環位置ＣＡ０から１～４回だけ移動させた回転位置ＣＡ１～ＣＡ４での評価値ｖを求めることができる。
【0067】
ステップＳＴ２２４において、情報処理装置９０の演算装置９１は、記憶部９２に記憶された補正環３２の複数の回転位置での評価値ｖに基づいて、補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳを求める。具体的には、演算装置９１は、補正環３２の複数の回転位置に対する評価値ｖをプロットした散布図を作成する。そして、演算装置９１は、図１９に示すように、このプロットに対して補間または関数近似を行うことで、評価値ｖが最大となる補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳを求める。演算装置９１は、求めた補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳのデータを、顕微鏡制御部８０Ａの補正環制御部８８へ出力する。補間を行う方法としては、例えば、補正環３２の複数の回転位置ＣＡ０～ＣＡ４に対する評価値ｖのプロットに対しラグランジュ補間やスプライン補間をする方法がある。関数近似を行う方法としては、例えば、最小二乗法により、補正環３２の複数の回転位置ＣＡ０～ＣＡ４に対する評価値ｖのプロットを二次曲線やガウス関数にフィッティングする方法がある。必要に応じて、求めた最適補正環位置ＣＰＳを記憶部９２に保持してもよい。
【0068】
ステップＳＴ２２５において、顕微鏡制御部８０Ａの補正環制御部８８は、補正環駆動部６３へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部６３は、補正環３２をステップＳＴ２２４で求めた最適補正環位置ＣＰＳへ回転移動させる。
【0069】
ステップＳＴ２２６において、顕微鏡制御部８０Ａは、補正環３２が最適補正環位置ＣＰＳに回転移動した状態で、対物レンズ３０Ａの位置Ｌを変化させた、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像を取得する。このとき、顕微鏡制御部８０Ａの対物ｚ位置制御部８５は、対物ｚ位置駆動部６２へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物ｚ位置駆動部６２は、対物レンズ３０Ａをｚ方向に移動させる。それぞれの対物レンズ３０Ａの位置において、顕微鏡制御部８０Ａは、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部８０Ａの検出制御部８２は、検出部５１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部５１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部８０Ａの検出制御部８２を介して情報処理装置９０の演算装置９１へ出力する。情報処理装置９０の演算装置９１は、検出制御部８２から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２４による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像を生成する。情報処理装置９０の演算装置９１は、生成した試料ＴＰの評価用ｚスタック画像データを記憶部９２へ出力する。
【0070】
ステップＳＴ２２７において、情報処理装置９０の演算装置９１は、記憶部９２に記憶された試料ＴＰの基準画像データと、ステップＳＴ２２６で生成した試料ＴＰの評価用ｚスタック画像データとの相関値をそれぞれ求める。演算装置９１は、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像のうち、相関値が最大となる画像が得られる対物レンズ３０Ａの位置を、最適対物レンズｚ位置ＬＰＳとして求める。なお、演算装置９１は、対物レンズ３０Ａの複数の位置に対する相関値をプロットした散布図を作成してもよい。そして、演算装置９１は、このプロットに対して補間または関数近似を行うことで、相関値が最大となる対物レンズ３０Ａの位置を、最適対物レンズｚ位置ＬＰＳとして求めるようにしてもよい。必要に応じて、求めた最適対物レンズｚ位置ＬＰＳを記憶部９２に保持してもよい。
【0071】
第２実施形態によれば、２つの対物レンズｚ位置のうちの一方の対物レンズｚ位置でマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際に生じるｚ方向のフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を求めることができる。求めた試料屈折率は、顕微鏡装置１Ａにおける装置パラメータを最適化するために利用することができる。
【0072】
［第３実施形態］
第３実施形態について説明する。第３実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第３実施形態について説明する。第３実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0073】
図２０は、第３実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。この図２０に基づき、第３実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第３実施形態に係る試料屈折率測定方法では、試料屈折率が試料ＴＰの複数の深さ領域（例えば、階層状の領域）ごとに異なる場合において、深さ領域ごとの試料屈折率を算出する。ステップＳＴ３０１～ステップＳＴ３０９においては、第１実施形態におけるステップＳＴ１０１～ステップＳＴ１０９と同様の処理が行われる。
【0074】
ステップＳＴ３１０において、試料ＴＰの深さ領域ごとの屈折率値を算出する。この屈折率値の算出は、例えば、次のように行う。概略的には、まず、図２１に示すように、ステップＳＴ３０２で設定した対物レンズｚ位置Ｌと、ステップＳＴ３０８でそれぞれの対物レンズｚ位置Ｌにおいて算出したフォーカス位置のずれ量（ここではΔＬＴと称する）との対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを直線でフィッティングする。試料屈折率が深さ領域ごとに異なる場合、深さ領域ごとに、対物レンズz位置Ｌとフォーカス位置のずれ量ΔＬとの比（Ｌ－ΔＬ変化比ｍｆｃ）が異なる。そこで例えば、深さ領域ごとに異なる複数の直線を表すモデルを用いてこのプロットをフィッティングすることによって、複数の深さ領域ごとの試料屈折率を求める。
【0075】
具体的には、ステップＳＴ３０３からステップＳＴ３０９で取得したＮ個の対物レンズz位置Ｌと対応するフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの組み合わせを、（Ｌ（ｉ），ΔＬＴ（ｉ））とする（ｉはデータを表すインデックスでありｉ＝０，１,…，Ｎ－１。またＬ(ｉ)＜Ｌ(ｉ＋１)とする)。このＮ個のデータをＭ（Ｍ＜Ｎ）本の直線でフィッティングすることで、各直線の傾きを深さ領域ごとのＬ－ΔＬ変化比として求める。図２１は、９個のデータを３本の直線でフィッティングしている状態を例示している。この際、異なる直線の交点（隣接する深さ領域の境界）となる対物レンズz位置Ｌもパラメータとし、後述する評価関数を最小にするよう境界を選ぶ。このとき傾きの異なるＭ個の直線からなる対物レンズｚ位置Ｌとフォーカス位置のずれ量ΔＬＴとの関係のモデルを、下記の式（４）で表す。
【0076】
【数4】
【0077】
ここで、ａ０，ａ１，…，ａＭ－１は直線の傾き、ｂ０，ｂ１，…，ｂＭ－１は直線の切片を表すＭ個のパラメータである。Ｉ１，…，ＩＭ－１は１つの直線が含むデータのインデックスを表す整数であり、０＜Ｉ１＜Ｉ２＜…＜ＩＭ－１＜Ｎ－１である。上記モデルはａｍ，ｂｍ，Ｉｍの（３Ｍ－１）個のパラメータからなる。取得データ（Ｌ（ｉ），ΔＬＴ（ｉ））を最もよく表す個数Ｍおよび（３Ｍ－１）個のパラメータを、下記の式（５）で表される評価関数を最小にするように選択する。
【0078】
【数5】
【0079】
ここで、αＭは取得データを表現する直線の数を増やすことによるペナルティーの項である。係数αの値は、例えば、屈折率が既知の試料などを用いて、最も精度よく屈折率を算出できる値を予め定めておく。
【0080】
以上のようにして求めた傾きａ０，ａ１，…，ａＭ－１から、第1実施形態におけるステップＳＴ１１０と同様に、設定用データテーブルＤＢ１を参照することによりＭ個の試料屈折率値ｎ０，ｎ１，…，ｎＭ－１を求めることが可能である。なお、試料屈折率の異なるz方向の領域（深さ領域）の数Ｍが既知の場合は、Ｍを固定してもよい。また、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０の焦点があるときの対物レンズz位置Ｌは以下のようにして求める。試料屈折率ｎｊとｎｊ＋１の境界面に対物レンズ３０の焦点があるときの対物レンズz位置をＬｊとすると、Ｌｊは求めた二つの直線、ΔＬＴ＝ａｊＬ＋ｂｊとΔＬＴ＝ａｊ＋１Ｌ＋ｂｊ＋１との交点の対物レンズｚ位置Ｌとして求められる。このようにしてＭ－１個の屈折率境界となる対物レンズz位置（Ｌｂ０，Ｌｂ１，…，ＬｂＭ－２と称する）を求めることができる。
【0081】
ステップＳＴ３１１において、求めた複数の試料屈折率値と屈折率が変化する境界となる対物レンズz位置Ｌを表示部９５に表示されるＧＵＩ上に表示することでユーザーに提示する。例えば図２２に示すように、屈折率値と対物レンズz位置を数値と図で表して表示してもよい。
【0082】
第３実施形態によれば、複数の対物レンズｚ位置でマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際に生じるｚ方向のフォーカス位置のずれ量に基づき試料ＴＰの深さ領域ごとの屈折率を求めることができる。求めた試料屈折率は、顕微鏡装置１における装置パラメータを最適化するために利用することができる。
【0083】
［第４実施形態］
第４実施形態について説明する。第４実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第４実施形態について説明する。第４実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0084】
第４実施形態では、マスク２７において変更するマスクパターンが第１～第３実施形態で用いるものとは異なる。そして、マスクパターンを変更したときに対物レンズ３０を含む光学系のフォーカス位置のずれが、ｚ方向へ生じるのではなくｘｙ方向へ生じるようにし、このｘｙ方向へのフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を算出する。第４実施形態で用いるマスクパターンの例として、図２３には、マスクパターンＭＰ３，ＭＰ４を示している。マスクパターンＭＰ３は、半円環状の光通過領域（白色で示す領域）がｘ方向負の側に配置され、半円板状の光透過領域（白色で示す領域）がｘ方向正の側に配置されている。マスクパターンＭＰ４は、マスクパターンＭＰ３とはｘ方向に対称的に、半円環状の光通過領域がｘ方向正の側に配置され、半円板状の光透過領域がｘ方向負の側に配置されている。
【0085】
図２４には、球面収差を有する波面Ｗ（ｘ，ｙ）の形状と、波面Ｗ（ｘ，ｙ）をｘ方向に微分したときの形状（波面微分ΔｘＷ（ｘ，ｙ）と称する）を模式的に表している。波面Ｗ（ｘ，ｙ）の図において、例えば、濃度が低い（明るい）領域は紙面手前側に凸の領域となり、濃度が高い（暗い）領域は紙面手前側に凹の領域となる。また、波面微分ΔｘＷ（ｘ，ｙ）の図において、例えば、濃度が低い（明るい）領域はｘ方向への傾きが正（＋）の領域となり、濃度が高い（暗い）領域はｘ方向への傾きが負（－）の領域となる。波面Ｗ（ｘ，ｙ）がマスクパターンＭＰ３に入射すると、波面微分ΔｘＷ（ｘ，ｙ）において傾きが負となる部分がマスクパターンＭＰ３を通過し、傾きが正となる部分は遮光される。一方、波面Ｗ（ｘ，ｙ）がマスクパターンＭＰ４に入射すると、波面微分ΔｘＷ（ｘ，ｙ）において傾きが正となる部分がマスクパターンＭＰ４を通過し、傾きが負となる部分は遮光される。そのため、波面Ｗ（ｘ，ｙ）がマスクパターンＭＰ３を通過したときと、マスクパターンＭＰ４を通過したときとでは、波面Ｗ（ｘ，ｙ）全体のｘ方向の傾きが異なり、これによりｘ方向にフォーカス位置のずれが生じる。第４実施形態では、マスクパターンＭＰ３のときと、マスクパターンＭＰ４のときとのフォーカス位置のｘｙ方向のずれ量を求め、そのｘｙ方向のずれ量に基づき、試料屈折率を算出する。
【0086】
図２５は、第４実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。この図２５に基づき、第４実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。まず、ステップＳＴ４０１において、試料屈折率ｎとＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃとの関係を表す設定用データテーブルＤＢ２（図２６を参照）を予め作成しておく。Ｌ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃとは、対物レンズｚ位置Ｌと、マスクパターンＭＰ３，ＭＰ４を変更した際のｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴとの比である。
【0087】
光学シミュレーションを行うことにより試料屈折率とＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃとの関係を求めることが可能である。具体的には、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、光学系の収差、試料中の観察深さを設定し、例えば、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置ＬＴとｘｙ位置（ＸＴ，ＹＴ）を求める。例えば、光路中にいずれのマスクパターンも設置されていない状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズｚ位置をＬＴ０、光路中にマスクパターンＭＰ３を設置した状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置をＬＴ１、ｘｙ位置を（ＸＴ１，ＹＴ１）、光路中にマスクパターンＭＰ４を配置した状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置をＬＴ２、ｘｙ位置を（ＸＴ２，ＹＴ２）とする。この場合、マスクパターンＭＰ３，ＭＰ４を切り替えた際のｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴは、下記の式（６）で求められる。
【0088】
【数6】
【0089】
例えば、複数の観察深さにおいて、対物レンズｚ位置ＬＴ０とｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴとを求め、ＬＴ０とΔＸＹＴとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして作成した散布図におけるプロットを例えば直線でフィッティングし、この直線の傾きを、Ｌ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃとして求める。複数の試料屈折率を設定し、それぞれの試料屈折率に応じてＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃを求めることで、設定用データテーブルＤＢ２を作成することが可能である。作成した設定用データテーブルＤＢ２は記憶部９２で保持する。なお、データテーブルは複数の波長や温度等の条件ごとに作成し保持しておき、観察条件に応じて使い分けてもよい。
【0090】
ステップＳＴ４０２～ＳＴ４０３においては、第１実施形態におけるステップＳＴ１０２～ステップＳＴ１０３と同様の処理が行われる。ステップＳＴ４０４において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ３に設定する。ステップＳＴ４０５において、ステップＳＴ４０３で選択したｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量算出ｚ位置Ｌｃにおける試料画像を撮影する。
【0091】
ステップＳＴ４０６において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ４に設定する。ステップＳＴ４０７において、ステップＳＴ４０３で選択したフォーカス位置ずれ量算出ｚ位置Ｌｃにおける試料画像を撮影する。第１実施形態とは異なり、２つ目のマスクパターンＭＰ４に設定した状態においてｚスタック画像を撮影する必要はなく、試料画像を１枚撮影するだけでもよい。
【0092】
ステップＳＴ４０８において、ステップＳＴ４０５で撮影した画像とステップＳＴ４０７で撮影した画像から画像のｘｙ方向のずれ量を算出する。例えば、ステップＳＴ４０５で撮影した画像と、ステップＳＴ４０７で撮影した画像間の相互相関関数を計算する。相互相関関数がピーク値となるｘｙ位置に基づき画像のずれ量を算出し、この画像のずれ量に基づきｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴを求める。この際、相互相関関数の補間または関数近似を行い、サブピクセルでのずれ量を算出してもよい。算出したｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴは、ステップＳＴ１０３で選択したｚ位置Ｌｃと共に記憶部９２に保持する。
【0093】
ステップＳＴ４０９において、ステップＳＴ４０２で設定した全ての対物レンズｚ位置についてｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴを算出したかどうか判断する。全てに対して算出済みでない場合（ステップＳＴ４０９：Ｎｏ）、はステップＳＴ４０３へ戻り、対物レンズｚ位置を次の位置へ移動させる。全てに対して算出済みの場合（ステップＳＴ４０９：Ｙｅｓ）はステップＳＴ４１０に進む。
【0094】
ステップＳＴ４１０において、試料屈折率値を算出する。この試料屈折率値の算出は、例えば、次のように行う。まず、図２７に示すように、ステップＳＴ４０２で設定した各対物レンズｚ位置Ｌと、それぞれの対物レンズｚ位置Ｌにおいて算出したｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量ΔＸＹＴとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを１本の直線ｆΔＸＹＴＥでフィッティングし、その直線ｆΔＸＹＴＥの傾きｍｓｃＥを算出する。この算出した傾きｍｓｃＥをステップＳＴ４０１で作成しておいた設定用データテーブルＤＢ２（図２６を参照）と照らし合わせることで、試料屈折率を求める。例えば、算出した傾きｍｓｃＥと最も値が近い設定用データテーブルＤＢ２上のＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃを選択し、その選択したＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃに対応する屈折率ｎの値を試料屈折率としてもよい。また、例えば設定用データテーブルＤＢ２上の屈折率ｎとＬ－ΔＸＹ変化比ｍｓｃとの関係を補間し、算出した傾きｍｓｃＥに対応する屈折率を算出してもよい。
【0095】
ステップＳＴ４１１において、ステップＳＴ４１０で算出した試料屈折率を表示部９５に表示されるＧＵＩ上に表示することでユーザーに提示する。なお、第１～第３実施形態においても、本実施形態と同様のマスクパターンＭＰ３，ＭＰ４を用い、対物レンズ３０，３０Ａを含む光学系のｚ方向のフォーカス位置のずれ量に代えて、ｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量（撮影した試料画像のＸＹ方向の位置ずれ量）に基づいて試料屈折率を算出してもよい。また、マスクパターンを切り替えたときのｚ方向のフォーカス位置のずれ量とｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量の両方の情報に基づいて試料屈折率を算出してもよい。
【0096】
第４実施形態によれば、複数の対物レンズｚ位置でマスクパターンＭＰ３，ＭＰ４を変更した際に生じるｘｙ方向のフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を求めることができる。また、求めた試料屈折率は、顕微鏡装置１における装置パラメータを最適化するために利用することができる。
【0097】
［第５実施形態］
第５実施形態について説明する。第５実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第５実施形態について説明する。第５実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第１実施形態における顕微鏡制御部８０および情報処理装置９０と同様である。上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0098】
第５実施形態では、２つのマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２のそれぞれを光路上に設定して試料ＴＰのｚスタック画像を撮影し、撮影された２つのzスタック画像（マスクパターンＭＰ１のときのzスタック画像とマスクパターンＭＰ２のときのzスタック画像）間のz方向の相対的な倍率（縮尺の違い）に基づき試料屈折率を測定する。２つのzスタック画像間のz方向の倍率は試料屈折率に応じて変わるため、その倍率から試料屈折率を算出することができる。
【0099】
図２８は、第５実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。この図２８に基づき、第５実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。まず、ステップＳＴ５０１において、試料屈折率ｎと、２つのzスタック画像間のz方向の倍率βzとの関係を表す設定用データテーブルＤＢ４（図２９を参照）を予め作成しておく。光学シミュレーションを行うことにより試料屈折率ｎと倍率βzとの関係を求めることが可能である。
【0100】
具体的には、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、光学系の収差、試料中の観察深さを設定し、例えば、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置ＬＴを求める。光路中にマスクパターンＭＰ１を設置した状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置をＬＴ１、光路中にマスクパターンＭＰ２を設置した状態で前記ストレール比を最大とする対物レンズのｚ位置をＬＴ２とする。複数の観察深さでＬＴ１とＬＴ２を求め、横軸をＬＴ１、縦軸をＬＴ２とした散布図を作成する。そしてこの散布図を例えば直線でフィッティングし、この直線の傾きを、z方向の倍率βzとして求める。複数の試料屈折率を設定してそれぞれ倍率βzを求めることで、試料屈折率ｎと倍率βzの関係を示す設定用データテーブルＤＢ４を作成することが可能である。作成した設定用データテーブルＤＢ４は記憶部９２で保持する。なお、データテーブルは複数の波長や温度の条件ごとに作成し保持しておき、観察条件に応じて使い分けてもよい。
【0101】
ステップＳＴ５０２において、ユーザーは図９に示すようなＧＵＩを利用して試料画像ＴＩを見ながら、zスタック画像を取得する観察領域ＲＯＩのｘｙ方向位置（ｘ方向位置およびｙ方向位置）、およびzスタック画像を取得する対物レンズz位置の可動範囲を決定し、ＧＵＩを利用して入力欄に入力する。本実施形態では第1実施形態で入力したフォーカス位置ずれ量算出z位置の代わりに、zスタック上端とzスタック下端の２つの対物レンズz位置を入力する。ユーザーがＧＵＩ上で開始ボタンを操作することで、ステップＳＴ５０３以降のステップへ進む。
【0102】
ステップＳＴ５０３において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ１に設定する。ステップＳＴ５０４において、ステップＳＴ５０２で設定したｘｙ位置と対物レンズz位置の可動範囲（zスタック上端とzスタック下端）に基づいて試料ＴＰのｚスタック画像（本発明に係る第１の画像に相当する）を取得する。
【0103】
ステップＳＴ５０５において、マスク２７におけるマスクパターンをマスクパターンＭＰ２に設定する。ステップＳＴ５０６において、ステップＳＴ５０４と同様に、試料ＴＰのｚスタック画像（本発明に係る第２の画像に相当する）を取得する。
【0104】
ステップＳＴ５０７において、ステップＳＴ５０４で取得したマスクパターンＭＰ１のときのｚスタック画像と、ステップＳＴ５０６で取得したマスクパターンＭＰ２のときのｚスタック画像との間のｚ方向の倍率βzを求める。ｚ方向の倍率βzは、例えば、以下の方法で求めることが可能である。まず、マスクパターンＭＰ１のときのｚスタック画像に基づき、マスクパターンＭＰ１のときのｘｚ断面画像ＺＳ１を作成するとともに、マスクパターンＭＰ２のときのｚスタック画像に基づき、マスクパターンＭＰ２のときのｘｚ断面画像ＺＳ２を作成する（図３０を参照）。そして、ｘｚ断面画像ＺＳ１をｚ方向に縮小または拡大した上で、ｘｚ断面画像ＺＳ２との画像相関値を計算し、最も相関値が高くなるときの拡大倍率または縮小倍率をｚ方向の倍率βzとして求める。
【0105】
また、ｚ方向の倍率βzは、例えば、以下の方法で求めることも可能である。まず、マスクパターンＭＰ１のときのｚスタック画像から、マスクパターンＭＰ１のときの任意の２つのz方向位置（ｚ１＿１、ｚ1＿２とする)のｘｙ断面画像を抽出する。また、マスクパターンＭＰ２のときのｚスタック画像から、マスクパターンＭＰ２のときの全てのz方向位置でのｘｙ断面画像を抽出する。そして、マスクパターンＭＰ１のときの２つのｘｙ断面画像が、マスクパターンＭＰ２のときのどのｚ方向位置でのｘｙ断面画像と相関値が高くなるのかに基づき、ｚ方向の倍率βzを求めることができる。具体的には、マスクパターンＭＰ１のときの２つのｘｙ断面画像それぞれと、マスクパターンＭＰ２のときの全てのz方向位置でのｘｙ断面画像との画像相関値を計算する。マスクパターンＭＰ１のときのz方向位置ｚ１＿１でのｘｙ断面画像と最も相関値が高いマスクパターンＭＰ２のときのｘｙ断面画像ｚ方向位置をｚ２＿１、マスクパターンＭＰ１のときのｚ方向位置ｚ１＿２でのｘｙ断面画像と最も相関値が高いマスクパターンＭＰ２のときのｘｙ断面画像ｚ方向位置をｚ２＿２とすると、倍率βzは、下記の式（７）を用いて求められる。
【0106】
【数7】
【0107】
ステップＳＴ５０８において、ステップＳＴ５０７で求めた倍率βｚをステップＳＴ５０１であらかじめ作成しておいた設定用データテーブルＤＢ４と照らし合わせることで、試料屈折率を求める。例えば、ステップＳＴ５０７で求めた倍率βｚと最も近い設定用データテーブルＤＢ４上の倍率βｚに対応する屈折率ｎの値を試料屈折率としてもよい。また、例えば設定用データテーブルＤＢ４上の屈折率ｎと倍率βｚとの関係を補間し、ステップＳＴ５０７で求めた倍率βｚに対応する屈折率を算出してもよい。
【0108】
ステップＳＴ５０９において、ステップＳＴ５０８で算出した試料屈折率を表示部９５に表示されるＧＵＩ上に表示することでユーザーに提示する。算出した試料屈折率値は記憶部９２に保持しておき、別の処理に用いてもよい。なお、本実施形態において、複数の深さ領域ごとにｚ方向の倍率βzを算出し、各深さ領域の試料屈折率を算出してもよい。
【0109】
第５実施形態によれば、マスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更して撮影されたzスタック画像間の倍率に基づき試料屈折率を求めることができる。求めた試料屈折率は、顕微鏡装置１における装置パラメータを最適化するために使用することができる。
【0110】
［第６実施形態］
第６実施形態について説明する。第６実施形態に係る顕微鏡装置は、第２実施形態に係る顕微鏡装置１Ａと同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第２実施形態における顕微鏡制御部８０Ａおよび情報処理装置９０と同様である。上述の第２実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第６実施形態について説明する。第６実施形態に係る顕微鏡装置は、第２実施形態に係る顕微鏡装置１Ａと同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第２実施形態における顕微鏡制御部８０Ａおよび情報処理装置９０と同様である。上述の第２実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0111】
第６実施形態では、第３実施形態に係る試料屈折率測定方法により求めることができる深さ領域ごとの複数の試料屈折率を利用して、深さ領域ごとに補正環位置を最適な状態に設定し、試料ＴＰのｚスタック画像の撮影を行う。以降、或る観察深さにおける補正環３２の最適位置をＣＰと称し、最適な対物レンズz位置をＬＰと称することがある。第６実施形態では、まず、或る１つの観察深さｄの位置に対物レンズ３０Ａを含む光学系のフォーカス位置があるときの、対物レンズ３０Ａのｚ位置Ｌを求める。次に、当該観察深さｄにおける補正環３２の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰを実験的に求める。そして、他の観察深さｄにおける補正環３２の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰを、第３実施形態で求めた深さ領域ごとの複数の試料屈折率および、試料屈折率の境界位置に対物レンズ３０Ａを含む光学系のフォーカス位置があるときの複数の対物レンズｚ位置に基づいて求める。
【0112】
第６実施形態において、情報処理装置９０の記憶部９２は、図３１に示す設定用データテーブルＤＢ３を記憶する。この設定用データテーブルＤＢ３は、図３１に示すように、試料ＴＰの屈折率ｎと、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰと、ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰと、Ｌ’－ｄ変化比ｍＬ’との関係を示すデータテーブルである（Ｌ’の詳細については後述する）。
【0113】
ここで、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰとは、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う補正環３２の最適補正環位置ＣＰの変化量との比である。例えば、図３２（Ａ）に示すように、試料の屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰは、直線ｆＣＰｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰは、直線ｆＣＰｎ１の傾きとは異なる直線ｆＣＰｎ２の傾きとして求まる。
【0114】
ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰとは、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰの変化量との比である。対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰとは、補正環３２の回転に伴う焦点ＰＦの位置の変位を補正した対物レンズ３０Ａの最適な位置である（図３３を参照）。例えば、図３２（Ｂ）に示すように、試料の屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと最適対物レンズｚ位置ＬＰとの関係は直線ｆＬＰｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと最適対物レンズｚ位置ＬＰとの関係は直線ｆＬＰｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰは、直線ｆＬＰｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰは、直線ｆＬＰｎ１の傾きとは異なる直線ｆＬＰｎ２の傾きとして求まる。
【0115】
Ｌ’－ｄ変化比ｍＬ’とは、観察深さｄの変化量と、観察深さdの変化に伴う対物レンズ３０Ａの位置Ｌ’の変化量との比である。対物レンズ３０Ａの位置Ｌ’とは、補正環の回転位置Ｃが一定であると仮定した場合における、対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの対物レンズ３０Ａのｚ位置である。例えば、図３２（Ｃ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと対物レンズ３０Ａのｚ位置Ｌ’との関係は直線ｆＬ’ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと対物レンズ３０Ａのｚ位置Ｌ’との関係は直線ｆＬ’ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＬ’－ｄ変化比ｍＬ’は、直線ｆＬ’ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬ’－ｄ変化比ｍＬ’は、直線ｆＬ’ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＬ’ｎ２の傾きとして求まる。
【0116】
なお、図３３に示すように、観察深さがｄｉから観察深さｄｉ＋１まで変位する際、補正環３２の回転位置をＣＰｉからＣＰｉ＋１まで変位させる場合には、対物レンズ３０Ａの位置をＬＰｉからＬＰｉ＋１まで変位させるものとする。図３４に示すように、観察深さがｄｉから観察深さｄｉ＋１まで変位する際、補正環３２の回転位置を一定の位置（Ｃ＝ＣＣＳＴ）に固定する場合には、対物レンズ３０Ａの位置をＬ’ｉからＬ’ｉ＋１まで変位させるものとする。補正環３２の回転位置が変位する場合の対物レンズ３０Ａの変位量（Ｌｉ＋１－Ｌｉ）は、補正環３２の回転位置が一定である場合の対物レンズ３０Ａの変位量（Ｌ’ｉ＋１－Ｌ’ｉ）とは異なる。
【0117】
図３５は、第６実施形態に係る試料屈折率測定方法を示すフローチャートである。この図３５に基づき、第６実施形態に係る試料屈折率測定方法および試料画像の取得方法について説明する。まず、ステップＳＴ６０１において、設定用データテーブルＤＢ３（本発明に係る第４の情報に相当する）を作成する。予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率について、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍＬ’を求めることで、設定用データテーブルＤＢ３を作成することが可能である。具体的には、光学シミュレーションを行うことによりＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰおよびＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰを求める。このときまず、或る試料ＴＰ中の観察深さｄにおいて、補正環３２の回転位置Ｃと対物レンズ３０Ａの位置Ｌとの２次元のパラメータ空間内で、結像状態が最良となる補正環３２の回転位置Ｃおよび対物レンズ３０Ａの位置Ｌを求める。具体的には、試料屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄなどを設定し、結像状態が最良となる補正環３２の回転位置（最適補正環位置ＣＰ）および対物レンズ３０Ａの位置（最適対物レンズｚ位置ＬＰ）を求める。結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。
【0118】
次に、複数の観察深さｄについて補正環３２の最適補正環位置ＣＰを求めることで、各観察深さｄと補正環３２の最適補正環位置ＣＰとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを例えば直線でフィッティングし、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰを求める。また、複数の観察深さｄについて対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰを求めることで、各観察深さｄと対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰとの対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを例えば直線でフィッティングし、ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰを求める。
【0119】
続いて、光学シミュレーションを行うことによりＬ’－ｄ変化比ｍＬ’を求める。このときまず、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄなどを設定し、補正環３２を任意の固定回転位置ＣＣＳＴで固定し、対物レンズｚ位置Ｌについての１次元のパラメータで、結像状態が最良となる対物レンズｚ位置Ｌ’を求める。結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。次に、複数の観察深さｄについて対物レンズｚ位置Ｌ’を求めることで、各観察深さｄと対物レンズｚ位置Ｌ’との対応点をプロットした散布図を作成する。そして、作成した散布図のプロットを例えば直線でフィッティングし、Ｌ’－ｄ変化比ｍＬ’を求める。補正環３２の任意の固定回転位置ＣＣＳＴには、例えば、ユーザーが最も高い頻度で観察を行うと予想される試料ＴＰ中の観察深さｄにおける、補正環の最適な回転位置が用いられてもよい。複数の試料屈折率を設定してＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰ、Ｌ’－ｄ変化比ｍＬ’を求めることで、試料屈折率毎にＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍＬＰ、Ｌ’－ｄ変化比ｍＬ’を求める。作成した設定用データテーブルＤＢ３は記憶部９２に保持しておく。
【0120】
ステップＳＴ６０２において、試料ＴＰの観察深さｄに応じて異なるＭ個の試料屈折率値ｎ０，ｎ１，…，ｎＭ－１および、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０Ａの焦点があるときのＭ－１個の対物レンズz位置Ｌｋ０，Ｌｋ１，…，ＬｋＭ－２を求める。ステップＳＴ６０２では、第３実施形態におけるステップＳＴ３０１～ＳＴ３１０と同様の処理が行われる（図２０を参照）。
【0121】
ステップＳＴ６０３において、補正環３２の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰを実験的に求める観察深さｄＳおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。ユーザーは、図９に示すように表示部９５に表示されるＧＵＩを利用して、試料画像ＴＩを見ながら、対物レンズｚ位置Ｌを入力する操作を入力部９４に対して行い、観察深さｄＳを設定する。また、ユーザーは、表示部９５に表示されるＧＵＩを利用して、試料画像ＴＩを見ながら、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９４に対して行い、観察領域ＲＯＩを設定する。ユーザーが、対物レンズｚ位置Ｌを入力する操作や、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９４に対して行うと、入力部９４は、これらの操作に対応する入力データを、演算装置９１を介して共焦点顕微鏡１０Ａの顕微鏡制御部８０Ａへ出力する。
【0122】
図３６は、対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦが、補正環３２の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄＳの位置にある状態を示す。図９を用いて説明したように、ユーザーは、補正環３２の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄＳが実際にはわからないため、観察深さｄＳは、対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦがこの観察深さｄＳの位置にあるときの対物レンズｚ位置ＬＳにより設定される。なお、観察深さｄＳのときの値を０とする相対的な観察深さを、相対観察深さｄｒと称することがある。補正環３２の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める、対物レンズｚ位置ＬＳおよび、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置は、手動に限らず、画像の信号強度（輝度値）やコントラストが高いこと等を条件として自動的に設定されるようにしてもよい。設定した対物レンズｚ位置ＬＳは記憶部９２に保持する。以下の説明では対物レンズｚ位置ＬＳが、ステップＳＴ６０２で求めた、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦがあるときのＭ－１個の対物レンズz位置Ｌｋ０，Ｌｋ１，…，ＬｋＭ－２からユーザーが予め任意に選択した場合を記述する。なお、対物レンズｚ位置ＬＳが、Ｌｋ０より大きい値を選択してもよい。
【0123】
ステップＳＴ６０４において、ユーザーが図９に示すＧＵＩ上で補正環調整「開始」を選択する操作を入力部９４に対して行うと入力部９４は、この操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の演算装置９１を介して共焦点顕微鏡１０Ａの顕微鏡制御部８０Ａへ出力する。そして、ステップＳＴ６０３で設定した観察深さｄＳ（対物レンズｚ位置ＬＳ）および観察領域ＲＯＩにおいて、補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳ（本発明に係る第５の情報に相当する）と最適対物レンズｚ位置ＬＰＳとを求める処理が開始される。最適補正環位置ＣＰＳと最適対物レンズｚ位置ＬＰＳは、第２実施形態におけるステップＳＴ２０４と同様の補正環位置自動調整処理（図１８を参照）を行い求める。求めた最適補正環位置ＣＰＳと最適対物レンズｚ位置ＬＰＳは、それぞれ記憶部９２に保持する。
【0124】
ステップＳＴ６０５において、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。図３４に示すように、ユーザーは、表示部９５に表示されるＧＵＩ（設定入力画面）を利用して、画像取得パラメータを入力する操作を入力部９４に対して行う。画像取得パラメータを入力する操作として、レーザーパワー（光源のパワー）、スキャンピッチ（スキャナ２４により走査される試料ＴＰにおける走査点の間隔）、スキャン点数(スキャナ２４により走査される試料ＴＰにおける走査点の数)を入力する操作が行われる。ユーザーは、表示部９５に表示されるＧＵＩを利用して、画像取得範囲を入力する操作を入力部９４に対して行う。画像取得範囲を入力する操作として、試料のｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズの上端位置ＬＴＰ、対物レンズの下端位置ＬＢＭを入力する操作が行われる。以下の説明では、ステップＳＴ６０２で求めた、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦがあるときのＭ－１個の対物レンズz位置Ｌｋ０，Ｌｋ１，…，ＬｋＭ－２のうち、最も小さい対物レンズz位置Ｌｋ０よりもＬＢＭが小さく（ＬＢＭ＜Ｌｋ０）、最も大きい対物レンズz位置ＬｋＭ－２よりもＬＴＰが大きい（ＬｋＭ－２＜ＬＴＰ）場合を記述する。なお、ＬＢＭがＬｋ０より大きい値を選択してもよい。
【0125】
ユーザーが、画像取得パラメータを入力する操作、画像取得範囲を入力する操作を入力部９４に対して行うと、これらの操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の演算装置９１は記憶部９２へ保存する。なお、ｚスタック画像は、対物レンズの上端位置ＬＴＰが設定されたときの対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦの位置から、対物レンズ３０Ａの下端位置ＬＢＭが設定されたときの対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦの位置までの間で取得される。
【0126】
ステップＳＴ６０６において、演算装置９１は記憶部９２に保持された設定用データテーブルＤＢ３と、ステップＳＴ６０２で求めて記憶部９２に保持したＭ個の試料屈折率値ｎ０，ｎ１，…，ｎＭ－１および、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦがあるときのＭ－１個の対物レンズz位置Ｌｋ０，Ｌｋ１，…，ＬｋＭ－２と、ステップＳＴ６０３で設定し記憶部９２に保持された対物レンズｚ位置ＬＳと、ステップＳＴ６０４で実験的に求め記憶部９２に保持された補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳと最適対物レンズｚ位置ＬＰｓと、ステップＳＴ６０５でユーザーにより入力され記憶部９２に保持された試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ３０Ａの上端位置ＬＴＰおよび、対物レンズ３０Ａの下端位置ＬＢＭとに基づいて、共焦点顕微鏡１０Ａの設定に関するパラメータリストＬＳ１を作成する（図３８を参照）。パラメータリストＬＳ１は、図３８に示すように、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さｄｒと、補正環３２の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰとの関係を示すリストである。
【0127】
パラメータリストを作成するには、まず、ステップＳＴ６０１で作成した設定用データテーブルＤＢ３に基づいて、ステップＳＴ６０２で求めたＭ個の試料屈折率値ｎ０，ｎ１，…，ｎＭ－１に対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰ０，ｍＣＰ1，…，ｍＣＰM-1、ＬＰ－ｄ変化比ｍLＰ０,ｍLＰ1，…，ｍLＰM-1、およびＬ’－ｄ変化比ｍL’０，ｍL’1，,…，ｍL’M-1を求める。屈折率ｎ０，ｎ１，…，ｎＭ－１と合致する屈折率の値が、設定用データテーブルにない場合、設定用データテーブルにおける屈折率の近傍の屈折率の値に対して補間を行うことで、ＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰ０，ｍＣＰ1，…，ｍＣＰM-1、ＬＰ－ｄ変化比ｍLＰ０,ｍLＰ1，…，ｍLＰM-1、およびＬ’－ｄ変化比ｍL’０，ｍL’1，,…，ｍL’M-1を求めるようにしてもよい。
【0128】
続いて求めたＭ個のＬ’－ｄ変化比ｍL’０，ｍL’1，,…，ｍL’M-1と下記の式（７），（８）に基づいて、屈折率が変化する境界面に対物レンズ３０Ａの焦点ＰＦがあるときのＭ－１個の対物レンズz位置Ｌｋ０，Ｌｋ１，…，ＬｋＭ－２を、それぞれ対応する試料ＴＰ中の相対観察深さｄｒｋ０，ｄｒｋ１，…，ｄｒｋＭ－１に変換する。以下の式（８），（９）では、補正環位置を固定した状態で得た対物レンズｚ位置をｍL’ｉ(ｉ＝０，１，…，Ｎ－１)で割ることで、対物レンズｚ位置を試料ＴＰ中の深さに変換することが可能である。
【0129】
【数8】
【0130】
続いて、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さの下端深さｄｒＢＭおよび相対観察深さの上端深さｄｒＴＰを下記の式（１０），（１１）から求める。なお、下記の式（１０），（１１）においてＬＰＳを減算する理由は、ステップＳＴ６０５のパラメータ設定が、補正環位置がＣＰＳにある状態で実行されるため、対物レンズｚ位置がＬＰＳのとき、対物レンズの焦点ＰＦは相対観察深さｄｒ＝０にあるためである。
【0131】
【数9】
【0132】
次に、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際に変化させる相対観察深さｄｒｊを求める。ここで、ｊは、１～Ｎ（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ）までの整数である。相対観察深さｄｒｊ（ｊ番目に取得される画像の相対観察深さ位置）は、下記の式（１２）を用いて求められる。下記の式（１２）では、ｊ番目の相対観察深さを求めるため、相対観察深さの下端深さｄｒＢＭに、ｚスタック画像の取得ステップ幅と画像取得インデックス（ｊ－１）とを掛けたものを加える。
【0133】
【数10】
【0134】
次に、各相対観察深さｄｒjに対応する補正環３２の最適補正環位置ＣＰjおよび対物レンズ３０Ａの最適対物レンズz位置ＬＰjを求める（図３９の関係に基づく）。補正環３２の最適補正環位置ＣＰjは、下記の式（１３）～（１５）を用いて求められる。下記の式（１３）～（１５）を用いる理由は、相対観察深さｄｒjとその深さでの補正環３２の最適補正環位置ＣＰｊとの関係が、相対観察深さｄｒjにおける試料屈折率ｎjに対応するＣＰ－ｄ変化比ｍＣＰjで決まるためである。
【0135】
【数11】
【0136】
対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰｉは、下記の式（１６）～（１８）を用いて求められる。
【0137】
【数12】
【0138】
そして、上記の式（１２）～（１８）を用いて求めた、相対観察深さｄｒｊと、補正環３２の最適補正環位置ＣＰｊと、対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰｊとの関係を示すリスト（本発明に係る第６の情報に相当する）を作成する。これにより、図３８に示すようなパラメータリストＬＳ１を作成することができる。
【0139】
ステップＳＴ６０７において、顕微鏡制御部８０Ａは、ステップＳＴ６０６で作成したパラメータリストＬＳ１に従って、補正環３２の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。
【0140】
第６実施形態によれば、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際、ｚ方向（対物レンズ３０Ａの光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、パラメータリストＬＳ１に従って、補正環３２の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ３０Ａの最適対物レンズｚ位置ＬＰとを変化させることができる。そのため、ｚ方向（対物レンズ３０Ａの光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、最適な収差補正を行うことができる。
【0141】
なお例えば、実際に試料ＴＰのｚスタック画像を取得するときのカバーガラスＣＧの厚みは、設定用データテーブルＤＢ３を作成する際に光学シミュレーションで設定したカバーガラスＣＧの厚みと異なっている場合がある。第６実施形態では、光学シミュレーションを行うことにより作成した設定用データテーブルＤＢ３と、或る一つの観察深さｄＳで実験的に求めた補正環３２の最適補正環位置ＣＰＳおよび対物レンズ３０Ａの最適位置ＬＰを用いることにより、他の観察深さ位置での補正環３２の最適補正環位置ＣＰｉおよび対物レンズ３０Ａの最適位置ＬＰｉを算出するので、補正環３２の最適補正環位置ＣＰｉおよび対物レンズ３０Ａの最適位置ＬＰｉを、光学シミュレーションだけを用いて算出する場合よりも精度よく算出することができる。
【0142】
［第７実施形態］
第７実施形態について説明する。図４０は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２の構成を示す図である。この顕微鏡装置２は、落射蛍光顕微鏡１１０と、情報処理装置１９０とを主体に構成される。落射蛍光顕微鏡１１０と情報処理装置１９０とは、互いにデータの送受信が可能に構成されている。以降の説明において、落射蛍光顕微鏡１１０の対物レンズ１３０の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。また、このｚ軸と垂直な面内において互いに直交する方向に延びる座標軸をそれぞれｘ軸およびｙ軸とする。
第７実施形態について説明する。図４０は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２の構成を示す図である。この顕微鏡装置２は、落射蛍光顕微鏡１１０と、情報処理装置１９０とを主体に構成される。落射蛍光顕微鏡１１０と情報処理装置１９０とは、互いにデータの送受信が可能に構成されている。以降の説明において、落射蛍光顕微鏡１１０の対物レンズ１３０の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。また、このｚ軸と垂直な面内において互いに直交する方向に延びる座標軸をそれぞれｘ軸およびｙ軸とする。
【0143】
落射蛍光顕微鏡１１０は、ステージ１１１と、光源１１７と、照明光学系１２０と、検出光学系１４０と、撮像素子１５１と、顕微鏡制御部１８０とを備える。ステージ１１１は、中央に開口部を有する板状に形成され、観察対象である試料ＴＰが載置されたカバーガラスＣＧを支持する。ステージ１１１には、ステージ駆動部１１２が設けられる。ステージ駆動部１１２は、ステージ１１１をｚ軸（対物レンズ１３０の光軸ＡＸ）と垂直な面内で移動させる。なお、ステージ駆動部１１２は、ステージ１１１をｚ軸（対物レンズ１３０の光軸ＡＸ）に沿って移動させてもよい。
【0144】
光源１１７は、試料ＴＰに含まれる蛍光物質を励起するための励起光を射出させる。光源１１７として、例えば、水銀ランプやＬＥＤ等が用いられる。
【0145】
照明光学系１２０は、光源１１７から射出された励起光で試料ＴＰを照明する。照明光学系１２０は、光源１１７側から順に、照明用レンズ１２１と、励起フィルタ１２２と、レンズ１２３と、ダイクロイックミラー１２４と、マスク１２７と、対物レンズ１３０とを有する。照明用レンズ１２１は、光源１１７から射出された励起光を略平行光にするためのコレクタレンズである。励起フィルタ１２２は、光源１１７から射出した光のうち、所定の波長域の励起光が透過し、他の波長の光（例、外光、迷光）の少なくとも一部を遮る特性を有する。レンズ１２３は、励起フィルタ１２２からの略平行光を集束させながらダイクロイックミラー１２４に導く。ダイクロイックミラー１２４は、光源１１７から射出された励起光が反射し、ステージ１１１上の試料ＴＰで発生した光のうち所定の波長帯の光（例えば、蛍光）が透過する特性を有する。マスク１２７（詳細後述）には、マスク切替部１２８が設けられる。
【0146】
対物レンズ１３０は、第1実施形態の対物レンズ３０と同様の構成であり、ステージ１１１の開口部およびカバーガラスＣＧを介して、ステージ１１１上の試料ＴＰと対向する。対物レンズ１３０とカバーガラスＣＧとの間隙部は、浸液で満たされるようになっているが、浸液に限らず、空気等の気体で満たされていてもよい。対物レンズ３０には、対物ｚ位置駆動部１６２が設けられる。対物ｚ位置駆動部１６２は、第1実施形態の対物ｚ位置駆動部６２と同様の構成であり、レボルバ（不図示）とともに対物レンズ１３０をｚ方向に上下移動させる。
【0147】
検出光学系１４０は、試料ＴＰで発生した蛍光を結像する。検出光学系１４０は、試料ＴＰ側から順に、対物レンズ１３０と、マスク１２７と、ダイクロイックミラー１２４と、蛍光フィルタ１４４と、結像レンズ１４５とを有する。蛍光フィルタ１４４は、試料ＴＰからの光のうち所定の波長帯の光（例えば、蛍光）が透過する特性を有する。蛍光フィルタ１４４は、例えば、試料ＴＰで反射した励起光、外光、迷光などの少なくとも一部を遮断する。結像レンズ１４５は、試料ＴＰからの蛍光を結像する。
【0148】
撮像素子１５１は、検出光学系１４０を介して、試料ＴＰで発生した蛍光を検出する検出部として機能する。撮像素子１５１として、例えば、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラ等が用いられる。撮像素子１５１は、撮像素子１５１に入射した光（蛍光）の光電変換を行い、光の検出信号として、その光の光量（明るさ）に対応するデータを生成する。撮像素子１５１は、生成したデータを顕微鏡制御部１８０の撮像素子制御部１８１（図４１を参照）へ出力する。情報処理装置１９０の演算装置１９１（図４１を参照）は、撮像素子１５１から入力された複数画素分のデータに基づき１つの画像データを生成し、ＲＡＭなどの記憶部１９２（図４１を参照）に記憶させる。このようにして、演算装置１９１は、試料ＴＰの画像を取得する。
【0149】
マスク１２７は、第1実施形態のマスク２７と同様の構成であり、試料ＴＰから発せられた蛍光の一部を透過させ一部を遮光する。マスク１２７は、検出光学系１４０における、試料ＴＰ中の１点から発せられた蛍光が略平行光となっている範囲内に配置される。なお、マスク１２７は照明光学系と検出光学系の共通光路に配置されてもよい。マスク切替部１２８は、第1実施形態のマスク切替部２８と同様の構成であり、マスク１２７における光を透過させる領域と遮断する領域の大きさや形状、配置等に関するマスクパターンを変更する。
【0150】
図４１は、第７実施形態に係る落射蛍光顕微鏡１１０の顕微鏡制御部１８０と情報処理装置１９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０は、本発明に係る演算制御部を構成する。顕微鏡制御部１８０は、撮像素子制御部１８１、対物ｚ位置制御部１８５、ステージ位置制御部１８６、およびマスク制御部１８７を有する。
【0151】
撮像素子制御部１８１は、撮像素子１５１と電気的に接続され撮像素子１５１を制御する。対物ｚ位置制御部１８５は、対物ｚ位置駆動部１６２と電気的に接続され対物ｚ位置駆動部１６２を制御する。ステージ位置制御部１８６は、ステージ駆動部１１２と電気的に接続されステージ駆動部１１２を制御する。マスク制御部１８７は、マスク切替部１２８と電気的に接続されマスク切替部１２８を制御する。なお、マスクの切り替えは自動での切り替えに限らない。例えば、ユーザーが手動でマスクを挿脱してマスクパターンを変更してもよい。
【0152】
情報処理装置１９０は、演算装置１９１および記憶部１９２を有する。演算装置１９１は、顕微鏡制御部１８０の各制御部１８１，１８５～１８７と電気的に接続されている。演算装置９１は、記憶部１９２に保持されている処理内容（プログラム）に従い処理を行い、接続されている各制御部１８１，１８５～１８７を制御する。記憶部１９２は、第1実施形態の記憶部と同様の構成であり、演算装置１９１が実行する処理内容や演算装置１９１から入力される各種データを記憶する。入力部１９４および表示部１９５は、それぞれ第1実施形態の入力部９４および表示部９５と同様の構成および機能を有する。情報処理装置１９０の演算装置１９１は、落射蛍光顕微鏡１１０の操作に必要なＧＵＩや、落射蛍光顕微鏡１１０の顕微鏡制御部１８０から出力された試料ＴＰの画像、算出した試料屈折率を表示部１９５に表示させる。
【0153】
次に、第７実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。検出光学系に収差があるとき、マスクパターンを変更することで、検出光の結像位置のみが変化する。以後、検出光の結像位置を、「フォーカス位置」と称する。第７実施形態に係る試料屈折率測定方法では、第１実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様、複数の観察深さ位置（対物レンズｚ位置Ｌ）において、マスク１２７のマスクパターンを変更した際に生じる、対物レンズ１３０を含む光学系のｚ方向のフォーカス位置のずれ量を求め、求めたフォーカス位置のずれ量に基づき試料ＴＰの屈折率を算出する。マスク１２７において変更するマスクパターンは、第１実施形態で用いたのと同様の２つのマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２である。第７実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第１実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図６を参照）、その詳細な説明は省略する。第７実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0154】
［第８実施形態］
第８実施形態について説明する。図４２は、第８実施形態に係る顕微鏡装置２Ａの構成を示す図である。この顕微鏡装置２Ａは、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と類似した構成であり、上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じまたは類似の符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。顕微鏡装置２Ａは、収差補正部１６０や顕微鏡制御部１８０Ａを有する落射蛍光顕微鏡１１０Ａを備えており、この点において、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と相違している。
第８実施形態について説明する。図４２は、第８実施形態に係る顕微鏡装置２Ａの構成を示す図である。この顕微鏡装置２Ａは、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と類似した構成であり、上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じまたは類似の符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。顕微鏡装置２Ａは、収差補正部１６０や顕微鏡制御部１８０Ａを有する落射蛍光顕微鏡１１０Ａを備えており、この点において、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と相違している。
【0155】
収差補正部１６０は、第２実施形態の収差補正部６０と同様の構成であり、対物レンズ１３０Ａの先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び試料中の観察深さなどに起因する球面収差を補正する。対物レンズ１３０Ａは、第２実施形態の対物レンズ３０Ａと同様の構成であり、収差補正レンズ（不図示）と、補正環１３２とを有する。収差補正レンズは、対物レンズ１３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動することで、対物レンズ１３０Ａの球面収差を変化させることが可能である。補正環１３２は、対物レンズ１３０Ａの鏡筒部に、対物レンズ１３０Ａの光軸ＡＸを中心に回転自在に設けられる。補正環１３２の回転に応じて、収差補正レンズが対物レンズ１３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動する。
【0156】
収差補正部１６０は、対物レンズ１３０Ａの収差補正レンズおよび補正環１３２と、撮像素子１５１とを含む。さらに、収差補正部１６０は、、補正環駆動部１６３と、対物ｚ位置駆動部１６２とを含む。補正環駆動部１６３は、例えば電動モータ（図示せず）を用いて構成される。補正環駆動部１６３は、補正環１３２を回転駆動し、補正環１３２の回転位置Ｃを変化させ、収差補正レンズを対物レンズ１３０Ａの光軸ＡＸに沿って移動させる。補正環駆動部１６３は、補正環１３２の回転位置Ｃを変化させて、収差補正レンズの光軸上の位置を変化させることにより、対物レンズ１３０Ａの球面収差を変化させる。対物ｚ位置駆動部１６２は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１のものと同様の構成および機能を有する。
【0157】
図４３は、落射蛍光顕微鏡１１０Ａの顕微鏡制御部１８０Ａと情報処理装置１９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。顕微鏡制御部１８０Ａおよび情報処理装置１９０は、本発明に係る演算制御部を構成する。第８実施形態に係る顕微鏡制御部１８０Ａは、第７実施形態に係る顕微鏡制御部１８０の構成に加えて補正環制御部１８８を備えており、この点において、第７実施形態に係る顕微鏡制御部１８０と相違している。補正環制御部１８８は、補正環駆動部１６３と電気的に接続され補正環駆動部１６３を制御する。
【0158】
次に、第８実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第８実施形態に係る試料屈折率測定方法では、第２実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様、２つの対物レンズｚ位置を設定し、一方の対物レンズｚ位置で補正環１３２を最適位置に調整した上で、もう一方の対物レンズｚ位置でマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２を変更した際のフォーカス位置のずれ量を求め、求めたフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を算出する。第８実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第２実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図１６を参照）、その詳細な説明は省略する。第８実施形態によれば、第２実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0159】
［第９実施形態］
第９実施形態について説明する。第９実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第９実施形態について説明する。第９実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0160】
次に、第９実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第９実施形態に係る試料屈折率測定方法では、第３実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様、試料屈折率が試料ＴＰの複数の深さ領域ごとに異なる場合において、深さ領域ごとの試料屈折率を算出する。第９実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第３実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図２０を参照）、その詳細な説明は省略する。第９実施形態によれば、第３実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0161】
［第１０実施形態］
第１０実施形態について説明する。第１０実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第１０実施形態について説明する。第１０実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0162】
次に、第１０実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第１０実施形態に係る試料屈折率測定方法では、マスク１２７において変更するマスクパターンを、第４実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様のマスクパターンＭＰ３，ＭＰ４（図２３を参照）としている。そして、マスクパターンを変更したときに対物レンズ１３０を含む光学系のフォーカス位置の位置ずれが、ｚ方向へ生じるのではなくｘｙ方向へ生じるようにし、このｘｙ方向へのフォーカス位置のずれ量に基づき試料屈折率を算出する。第１０実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第４実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図２５を参照）、その詳細な説明は省略する。第１０実施形態によれば、第４実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0163】
［第１１実施形態］
第１１実施形態について説明する。第１１実施形態に係る顕微鏡装置は、第８実施形態に係る顕微鏡装置２Ａと同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第８実施形態における顕微鏡制御部１８０Ａおよび情報処理装置１９０Ａと同様である。上述の第８実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第１１実施形態について説明する。第１１実施形態に係る顕微鏡装置は、第８実施形態に係る顕微鏡装置２Ａと同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第８実施形態における顕微鏡制御部１８０Ａおよび情報処理装置１９０Ａと同様である。上述の第８実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0164】
次に、第１１実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第１１実施形態に係る試料屈折率測定方法では、第９実施形態に係る試料屈折率測定方法により求めることができる深さ領域ごとの複数の試料屈折率を利用して、深さ領域ごとに補正環位置を最適な状態に設定し、試料ＴＰのｚスタック画像の撮影を行う。第１１実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第６実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図３２を参照）、その詳細な説明は省略する。第１１実施形態によれば、第６実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0165】
［第１２実施形態］
第１２実施形態について説明する。第１２実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
第１２実施形態について説明する。第１２実施形態に係る顕微鏡装置は、第７実施形態に係る顕微鏡装置２と同様であり、顕微鏡制御部および情報処理装置は、第７実施形態における顕微鏡制御部１８０および情報処理装置１９０と同様である。上述の第７実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。
【0166】
次に、第１２実施形態に係る試料屈折率測定方法について説明する。第１２実施形態に係る試料屈折率測定方法では、第５実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様、２つのマスクパターンＭＰ１，ＭＰ２のそれぞれを光路上に設定して試料ＴＰのｚスタック画像を撮影し、撮影された２つのzスタック画像間のz方向の倍率に基づき試料屈折率（観察深さによらず均一の屈折率とする）を測定する。第１２実施形態に係る試料屈折率測定方法の具体的な手順は、第５実施形態に係る試料屈折率測定方法と同様であり（図３７を参照）、その詳細な説明は省略する。第１２実施形態によれば、第５実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0167】
上述の各実施形態において、画像取得パラメータ、および画像取得範囲は、ユーザーの入力操作によって設定されるが、これに限られるものではない。例えば、これらのデータのうち少なくともいずれかは、記憶部等に記憶された、以前に試料ＴＰのｚスタック画像を取得したときのデータを参照して、自動的に設定されるようにしてもよい。
【0168】
上述の各実施形態において、対物レンズ先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び観察深さｄなどに起因する収差、または、対物レンズ先端から試料ＴＰまでの距離、及び観察深さｄなどに起因する収差を補正する収差補正素子として、収差補正レンズが用いられているが、これに限られるものではない。例えば、収差補正素子として、液体レンズ、デフォーマブルミラーおよび液晶素子等の他の位相変調素子が用いられてもよい。液体レンズは、照明光学系または検出光学系または２つの光学系の共通部分、あるいは対物レンズ内部に配置され、レンズの形状を変化させることにより、収差を補正する。デフォーマブルミラーおよび液晶素子等の位相変調素子は、照明光学系または検出光学系または２つの光学系の共通部分に配置され、試料ＴＰに対する照明光（励起光）および、試料ＴＰからの検出光（蛍光）のうち、少なくとも一方の位相を変調することにより、収差を補正する。
【0169】
位相変調素子には、収差の補正量を変更もしくは調整することが可能な調整部が設けられる。例えば、液体レンズに設けられる調整部は、液体レンズに印加される電圧値を制御することで、レンズの形状を変化させる。これにより、液体レンズによる収差の補正量を変更もしくは調整することができる。デフォーマブルミラーに設けられる調整部は、デフォーマブルミラーに印加される電圧値を制御することで、ミラーの形状を変化させる。これにより、デフォーマブルミラーによる、収差の補正量を変更もしくは調整することができる。液晶素子に設けられる調整部は、液晶素子に印加される電圧値を制御することで、液晶の分布を変化させる。これにより、液晶素子による収差の補正量を変更もしくは調整することができる。なお、１つの液晶素子が、収差補正とマスクの両方の役割を担ってもよい。
【0170】
上述の各実施形態において、入力部および表示部は、情報処理装置と別体に設けられた装置であるが、これに限られるものではない。例えば、入力部は、情報処理装置と一体的に設けられた装置（例えば、内蔵型のタッチパッド等）であってもよい。入力部は、表示部と一体的に設けられた装置（例えば、タッチパネル）であってもよい。表示部は、情報処理装置と一体的に設けられた装置であってもよい。
【0171】
上述の各実施形態において、顕微鏡装置に共焦点顕微鏡または落射蛍光顕微鏡が設けられているが、これに限られるのではない。例えば、共焦点顕微鏡に代えて二光子励起顕微鏡を用いてもよい。その場合、ダイクロイックミラーを光路のスキャナと対物レンズの間に配置し、ピンホールおよびピンホール駆動部を取り除いてもよい。顕微鏡装置に設けられる顕微鏡は、微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡、、超解像顕微鏡、暗視野顕微鏡、熱レンズ顕微鏡等であってもよい。また、顕微鏡装置に設けられる顕微鏡は、倒立顕微鏡に限らず、正立顕微鏡であってもよい。
【符号の説明】
【0172】
１，１Ａ，２，２Ａ 顕微鏡装置
１０，１０Ａ 共焦点顕微鏡
１１，１１１ ステージ
２０，１２０ 照明光学系
３０，３０Ａ，１３０，１３０Ａ 対物レンズ
３２，１３２ 補正環
４０，１４０ 検出光学系
５１ 検出部
８０，８０Ａ，１８０，１８０Ａ 顕微鏡制御部
９０，１９０ 情報処理装置
１１０，１１０Ａ 落射蛍光顕微鏡
１５１ 撮像素子
ＴＰ 試料
ＭＰ１～ＭＰ４ マスクパターン
１０，１０Ａ 共焦点顕微鏡
１１，１１１ ステージ
２０，１２０ 照明光学系
３０，３０Ａ，１３０，１３０Ａ 対物レンズ
３２，１３２ 補正環
４０，１４０ 検出光学系
５１ 検出部
８０，８０Ａ，１８０，１８０Ａ 顕微鏡制御部
９０，１９０ 情報処理装置
１１０，１１０Ａ 落射蛍光顕微鏡
１５１ 撮像素子
ＴＰ 試料
ＭＰ１～ＭＰ４ マスクパターン
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】