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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】有機化合物の構造解析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20231114BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 D
G01N33/68
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020078167
(22)【出願日】2020-04-27
(65)【公開番号】P2021173655
(43)【公開日】2021-11-01
【審査請求日】2022-08-12
(73)【特許権者】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001069
【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】田中 耕一
(72)【発明者】
【氏名】山本 卓志
(72)【発明者】
【氏名】山口 愛歩
(72)【発明者】
【氏名】泉 俊輔
【審査官】伊藤 裕美
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１６３１４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】再公表特許第２０１４／１６３１５３（ＪＰ，Ａ１）
【文献】特開２００９－２１０３５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５４２７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】再公表特許第２０１４／１６３１７９（ＪＰ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－１６６９９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１９２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３６９１１５（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２７／６０ － Ｇ０１Ｎ ２７／７０
Ｇ０１Ｎ ３３／６８ － Ｇ０１Ｎ ３３／９８
Ｈ０１Ｊ ４９／００ － Ｈ０１Ｊ ４９／４８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を用いて有機化合物の構造を解析する方法であって、解析対象の有機化合物を含む試料と所定のマトリックスとの混合比を、モル比で１：５～１：５０の範囲としてサンプルを調整するサンプル調製工程と、
調製された前記サンプルに、その照射径が１５μm以下であるレーザー光を照射することにより、該サンプル中の試料成分由来のイオンを生成し、生成されたイオンを質量分析する分析工程と、
前記分析工程において得られたマススペクトルから、インソース分解によるプロダクトイオンを含むイオンを検出し、該イオンの情報に基いて前記解析対象の有機化合物の構造を推定する解析工程と、
を有する、有機化合物の構造解析方法。
【請求項2】
前記有機化合物はペプチド、タンパク質、又は糖鎖である、請求項１に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項3】
前記有機化合物はペプチドであり、前記プロダクトイオンは、ペプチドの主鎖が切断されることにより生成されるイオンと、ペプチドの側鎖が切断されることにより生成されるイオンと、の両方を含む、請求項２に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項4】
前記マトリックスは、紫外レーザー光を吸収するための部分構造、プロトン又はカチオンを供与するための部分構造、及び、溶媒に溶解可能であるための部分構造、を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項5】
前記紫外レーザー光を吸収するための部分構造は芳香族環、前記プロトン又はカチオンを供与するための部分構造はカルボキシル基、前記溶媒に溶解可能であるための部分構造は水酸基である、請求項４に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項6】
前記マトリックスは、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸、又は、２，５－ジヒドロキシ安息香酸である、請求項４又は５に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項7】
前記サンプル調製工程では、Dried-Droplet法又はThin-Layer法によりサンプルを調製する、請求項１～６のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項8】
前記サンプル調製工程では、その表面が平滑で且つ清浄であるガラス製のサンプルプレート上にサンプルを調製する、請求項１～７のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法。
【請求項9】
前記サンプル調製工程において調製されたサンプルに対し、レーザー光の照射径を１５μm以下と２５μm以上とで切り替えてそれぞれ質量分析を行い、前者の質量分析の結果に基いて該サンプル中の解析対象の有機化合物の構造情報を得る一方、後者の質量分析の結果に基いて該有機化合物の分子量情報を得る、請求項１に記載の有機化合物の構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、質量分析を利用した有機化合物の構造解析方法に関し、特に、ペプチドやタンパク質、糖鎖などの構造を解析するのに好適な方法に関する。
【背景技術】
【0002】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：ＭＡＬＤＩ）によるイオン源を用いた質量分析装置（以下「ＭＡＬＤＩ質量分析装置」という）では、解析対象である試料とマトリックス（Matrix）と呼ばれるイオン化補助剤とを混合することで調製したサンプルに、レーザー光を短時間照射することで該サンプル中の試料成分を気化させつつイオン化し、生成されたイオンを質量分離器に導入してその質量電荷比m/zに応じて分離して検出する。
【0003】
ＭＡＬＤＩ法は一般に、難揮発性化合物をあまり分解することなくイオン化することが可能な、ソフトなイオン化法として知られている。そのため、ＭＡＬＤＩイオン源と、質量分解能や質量精度が高い飛行時間型質量分離器とを組み合わせた質量分析装置は、タンパク質、ペプチドなどの生体由来の化合物から生成された分子イオン（例えばプロトン付加分子［Ｍ＋Ｈ］＋：ここでＭは解析対象である試料分子を表す）を測定し、分子量情報を取得するのにしばしば用いられる。こうした測定の際には、検出感度を重視し、レーザー光の照射径を敢えて大きめ（例えばφ５０～２００μm）にすることで、１回のレーザー光照射によって発生するイオンの量を多くするようにしている。
【0004】
一方、ペプチドのアミノ酸配列や糖鎖の構造などを解析するには、ペプチドや糖鎖を意図的に分解し、それにより生成される多様な部分構造物の質量情報を取得する必要がある。そのために広く利用されているのが、低エネルギー衝突誘起解離（Low-energy Collision Induced Dissociation）、高エネルギー衝突誘起解離（High-energy Collision Induced Dissociation）などの解離手法を利用したＭＳ／ＭＳ分析（又はｎが３以上のＭＳn分析）である。
【0005】
例えば非特許文献１等に開示されているイメージング質量分析装置は、大気圧雰囲気の下でイオン化を行う大気圧ＭＡＬＤＩイオン源と、イオントラップと、飛行時間型質量分離器と、を備える。真空雰囲気の下でイオン化を行う真空ＭＡＬＤＩイオン源ではなく大気圧ＭＡＬＤＩイオン源を用いるのは、生体組織切片などの生体試料を乾燥させずにそのまま分析するためである。一般に、大気圧ＭＡＬＤＩ法では真空ＭＡＬＤＩ法に比べて、イオン化の際のイオンの分解が抑制される傾向がある。そこで、上述したイメージング質量分析装置では、生体試料中の目的化合物の質量情報を取得したい場合には、大気圧ＭＡＬＤＩイオン源で生成された目的化合物由来のイオンをイオントラップで解離させることなく飛行時間型質量分離器で質量分離して検出する。一方、上記目的化合物の構造解析を行いたい場合には、大気圧ＭＡＬＤＩイオン源で生成された目的化合物由来のイオンをイオントラップにおいて低エネルギーＣＩＤにより解離し、それにより生成されたプロダクトイオンを飛行時間型質量分離器で質量分離して検出する。
【0006】
目的化合物がペプチドである場合、こうしたＭＳ／ＭＳ分析によって得られるマススペクトルには、ペプチドの主鎖が切断された、アミノ酸配列情報を表すａ系列、ｂ系列、ｃ系列、ｙ系列などのプロダクトイオンが多く観測される。しかしながら、低エネルギーＣＩＤを行うと、Ｎ末端やＣ末端を含まないインターナルフラグメントイオンや、複数個所で結合が切断されたイオン（例えばａ［-17］、ｂ［-17/18］）などが観測されることも多い。一方で、構造異性体のアミノ酸であるロイシンとイソロイシンとを識別するのに有用なｄ系列、ｗ系列等の側鎖が切断されたプロダクトイオンは殆ど観測されない。そのため、上記マススペクトルでは、ペプチドについての詳細な構造解析を行うための情報が必ずしも十分でなく、構造解析がうまく行えない場合がある。
【0007】
一方、構造解析が可能なマススペクトルを取得可能な他の手法として、インソース分解（In-source decay：ＩＳＤ）と呼ばれる手法がある。ＭＡＬＤＩ法では、例えばレーザー光パワーを高める等、イオン化の際のエネルギーを高めたり、特殊なマトリックスを使用したりすることで、イオン化の際に、測定対象物質由来のイオンの解離が促進されることが知られている。インソース分解はこれを利用したものであり、イオントラップや衝突セルなどのイオン解離のための素子を用いることなく、プロダクトイオンが観測されるマススペクトルを得ることができる。
【0008】
どのような条件の下でどのようなインソース分解が生じるのかについて、従来、様々な研究が行われている。例えば非特許文献２には、マトリックスとして１，５－ジアミノナフタレン（1,5-Diaminonaphthalene、以下、慣用に従い「１，５－ＤＡＮ」という）を用い、一般的な真空ＭＡＬＤＩ法において試料とマトリックスとを混合する際のモル比に比べてマトリックスの割合がかなり少ない条件の下で真空ＭＡＬＤＩ法によるイオン化を行うことで、特殊なプロダクトイオンが生成され易いことが報告されている。しかしながら、該文献では、ｄ系列のイオンが観測可能であることは報告されていない。
【0009】
一方、非特許文献３には、マトリックスとして１，５－ＤＡＮや３－ヒドロキシ－２－ニトロ安息香酸（3-Hydroxy-2-Nitrobenzoic Acid、以下、慣用に従い「３Ｈ２ＮＢＡ」という）を用いた真空ＭＡＬＤＩ法において、ｄ系列イオンを含めたプロダクトイオンが得られることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【文献】「iMScope TRIO イメージング質量顕微鏡」、株式会社島津製作所、［online］、［2020年3月19日検索］、インターネット＜URL: https://www.an.shimadzu.co.jp/bio/imscope/index.htm＞
【文献】Mariko Yamakoshi、ほか１名、「オキサイダティブ・ ラディカル・ドリブン・クリーヴィジ・オブ・ペプタイド・バックボーン・コウズド・バイ・マトリックス-アシステッド・レーザー・デソープション／イオナイゼイション-イン-ソース・ディケイ・ウィズ・ロー・マトリックス-トゥー-ペプタイド・モラー・レシオズ（Oxidative radical driven cleavage of peptide backbone caused by matrix-assisted laser desorption/ionization-in-source decay with low matrix-to-peptide molar ratios）」、International Journal of Mass Spectrometry、2017年、Vol.422、pp.56-61
【文献】Yuko Fukuyama、ほか２名、「3-ハイドロキシー-2-ナイトロベンゾイック・アシッド・アズ・ア・マルディ・マトリックス・フォー・イン-ソース・ディケイ・アンド・エバルエイション・オブ・ジ・アイソマーズ（3-Hydroxy-2-Nitrobenzoic Acid as a MALDI Matrix for In-Source Decay and Evaluation of the Isomers）」、Journal of American Society for Mass Spectrometry、2018年、Vol.29、No.11、pp.2227-2236
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
しかしながら、上述したような従来のインソース分解によって得られるマススペクトルでは、一般に、マトリックスに由来する多様なクラスターイオン（例えば［ｎ×matrix＋Ｈ］+ ）が多量に観測され、それらがペプチドの構造解析の障害になる場合が多い。また、ＭＡＬＤＩ法にごく一般的に利用されているマトリックス（例えば α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid：ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（2,5-dihydroxybenzoic acid：ＤＨＢ）ではない特殊なマトリックスを用いるために、分析に手間が掛かる、コストが掛かるといった問題もある。
【0012】
本発明はこうした課題の少なくとも一つを解決するために成されたものであり、ペプチドや糖鎖などの有機化合物の詳細構造を解析するのに有用なプロダクトイオンについての情報を良好に得ることを主たる目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本願発明者は、ＭＡＬＤＩ質量分析における分析条件と得られるマススペクトルとの関係を実験的に調べる過程で、所定の条件の下で調製されたサンプルに対し、非特許文献１に記載のイメージング質量分析装置を用いた質量分析を行うと、ペプチドの構造解析に有用である多様なプロダクトイオンが多量に観測されることを見出した。また、実験を鋭意進めることにより、このようなプロダクトイオンを観測可能であることの主たる理由が、イメージング質量分析装置では空間分解能を高めることが重要であるために、サンプルに照射するレーザー光の照射径をかなり小さく絞ることができることにある、との知見が得られた。本願発明者はこうした知見に基き、本発明をするに至った。
【0014】
即ち、上記課題の一つを解決するために成された本発明の一態様は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を用いて有機化合物の構造を解析する方法であって、
解析対象の有機化合物を含む試料と所定のマトリックスとの混合比を、モル比で１：５～１：５０００の範囲としてサンプルを調製するサンプル調製工程と、
調製された前記サンプルに、その照射径が１５μm以下であるレーザー光を照射することにより、該サンプル中の試料成分由来のイオンを生成し、生成されたイオンを質量分析する分析工程と、
前記分析工程において得られたマススペクトルから、インソース分解によるプロダクトイオンを含むイオンを検出し、該イオンの情報に基いて前記解析対象の有機化合物の構造を推定する解析工程と、
を有する。
解析対象の有機化合物を含む試料と所定のマトリックスとの混合比を、モル比で１：５～１：５０００の範囲としてサンプルを調製するサンプル調製工程と、
調製された前記サンプルに、その照射径が１５μm以下であるレーザー光を照射することにより、該サンプル中の試料成分由来のイオンを生成し、生成されたイオンを質量分析する分析工程と、
前記分析工程において得られたマススペクトルから、インソース分解によるプロダクトイオンを含むイオンを検出し、該イオンの情報に基いて前記解析対象の有機化合物の構造を推定する解析工程と、
を有する。
【0015】
本発明における「解析対象である有機化合物」としては、例えば、ペプチド、糖鎖、タンパク質、脂質、核酸関連物質などが挙げられる。
【発明の効果】
【0016】
化合物の分子量情報を取得することを主たる目的としたＭＡＬＤＩ質量分析では、一般に、解析対象の化合物を含む試料とマトリックスとの混合比は、モル比で例えば１：１０００００程度又はそれ以上である。これに対し本発明では、試料とマトリックスとを混合する際の試料の割合が格段に多い。また、化合物の分子量情報を取得することを主たる目的としたＭＡＬＤＩ質量分析では、上述したように、レーザー光の照射径は例えば５０～２００μmであることが多い。これに対し本発明では、レーザー照射径は格段に小さく、高空間分解能でのイメージング質量分析を実施するための装置並みである。
【0017】
即ち、本発明は、従来の一般的なＭＡＬＤＩ質量分析では使用しないような条件の下でＭＡＬＤＩ法によるイオン化を行うことで、例えばペプチドにおいてはその主鎖のみならず、側鎖をも積極的に切断するようなインソース分解を生じさせ、構造解析に有用である多様なプロダクトイオンを生成させるものである。
【0018】
本発明によれば、低エネルギーＣＩＤ等を利用したＭＳ／ＭＳ分析を行うことなく、ペプチドや糖鎖などの有機化合物の詳細構造を解析するのに有用であるプロダクトイオンが良好に観測されるマススペクトルを得ることができる。より具体的には、マススペクトルにおいて概ねm/z ２００から最大で数千程度（この上限値は質量分析装置の方式等に依存するが、一般的には二、三千程度）までの質量電荷比範囲にプロダクトイオンが観測され得るマススペクトルを得ることができる。それにより、ＭＳ／ＭＳ分析が可能な装置を用いずに、より廉価である質量分析装置を用いて有機化合物の構造解析を行うことができる。また、ＭＳ／ＭＳ分析を実施する手間や時間を省き、効率良く、且つ高い精度で以て有機化合物の詳細構造を把握することができる。さらにまた、同じ装置でレーザー光の照射径を切り替えることで、同じ有機化合物についての分子量測定と構造解析との両方を行うことができるため、それによっても、有機化合物の解析の効率化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明に係る有機化合物の構造解析方法の作業手順を示すフローチャート。
【図2】本発明に係る有機化合物の構造解析方法を実施するための質量分析システムの一実施形態を示す概略構成図。
【図4】レーザー照射径が５μmである場合と２５μmである場合との実測マススペクトルの比較例を示す図。
【図5】インソース分解を利用した場合とＭＳ／ＭＳ分析を利用した場合との実測マススペクトルの比較例を示す図。
【図6】試料とマトリックスとの混合比が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図。
【図7】使用するマトリックスの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図。
【図8】使用するサンプルプレートの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図。
【図9】試料がGlu-Fibrinopeptide Bであるときのマススペクトルの実測例を示す図。
【図10】サンプルの結晶写真の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明に係る有機化合物の構造解析方法の一実施形態を、図面を参照して説明する。この構造解析方法は、解析対象の有機化合物を質量分析することで得られるマススペクトルに基いて、その有機化合物の化学構造を推定する方法である。
【0021】
図１は、本発明に係る有機化合物の構造解析方法の作業手順を示すフローチャートである。図２は、本発明に係る有機化合物の構造解析方法を実施するために用いられる質量分析システムの一例を示す概略構成図である。図３は、図２に示した質量分析システムにおけるイオン源の詳細な構成図である。
【0022】
［ペプチドの構造解析方法の概要］
ここでは一例として、解析対象である有機化合物はペプチドであるものとする。ペプチドは生体内から取り出されたもの、人工的に合成されたものの両方を含む。未知のペプチドの構造を推定する場合、主鎖が切断されることで生成された各種のプロダクトイオン（ａ系列、ｂ系列、ｃ系列、ｘ系列、ｙ系列、ｚ系列など）のみならず、側鎖が切断されることで生成された各種のプロダクトイオン（ｄ系列、ｖ系列、ｗ系列など）の情報を収集する必要がある。
ここでは一例として、解析対象である有機化合物はペプチドであるものとする。ペプチドは生体内から取り出されたもの、人工的に合成されたものの両方を含む。未知のペプチドの構造を推定する場合、主鎖が切断されることで生成された各種のプロダクトイオン（ａ系列、ｂ系列、ｃ系列、ｘ系列、ｙ系列、ｚ系列など）のみならず、側鎖が切断されることで生成された各種のプロダクトイオン（ｄ系列、ｖ系列、ｗ系列など）の情報を収集する必要がある。
【0023】
図１に示すように、目的のペプチドの構造解析をするに際し、ユーザーはまず、目的のペプチドを含む試料とＭＡＬＤＩ用のマトリックスとを用いて、分析対象のサンプルを調製する（ステップＳ１）。サンプル調製方法はごく一般的なDried-Droplet法やThin-Layer法などを利用し、用意されたサンプルプレートのウェル内にサンプルを形成する。
【0024】
次に、図２に示すような質量分析システムを用い、所定の分析条件の下で、ペプチドを含むサンプルに対する通常の質量分析、即ち、レーザー照射径を例えば２５μm以上に設定したイオン化を行うことで主としてプロトン付加分子［Ｍ＋Ｈ］+を生成したうえで、イオンの解離操作を伴わない質量分析を実行し（ステップＳ２）、所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルを取得する。そのあと、同じサンプルに対し、今度はレーザー照射径を例えば１５μm以下に設定したイオン化を行って質量分析を実施し、所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルを取得する（ステップＳ３）。
【0025】
ステップＳ３で実施される質量分析におけるイオン化法は、サンプルに含まれるペプチド由来のプロトン付加分子をインソース分解させるようなＭＡＬＤＩ法であり、それによって生成された多様なプロダクトイオンがマススペクトルにおいて観測される。つまり、上記ステップＳ３によるマススペクトルは実質的にはプロダクトイオンを多く含むマススペクトルである。
【0026】
一般的にペプチドの分子量は千弱から数千の範囲である。そのため、ステップＳ３によるマススペクトルには、m/z ２００程度から最大で数千程度までの質量電荷比範囲に主たるプロダクトイオンが観測される。そして、そのマススペクトルに含まれる各種のイオンの情報に基いて、目的のペプチドの構造を推定する処理を実行する（ステップＳ４）。
【0027】
上述した各ステップの流れは一般的なものである。重要なサンプル調製条件及びイオン化条件を、図１中のステップＳ１～Ｓ３の右方に示している。即ち、サンプル調製条件は、サンプル調製方法、使用するマトリックスの種類、使用するサンプルプレートの種類（材質）、試料とマトリックスとの混合比、などの少なくとも一つを含む。また、質量分析時のイオン化条件は、レーザー照射径、レーザーパワー、などの少なくとも一つを含む。これらについてはあとで詳しく述べる。
【0028】
なお、後述の実例から分かるように、ステップＳ３によるマススペクトルにもプロトン付加分子由来のピークは観測されることが多いため、このピークから分子量を求めることが可能である。その場合には、ステップＳ２の処理を省略できる場合もある。但し、プロトン付加分子の質量電荷比が大きい（ステップＳ３によるマススペクトルの質量電荷比範囲を超える）場合やその感度が低い場合には、ステップＳ２によるマススペクトルから分子量を求めるとよい。
【0029】
［使用される質量分析システム］
ここで、図２に示した質量分析システムについて説明する。このシステムは、測定部１、データ処理部４、分析制御部５、主制御部６、入力部７、及び表示部８、を含み、非特許文献１に記載のイメージング質量分析装置と実質的には同じである。測定部１は、大気圧ＭＡＬＤＩ－イオントラップ飛行時間型質量分析装置である。
ここで、図２に示した質量分析システムについて説明する。このシステムは、測定部１、データ処理部４、分析制御部５、主制御部６、入力部７、及び表示部８、を含み、非特許文献１に記載のイメージング質量分析装置と実質的には同じである。測定部１は、大気圧ＭＡＬＤＩ－イオントラップ飛行時間型質量分析装置である。
【0030】
通常、データ処理部４、分析制御部５、及び主制御部６は、パーソナルコンピューター又はより高性能なワークステーション等をハードウェア資源とし、該コンピューターにインストールされた専用の制御・処理ソフトウェアを該コンピューター上で動作させることでそれぞれの機能を達成する構成である。
【0031】
測定部１は、その内部が略大気圧雰囲気であるイオン化室２と、図示しない真空ポンプにより真空排気される真空チャンバー３と、を有する。イオン化室２の内部には、試料ステージ２１及びレーザー照射部２４が配置され、試料ステージ２１の上に、解析対象である試料を含むサンプル２３が形成されているサンプルプレート２２が載置される。イオン化室２と真空チャンバー３とは、細径のイオン輸送管３１により連通している。真空チャンバー３の内部には、イオンガイド３２、イオントラップ３３、飛行時間型質量分離器３４、及びイオン検出器３５が配置されている。
【0032】
なお、図１では、真空チャンバー３の内部は区切られていないが、飛行時間型質量分離器３４を高い真空度の下に置くために、イオン化室２側から順に真空度が高くなる多段差動排気系の構成としてもよい。
【0033】
図３に示すように、レーザー照射部２４は、紫外パルスレーザー光源２４１と、可変光学フィルター２４２と、ビームエキスパンダーを構成する第１レンズ２４３及び第２レンズ２４４と、対物レンズ２４５と、を含む。対物レンズ２４５は、図示しない移動機構により、図３中のＺ軸方向（光軸方向）に所定範囲で移動自在である。また、この対物レンズ２４５は焦点距離が２０～１００mm程度の短焦点レンズである。
【0034】
上記質量分析システムにおける質量分析動作を概略的に説明する。
図２に示すように、試料ステージ２１上には、上記ステップＳ１において調製されたサンプル２３を担持するサンプルプレート２２が載置される。ユーザーにより入力部７から分析開始の指示がなされると、分析制御部５の制御の下で、紫外パルスレーザー光源２４１はパルス状のレーザー光を射出する。レーザー光の半値幅は通常、１０nsec以下である。また、射出されるレーザー光の径は例えば１mm以下である。このレーザー光のパワーは可変光学フィルター２４２を通過する際に調整される。
図２に示すように、試料ステージ２１上には、上記ステップＳ１において調製されたサンプル２３を担持するサンプルプレート２２が載置される。ユーザーにより入力部７から分析開始の指示がなされると、分析制御部５の制御の下で、紫外パルスレーザー光源２４１はパルス状のレーザー光を射出する。レーザー光の半値幅は通常、１０nsec以下である。また、射出されるレーザー光の径は例えば１mm以下である。このレーザー光のパワーは可変光学フィルター２４２を通過する際に調整される。
【0035】
可変光学フィルター２４２を通過したレーザー光は、ビームエキスパンダーの第１レンズ２４３でその径が例えば１０mm程度まで一旦拡大される。そして、同じくビームエキスパンダーの第２レンズ２４４でレーザー光は平行光化され、対物レンズ２４５で絞られてサンプルプレート２２上のサンプル２３表面のごく小径の範囲に照射される。サンプル２３上でのレーザー照射径の大きさは対物レンズ２４５のＺ方向の位置によって異なるが、最小のレーザー照射径は例えば１５μm以下、好ましくは５μm程度又はそれ以下である。このようにサンプル２３上でのレーザー照射径を小さく絞ることができるのは、短焦点の対物レンズ２４５をサンプル２３に近い位置に配置することができるからであり、それは大気圧ＭＡＬＤＩ法を採用していることが主たる要因である。
【0036】
一般的な真空ＭＡＬＤＩイオン源を用いた飛行時間型質量分析装置（以下、「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ」と称す）では、レーザー光の照射によって生成されたイオンを直ぐにサンプル付近から引き出して加速し、飛行時間型質量分離器に導入する。そのため、サンプルに近接してイオン引出電極や加速電極を配置しなければならず、レーザー照射のための対物レンズをサンプルに近接して配置することが困難である。それ故に、例えば焦点距離が２００～３００mmという長焦点の対物レンズを用いるのが一般的であり、サンプル上でのレーザー照射径を微小径に絞ることが困難である。また、そもそも、一般的なＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳでは、レーザー光をサンプルに照射したときに生成されるイオンの量を増やして検出感度を向上させるために、レーザー照射径を敢えて大きめに設定することが多い。こうしたことから、一般的に、レーザー照射径は５０～２００μm程度である。
【0037】
これに対し、非特許文献１に記載のようなイメージング質量分析装置では、生体試料切片などを解析の対象とするためにイオン化法として大気圧ＭＡＬＤＩ法が採用されており、生成されたイオンを細径のキャピラリ管で吸引して後段へと輸送するため、図３に示したように、サンプルに近接して対物レンズを配置することができる。また、イメージング質量分析装置は、試料上の２次元領域内における所定の質量電荷比を有するイオンの強度分布を求めるものであり、その強度分布の空間分解能を高くするには、試料に照射されるレーザー光の照射径を小さく絞ることが必要である。そのため、図３に示したように、レーザー光を５μm程度の微小径まで絞ることが可能な構成が採用されており、こうした構成の測定部１を利用することで、一般的なＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳでは実現できないような、微小径のレーザー光の照射を実現することができる。
【0038】
サンプル２３に上述したような微小径のレーザー光が照射されるとき、次のようなメカニズムのインソース分解が生じると推察される。
【0039】
サンプル２３に微小径のレーザー光が照射されると、サンプル２３中から様々な微粒子が飛び出したり気化したりして、サンプル２３の表面ごく近傍に、それら微粒子や気体分子が混在するプルーム（plume）２６を形成する。レーザー照射径が小さいためにこのプルーム２６の径は小さく、その代わりに濃度は濃い（つまりは密度が高い）。また、レーザー光が照射されている時間は１０nsec以下であるため、プルーム２６における粒子密度の時間的な変化は非常に急峻である。即ち、サンプル２３の表面近傍におけるプルーム２６中の粒子濃度の変化や温度変化は時間的、空間的ともに非常に激しい。そのため、プルーム２６中では様々な激しい化学反応が生じ易く、インソース分解によって、ペプチドを構成するアミノ酸の主鎖のほか側鎖まで切断された多様なイオンが発生し易くなる。これにより、大きな照射径のレーザー光が照射された場合に比べても、目的のペプチドに由来する多種多様なプロダクトイオンが生成されると考えられる。
【0040】
なお、ここでは、イオン化の雰囲気が真空ではなく大気圧であることで、レーザー光の照射によりアブレーションされた粒子の拡散が或る程度抑制されることも、プルーム２６の径が小さい状態となる補助的な要因として考えられる。
【0041】
イオン輸送管３１の左端は略大気圧雰囲気、右端は真空雰囲気であるため、その両端の間には大きな圧力差があり、そのためにイオン輸送管３１を通してイオン化室２から真空チャンバー３内へと流れるガス流が形成されている。上記のようにサンプル２３から発生した各種のイオンは、このガス流に乗ってイオン輸送管３１に吸い込まれ、真空チャンバー３内へと送られる。このイオンはイオンガイド３２を経てイオントラップ３３内の空間に導入され、一旦イオントラップ３３の内部に集積される。そのあと、集積されたイオンは所定のタイミングで一斉にイオントラップ３３から放出され、飛行時間型質量分離器３４に導入される。飛行時間型質量分離器３４においてイオンは質量電荷比に応じて分離され、イオン検出器３５に到達する。イオン検出器３５は入射したイオンの量に応じた強度の信号を出力する。
【0042】
データ処理部４はイオン検出器３５による検出信号を受けてデジタルデータに変換し、イオン射出時点を起点とした飛行時間を質量電荷比に換算して、イオンの質量電荷比と強度との関係を示すマススペクトルを作成する。このマススペクトルは主制御部６を通して表示部８の画面上に表示される。また、データ処理部４では、作成されたマススペクトルから目的のペプチドに由来すると推測されるプロダクトイオンの情報を抽出し、その抽出されたプロダクトイオンの質量電荷比及び強度から、目的のペプチドのアミノ酸配列を含む構造を推定する。
【0043】
上述したように、イオン化時にインソース分解により、目的のペプチドに由来する多種多様なプロダクトイオンが生成されるため、マススペクトルにはそれらプロダクトイオンが数多く観測される。特に、ペプチドの主鎖が切断されたｂ系列やｙ系列のイオンのほか、側鎖が切断されたｄ系列やｗ系列などのイオンも観測される。それによって、ペプチドのアミノ酸配列を高い精度で推定可能であるほか、単に質量では区別できないロイシンとイソロイシンの区別も可能となる。また、特に、後述するような条件の下でサンプル調製を行うことで、通常、m/z ２００～最大数千程度の質量電荷比範囲に現れ易い、マトリックスが付加し合って発生するクラスターイオンの生成量を抑えることができる。こうしたマトリックスに由来するクラスターイオンが数多く、また高い強度でマススペクトルに現れると、ペプチドの構造解析の精度を低下させる大きな要因となる。これに対し、そうしたバックグラウンドイオンを抑えることで、ペプチドの構造解析の精度を向上させることができる。
【0044】
また、上記質量分析システムによれば、同じマトリックス試料混合物に対し、レーザー光の照射径を２５μm以上から１５μm以下に切り替えて質量分析を実行するだけで、目的のペプチドの分子量情報と構造情報との両方を得ることができるという利点がある。
【0045】
［サンプル調製及びイオン化の条件］
次に、本実施形態の構造解析方法を実施する際における、サンプル調製時及びイオン化時の適切な条件について、実測結果を交えて詳しく説明する。
図４～図９はいずれも、実際の装置を用いて得られた実測のマススペクトルを示す図である。また、図１０は、サンプルの結晶写真の一例を示す図である。質量分析システムとしては、非特許文献１に記載の島津製作所製「iMScope TRIO」を使用した。
次に、本実施形態の構造解析方法を実施する際における、サンプル調製時及びイオン化時の適切な条件について、実測結果を交えて詳しく説明する。
図４～図９はいずれも、実際の装置を用いて得られた実測のマススペクトルを示す図である。また、図１０は、サンプルの結晶写真の一例を示す図である。質量分析システムとしては、非特許文献１に記載の島津製作所製「iMScope TRIO」を使用した。
【0046】
＜サンプル調製方法＞
上述したようにサンプルの調製方法は、一般的な真空ＭＡＬＤＩ法で用いられているDried-Droplet法やThin-Layer法などの標準的な方法を利用することができる。即ち、このサンプル調製方法は、少なくとも試料及びマトリックスを含む溶液をサンプルプレートに滴下する、又は、少なくとも試料を含む溶液と少なくともマトリックスを含む溶液とを交互にサンプルプレートに滴下することにより、サンプルを調整する方法である。このとき、滴下する溶液の容量としては、好ましくは、０．５μL以上である。こうした方法により調製されたサンプルの表面には、図１０に示すように、１０μm程度以下の大きさの不揃いの結晶が多く観測される。
上述したようにサンプルの調製方法は、一般的な真空ＭＡＬＤＩ法で用いられているDried-Droplet法やThin-Layer法などの標準的な方法を利用することができる。即ち、このサンプル調製方法は、少なくとも試料及びマトリックスを含む溶液をサンプルプレートに滴下する、又は、少なくとも試料を含む溶液と少なくともマトリックスを含む溶液とを交互にサンプルプレートに滴下することにより、サンプルを調整する方法である。このとき、滴下する溶液の容量としては、好ましくは、０．５μL以上である。こうした方法により調製されたサンプルの表面には、図１０に示すように、１０μm程度以下の大きさの不揃いの結晶が多く観測される。
【0047】
＜レーザー照射径＞
図４（Ａ）はイオン化条件の一つであるレーザー照射径を５μmとした場合、図４（Ｂ）はレーザー照射径を２５μmとした場合の実測マススペクトルである。また、図４中には、目的のペプチドを構成するアミノ酸にそれぞれ対応する各種系列のプロダクトイオンの質量電荷比の中で、図４（Ａ）に示したマススペクトルにおいて検出されているイオンを下線又は四角枠囲みで明示した（下線及び四角枠囲みのいずれもがないイオンは非検出イオン又は実質的にピークが確認できなかったイオン）テーブルを記載している。なお、レーザー照射径は、同じ装置において、図３中に示す対物レンズ２４５のＺ軸方向の位置を変えることで調整した。但し、５μm、２５μmというレーザー照射径はそれ自体を計測した厳密な値ではなく、上記装置において選択可能である仕様値（つまりは設計上の値）である。
図４（Ａ）はイオン化条件の一つであるレーザー照射径を５μmとした場合、図４（Ｂ）はレーザー照射径を２５μmとした場合の実測マススペクトルである。また、図４中には、目的のペプチドを構成するアミノ酸にそれぞれ対応する各種系列のプロダクトイオンの質量電荷比の中で、図４（Ａ）に示したマススペクトルにおいて検出されているイオンを下線又は四角枠囲みで明示した（下線及び四角枠囲みのいずれもがないイオンは非検出イオン又は実質的にピークが確認できなかったイオン）テーブルを記載している。なお、レーザー照射径は、同じ装置において、図３中に示す対物レンズ２４５のＺ軸方向の位置を変えることで調整した。但し、５μm、２５μmというレーザー照射径はそれ自体を計測した厳密な値ではなく、上記装置において選択可能である仕様値（つまりは設計上の値）である。
【0048】
そのほかの主な分析条件は次の通りである。
・試料（ペプチド）： アンジオテンシン（Angiotensin）II
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
・試料（ペプチド）： アンジオテンシン（Angiotensin）II
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
【0049】
図４（Ａ）及びその下のテーブルに示すように、レーザー照射径が５μmであるときには、アンジオテンシンII由来のａ、ｂ、ｃ、ｙ系列イオンと、ｄ、ｖ、ｗ系列イオンとが共に多く観測されている。一方、マトリックス由来のクラスターイオンはm/z ４００以下の範囲にいくつか観測されるものの、その数は少なくその信号強度も大きくなく、アンジオテンシンII由来のプロダクトイオンが多く観測されるm/z ４００以上の質量電荷比範囲では殆ど観測されていない。こうしたことから、このマススペクトルから得られるプロダクトイオンの情報はペプチドの構造解析に非常に有用であることが容易に理解できる。
【0050】
これに対し、レーザー照射径を２５μmに拡大すると、図４（Ｂ）に示すように、観測されるイオン種が大幅に変化する。このとき、アンジオテンシンIIの構造に関連するイオンは殆ど観測されず、マトリックス由来の多様なクラスターイオンが盛んに観測される。したがって、このマススペクトルに基いてペプチドの構造解析を行うのは実質的に不可能である。一方で、アンジオテンシンIIのプロトン付加分子［Ｍ＋Ｈ］+は明瞭に観測され、しかもその近辺に他のピークが存在しないので、プロトン付加分子ピークの同定が容易である。そのため、このマススペクトルを利用することで、ペプチドの分子量を容易に求めることができる。
【0051】
即ち、レーザー照射径を２５μmまで拡大してしまうと、構造解析に有用であるプロダクトイオンの情報は得られなくなるものの、ペプチドのプロトン付加分子ピークの検出が容易になることが分かる。したがって、例えば図３に示すような構成のイオン源において対物レンズの位置を変更することで、レーザー照射径を５μmと２５μmとで切り替えることにより、目的のペプチドの構造情報と分子量情報との両方を得ることができることが分かる。
【0052】
レーザー照射径を５μmから２５μmまで拡大していくと、ペプチド由来のプロダクトイオンは徐々に減少し、他方、マトリックス由来のクラスターイオンが徐々に増加していくものと推測される。その様相は他の条件、試料の種類などによっても異なるが、概ね、１５μm以下のレーザー照射径であれば、ペプチドの構造解析に十分な強度のプロダクトイオンが観測されるものと推測できる。
【0053】
一方、レーザー照射径を５μmよりも小さくすれば、サンプル２３表面の付近に形成されるプルーム２６はより小さく、粒子密度は一層濃くなるため、インソース分解によるプロダクトイオンの生成は一層盛んになるものと推測される。但し、レーザー照射径の最小値は装置を構成する部材の精度や組立精度の制約を受けるため、技術的及びコスト的な限界がある。実用的には、レーザー照射径の最小値は１μm又は２μm程度であると考えられる。
【0054】
図５は、上記図４（Ａ）の分析条件の下で、インソース分解を利用した場合（Ａ）とＭＳ／ＭＳ分析を利用した場合（Ｂ）との実測マススペクトルの比較例である。図５（Ａ）に示したマススペクトルは図４（Ａ）に示したマススペクトルと同じである。
【0055】
アミノ酸の側鎖の構造はアミノ酸の種類によって大幅に異なり、特にｄ系列イオンが得られ易いアミノ酸は例えばロイシン、イソロイシンなどに限られている。図５（Ａ）に示したマススペクトルでは、イソロイシンの側鎖を特徴付けるm/z ５９１．３２であるｄa5イオン、及びm/z ６０５．３４であるｄb5イオンが明瞭に観測されている。イソロイシンとロイシンとは質量は同じであるが、ロイシンの場合、ｄa5イオンのm/zは５７７．３１であり、ｄb5イオンは存在しない。したがって、図５（Ａ）に示すマススペクトルから、左端から５番目に位置するアミノ酸はロイシンではなくイソロイシンであることが判明する。
【0056】
また、アスパラギン酸（略号：Ｄ）やプロリン（略号：Ｐ）を含むアンジオテンシンIIの場合、低エネルギーＣＩＤを利用したＭＳ／ＭＳ分析では、Ｄの右方且つＰの左方での結合の切断が生じ易く、またＮＨ3やＨ2Ｏの脱離も多い。そのため、図５（Ｂ）に示すように、Ｎ末端やＣ末端を保持したａ系列、ｂ系列、ｃ系列、ｙ系列等以外の複雑に分解したインターナルフラグメントイオンが比較的多く観測され、それらの妨害により、アミノ酸配列等の構造解析が容易ではない。これに対し、図５（Ａ）に示すマススペクトルでは、そうしたインターナルフラグメントイオンが殆ど観測されないため、その点でも構造解析が容易である。さらにまた、インソース分解では、イオントラップでのイオン捕捉及びイオン解離を行わない分だけＭＳ／ＭＳ分析に比べて測定時間が短くて済むので、解析の効率も良好であるという利点もある。また、そもそもＭＳ／ＭＳ分析の機能を有する装置を用いる必要がないので、廉価で且つ入手し易い（或いは手元にある）装置を用いた解析が可能であるという利点もある。
【0057】
＜試料とマトリックスとの混合比＞
図６は、試料とマトリックスとの混合比が相違する場合の実測マススペクトルの比較例である。図６（Ａ）はマトリックスと試料との混合比が約５０：１（モル比）である場合のマススペクトル、図６（Ｂ）はマトリックスと試料との混合比が約５：１（モル比）である場合のマススペクトル、図６（Ｃ）はマトリックスと試料との混合比が約５００：１（モル比）である場合のマススペクトルである。そのほかの条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
図６は、試料とマトリックスとの混合比が相違する場合の実測マススペクトルの比較例である。図６（Ａ）はマトリックスと試料との混合比が約５０：１（モル比）である場合のマススペクトル、図６（Ｂ）はマトリックスと試料との混合比が約５：１（モル比）である場合のマススペクトル、図６（Ｃ）はマトリックスと試料との混合比が約５００：１（モル比）である場合のマススペクトルである。そのほかの条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
【0058】
一般的なＭＡＬＤＩ法では、試料とマトリックスとの混合比はモル比で１：５００よりも大、通常は１：１００００以上である。しかしながら、マトリックスの割合が多いとマトリックス由来のクラスターイオンが生成され易い。ペプチドなどの比較的分子量の小さな有機化合物のプロダクトイオンを観測する場合、主たるプロダクトイオンはm/z ２００～最大数千程度の質量電荷比範囲に現れるが、マトリックス由来のクラスターイオンも同じ質量電荷比範囲に重なるため、このクラスターイオンが多いとペプチド由来のプロダクトイオンとの判別が困難になる。そこで、試料とマトリックスとの混合比を一般的なＭＡＬＤＩ法よりも小さくすることで、マトリックス由来のクラスターイオンの発生を抑制する。
【0059】
図６（Ａ）に示すマススペクトルと図６（Ｂ）に示すマススペクトルとを比較すると、生成されるイオン種自体に大きな変化はないことが分かる。また、いずれのマススペクトルにも、マトリックス由来のクラスターイオンの影響は殆どみられない。但し、図６（Ｂ）では図６（Ａ）に比べると、ペプチド由来のイオンの量自体は減少している。これは、イオン化を促進させるマトリックスの量が図６（Ａ）の場合よりも大幅に少なくなり、試料由来のイオンの発生が減少したことによるものと推測される。
【0060】
一方、図６（Ａ）に示すマススペクトルと図６（Ｃ）に示すマススペクトルとを比較すると、ペプチド由来のイオンの検出量はほぼ同じであるものの、図６（Ｃ）ではマトリックス由来のクラスターイオンの強度が増加していることが分かる。このように、試料の量に対してマトリックスの量が増加すると、マトリックスやそれに含まれる不純物に由来するイオンの強度が相対的に大きくなり、ペプチドの構造解析が困難になる場合がある。この結果から、構造解析が容易であるマススペクトルを取得するには、マトリックスと試料との混合比（モル比）を５：１～５０００：１の範囲にするとよく、好ましくは１０００：１以下、さらに好ましくは５００：１以下とするとよく、さらに５０：１程度がより好ましいということができる。但し、これらの条件もマトリックスの種類などの他の条件に依存して変化し得る。
【0061】
＜マトリックスの種類＞
図７は、使用するマトリックスの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図である。但し、ここでは、１，５－ＤＡＮなどの特殊なマトリックスではなく、入手が容易でコストも安価である、ごく一般に使用されているマトリックスについて実測した。図７（Ａ）はＣＨＣＡを用いた場合のマススペクトル、図７（Ｂ）はＤＨＢを用いた場合のマススペクトル、図７（Ｃ）はシナピン酸（Sinapinic Acid：ＳＡ）を用いた場合のマススペクトルである。そのほかの分析条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
なお、図７（Ａ）に示したマススペクトルは、図４（Ａ）及び図５（Ａ）に示したマススペクトルと同じである。
図７は、使用するマトリックスの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図である。但し、ここでは、１，５－ＤＡＮなどの特殊なマトリックスではなく、入手が容易でコストも安価である、ごく一般に使用されているマトリックスについて実測した。図７（Ａ）はＣＨＣＡを用いた場合のマススペクトル、図７（Ｂ）はＤＨＢを用いた場合のマススペクトル、図７（Ｃ）はシナピン酸（Sinapinic Acid：ＳＡ）を用いた場合のマススペクトルである。そのほかの分析条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
なお、図７（Ａ）に示したマススペクトルは、図４（Ａ）及び図５（Ａ）に示したマススペクトルと同じである。
【0062】
図７（Ａ）に示したマススペクトルと図７（Ｂ）に示したマススペクトルとを比較すると、マトリックスとしてＤＨＢを使用した場合でもＣＨＣＡを使用した場合と同じ程度に、ｄ系列イオンを含めた多様なプロダクトイオンを検出できていることが分かる。一方で、ＤＨＢを使用した場合にはＣＨＣＡを用いた場合に比べて、マトリックス由来のクラスターイオンが多く観測される。ここでは、そのクラスターイオンの質量電荷比は殆どm/z ８００以下であり、またどの質量電荷比にクラスターイオンが出現するのかが概ね既知であるため、それらクラスターイオンは比較的妨害になりにくく、ペプチドの構造解析は可能である。
【0063】
図７（Ｃ）に示したマススペクトルでは、ペプチドの分子イオンが殆ど観測されず、またマトリックス由来のクラスターイオンやそのフラグメントイオンが極めて多い。ＳＡはもともとタンパク質などの分子量が大きな化合物のイオン化に適したマトリックスであり、ペプチドのような分子量が比較的小さな化合物のイオン化には不向きである。
この実験の結果から、ごく一般的なマトリックスの中ではＣＨＣＡが最も良好な結果が得られるものの、ＤＨＢも利用可能であると結論付けることができる。これらはいずれも、ＭＡＬＤＩ法にごく一般的に利用されるマトリックスであり、入手が容易であるとともにコストを抑え易い。もちろん、これら以外の特殊なマトリックスを用いても十分なイオン情報が得られる可能性がある。
この実験の結果から、ごく一般的なマトリックスの中ではＣＨＣＡが最も良好な結果が得られるものの、ＤＨＢも利用可能であると結論付けることができる。これらはいずれも、ＭＡＬＤＩ法にごく一般的に利用されるマトリックスであり、入手が容易であるとともにコストを抑え易い。もちろん、これら以外の特殊なマトリックスを用いても十分なイオン情報が得られる可能性がある。
【0064】
化学的若しくは物理的な性質、又は構造的な特徴から考えると、使用可能なマトリックスとしては、紫外レーザー光を吸収するための主として芳香族環構造、特にはベンゼン環を有すること、イオン化対象の化合物にプロトンやカチオンを供与可能であるための例えばカルボキシル基を有すること、溶媒に溶解可能である（つまりは極性を有する）ための例えば水酸基を有すること、といった条件が揃うことが望ましい。
【0065】
＜サンプルプレートの種類＞
図８は、使用するサンプルプレートの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図である。図８（Ａ）はサンプルプレートとしてカバーガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｂ）はサンプルプレートとしてスライドガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｃ）はサンプルプレートとしてＩＴＯ（Indium Tin Oxide）ガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｄ）はサンプルプレートとしてステンレスプレートを用いた場合のマススペクトルである。そのほかの分析条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
図８は、使用するサンプルプレートの種類が相違する場合の実測マススペクトルの比較例を示す図である。図８（Ａ）はサンプルプレートとしてカバーガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｂ）はサンプルプレートとしてスライドガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｃ）はサンプルプレートとしてＩＴＯ（Indium Tin Oxide）ガラスを用いた場合のマススペクトル、図８（Ｄ）はサンプルプレートとしてステンレスプレートを用いた場合のマススペクトルである。そのほかの分析条件は次の通りである。
・試料： アンジオテンシンII
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
【0066】
サンプルプレートはサンプルに含まれる成分のイオン化自体にはあまり影響を与えないが、サンプルプレートに付着している不純物（汚れや塵芥など）や該プレートに含まれる成分は化学ノイズの原因となる。カバーガラスは、顕微鏡等での良好な観察を実現するために高い清浄性が求められ、且つ表面の平坦性が高い部材である。そのために、図８（Ａ）から明らかであるように、特に質量電荷比がm/z ５００以下の範囲でバックグラウンドノイズがかなり抑えられている。これに対し、一般にスライドガラスはカバーガラスに比べれば清浄性が劣るため、図８（Ｂ）に示すようにバックグラウンドノイズが若干大きくなっている。但し、このノイズは実質的に問題ないレベルである。
【0067】
なお、ガラスはＳｉ、Ｃａ、Ｏといった小さな元素から構成されており、それらの化合物（酸化物）の融点や沸点は比較的高い。そのため、こうしたガラスを構成する成分がイオン化したとしても、通常、それらイオンがアミノ酸配列の解析に重要な質量電荷比範囲（m/z＞２００）に現れることは稀であり、殆ど問題とならない。
【0068】
一方、ＩＴＯガラスはイメージング質量分析において生体組織観察用に頻用されるが、カバーガラスやスライドガラスに比べると格段に高価である。また、図８（Ｃ）に示すように、出所が不明であるイオン（例えばm/z ４１７．８５）が比較的高い強度でm/z＞２００の質量電荷比範囲に現れる。このため、ペプチドの構造解析が困難になるおそれがある。
ステンレスプレートはガラスに比べて表面が粗く、表面に汚れが付着し易い。図８（Ｄ）に示すマススペクトルでは、不純物に起因するバックグラウンドノイズは比較的抑えられているものの、汚れが付着しないように管理することが困難である。
ステンレスプレートはガラスに比べて表面が粗く、表面に汚れが付着し易い。図８（Ｄ）に示すマススペクトルでは、不純物に起因するバックグラウンドノイズは比較的抑えられているものの、汚れが付着しないように管理することが困難である。
【0069】
この実験の結果から、サンプルプレートとしてはカバーガラス又はスライドガラスが無難であり、好ましくは、カバーガラスを用いるとよいということができる。
【0070】
なお、上述したもの以外に、イオン化条件には、レーザーパワーなどがあるが、これらはＭＡＬＤＩ質量分析装置において標準的に使用されている値に設定するか、或いは、一般的に行われているように適宜に調整すればよい。
【0071】
［他のペプチドへの適用例］
図４～図８に示したマススペクトルはいずれもアンジオテンシンIIを解析対象としていたが、本実施形態の構造解析方法を他のペプチドに適用した例として、フィブリノペプチドＢ（Glu-Fibrinopeptide B）を実測したマススペクトルを図９に示す。また、図９中には、図４等と同様に、目的のペプチドを構成するアミノ酸にそれぞれ対応する各種系列のプロダクトイオンの質量電荷比の中で、図９に示したマススペクトルにおいて検出されているイオンを下線又は四角枠囲みで明示したテーブルを記載している。
分析条件は次の通りである。
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
図４～図８に示したマススペクトルはいずれもアンジオテンシンIIを解析対象としていたが、本実施形態の構造解析方法を他のペプチドに適用した例として、フィブリノペプチドＢ（Glu-Fibrinopeptide B）を実測したマススペクトルを図９に示す。また、図９中には、図４等と同様に、目的のペプチドを構成するアミノ酸にそれぞれ対応する各種系列のプロダクトイオンの質量電荷比の中で、図９に示したマススペクトルにおいて検出されているイオンを下線又は四角枠囲みで明示したテーブルを記載している。
分析条件は次の通りである。
・マトリックス： ＣＨＣＡ
・マトリックスと試料との混合比： 約５０：１（モル比）
・レーザー照射径： ５μm
・サンプルプレート： 顕微鏡用カバーガラス
【0072】
フィブリノペプチドＢは、正電荷を持ち易いアルギニン（略号：Ｒ）がＣ末端に存在するペプチドである。そのため、ａ、ｂ、ｃ系列ではなく、ｙ系列イオンが顕著に観測されている。一方で、側鎖が切断されて発生するｄ系列、ｖ系列イオンも多く観測されている。また、マトリックス由来のクラスターイオンなどは殆どみられない。こうしたことから、このマススペクトルのイオン情報に基いて、構造解析を良好に行うことが可能である。
即ち、本実施形態の構造解析方法は、アンジオテンシンIIのみならず、それ以外のペプチドにも十分に利用可能であることが分かる。
即ち、本実施形態の構造解析方法は、アンジオテンシンIIのみならず、それ以外のペプチドにも十分に利用可能であることが分かる。
【0073】
また、上記説明では、ペプチドを解析対象としたが、より長いペプチド結合を有するタンパク質も解析対象に含めることができる。さらには、他の種類の有機化合物、例えば糖鎖、脂質、核酸関連物質などにも、本発明を適用することが可能である。
【0074】
また、上記実施形態は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【0075】
具体的には、例えば、本発明において質量分析を実行するための装置は図２及び図３に示したような構成の装置に限るものではなく、必要なイオン化条件などを実現可能である装置であればよい。具体的には、例えばＭＡＬＤＩイオン源を搭載した四重極－飛行時間型質量分析装置などを利用することができる。
但し、構造解析にはプロダクトイオンの質量電荷比をかなり高い精度で求めることが必要であるから、飛行時間型質量分離器又はそれと同程度以上の質量精度及び質量分解能が得られるような質量分離器（例えばフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分離器）を使用した質量分析装置が好ましい。また、質量分離の方式等によって、得られるマススペクトルの質量電荷比範囲が異なるため、分子量が大きな化合物を解析対象とする場合には、得られるマススペクトルの上限の質量電荷比ができるだけ高いような質量分析装置を選択することが望ましい。
但し、構造解析にはプロダクトイオンの質量電荷比をかなり高い精度で求めることが必要であるから、飛行時間型質量分離器又はそれと同程度以上の質量精度及び質量分解能が得られるような質量分離器（例えばフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分離器）を使用した質量分析装置が好ましい。また、質量分離の方式等によって、得られるマススペクトルの質量電荷比範囲が異なるため、分子量が大きな化合物を解析対象とする場合には、得られるマススペクトルの上限の質量電荷比ができるだけ高いような質量分析装置を選択することが望ましい。
【0076】
［種々の態様］
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
【0077】
（第１項）本発明の一態様は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を用いて有機化合物の構造を解析する方法であって、
解析対象の有機化合物を含む試料と所定のマトリックスとの混合比を、モル比で１：５～１：５０００の範囲としてサンプルを調製するサンプル調製工程と、
調製された前記サンプルに、その照射径が１５μm以下であるレーザー光を照射することにより、該サンプル中の試料成分由来のイオンを生成し、生成されたイオンを質量分析する分析工程と、
前記分析工程において得られたマススペクトルから、インソース分解によるプロダクトイオンを含むイオンを検出し、該イオンの情報に基いて前記解析対象の有機化合物の構造を推定する解析工程と、
を有する。
解析対象の有機化合物を含む試料と所定のマトリックスとの混合比を、モル比で１：５～１：５０００の範囲としてサンプルを調製するサンプル調製工程と、
調製された前記サンプルに、その照射径が１５μm以下であるレーザー光を照射することにより、該サンプル中の試料成分由来のイオンを生成し、生成されたイオンを質量分析する分析工程と、
前記分析工程において得られたマススペクトルから、インソース分解によるプロダクトイオンを含むイオンを検出し、該イオンの情報に基いて前記解析対象の有機化合物の構造を推定する解析工程と、
を有する。
【0078】
第１項に記載の有機化合物の構造解析方法によれば、低エネルギーＣＩＤ等を利用したＭＳ／ＭＳ分析を行うことなく、ペプチドや糖鎖などの有機化合物の詳細構造を解析するのに有用であるプロダクトイオンが良好に観測されるマススペクトルを得ることができる。具体的には、解析対象の有機化合物がペプチドである場合には、ペプチドの主鎖が切断されて得られるイオンのみならず、側鎖が切断されて得られるイオンも観測可能となる。それにより、ＭＳ／ＭＳ分析を実施する手間や時間を省き、効率良く、且つ高い精度で以てペプチド等の有機化合物の詳細構造を把握することができる。
【0079】
第１項に記載の有機化合物の構造解析方法では、m/z ２００～最大数千程度の質量電荷比範囲、特にその中でも比較的低い質量電荷比範囲における、マトリックス由来のクラスターイオンの出現を抑制することができる。そのため、こうした質量電荷比範囲において観測される、目的の有機化合物由来のプロダクトイオンの検出が容易になり、該有機化合物の構造解析の正確性を向上させることができる。
【0080】
（第２項）第１項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記有機化合物はペプチド、タンパク質、又は糖鎖とすることができる。
【0081】
（第３項）また第２項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記有機化合物はペプチドであり、前記プロダクトイオンは、ペプチドの主鎖が切断されることにより生成されるイオンと、ペプチドの側鎖が切断されることにより生成されるイオンと、の両方を含むものとすることができる。
【0082】
第３項に記載の有機化合物の構造解析方法によれば、同一の質量を有するアミノ酸であるロイシンとイソロイシンとを区別したうえで、ペプチドのアミノ酸配列を含めた構造を的確に決定することができる。
【0083】
（第４項）第１項～第３項のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記マトリックスは、紫外レーザー光を吸収するための部分構造、プロトン又はカチオンを供与するための部分構造、及び、溶媒に溶解可能であるための部分構造、を有するものとすることができる。
【0084】
（第５項）第４項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記紫外レーザー光を吸収するための部分構造は芳香族環、前記プロトン又はカチオンを供与するための部分構造はカルボキシル基、前記溶媒に溶解可能であるための部分構造は水酸基とすることができる。
なお、特に上記芳香族環はベンゼン環とすることができる。
なお、特に上記芳香族環はベンゼン環とすることができる。
【0085】
（第６項）また第４項又は第５項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記マトリックスは、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、又は、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）であるものとすることができる。
【0086】
第４項～第６項に記載の有機化合物の構造解析方法によれば、ペプチド等の有機化合物由来のプロダクトイオンを十分に生成するとともに、マススペクトルにおいてそれらプロダクトイオンに重なるマトリックス由来のクラスターイオンの生成を抑え、構造解析に好適なマススペクトルを得ることができる。また、ＣＨＣＡやＤＨＢは一般的なＭＡＬＤＩ法に広く利用されているマトリックスであり、入手が容易であるとともにコストも安価であり、ユーザーにとって使い勝手がよい。
【0087】
（第７項）第１項～第６項のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記サンプル調製工程では、Dried-Droplet法又はThin-Layer法によりサンプルを調製するものとすることができる。
【0088】
第７項に記載の有機化合物の構造解析方法によれば、ペプチドなどの有機化合物のインソース分解を促進し、構造解析が行い易いマススペクトルを得ることができる。
【0089】
（第８項）第１項～第７項のいずれか１項に記載の有機化合物の構造解析方法において、前記サンプル調製工程では、その表面が平滑で且つ清浄であるガラス製のサンプルプレート上にサンプルを調製するものとすることができる。
【0090】
第８項に記載の有機化合物の構造解析方法によれば、目的の有機化合物由来のプロダクトイオンが良好に観測でき、他方、不純物由来のイオンなどが少ない、良好なマススペクトルを得ることができる。
【符号の説明】
【0091】
１…測定部
２…イオン化室
２１…試料ステージ
２２…サンプルプレート
２３…サンプル
２４…レーザー照射部
２４１…紫外パルスレーザー源
２４２…可変光学フィルター
２４３…ビームエキスパンダーの第１レンズ
２４４…ビームエキスパンダーの第２レンズ
２４５…対物レンズ
３…真空チャンバー
３１…イオン輸送管
３２…イオンガイド
３３…イオントラップ
３４…飛行時間型質量分離器
３５…イオン検出器
４…データ処理部
５…分析制御部
６…主制御部
７…入力部
８…表示部
２…イオン化室
２１…試料ステージ
２２…サンプルプレート
２３…サンプル
２４…レーザー照射部
２４１…紫外パルスレーザー源
２４２…可変光学フィルター
２４３…ビームエキスパンダーの第１レンズ
２４４…ビームエキスパンダーの第２レンズ
２４５…対物レンズ
３…真空チャンバー
３１…イオン輸送管
３２…イオンガイド
３３…イオントラップ
３４…飛行時間型質量分離器
３５…イオン検出器
４…データ処理部
５…分析制御部
６…主制御部
７…入力部
８…表示部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
