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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-01
(45)【発行日】2023-12-11
(54)【発明の名称】ゲノムＤＮＡに欠失を誘導する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231204BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231204BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20231204BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231204BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20231204BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20231204BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20231204BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/10 ZNA
C12N5/074
C12N5/0735
C12N5/0775
C12N5/0789
C12N5/0797
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020559274
(86)(22)【出願日】2019-12-11
(86)【国際出願番号】 JP2019048426
(87)【国際公開番号】W WO2020122104
(87)【国際公開日】2020-06-18
【審査請求日】2022-07-13
(31)【優先権主張番号】62/938,346
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】P 2018231649
(32)【優先日】2018-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(72)【発明者】
【氏名】堀田 秋津
(72)【発明者】
【氏名】奥嵜 雄也
(72)【発明者】
【氏名】徐 淮耕
(72)【発明者】
【氏名】ジー ピーター デビド
(72)【発明者】
【氏名】北 悠人
(72)【発明者】
【氏名】真下 知士
(72)【発明者】
【氏名】吉見 一人
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２２５８５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１３７０８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２０４４９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１９８０７７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１８／１７５７３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１２９２９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０９８４８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／００５５５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０６６４９７（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インビトロで、幹細胞のゲノムＤＮＡに、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体）と、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含み、
前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質からなり、
前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質を、発現ベクター又はｍＲＮＡの形態で前記幹細胞に導入する工程を更に含み、
前記発現ベクターは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させ、残りの３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させるものであり、
前記ｍＲＮＡは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させ、残りの３つのタンパク質を別の単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させるものである、ゲノムＤＮＡが改変された幹細胞の製造方法。
【請求項2】
前記ｃｒＲＮＡの標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍内に存在する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
インビトロで、幹細胞のゲノムＤＮＡに、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含み、
前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質からなり、
前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質を、発現ベクター又はｍＲＮＡの形態で前記幹細胞に導入する工程を更に含み、
前記発現ベクターは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させ、残りの３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させるものであり、
前記ｍＲＮＡは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させ、残りの３つのタンパク質を別の単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させるものである、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入されたゲノムＤＮＡの製造方法。
【請求項4】
前記標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍内に存在する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項5】
タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、
Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、
を含み、
前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質であり、
前記発現ベクターは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させ、残りの３つのタンパク質を１つのプロモーターで発現させるものであり、
前記ｍＲＮＡは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される３つのタンパク質を単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させ、残りの３つのタンパク質を別の単一のｍＲＮＡからそれぞれ個別のタンパク質として発現させるものである、幹細胞のゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノムＤＮＡに欠失を誘導する方法に関する。より具体的には、本発明は、標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入されたゲノムＤＮＡの製造方法、ゲノムＤＮＡが改変されたｉＰＳ細胞の製造方法及びゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キットに関する。本願は、２０１８年１２月１１日に日本に出願された特願２０１８－２３１６４９号、及び、２０１９年１１月２１日に米国に仮出願されたＵＳ６２／９３８，３４６号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
近年、原核生物の獲得免疫システムであるＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）システムの１種である、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが、遺伝子破壊（ノックアウト）等のゲノム編集技術に広く用いられている。これは、当該システムによってゲノムＤＮＡの所望の部位に二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、その後宿主細胞に備わっている修復機構によって欠失や挿入を起こさせる技術である。
【0003】
ＣＲＩＳＰＲシステムには、複数の因子が複合体を形成して機能するクラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムと、単一の因子で機能するクラス２ ＣＲＩＳＰＲシステムが存在する。クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲシステムが含まれる。また、クラス２ ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩＩ、タイプＶ、タイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが含まれる。このうち、クラス２タイプＩＩに属するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質と１種類のＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列を備えるＲＮＡ。）だけで所望の部位にＤＮＡ切断が誘導できるという簡便さから、登場からわずか１年でゲノム編集技術のスタンダードとなった（例えば、非特許文献１を参照。）
【0004】
これに対し、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムは複雑で、例えば、クラス１タイプＩに属するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、Ｃａｓ３タンパク質は、Ｃｓｅ１タンパク質（ＣａｓＡ、Ｃａｓ８ｅ又はＣａｓ８と呼ばれることもある。）、Ｃｓｅ２タンパク質（ＣａｓＢ、Ｃａｓ１１）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）タンパク質、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）タンパク質及びＣａｓ６（ＣａｓＥ）タンパク質からなるＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（以下、「タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体」という場合がある。）及びｃｒＲＮＡと複合体を形成することにより試験管内でＤＮＡ切断活性を発揮することが報告されている（非特許文献２）。よって、何種類ものタンパク質を発現させなくてはならない煩雑さ等から、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムのゲノム編集ツールとしての開発は遅れがちであった。
【0005】
ところで、ヒト胎児腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、遺伝子導入効率が非常に高い特性を持つ細胞であることが知られている。このため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いたゲノム編集効率の評価系にもＨＥＫ２９３Ｔ細胞が多用され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより十分に実用可能な（高いレベルの）ゲノム編集効率が得られることが多数報告されている。
【0006】
一方、近年の人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞研究の進展により、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から多種多様な細胞が分化誘導できるようになり、医療応用への気運が高まっている。特に、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子変異や多型に起因する疾患に対しては、多能性幹細胞の段階で当該原因を解消し得るゲノム編集を行い、編集後の多能性幹細胞から分化誘導した細胞を細胞製剤として用いる新たな治療方法に大変な期待が寄せられている。
【0007】
しかしながら、通常、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等は遺伝子導入効率が非常に低いことが知られている。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞では転写発現抑制を受けやすく、ウイルス由来ＣＭＶプロモーターや強力なＣＡＧプロモーターを用いても、一般的な腫瘍由来細胞株と比較して、タンパク質発現量が低いことが知られている。その結果、多能性幹細胞においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによるゲノム編集効率も非常に低いことが知られている。
【0008】
例えば、非特許文献３には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と異なりｉＰＳ細胞ではＣＡＧプロモーターよりもＥＦ１αプロモーターを用いた場合の方が外来遺伝子の発現量が高くなるが、ＥＦ１αプロモーターを用いた場合であっても、外来遺伝子産物（血液凝固第ＶＩＩＩ因子）の活性レベルは同じコンストラクトを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のわずか１／８～１／５程度であることが示されている（非特許文献３、Ｆｉｇ．２等）。
【0009】
また、非特許文献４には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集効率がＨＥＫ２９３Ｔ細胞では８０％以上であったのに対し、ｉＰＳ細胞ではわずか４０％程度であったことが記載されている（非特許文献４、Ｆｉｇ．１等）。
【0010】
さらに、非特許文献５では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにおける非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の発生率をＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉＰＳ細胞で比較解析し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＨＥＪの発生率は１０～２５％であったのに対し、ｉＰＳ細胞におけるＮＨＥＪの発生率は２～４％であったことを記載している（非特許文献５、Ｆｉｇ．２等）。
【0011】
このように、ｉＰＳ細胞等の幹細胞ではＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによるゲノム編集効率が非常に低いため、ゲノム編集技術のヒト遺伝性疾患治療への応用は容易ではないと考えられていた。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでは通常数ヌクレオチドから数十ヌクレオチドの小さな欠失しか導入できないことも、前記治療用途を狭める要因となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【文献】Mohanraju P., et al., Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems, Science, 353 (6299), aad5147, 2016.
【0013】
【文献】Westra ER et al., CRISPR Immunity Relies on the Consecutive Binding and Degradation of Negatively Supercoiled Invader DNA by Cascade and Cas3, Mol Cell, 46 (5), 595-605, 2012.
【文献】Matsui H. et al., Delivery of full-length factor VIII using a piggyBac transposon vector to correct a mouse model of hemophilia A, PLoS One., 9 (8), e104957, 2014.
【文献】Ishida K., et al., Site-specific randomization of the endogenous genome by a regulatable CRISPR-Cas9 piggyBac system in human cells, Sci Rep.,, 8 (1), 310, 2018.
【文献】Mali P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science., 339 (6121), 823-826, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
ヒト遺伝性疾患では、特定の遺伝子をノックアウト又は遺伝子内の特定の領域を広域に欠失させることにより、非常に高い治療効果が期待できるものが少なくない。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムでは単一のｇＲＮＡを用いても、通常数塩基から数十塩基のヌクレオチドの欠失しか導入できないため、遺伝子ノックアウトや遺伝子内広域欠失の誘導には不向きであった。欠失部位以降のＡＵＧが開始コドンとして機能して短縮型タンパク質が発現し、全長タンパク質の機能を部分的に補償する場合があるからである。そこで、複数のｇＲＮＡを用いてゲノム上の複数箇所に小さな欠失を導入し、当該小さな欠失間がさらに欠失したゲノムＤＮＡを有する細胞を選択することにより、ゲノム上の標的部位に巨大な欠失を導入する方法が検討されている。しかしながら、この方法では前記複数箇所すべてで欠失が生じる必要があるため、欠失導入効率が非常に低い幹細胞（特に多能性幹細胞）においては現実的とはいえない方法である。
【0015】
このような事情を鑑み、本発明は、幹細胞を含む細胞全般において、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ゲノムＤＮＡに、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体）と、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入されたゲノムＤＮＡの製造方法。
［２］前記接触させる工程が真核細胞中で行われる、［１］に記載の製造方法。
［３］前記真核細胞が幹細胞である、［２］に記載の製造方法。
［４］前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質からなり、前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質を、発現ベクターの形態で前記真核細胞に導入する工程を更に含み、前記発現ベクターは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される２～４のタンパク質を１つのプロモーターで発現させるものである、［２］又は［３］に記載の製造方法。
［５］前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、及びＣａｓ６タンパク質からなり、前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質、前記Ｃａｓ３タンパク質及び前記ｃｒＲＮＡを、ＲＮＡ分子の形態で前記真核細胞に導入する工程を更に含む、［２］又は［３］に記載の製造方法。
［６］前記標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍である、［２］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］幹細胞のゲノムＤＮＡに、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、ゲノムＤＮＡが改変された幹細胞の製造方法。
［８］タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット。
［１］ゲノムＤＮＡに、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体）と、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入されたゲノムＤＮＡの製造方法。
［２］前記接触させる工程が真核細胞中で行われる、［１］に記載の製造方法。
［３］前記真核細胞が幹細胞である、［２］に記載の製造方法。
［４］前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質からなり、前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質を、発現ベクターの形態で前記真核細胞に導入する工程を更に含み、前記発現ベクターは、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質及び前記Ｃａｓ３タンパク質からなる群より選択される２～４のタンパク質を１つのプロモーターで発現させるものである、［２］又は［３］に記載の製造方法。
［５］前記タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体が、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、及びＣａｓ６タンパク質からなり、前記接触させる工程の前に、前記Ｃｓｅ１タンパク質、前記Ｃｓｅ２タンパク質、前記Ｃａｓ７タンパク質、前記Ｃａｓ５タンパク質、前記Ｃａｓ６タンパク質、前記Ｃａｓ３タンパク質及び前記ｃｒＲＮＡを、ＲＮＡ分子の形態で前記真核細胞に導入する工程を更に含む、［２］又は［３］に記載の製造方法。
［６］前記標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍である、［２］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］幹細胞のゲノムＤＮＡに、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、ゲノムＤＮＡが改変された幹細胞の製造方法。
［８］タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット。
【0017】
本発明は以下の態様を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法であって、前記ゲノムＤＮＡに、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体）と、前記標的領域にハイブリダイズ可能なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、方法。
［Ｐ２］前記接触させる工程が真核細胞中で行われる、［Ｐ１］に記載の方法。
［Ｐ３］前記標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域である、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の方法。
［Ｐ４］［Ｐ２］又は［Ｐ３］に記載の方法により製造された、ゲノムＤＮＡ改変細胞。
［Ｐ５］タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ゲノムＤＮＡの標的領域にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット。
［Ｐ１］ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法であって、前記ゲノムＤＮＡに、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ（タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体）と、前記標的領域にハイブリダイズ可能なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む、方法。
［Ｐ２］前記接触させる工程が真核細胞中で行われる、［Ｐ１］に記載の方法。
［Ｐ３］前記標的領域が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子若しくはその制御領域、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子若しくはその制御領域、又はジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子若しくはその制御領域である、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の方法。
［Ｐ４］［Ｐ２］又は［Ｐ３］に記載の方法により製造された、ゲノムＤＮＡ改変細胞。
［Ｐ５］タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ゲノムＤＮＡの標的領域にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、幹細胞（特に好ましくは多能性幹細胞）を含む細胞に対し、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を効率よく導入する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】Ｂ２Ｍ遺伝子座の構造を示す模式図である。
【図2】実験例１において作製したｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図3】（ａ）～（ｆ）は、実験例１で作製したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの構造を示す模式図である。
【図4】実験例１において算出したＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を示すグラフである。
【図5】実験例２においてタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質を発現させるために用いたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの構造を示す模式図である。
【図6】（ａ）～（ｃ）は、実験例２で樹立したｉＰＳ細胞クローンを免疫染色し、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。
【図7】（ａ）は、実験例２において、ＰＣＲにより得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に写真を示したＰＣＲ産物をサンガーシーケンスにより更に詳細に解析した結果を表す模式図である。
【図8】（ａ）～（ｅ）は、実験例３におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図9】（ａ）～（ｄ）は、実験例４で作製した、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図10】（ａ）～（ｈ）は、実験例５におけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図11】（ａ）～（ｇ）は、実験例５におけるｉＰＳ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図12】実験例５において、ＨＬＡ－Ａ２陰性ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子座を解析した結果を示す模式図である。
【図13】実験例６で使用した、エクソンスキッピングモデルルシフェラーゼアッセイに用いたレポーターベクターの構造を説明する模式図である。
【図14】実験例６において、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示すグラフである。
【図15】実験例６において、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定したｉＰＳ細胞の結果を示すグラフである。
【図16】（ａ）は、実験例７において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。（ｂ）は、（ａ）において矢印で示したバンドをサンガーシーケンスによって更に詳細に解析した結果を示す模式図である。
【図17】（ａ）は、実験例８において、ジェノタイピングの結果の一例を示す模式図である。（ｂ）は、実験例８において、ジェノタイピングの結果の一例を示す写真である。
【図18】実験例８において、骨格筋細胞（筋芽細胞）へ分化誘導したｉＰＳ細胞株の細胞の形状を撮影した顕微鏡写真である。
【図19】実験例８において、ＰＣＲ産物の電気泳動解析結果を示した画像及び増幅産物の構造を示す模式図である。
【図20】実験例８におけるＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＴＭ）アッセイによるタンパク質電気泳動の実験結果を示す画像である。
【図21】（ａ）は、Ｂ２Ｍ遺伝子座の大まかな構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例９において算出したＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を示すグラフである。
【図22】実験例１０で作製したｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図23】実験例１０におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図24】実験例１１において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図25】実験例１１において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図26】実験例１１において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図27】実験例１１において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図28】実験例１２において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図29】（ａ）は、単一のｍＲＮＡからＣａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡのコンストラクトを示す模式図である。（ｂ）は、単一のｍＲＮＡからＣｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡのコンストラクトを示す模式図である。
【図30】（ａ）～（ｆ）は、実験例１３におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図31】実験例１４で作製したｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構造を示す模式図である。
【図32】タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰｒｅ－ｃｒＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図33】大腸菌のタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡリピート領域の構造を示す模式図である。
【図34】実験例１５で作製したプラスミドＤＮＡベクターの構造を示す模式図である。
【図35】実験例１５においてルシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。
【図36】（ａ）～（ｄ）は、実験例１６で使用した、発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図37】実験例１６におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図38】ｃｒＲＮＡが二次構造を形成している状態を示す模式図である。
【図39】（ａ）～（ｅ）は大腸菌のリピート配列の二次構造を示す模式図である。
【図40】実験例１７におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図41】実験例１８において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図42】実験例１８において、ＰＣＲ産物を解析した結果を表す画像である。
【図43】実験例１８において、解析した塩基配列をヒトＤＭＤの塩基配列にアライメントした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
［標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法］
１実施形態において、本発明は、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法であって、前記ゲノムＤＮＡに、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む方法を提供する。本実施形態の方法は、１００塩基超のヌクレオチドが欠失したゲノムＤＮＡの製造方法であるということもできる。
１実施形態において、本発明は、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法であって、前記ゲノムＤＮＡに、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程を含む方法を提供する。本実施形態の方法は、１００塩基超のヌクレオチドが欠失したゲノムＤＮＡの製造方法であるということもできる。
【0021】
実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いた場合よりも効率よく、ゲノムＤＮＡの標的領域にヌクレオチドの欠失を導入できる場合がある。
【0022】
本実施形態の方法において、標的配列とは、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズするＤＮＡと相補鎖を形成する一本鎖ＤＮＡの塩基配列を指す。また、本実施形態の方法において、ゲノムＤＮＡの標的領域とは、欠失を導入したいゲノムＤＮＡ上の領域（二本鎖ＤＮＡ領域）のことであり、具体的には、標的配列の近傍の二本鎖ＤＮＡ領域を意味する。より詳細には、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列は標的配列のアンチセンス鎖に相補的に結合する。したがって、ｃｒＲＮＡのスペーサー塩基配列と標的配列のセンス鎖の塩基配列は相同性が高く、ｃｒＲＮＡのスペーサー塩基配列と標的配列のアンチセンス鎖の塩基配列は概ね相補的である。
【0023】
標的配列の近傍とは、例えば標的配列の５’側又は３’側から１～５，０００塩基程度、好ましくは５’側又は３’側から１～１，０００塩基程度、より好ましくは５’側から１～１，０００塩基程度、更に好ましくは５’側から１０～５００塩基程度離れたヌクレオチドを開始点とする二本鎖ＤＮＡ領域であってよい。また、標的配列の終点は、前記開始点から後述するヌクレオチド欠失の長さだけ離れた塩基であってもよい。本実施形態の方法によれば、標的配列の近傍に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入することができる。
【0024】
欠失させることができるヌクレオチドの長さは１００塩基超であり、約１０，０００塩基の長さのヌクレオチドを欠失させることもできる。また、１０，０００塩基以上の長さのヌクレオチドを欠失させることもできる。
【0025】
本実施形態の方法は、インビトロ（試験管内）で行うこともできるし、真核細胞中で行うこともできるし、インビボ（生体内）で行うこともできる。真核細胞としては、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。動物細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよい。非ヒト動物としては、特に限定されず、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル等が挙げられる。また、動物細胞は幹細胞であってもよい。幹細胞としては、多能性幹細胞、成体幹細胞等が挙げられ、多能性幹細胞が特に好ましい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞、体細胞由来ES細胞であるｎｔＥＳ細胞等が挙げられる。成体幹細胞は、組織幹細胞、体性幹細胞とも呼ばれるものである。成体幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞（サテライト細胞）、皮膚幹細胞等が挙げられる。
【0026】
上記のうち、本発明においては、幹細胞を好適に用いることができ、より好ましくは多能性幹細胞、更に好ましくは胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞、最も好ましくは人工多能性幹細胞である。これらの細胞に対しては、従来技術を用いてゲノムＤＮＡの所望の部位に巨大な欠失を導入することは困難であるからである。なお、上記細胞種はヒト細胞であることが好ましい。
【0027】
本実施形態の方法を細胞中で行う場合、本実施形態の方法は、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入された、ゲノムＤＮＡ改変細胞の製造方法であるということもできる。
【0028】
上述したように、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲシステムが含まれるが、本実施形態の方法では、クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムのうち、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの使用が好ましい。
【0029】
Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、又は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体）だけで機能するタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムとは異なり、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓｃａｄｅ複合体とｃｒＲＮＡとＣａｓ３タンパク質とで機能する。
【0030】
クラス１ ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、リーダー配列の後に、リピート配列とスペーサー配列からなる配列が複数連続したｐｒｅ－ｃｒＲＮＡが転写される。その後、Ｃａｓ６等のＲＮＡヌクレアーゼの作用によってリピート配列の中のステムループの３’側によりＲＮＡ切断が誘導され、成熟ｃｒＲＮＡとなる。すなわち、一般的に、成熟ｃｒＲＮＡは、５’側から３’側に向かって、リピート配列の一部（５～１０塩基程度の５’ハンドル配列と呼ばれる塩基配列）、スペーサー配列、リピート配列を有する。
【0031】
本実施形態の方法におけるｃｒＲＮＡは、第１のリピート配列、スペーサー配列、第２のリピート配列からなるＲＮＡである。本明細書において、第１のリピート配列、標的配列の相補鎖に結合するスペーサー配列、第２のリピート配列からなるＲＮＡをｐｒｅ－ｃｒＲＮＡという場合がある。また、ｃｒＲＮＡは、リピート配列とスペーサー配列からなる配列部分が複数回連続した塩基配列を有していてもよい。更に、本実施形態の方法におけるｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの５’側に更にリーダー配列を有していてもよい。すなわち、本実施形態の方法におけるｃｒＲＮＡは、リーダー配列、第１のリピート配列、標的配列の相補鎖に結合するスペーサー配列、第２のリピート配列からなるＲＮＡであってもよい。
【0032】
本実施形態の方法において、標的領域にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡとは、成熟したｃｒＲＮＡが標的領域にハイブリダイズ可能なｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであることが好ましい。すなわち、本実施形態の方法におけるｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであることが好ましい。
【0033】
本実施形態の方法において、ｃｒＲＮＡは、第１のリピート配列、標的配列の相補鎖に結合するスペーサー配列、第２のリピート配列をこの順に有するＲＮＡであってもよく、第１のリピート配列の前にリーダー配列を更に有するＲＮＡであってもよい。
【0034】
あるいは、ｃｒＲＮＡは、第１のリピート配列、標的配列の相補鎖に結合する第１のスペーサー配列、第２のリピート配列、第２のスペーサー配列、第３のリピート配列をこの順に有するＲＮＡであってもよく、第３のリピート配列の後に、第３のスペーサー配列と第４のリピート配列を更に有するＲＮＡであってもよい。
【0035】
本実施形態の方法を実施するためには、ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列の５’側にリピート配列を有するｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであることが好ましい。
【0036】
また、リーダー配列は、大腸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｕ０００９６．２）における第２，８９９，０００～２，９０６，０００番目の領域（本明細書において「Ｌｏｃｕｓ Ｂ」という場合がある。）に存在するリーダー配列であってもよい。Ｌｏｃｕｓ Ｂ由来のリーダー配列の塩基配列を配列番号５８に示す。
【0037】
あるいは、リーダー配列は、大腸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｕ０００９６．２）における第２，８７５，０００～２，８８６，０００番目の領域（本明細書において「Ｌｏｃｕｓ Ａ」という場合がある。）に存在するリーダー配列であってもよい。Ｌｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列の塩基配列を配列番号５７に示す。
【0038】
実施例において後述するように、発明者らは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡのリーダー配列として、Ｌｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列を使用可能であることを明らかにした。
【0039】
ｃｒＲＮＡは、リピート配列を挟んでスペーサー配列がタンデムに並んだ構造を有していてもよい。実施例において後述するように、発明者らは、このようなｃｒＲＮＡを用いることにより、１種類のｃｒＲＮＡ分子を用いるだけで、複数の標的配列に対してゲノム編集を一度に誘導できることを明らかにした。このようなｃｒＲＮＡを用いて複数箇所でＤＮＡ切断を一度に誘導する方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムには適用することが困難なものである。
【0040】
また、ｃｒＲＮＡは、第１のリピート配列の５’側第１番目から第５番目までの５塩基を欠損していてもよく、第１のリピート配列の５’側第１番目から第１１番目までの５塩基を欠損していてもよく、第１のリピート配列の５’側第１番目から第１５番目までの５塩基を欠損していてもよい。
【0041】
実施例において後述するように、発明者らは、このような短縮型の第１リピート配列を有するｃｒＲＮＡを用いたタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより、高効率でゲノム編集を誘導できることを明らかにした。細胞や生体内に導入するＲＮＡを準備する際、ＲＮＡの長さが短いほど合成コストが抑えられるため、より短いｃｒＲＮＡを用いることは大きな利点となる。
【0042】
本実施形態の方法において、複数種類のｃｒＲＮＡを組み合わせて用いてもよい。実施例において後述するように、発明者らは、互いに向き合うように設計した２種類のｃｒＲＮＡを用いることにより、３４０ｋｂ以上の巨大な領域のゲノムＤＮＡを欠失させることができることを明らかにした。
【0043】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムには、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆのサブタイプが存在し、いずれのＣＲＩＳＰＲシステムも同様に機能するが、なかでもタイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムを好適に用いることができる。タイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムの代表例として、大腸菌由来のＣＲＩＳＰＲシステムが挙げられるが、大腸菌由来に限定されず、他の生物種由来も同様に使用できる。実施例において後述するように、発明者らは、タイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムが、ヒトｉＰＳ細胞を含むヒト細胞等でも機能することを明らかにした。
【0044】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、ｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ３タンパク質から構成される。タイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体は、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質から構成される。本明細書では、これら５種類のタンパク質を、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質と呼ぶ場合がある。大腸菌由来のタイプＩ－Ｅに属するＣｓｅ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２４０．１等が挙げられる。Ｃｓｅ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２３９．１等が挙げられる。Ｃａｓ７タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２３８．１等が挙げられる。Ｃａｓ５タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２３７．２等が挙げられる。Ｃａｓ６タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２３６．１等が挙げられる。また、Ｃａｓ３タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号としては、ＮＰ＿４１７２４１．１等が挙げられる。
【0045】
Ｃａｓｃａｄｅ複合体の各構成タンパク質は、本実施形態の方法を実施することができる限り、上述したアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。変異は、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加等であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば、１～３０個であってもよく、１～２０個であってもよく、１～１０個であってもよく、１～５個であってもよい。
【0046】
あるいは、Ｃａｓｃａｄｅ複合体の各構成タンパク質は、本実施形態の方法を実施することができる限り、変異を有していてもよく、上述したアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の配列同一性を有していてもよい。
【0047】
Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質は、上述したアクセッション番号で公開された塩基配列情報に基づいて大腸菌からクローニングして使用してもよいし、市販のタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを含むプラスミドを入手して使用してもよいし、当該プラスミドを鋳型としたＰＣＲによりＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓをコードするＤＮＡを得てもよいし、公知の人工遺伝子合成技術を用いて人工的に作製してもよく、その入手方法に制限はない。
【0048】
本実施形態の方法を真核細胞中で行う場合、Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質にそれぞれ核移行シグナル（ＮＬＳ）を付加することが好ましい。ＮＬＳは、各タンパク質のＮ末端に付加してもよく、Ｃ末端に付加してもよく、Ｎ末端及びＣ末端の双方に付加してもよい。付加するＮＬＳの数は一つでも良く、二つ以上、あるいは三つ以上でも良い。また、タンパク質翻訳量の最適化を期待して、各タンパク質をコードする遺伝子のコドンを、本実施形態の方法を行う真核生物種のコドンの使用頻度に合わせて改変してもよい。
【0049】
タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体は、ｃｒＲＮＡと複合体（以下、「タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体」という場合がある。）を形成する。続いて、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体は、ＰＡＭ配列及び標的配列を含む二本鎖ＤＮＡと結合する。ＰＡＭ配列を見つけたタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡの２本鎖を部分的にほどき、Ｒループと呼ばれる構造を形成する。この時、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体自身も構造変化を起こし、Ｃａｓ３タンパク質と結合する。Ｃａｓ３タンパク質は、ＤＮＡニッカーゼ活性及びＤＮＡヘリカーゼ活性を有している。
【0050】
実施例において後述するように、発明者らは、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ－ｃｒＲＮＡ複合体と結合したＣａｓ３タンパク質が、ｃｒＲＮＡ標的配列の５’側に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入することを明らかにした。ニックの誘導活性およびヘリカーゼ活性しか有していないＣａｓ３タンパク質が、あたかも二本鎖ＤＮＡ切断を誘導したかのようなヌクレオチドの欠失を導入することは意外なことであり、また、なぜ欠失長が１００塩基を超えるのかについても、それらの分子機構は不明である。
【0051】
ｃｒＲＮＡは、標的塩基配列に相補的な配列にハイブリダイズすることができる。標的配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識される短い配列（プロトスペーサー隣接モチーフ、ＰＡＭ）と隣接する。ＰＡＭの配列及び長さは、使用されるヌクレアーゼの種類に応じて異なるが、典型的には、標的配列に隣接する２～５塩基の塩基配列である。例えば、大腸菌由来のタイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列としては、「ＡＴＧ」、「ＡＡＧ」、「ＡＧＧ」、「ＧＡＧ」、「ＴＡＧ」等が知られている。実施例において後述するように、発明者らは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列として、「ＡＡＡ」を使用できることを新たに見出した。よって、本発明において、ＰＡＭ配列としては、「ＡＴＧ」、「ＡＡＧ」、「ＡＧＧ」、「ＧＡＧ」、「ＴＡＧ」または「ＡＡＡ」を用いることができる。
【0052】
クラス１タイプＩ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲシステムの標的配列は、標的遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖において、ＰＡＭ配列に隣接する１５～３０塩基の連続する塩基配列として設計することができる。また、６塩基毎にｃｒＲＮＡが塩基を認識せず配列特異性に寄与しない塩基が存在する。例えば、ｃｒＲＮＡの配列認識に寄与しない任意の塩基をＸ、標的配列の塩基をＮ（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）とすると、ＰＡＭ配列及び標的配列は5’-AAGNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号２５）、5’-AGGNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号２６）、5’-ATGNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号１０８）、5’-GAGNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号１０９）、5’-TAGNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号１１０）、5’-AAANNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNNNNNXNN-3’（配列番号１１１）等であることができる。上記Ｎで表される塩基配列部分において、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列の塩基配列と標的配列が１００％一致していなくても切断は起こりうるため、標的配列は、上記Ｎで表される塩基配列において、１～３塩基の変異を有していてもよい。変異としては、置換、欠失、付加が挙げられる。また、上記Ｘで表される塩基は任意の塩基で良いため、ｃｒＲＮＡの塩基配列は、更に追加で最大５塩基の変異を有することができる。標的配列は、上述したＰＡＭ配列に隣接する塩基配列である限り特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【0053】
ゲノムＤＮＡにタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とを接触させる工程は、細胞中で、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、ｃｒＲＮＡ及びＣａｓ３タンパク質を共存させることにより行うことができる。このためには、例えば、（１）タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、（２）ｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡの発現ベクターと、（３）Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターとを、細胞に導入すればよい。以下、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体と、ｃｒＲＮＡと、Ｃａｓ３タンパク質とからなるＣＲＩＳＰＲシステムを「タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム」という場合がある。ｃｒＲＮＡはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであることが好ましく、リーダー配列を含むｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであってもよい。
【0054】
タンパク質、ｍＲＮＡ、発現ベクターの細胞への導入は、リポフェクション法で行ってもよいし、エレクトロポレーション法で行ってもよいし、その他の導入方法（ウイルスベクター法、ソノポレーション法、脂質ナノ粒子法、ウイルス様粒子法等）も利用可能である。しかしながら、実施例に示されるように、発明者らは、ｉＰＳ細胞のように遺伝子導入効率が低い細胞にタンパク質、ｍＲＮＡや発現ベクターを導入する場合には、リポフェクション法よりもエレクトロポレーション法を用いた方が、導入効率及びＣａｓ３を介したゲノム編集効率が向上することを見出した。よって、対照細胞が幹細胞（特に多能性幹細胞）である実施態様では、エレクトロポレーション法を好適に用いることができる。
【0055】
Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３をコードするｍＲＮＡは、試験管内転写反応（ＩＶＴ）により合成することができる。その際、使用するヌクレオチドとしては、天然に存在するヌクレオチドを用いてもよく、ヌクレアーゼ耐性付与や化学的性質を改変するために、化学修飾されたヌクレオチドを用いてもよく、更には両者を混合して使用してもよい。また、ｍＲＮＡには、５’Ｃａｐ構造又は５’Ｃａｐ類似構造を付与してもよい。更に、ｍＲＮＡの５’側又は３’側の非翻訳領域には、ＲＮＡの安定性を高める配列（例えばヘモグロビンの３’ＵＴＲ配列）や翻訳効率を高める配列（例えばＷＰＲＥ）を付与してもよい。
【0056】
ｃｒＲＮＡは、試験管内転写反応（ＩＶＴ）により合成してもよいし、化学合成により用意してもよい。ＲＮＡの化学合成方法としては、ヌクレオシドホスホロアミダイトと固相担体を用いた方法等、一般的な核酸合成方法を好適に用いることができる。ｃｒＲＮＡの合成にあたって、天然塩基はもちろんのこと、化学修飾を導入することで、ヌクレアーゼ耐性、ハイブリダイズ能力の調整、細胞毒性、細胞内半減期、細胞内局在、細胞への取り込みやすさ、分子サイズ等を調整することもできる。
【0057】
発現ベクターとしては、ｍＲＮＡを発現するＤＮＡベクター、人工染色体ベクター、真核生物細胞において複製可能なベクター、エピソームとして細胞内である程度維持されるベクター、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクター等が挙げられ、ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。
【0058】
ＤＮＡベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、ミニサークルベクター、エピソーマルＤＮＡベクター等が挙げられる。
【0059】
人工染色体ベクターとしては、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＨＡＣベクター（Ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等が挙げられる。
【0060】
ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。
【0061】
トランスポゾンベクターとしては、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃベクター、ｐｉｇｇｙＢａｔベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベクター、ＴｏｌＩＩベクター、ＬＩＮＥベクター等が挙げられる。
【0062】
ベクターは、選択マーカーを含んでいてもよい。「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝エレメントをいい、例えば、遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するか又は細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
【0063】
薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラスチサイジン耐性遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子、Ｂｌｅ遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子の存在を選択するために有用な薬物としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子に対してはピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子に対してはＧ４１８、ハイグロマイシン耐性遺伝子に対してはハイグロマイシン、ブラスチサイジン遺伝子に対してはブラスチサイジン、ｈｉｓＤに対してはヒスチジノール、Ｇｐｔに対してはキサンチン、そしてＢｌｅに対してはブレオマイシンが挙げられる。また、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその誘導体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＲＦＰ、ＢＦＰ等が挙げられる。
【0064】
実施例において後述するように、発明者らは、多能性幹細胞のように遺伝子導入効率が低い細胞に発現ベクターを導入する場合には、発現ベクターに薬剤耐性遺伝子を搭載し、発現ベクターの導入後に短期間の薬剤選択を行って、発現ベクターを取り込んだ細胞を濃縮することにより、ゲノム編集効率を向上させることができることを明らかにした。
【0065】
発現ベクターは、Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、ｃｒＲＮＡの各因子を１つずつ発現可能な個別の発現ベクターの組み合わせであってもよいし、１つの発現ベクターがこれらの因子の複数を発現可能に調製されていてもよいし、１つの発現ベクターが、これらの因子のすべてを発現可能に調製されていてもよい。
【0066】
１つの発現ベクターがこれらの因子の複数を発現する場合、各因子は、リボソームスキッピングを誘導する２Ａ配列や、リボソーム結合サイトを有するＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）配列等で連結されていてもよい。２Ａ配列としては、例えば、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来のＰ２Ａ配列、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎｅ由来のＴ２Ａ配列、ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ由来のＦ２Ａ配列、ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ由来のＥ２Ａ配列等が挙げられ、いずれの２Ａ配列であってもよい。２Ａ配列のことを、自己切断ペプチド配列ともいう。ＩＲＥＳ配列は、Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓウイルス、Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅウイルス等のウイルス由来の配列であってもよいし、細胞中のｍＲＮＡ由来の配列であってもよい。これにより、単一のｍＲＮＡから２つ以上の複数のタンパク質を個別に発現させることができる。
【0067】
［細胞に導入する、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体構成タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、及びｃｒＲＮＡの形態］
実施例において後述するように、発明者らは、（１）Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子及びＣａｓ６遺伝子が１つのプロモーターでドライブされる単一の発現ベクター、（２）Ｃａｓ３タンパク質を発現する発現ベクター、（３）ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）の発現ベクター、の３種類の発現ベクターを導入した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では高効率にゲノム編集を誘導できるのに対し、ｉＰＳ細胞ではゲノム編集効率が非常に低いことを明らかにした。
実施例において後述するように、発明者らは、（１）Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子及びＣａｓ６遺伝子が１つのプロモーターでドライブされる単一の発現ベクター、（２）Ｃａｓ３タンパク質を発現する発現ベクター、（３）ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）の発現ベクター、の３種類の発現ベクターを導入した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では高効率にゲノム編集を誘導できるのに対し、ｉＰＳ細胞ではゲノム編集効率が非常に低いことを明らかにした。
【0068】
また、発明者らは、（１）Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子、Ｃａｓ６遺伝子及びＣａｓ３遺伝子が１つのプロモーターでドライブされる単一の発現ベクター、（２）ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）の発現ベクター、の２種類の発現ベクターを導入した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では高効率にゲノム編集を誘導できるのに対し、ｉＰＳ細胞ではゲノム編集効率が非常に低いことを明らかにした。
【0069】
また、発明者らは、Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子、Ｃａｓ６遺伝子、Ｃａｓ３遺伝子、ｃｒＲＮＡ遺伝子（転写物がｐｒｅ－ｃｒＲＮＡとなる。）の転写がそれぞれ別個のプロモーターでドライブされる７種類の発現ベクターを導入した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では高効率でゲノム編集を誘導できるのに対し、ｉＰＳ細胞ではゲノム編集の誘導がほとんど検出できないことを明らかにした。
【0070】
これに対し、発明者らは、（１）Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子、Ｃａｓ６遺伝子及びＣａｓ３遺伝子のうちの３遺伝子ずつが１つのプロモーターでドライブされる２種類の発現ベクター、（２）ｃｒＲＮＡの発現ベクター、の３種類の発現ベクターを導入した場合、ｉＰＳ細胞においてもゲノム編集を効率よく誘導できることを明らかにした。ゲノム編集効率は、最大で、上述した発現形式を採用した場合の約４倍に達した。このような結果は予想が困難な意外な結果であった。
【0071】
よって、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質を発現ベクターの形態で幹細胞に導入する態様では、２～４の構成タンパク質の遺伝子ごとに１つのプロモーターで発現させる態様が好ましく、更に好ましくは３構成タンパク質の遺伝子ごとに１つのプロモーターで発現させる態様である。
【0072】
また、発明者らは、（１）Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質及びＣａｓ３タンパク質のうちの３構成タンパク質ずつを個別に発現させる２種類のｍＲＮＡ、（２）ｃｒＲＮＡ、の３種類のＲＮＡを導入した場合、ｉＰＳ細胞においてもゲノム編集を高効率で行うことができることを明らかにした。
【0073】
よって、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をｍＲＮＡの形態で幹細胞に導入する態様では、２～４の構成タンパク質をポリシストロニックにコードするｍＲＮＡを用いることが好ましく、３構成タンパク質をポリシストロニックにコードするｍＲＮＡを用いることが更に好ましい。
【0074】
発明者らは更に、（１）プロモーターを２つ有し、Ｃｓｅ１遺伝子、Ｃｓｅ２遺伝子、Ｃａｓ７遺伝子、Ｃａｓ５遺伝子、Ｃａｓ６遺伝子及びＣａｓ３遺伝子のうちの３遺伝子ずつが１つのプロモーターでドライブされる単一の発現ベクター、（２）ｃｒＲＮＡの発現ベクター、の２種類の発現ベクターを導入してゲノム編集を行う態様において、前記２つのプロモーターの転写方向の向きが同じ方向である場合（Ｕｎｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と、逆向きである場合（Ｂｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とで、ｉＰＳ細胞におけるゲノム編集効率が大きく異なることを明らかにした。そして、２つのプロモーターが逆向きである場合に、最もゲノム編集効率が高いことを明らかにした。このような結果は予想が困難な意外な結果であった。なお、上記Ｕｎｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒで３遺伝子ずつ発現させる態様で得られるゲノム編集効率は、２種類の発現ベクターを用いて３遺伝子ずつ１つのプロモーターで発現させる態様で得られるゲノム編集効率と、ほぼ同等であった。
【0075】
以上の結果は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの各因子を発現させる様式により、ゲノム編集効率が大きく変わることを示すものである。
【0076】
よって、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質を発現ベクターの形態で幹細胞（特に多能性幹細胞）に導入する態様では、３遺伝子ずつ１つのプロモーター（合計２つのプロモーター）で発現させる発現カセット態様が特に好ましく、当該２つの発現カセットは同一の発現ベクター上にあってもよく、異なる発現ベクター上にあってもよい。最も好ましくは、３遺伝子を搭載した発現カセットが２つ、同一の発現ベクター上に逆向きに配置されている態様（Ｂｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）である。
【0077】
Ｃｓｅ１タンパク質、Ｃｓｅ２タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質を発現させるプロモーターは、ＣＡＧプロモーターやＥＦ１αプロモーター等の安定発現型プロモーターであってもよいし、発現誘導型プロモーターであってもよい。
【0078】
発現誘導型プロモーターとしては、例えば、培地への発現制御物質の添加又は除去、光照射、温度変化等により発現を誘導することができるプロモーターを用いることができる。発現誘導型プロモーターは、発現制御物質を培地に添加することにより、融合タンパク質の発現が誘導されるものであってもよいし、発現制御物質を培地から除去することにより、融合タンパク質の発現が誘導されるものであってもよい。より具体的な発現誘導型プロモーターとしては、例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター）が挙げられるがこれに限定されない。
【0079】
実施例において後述するように、発明者らは、ドキシサイクリン誘導性に、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現が誘導されるｐｉｇｇｙＢａｃベクターを作製した。また、このベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、安定発現株を取得した。
【0080】
このようなベクターは、特に細胞モデルでタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を誘導する場合に好適に用いることができる。
【0081】
［標的領域］
ヌクレオチドの欠失を導入する対象であるゲノムＤＮＡの標的領域は、遺伝子又はその制御領域等であってもよい。遺伝子制御領域としては、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列等が挙げられる。遺伝子は、例えば、遺伝子疾患に関与しており、遺伝子治療の対象となり得る遺伝子であってもよく、変異を有する遺伝子であってもよく、タンパク質をコードしていない遺伝子（ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子、例としてｍｉＲＮＡをコードする遺伝子）であってもよく、染色体複製や分配に関する領域であってもよく、細菌やウイルス等の病原体の感染に関与している遺伝子であってもよく、細胞の免疫拒絶に関与している遺伝子であってもよい。
ヌクレオチドの欠失を導入する対象であるゲノムＤＮＡの標的領域は、遺伝子又はその制御領域等であってもよい。遺伝子制御領域としては、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列等が挙げられる。遺伝子は、例えば、遺伝子疾患に関与しており、遺伝子治療の対象となり得る遺伝子であってもよく、変異を有する遺伝子であってもよく、タンパク質をコードしていない遺伝子（ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子、例としてｍｉＲＮＡをコードする遺伝子）であってもよく、染色体複製や分配に関する領域であってもよく、細菌やウイルス等の病原体の感染に関与している遺伝子であってもよく、細胞の免疫拒絶に関与している遺伝子であってもよい。
【0082】
具体的な標的領域としては、例えば、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子又はその制御領域又はそれらの近傍、Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）遺伝子又はその制御領域又はそれらの近傍、ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子又はその制御領域又はそれらの近傍等が挙げられる。ここで、近傍とは、５～１０ｋｂ以内、より好ましくは１ｋｂ以内の領域を意味する。
【0083】
ＨＬＡ遺伝子とは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ遺伝子等を指す。それぞれのＨＬＡ遺伝子は配列多様性を持つことが知られており、例えばＨＬＡ－Ａ遺伝子には、そのアミノ酸配列や塩基配列の違いから、ＨＬＡ－Ａ２やＨＬＡ－Ａ２７等の多数のＨＬＡ型が存在する（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）。ＨＬＡ遺伝子は、ＭＨＣ遺伝子とも呼ばれている。
【0084】
例えば、標的領域がＢ２Ｍ遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍、又はＨＬＡ遺伝子若しくはその制御領域若しくはそれらの近傍であり、Ｂ２Ｍタンパク質又はＨＬＡタンパク質の発現に重要な、エクソン領域、プロモーター領域等の欠失を誘導した場合、細胞表面へのクラスＩ ＨＬＡタンパク質の発現を減弱又は消失させることができ、細胞のＨＬＡを介した抗原性を低下させることができる。このような細胞は、宿主に移植した場合に、宿主からの免疫拒絶反応を回避又は低減することができる。
【0085】
したがって、他家移植であってもＨＬＡ抗原を介した免疫拒絶反応を低減した細胞を作製することができる。本手法はｉＰＳ細胞に留まらず、ＥＳ細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、巨核球細胞、骨髄細胞、臍帯血細胞、筋肉細胞、筋肉幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、グリア細胞、マイクログリア細胞、神経幹細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、網膜細胞、角膜細胞、視細胞、肝臓細胞、膵島細胞、β細胞、間葉系幹細胞等、他の細胞種を用いた他家由来細胞移植へも広く適応可能な技術であり、極めて汎用性および応用性が高い。これにより、他家移植の際のレシピエント選択の幅を広げることができ、細胞治療や再生医療の細胞製造コストを劇的に下げることが可能となる。
【0086】
また、例えば、標的領域がＤＭＤ遺伝子又はその制御領域又はそれらの近傍であり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者においてジストロフィン（ＤＭＤ）タンパク質の読み枠がずれている細胞の場合、特定の単一又は複数のエクソンの欠失を誘導することにより、ＤＭＤタンパク質の読み枠を回復し、ＤＭＤタンパク質の発現を回復することができる。この場合に発現するＤＭＤタンパク質は、完全長ではなくアミノ酸の一部が欠失したタンパク質ではあるが、ＤＭＤタンパク質として機能し得るため、当該ＤＭＤタンパク質の発現を回復した細胞は、筋ジストロフィー患者の細胞移植治療に利用することができる。また、ＤＭＤ遺伝子を標的遺伝子とするタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、筋ジストロフィー患者の遺伝子治療に利用することもできる。
【0087】
このような理由から、本実施形態における標的領域は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子又はこれらの制御領域であってよく、好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ＨＬＡ－Ｆ遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ遺伝子又はこれらの制御領域であり、更に好ましくは、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＤＭＤ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ遺伝子又はこれらの制御領域である。
【0088】
本実施形態の方法は、ゲノムＤＮＡの標的領域におけるヌクレオチドの欠失を確認する工程、ゲノムＤＮＡの標的領域にヌクレオチドの欠失が導入された細胞を選別して回収する工程等を更に含んでいてもよい。
【0089】
ゲノムＤＮＡの標的領域におけるヌクレオチドの欠失の確認は、例えば、ｃｒＲＮＡの標的配列の前後をＰＣＲで増幅し、アガロース電気泳動や、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ等を用いて増幅ＤＮＡのサイズを解析することにより行うことができる。ＰＣＲをバルクの細胞で行った場合、一部の細胞に標的領域におけるヌクレオチドの欠失が存在すると、本来のサイズの増幅ＤＮＡ断片より小さな増幅ＤＮＡ断片が出現する。
【0090】
あるいは、ｃｒＲＮＡの標的配列の前後を含む領域をＰＣＲで増幅し、サンガーシーケンス法により、塩基配列を決定してもよい。シーケンスをバルクの細胞について行った場合、一部の細胞に標的領域におけるヌクレオチドの欠失が存在すると、欠失部分以降の塩基配列クロマトグラムデータに、複数の塩基配列が混合した波形が検出される。場合によっては、ＴＩＤＥ法（https://tide.nki.nl/）やＩＣＥ法（https://ice.synthego.com/#/）等を用いて、混合したシーケンス波形を分離することも可能である。または、PCR増幅DNAをプラスミドDNA等にクローニングし、プラスミドＤＮＡクローンを大腸菌等から回収することにより、単一のＤＮＡ由来の配列をサンガーシーケンスで解析することもできる。
【0091】
また、ｃｒＲＮＡの標的配列の前後を含む領域をＰＣＲで増幅し、ナノポア社ＭｉｎｉＯＮシーケンサーやＰａｃＢｉｏ社シーケンサー等の一分子長鎖シーケンスを行い、標的配列の前後のリファレンス塩基配列に対してＬＡＳＴ（http://last.cbrc.jp/）やｍｉｎｉｍａｐ２（https://github.com/lh3/minimap2）等のソフトを利用してマッピングすることにより、欠失領域を同定することができる。
【0092】
また、標的領域が細胞膜タンパク質をコードする遺伝子又はその制御領域である場合、標的領域にヌクレオチドの欠失が導入された結果、細胞膜タンパク質が消失する。この場合、細胞膜タンパク質を認識する抗体、細胞膜タンパク質に結合するタンパク質や基質を用いて、標的遺伝子にヌクレオチドの欠失が導入された細胞を検出することができる。更に、当該細胞膜タンパク質が陰性となった細胞をセルソーターやＭＡＣＳ等によって分取することにより、標的領域にヌクレオチドの欠失が導入された細胞を濃縮又は回収することができる。
【0093】
［遺伝子改変細胞］
１実施形態において、本発明は、上述した方法により、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入された、ゲノムＤＮＡ改変細胞を提供する。本実施形態の方法によってゲノムＤＮＡが改変される細胞は、生体から採取された細胞であってもよい。また、本実施形態の遺伝子改変細胞は、遺伝子治療を目的とした細胞移植に用いることができ、すなわち、細胞移植用細胞であってもよい。本実施形態の遺伝子改変細胞において、標的領域としては、Ｂ２Ｍ遺伝子又はその制御領域、ＨＬＡ遺伝子又はその制御領域、ＤＭＤ遺伝子又はその制御領域等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、上述した方法により、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入された、ゲノムＤＮＡ改変細胞を提供する。本実施形態の方法によってゲノムＤＮＡが改変される細胞は、生体から採取された細胞であってもよい。また、本実施形態の遺伝子改変細胞は、遺伝子治療を目的とした細胞移植に用いることができ、すなわち、細胞移植用細胞であってもよい。本実施形態の遺伝子改変細胞において、標的領域としては、Ｂ２Ｍ遺伝子又はその制御領域、ＨＬＡ遺伝子又はその制御領域、ＤＭＤ遺伝子又はその制御領域等が挙げられる。
【0094】
上述したように、標的領域がＢ２Ｍ遺伝子若しくはその制御領域、又はＨＬＡ遺伝子若しくはその制御領域である場合、本実施形態の遺伝子改変細胞は、抗原性が低下している。このため、宿主に移植した場合に、宿主からの免疫拒絶反応を回避又は低減することができる。
【0095】
また、標的領域がＤＭＤ遺伝子であり、筋ジストロフィー患者においてＤＭＤタンパク質の読み枠がずれている場合、本実施形態の遺伝子改変細胞は、適切にデザインされた標的のエクソンにおいてエクソンスキッピングを誘導することにより、ＤＭＤタンパク質の読み枠を回復し、ジストロフィンタンパク質の発現を回復することができる。このため、筋ジストロフィー患者の細胞移植治療に利用することができる。
【0096】
本実施形態の遺伝子改変細胞において、欠失したヌクレオチドの長さは１００塩基超であり、約１０，０００塩基であることができる。また、１０，０００塩基以上の長さのヌクレオチドが欠失していてもよい。
【0097】
実施例（実験例５、図１２）等において後述するように、本実施形態の遺伝子改変細胞は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡの標的配列を保持している場合がある。
【0098】
他の手段により、標的遺伝子に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入された遺伝子改変細胞を製造することは困難である。また、本実施形態の遺伝子改変細胞は、標的遺伝子に１００塩基超のヌクレオチドの欠失が導入されているという特徴を有している。また、本実施形態の遺伝子改変細胞は、場合によっては、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターやタンパク質等を細胞内部に有している。しかしながら、これらの特徴により本実施形態の遺伝子改変細胞であるか否かを特定することは困難であり、製造方法で特定することが実際的である。
【0099】
［ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キット］
１実施形態において、本発明は、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ゲノムＤＮＡの標的領域にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キットを提供する。ここで、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変とは、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入することを意味する。
１実施形態において、本発明は、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクターと、ゲノムＤＮＡの標的領域にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＣａｓ３タンパク質の発現ベクターと、を含む、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変用キットを提供する。ここで、ゲノムＤＮＡの標的領域の改変とは、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入することを意味する。
【0100】
本実施形態のキットにより、上述した、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を導入する方法を好適に実施することができる。また、本実施形態のキットにより、上述したゲノムＤＮＡ改変細胞を簡便に製造することができる。
【0101】
本実施形態のキットにおいて、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質、標的遺伝子にハイブリダイズ可能なｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ３タンパク質、発現ベクターについては、上述したものと同様である。
【実施例】
【0102】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0103】
［実験例１］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊１）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム上のβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を破壊（ノックアウト）した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊１）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム上のβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を破壊（ノックアウト）した。
【0104】
ＨＬＡはクラスＩとクラスＩＩに分類されている。クラスＩのＨＬＡタンパク質（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ等）は体内のほとんどの種類の細胞で発現している。クラスＩのＨＬＡタンパク質はＢ２Ｍとヘテロダイマーを形成して細胞表面へ発現し、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に対してペプチドを提示し活性化を誘導する機能を担っている。すなわち、ヒトクラスＩ ＨＬＡタンパク質が細胞表面に提示されるためには、Ｂ２Ｍタンパク質とヘテロダイマーを形成することが必要である。本実験により、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いてＢ２Ｍ遺伝子が破壊された場合、細胞表面のＨＬＡタンパク質が消失することになる。
【0105】
図１は、Ｂ２Ｍ遺伝子座の構造を示す模式図である。図１中、「ｅｘ１」、「ｅｘ２」、「ｅｘ３」、「ｅｘ４」は、それぞれＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１、２、３、４の大まかな位置を表し、＃１～＃１０は、ｃｒＲＮＡの標的配列の位置を示す。＃１～＃１０で示される標的配列の塩基配列をそれぞれ配列番号１～１０に示す。
【0106】
続いて、上記の＃１～＃１０の各標的配列に、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムをそれぞれリクルートするためのｃｒＲＮＡ（以下、それぞれ「ｃｒＲＮＡ ＃１」～「ｃｒＲＮＡ ＃１０」という場合がある。）の発現ベクターを作製した。
【0107】
図２は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターの構造を示す模式図である。図２中、「Ｕ６」は、Ｕ６プロモーターを表し、「Ｌｅａｄｅｒ」は大腸菌ｃｒＲＮＡのリーダー配列を表し、「Ｒｅｐｅａｔ」はｃｒＲＮＡのリピート配列を表し、「Ｔａｒｇｅｔ」はｃｒＲＮＡの標的配列を表す。標的配列をスペーサー配列ともいう。また、下流側のリピート配列の３’末端には、Ｕ６プロモーターのターミーネーションシグナル（転写終止シグナル）として「ＴＴＴＴＴＴ」（Ｔはチミジンを意味する。）で表される塩基配列を付与した。このｃｒＲＮＡはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡであるということができる。
【0108】
また、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターを作製した。図３（ａ）～（ｆ）は、作製したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの構造を示す模式図である。
【0109】
図３（ａ）～（ｆ）中、「Ｃｓｅ１」は大腸菌由来Ｃｓｅ１遺伝子を表し、「Ｃｓｅ２」は大腸菌由来Ｃｓｅ２遺伝子を表し、「Ｃａｓ５」は大腸菌由来Ｃａｓ５遺伝子を表し、「Ｃａｓ６」は大腸菌由来Ｃａｓ６遺伝子を表し、「Ｃａｓ７」は大腸菌由来Ｃａｓ７遺伝子を表し、「Ｃａｓ３」は大腸菌由来Ｃａｓ３遺伝子を表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「ＣＡＧ」はＣＡＧプロモーターを表す。
【0110】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子としては、ヒトコドン頻度に合わせて塩基配列を最適化したものを使用した。また、各遺伝子の５’側及び３’側には、それぞれ核移行シグナルとなるペプチド配列をコードする塩基配列を付加した。３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣｓｅ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に示し、３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣｓｅ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示し、３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣａｓ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２９に示し、３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣａｓ６タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３０に示し、３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣａｓ７タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３１に示し、３’側及び５’側に核移行シグナルを付加したＣａｓ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３２に示す。
【0111】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ３５０ｎｇずつ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター３５０ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0112】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン（ＩＦＮ）－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の細胞表面への発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0113】
図４は、算出したＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を示すグラフである。図４中、「ｎｏｎ－ｅｄｉｔ」はｃｒＲＮＡの発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表し、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３ ｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを添加した結果であることを表し、「＃１」～「＃１０」は、それぞれ、上述した＃１～＃１０の各標的配列にタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムをリクルートするためのｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示し、「＃１＋＃２」は、上述した＃１の標的配列にタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムをリクルートするためのｃｒＲＮＡの発現ベクターと、上述した＃２の標的配列にタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムをリクルートするためのｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示す。
【0114】
その結果、いずれのｃｒＲＮＡを用いた場合においても、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を観察することができた。この結果から、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより、ヒト細胞のＢ２Ｍ遺伝子を破壊し、細胞表面のＨＬＡタンパク質の発現を消失させることができることが明らかとなった。
【0115】
［実験例２］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊２）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒトｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊２）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒトｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。
【0116】
図５は、本実験例でタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質を発現させるために用いたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの構造を示す模式図である。図５中、「Ｃｓｅ１」は大腸菌由来Ｃｓｅ１遺伝子を表し、「Ｃｓｅ２」は大腸菌由来Ｃｓｅ２遺伝子を表し、「Ｃａｓ７」は大腸菌由来Ｃａｓ７遺伝子を表し、「Ｃａｓ５」は大腸菌由来Ｃａｓ５遺伝子を表し、「Ｃａｓ６」は大腸菌由来Ｃａｓ６遺伝子を表し、「Ｐ２Ａ」はリボソームスキッピングを誘導するＰｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来のＰ２Ａ配列を表し、「ＩＲＥＳ」はＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅを表し、「ＰｕｒｏＲ」はピューロマイシン耐性遺伝子を表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「ＣＡＧ」はＣＡＧプロモーターを表す。
【0117】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６遺伝子としては、ヒトコドン頻度に合わせて塩基配列を最適化したものを使用した。また、各遺伝子の３’側には、それぞれ核移行シグナルとなるペプチド配列をコードする塩基配列を付加した。なお、本実験例では、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の各構成タンパク質に、核移行シグナルが１つずつしか付加されていないため、実験例１と比較して遺伝子を破壊する効率が低下することが予想された。
【0118】
この発現ベクターでは、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の各構成タンパク質が、Ｐ２Ａ配列で連結されていることにより、単一のｍＲＮＡから個別のタンパク質として発現される。
【0119】
遺伝子導入の前日に２５０，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクター６００ｎｇ、実験例１と同様のＣａｓ３タンパク質の発現ベクター２００ｎｇ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター２００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて導入した。ｃｒＲＮＡ発現ベクターは、単独のベクターを導入する場合には１ウェルあたり２００ｎｇ使用し、２種類のベクターを共導入する場合には１ウェルあたりそれぞれ１００ｎｇずつ使用した。
【0120】
遺伝子導入したｉＰＳ細胞は、２４時間後に終濃度１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加え、１日間遺伝子導入された細胞の選択を行なった。続いて、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ｉＰＳ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメーターを用いたソーティングにより、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を回収した。
【0121】
続いて、ソーティングしたＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を増殖培養した後、再び同様に免疫染色を行い、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞群をソーティングした後、クローンを樹立した。
【0122】
図６（ａ）～（ｃ）は、樹立したｉＰＳ細胞クローンを再度免疫染色し、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。図６（ａ）～（ｃ）中、横軸はＨＬＡ－Ａ２の発現量を示し、縦軸は前方散乱光の強度を示す。また、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｉＰＳＣｓ」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体で染色していないｉＰＳ細胞の解析結果を表すグラフであり、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ ｉＰＳＣｓ」は免疫染色を行なった野生型のｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「Ｂ２Ｍ ＫＯ ｉＰＳＣ ｃｌｏｎｅ」は本実験例で樹立したｉＰＳ細胞クローンを免疫染色した結果を表すグラフである。
【0123】
本実験例で樹立したｉＰＳ細胞クローンは、全ての細胞でＨＬＡ－Ａ２が陰性になっており、ｉＰＳ細胞においてもタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりＢ２Ｍ遺伝子を破壊できることが明らかとなった。
【0124】
また、以下のようにして、図６（ｃ）に結果を示すｉＰＳ細胞クローンよりゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲ及びサンガーシーケンスを行って、Ｂ２Ｍ遺伝子座のジェノタイピングを行なった。まず、ｉＰＳ細胞クローンより市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。続いて、センス鎖プライマー（配列番号１１）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号１２）を用いてｐｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）によりＰＣＲを行なった。
【0125】
図７（ａ）は上述したＰＣＲにより得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す写真である。図７（ａ）中、「１ｋｂラダー」は分子量参照用の１ｋｂ ＤＮＡマーカー（ワトソン社）を表し、「ＷＴ」は未編集のｉＰＳ細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて行なったＰＣＲの結果を表し、「Ｂ２Ｍ ＫＯ ｃｌｏｎｅ」は、図６（ｃ）に結果を示すｉＰＳ細胞クローン由来のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて行なったＰＣＲの結果を表す。
【0126】
その結果、Ｂ２Ｍ遺伝子破壊ｉＰＳ細胞クローンでは、Ｂ２Ｍ遺伝子座の両アレルに大きな欠失が生じていることが明らかとなった。
【0127】
また、図７（ｂ）は、図７（ａ）に写真を示したＰＣＲ産物をサンガーシーケンスにより更に詳細に解析した結果を表す模式図である。図７（ｂ）において、「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ」は、図７（ａ）に結果を示すＰＣＲ反応で用いたＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒのＢ２Ｍ遺伝子座における大まかな位置を表し、「ｃｒＲＮＡ」、「＃１」及び「＃２」は、Ｂ２Ｍ遺伝子破壊に用いた２種類のｃｒＲＮＡの標的配列のＢ２Ｍ遺伝子座における大まかな位置を表し、「ｅｘ１」、「ｅｘ２」、「ｅｘ３」、「ｅｘ４」は、それぞれＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１、２、３、４の大まかな位置を表し、「ａｌｌｅｌｅ １」、「ａｌｌｅｌｅ ２」は、ｉＰＳ細胞クローンの各アレルを示す。また、破線は各アレルにおけるゲノムＤＮＡ欠失領域の大まかな位置及び欠失していた塩基長を表す。
【0128】
その結果、Ｂ２Ｍ遺伝子破壊ｉＰＳ細胞クローンでは、一方のアレルでは標的配列「＃２」の５’上流側に２ｋｂ弱の欠失が生じていることが明らかとなった。また、もう一方のアレルにおいても標的配列「＃２」の５’上流側に１０ｋｂ弱の大きな欠失が生じていることが明らかとなった。
【0129】
［実験例３］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊３）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。本実験例では、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクター及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターではなく、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質のｍＲＮＡ及びＣａｓ３タンパク質のｍＲＮＡを用いた。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊３）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。本実験例では、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクター及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターではなく、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質のｍＲＮＡ及びＣａｓ３タンパク質のｍＲＮＡを用いた。
【0130】
まず、いずれも大腸菌由来である、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７及びＣａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを、市販のキット（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して試験管内で合成した。ｍＲＮＡ合成の際は、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰに加えて、５’キャップアナログであるＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ＴｒｉＬｉｎｋ社）とＧＴＰを４：１の割合になるよう混合したものを使用した。また、試験管内で転写を行うＴ７プロモーター配列及び５’ＵＴＲの配列とコザック配列として配列番号３３の配列を、３’ＵＴＲ及びポリＡシグナルの配列として配列番号３４の配列を用いた。ここで、３’ＵＴＲの配列は、αグロビン（Ｈｂａ－ａ１）遺伝子のＵＴＲ配列に基づいている。
【0131】
また、それぞれ配列番号１３及び１４に示す塩基配列からなるｃｒＲＮＡを市販のキット（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して試験管内で合成した。合成したｃｒＲＮＡは、大腸菌ｃｒＲＮＡのリーダー配列、リピート配列、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する標的配列及びリピート配列をこの順に有していた。
【0132】
遺伝子導入の前日に３００，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７及びＣａｓ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ並びにｃｒＲＮＡを、それぞれ５００ｎｇずつ、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0133】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0134】
図８（ａ）～（ｅ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図８（ａ）～（ｅ）中、横軸はＨＬＡ－Ａ２の発現量を示し、縦軸は前方散乱光の強度を示す。また、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体で染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は免疫染色を行なった野生型のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表し、「ｃｒＲＮＡ ＃１」は配列番号１３のｃｒＲＮＡを導入した結果を表し、「ｃｒＲＮＡ ＃２」は配列番号１４のｃｒＲＮＡを導入した結果を表し、「ｃｒＲＮＡ ＃１＋＃２」は配列番号１３のｃｒＲＮＡと配列番号１４のｃｒＲＮＡを共導入した結果を表す。
【0135】
その結果、図８（ｃ）～（ｅ）において、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の出現が確認された。この結果から、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現方法として、試験管内で合成したｍＲＮＡとｃｒＲＮＡを細胞に導入した場合でも、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊できることが明らかとなった。
【0136】
［実験例４］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターの作製）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるヒト細胞におけるゲノム欠失効率を更に向上させるため、発現ベクターの検討を行なった。具体的には、まず、図９（ａ）～（ｄ）に示す構造を有する発現プラスミドＤＮＡベクターを作製した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターの作製）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるヒト細胞におけるゲノム欠失効率を更に向上させるため、発現ベクターの検討を行なった。具体的には、まず、図９（ａ）～（ｄ）に示す構造を有する発現プラスミドＤＮＡベクターを作製した。
【0137】
図９（ａ）～（ｄ）中、「Ｃｓｅ１」は大腸菌由来Ｃｓｅ１遺伝子を表し、「Ｃｓｅ２」は大腸菌由来Ｃｓｅ２遺伝子を表し、「Ｃａｓ３」は大腸菌由来Ｃａｓ３遺伝子を表し、「Ｃａｓ５」は大腸菌由来Ｃａｓ５遺伝子を表し、「Ｃａｓ６」は大腸菌由来Ｃａｓ６遺伝子を表し、「Ｃａｓ７」は大腸菌由来Ｃａｓ７遺伝子を表し、「Ｐ２Ａ」はＰ２Ａ配列を表し、「Ｔ２Ａ」はＴ２Ａ配列を表し、「ＩＲＥＳ」はＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅを表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「ＥＦ１α」はＥＦ１αプロモーターを表し、「ＥＧＦＰ」はＥＧＦＰ蛍光タンパク質遺伝子を表し、「ｍＣｈｅｒｒｙ」はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を表し、「ＰｕｒｏＲ」はピューロマイシン耐性遺伝子を表し、「ＨｇｒＲ」はハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。
【0138】
また、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子としては、ヒトコドン頻度に合わせて塩基配列を最適化したものを使用した。また、各遺伝子の３’側及び５’側には、それぞれ核移行シグナル（ＮＬＳ）となるペプチド配列をコードする塩基配列を付加した。
【0139】
これらの発現ベクターでは、各遺伝子が、リボソームスキッピングを誘導する、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来Ｐ２Ａ配列又はＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎｅ由来Ｔ２Ａ配列で連結されていることにより、単一のｍＲＮＡから個別のタンパク質として発現される。
【0140】
図９（ａ）～（ｄ）に示す構造を有する発現プラスミドＤＮＡベクターは、上述したコンストラクトがｐｉｇｇｙＢａｃ由来５’ＴＲ配列及び３’ＴＲ配列ではさまれているため、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとして使用することもできる。
【0141】
これらのベクターをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと共に共発現させると、トランスポザーゼにより「３’ＴＲ」及び「５’ＴＲ」に挟まれた領域が切り出され、宿主細胞ゲノム中の「ＴＡＴＡ」塩基配列部位に組み込まれ、安定発現細胞株が樹立される。
【0142】
また、トランスポゾンベクターが導入された細胞は、ピューロマイシン又はハイグロマイシンを用いた薬剤選択、或いはＥＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の蛍光を利用したソーティングにより選択することができる。
【0143】
［実験例５］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊４）
実験例４で作製したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。また、比較のために、実験例１、実験例２で作製した発現ベクターも使用した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊４）
実験例４で作製したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。また、比較のために、実験例１、実験例２で作製した発現ベクターも使用した。
【0144】
《ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討》
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討を行った。遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、上述したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター１６００ｎｇと、実験例１で作製したｃｒＲＮＡ ＃１の発現ベクター８００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討を行った。遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、上述したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター１６００ｎｇと、実験例１で作製したｃｒＲＮＡ ＃１の発現ベクター８００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0145】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターとして、複数の発現ベクターを同時に遺伝子導入する場合、導入するベクターの数に応じて、合計質量が１６００ｎｇになるよう各ベクターの量を均等に割り振った。
【0146】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0147】
図１０（ａ）～（ｈ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１０（ａ）～（ｈ）中、横軸はＨＬＡ－Ａ２の発現量を示し、縦軸は前方散乱光の強度を示す。また、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体で染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は免疫染色を行なった野生型のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表し、「ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ＋Ｃａｓ３」は図５で示したベクター及び図３（ｆ）で示したベクターを共導入した結果を表し、「ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ」は図３（ａ）～（ｆ）で示した計６種類のタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム発現ベクターを共導入した結果を表し、「２６３－ｉＣＡ＋７５１－ｉＣＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてｍＣｈｅｒｒｙを持つベクターを共導入した結果を表し、「２６３－ｉＨＡ＋７５１－ｉＨＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「２６３－ｉＰＡ＋７５１－ｉＰＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＳＰ」は図９（ｂ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表す。
【0148】
その結果、いずれの発現ベクターを用いた場合においてもＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を観察することができた。中でも、特に図９（ａ）で示したベクターを用いることで、図３（ａ）～（ｆ）で示したベクター及び図５で示したベクターよりも効率よくＢ２Ｍ遺伝子を破壊できることが明らかとなった。
【0149】
また、図９（ｂ）で示したベクターは、図５で示したベクターを用いた時よりは高い効率でＢ２Ｍ遺伝子を破壊できたが、図３（ａ）～（ｆ）で示したベクターを６種類同時に用いた時よりはＢ２Ｍ遺伝子の破壊効率が低い値を示した。
【0150】
《ｉＰＳ細胞を用いた検討》
続いて、ｉＰＳ細胞を用いた検討を行った。遺伝子導入の前日に３０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、上述したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター６００ｎｇと、実験例１で作製したｃｒＲＮＡ ＃１の発現ベクター３００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ｉＰＳ細胞に導入した。
続いて、ｉＰＳ細胞を用いた検討を行った。遺伝子導入の前日に３０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、上述したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター６００ｎｇと、実験例１で作製したｃｒＲＮＡ ＃１の発現ベクター３００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ｉＰＳ細胞に導入した。
【0151】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターとして、複数の発現ベクターを同時に遺伝子導入する場合、導入するベクターの数に応じて、合計質量が６００ｎｇになるよう各ベクターの量を均等に割り振った。
【0152】
遺伝子導入したｉＰＳ細胞は、２４時間後に終濃度０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加え、１日間遺伝子導入された細胞の選択を行なった。続いて、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ｉＰＳ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0153】
図１１（ａ）～（ｇ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１１（ａ）～（ｇ）中、横軸はＨＬＡ－Ａ２の発現量を示し、縦軸は前方散乱光の強度を示す。また、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体で染色していないｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は免疫染色を行なった野生型のｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ＋Ｃａｓ３」は図５で示したベクター及び図３（ｆ）で示したベクターを共導入した結果を表し、「２６３－ｉＰＡ＋７５１－ｉＰＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＳＰ」は図９（ｂ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＵ」（ＤＰＵ：Ｄｕａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｕｎｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）は図９（ｃ）で示したベクターを導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＢ」（ＤＰＢ：Ｄｕａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｂｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）は図９（ｄ）で示したベクターを導入した結果を表す。
【0154】
その結果、いずれの発現ベクターを用いた場合においてもＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を観察することができたが、特に図９（ａ）、（ｃ）、（ｄ）で示したベクターを用いることで、図５で示したベクター及び図９（ｂ）で示したベクターよりも効率よくＢ２Ｍ遺伝子を破壊できることが明らかとなった。
【0155】
続いて、フローサイトメーターを用いたソーティングにより、作出したＨＬＡ－Ａ２陰性ｉＰＳ細胞を回収した。続いて、得られたバルクｉＰＳ細胞を用いてＢ２Ｍ遺伝子座のジェノタイピングを行った。
【0156】
具体的には、まず、バルクｉＰＳ細胞より市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。続いて、センス鎖プライマー（配列番号１５）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号１６）を用いてＱｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）を用いてＰＣＲを行なった。
【0157】
得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により解析した。その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより欠失が生じて野生型より増幅産物の分子量が低下したと考えられたバンドを分離・精製し、サンガーシーケンスにより欠失部位を特定した。場合により、得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニングし、得られたコロニーを用いてサンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
【0158】
図１２は、バルクのＨＬＡ－Ａ２陰性ｉＰＳ細胞のＢ２Ｍ遺伝子座を解析した結果を示す模式図である。図１２中、「Ｂ２Ｍ」は、Ｂ２Ｍ遺伝子座の大まかな構造を表し、「ｅｘ１」、「ｅｘ２」及び「ｅｘ３」は、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン番号とその領域を表し、「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ」はＰＣＲ増幅に用いたプライマーのＢ２Ｍ遺伝子座における大まかな位置を表し、「ｃｒＲＮＡ」は、遺伝子破壊に用いたｃｒＲＮＡのＢ２Ｍ遺伝子座における大まかな位置を表し、「Ｃｌｏｎｅ＃１」～「Ｃｌｏｎｅ＃１２」は、ＴＡクローニングにより得られた大腸菌クローンを示す。図１２にはまた、「Ｃｌｏｎｅ＃１」～「Ｃｌｏｎｅ＃１２」のサンガーシーケンスの結果に基づいて特定したゲノムＤＮＡ欠失領域を点線又は＊印で示す。
【0159】
その結果、Ｃｌｏｎｅ＃１～Ｃｌｏｎｅ＃１２のすべてのサンプルにおいて、ｃｒＲＮＡの結合部位を基準に５’側（ＰＡＭ側）上流方向に数百ｂｐ～数ｋｂに渡る大きなヌクレオチドの欠失が確認された。また、Ｃｌｏｎｅ＃１では、ｃｒＲＮＡの標的配列に２１塩基のヌクレオチドの欠失が認められた。また、Ｃｌｏｎｅ＃２、＃４、＃８、＃９、＃１０ではエクソン２に欠失が認められ、Ｃｌｏｎｅ＃４ではエクソン２の完全な欠失が認められた。また、Ｃｌｏｎｅ＃５ではエクソン１に欠失が認められた。また、Ｃｌｏｎｅ＃３、＃６、＃７、＃１１、＃１２ではエクソンには欠失は認められなかった。また、解析した１２サンプルの内「Ｃｌｏｎｅ＃１」を除く１１サンプルにおいて、ｃｒＲＮＡの標的配列が保持されていることが明らかとなった。
【0160】
［実験例６］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤエクソンスキッピング）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いてジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン４５番に対してエクソンスキッピングを誘導できるか否かを検討した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤエクソンスキッピング）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いてジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン４５番に対してエクソンスキッピングを誘導できるか否かを検討した。
【0161】
エクソンスキッピングは、国際公開第２０１８／１７９５７８号公報に記載されたものと同様のエクソンスキッピングモデルルシフェラーゼアッセイにより検出した。図１３は、エクソンスキッピングモデルルシフェラーゼアッセイに用いたレポーターベクターの構造を説明する模式図である。
【0162】
図１３中、四角はエクソン部分を表し、線はイントロン部分及び非翻訳領域を表す。また、「ＥＦ１α」はＥＦ１αプロモーターを表し、「ＩＲＥＳ」はＩｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅを表し、「ＰｕｒｏＲ」はピューロマイシン耐性遺伝子を表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「３’ＴＲ」はｐｉｇｇｙＢａｃ由来３’ＴＲ配列を表し、「５’ＴＲ」はｐｉｇｇｙＢａｃ由来５’ＴＲ配列を表し、「＃１」及び「＃２」はｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの標的配列の位置を表す。
【0163】
このレポーターベクターには、Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）遺伝子に含まれる偽スプライシングドナー配列を破壊したＬｕｃ２（Ｇ９６７Ａ）遺伝子を２つに分割し、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５の前後の約４ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したコンストラクト（Ｌｕｃ２＋ｈＥｘ４５）が挿入されている。このレポーターベクターより発現されるＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ遺伝子は、スプライシングによりＤＭＤ遺伝子エクソン４５が挿入されるため不活性型である。
【0164】
一方、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより、レポーターベクター中のヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５がスキッピング（あるいは欠失）されると、活性型のＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼが発現されるようになる。
【0165】
したがって、このレポーターベクターを細胞に導入し、Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの活性を測定することにより、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に対してエクソンスキッピングを誘導する活性を測定することができる。
【0166】
本実験例では、図１３中、「＃１」で表されるヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４４中の標的配列（配列番号１７）に対するタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡ、及び、図１３中、「＃２」で表されるヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４５中の標的配列（配列番号１８）に対するタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡを使用した。
【0167】
また、比較のために、クラス２ ＣＲＩＳＰＲシステムであるＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を用いた実験も同時に行った。Ｃａｓ９の発現には、プラスミドＤＮＡ（ｐｉｇｇｙＢａｃ）ベクターを用いた。Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡとしては、上述したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡの標的配列とオーバーラップする２種類の標的配列に対するｓｇＲＮＡを使用した。
【0168】
具体的には、図１３中、「＃１」で表されるヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４４中の標的配列（配列番号１９）に対するＣａｓ９のｓｇＲＮＡ、及び、図１３中、「＃２」で表されるヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４５中の標的配列（配列番号２０）に対するＣａｓ９のｓｇＲＮＡを使用した。Ｕ６プロモーターの制御下でこれらのｓｇＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターを作製し使用した。
【0169】
《ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討》
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討を行った。タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた検討では、上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターを２００ｎｇ、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、９６ウェルプレートに６０，０００個／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。
まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた検討を行った。タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた検討では、上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターを２００ｎｇ、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、９６ウェルプレートに６０，０００個／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。
【0170】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターとして、複数の発現ベクターを同時に遺伝子導入する場合、導入するベクターの数に応じて、合計質量が２００ｎｇになるよう各ベクターの量を均等に割り振った。また、２種類のｃｒＲＮＡを共導入する場合には、それぞれ５０ｎｇずつ使用した。
【0171】
Ｃａｓ９を用いた検討では、上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、Ｃａｓ９発現ベクター２００ｎｇ、ｓｇＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、９６ウェルプレートに６０，０００個／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。また、２種類のｓｇＲＮＡを共導入する場合には、それぞれ５０ｎｇずつ使用した。
【0172】
遺伝子導入には、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。
【0173】
続いて、遺伝子導入の２日後に、市販のキット（「Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ」Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２９２０、プロメガ社）を用いてルシフェラーゼレポーター活性を解析した。
【0174】
図１４は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図１４中、「Ｒｌｕｃ」はウミシイタケルシフェラーゼの活性を表し、「Ｆｌｕｃ」はＦｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を表し、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」はＣａｓ９を遺伝子導入した結果を表す。また、Ｃａｓ９を遺伝子導入した結果において、「＃１」は図１３の「＃１」（配列番号１９）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃２」は図１３の「＃２」（配列番号２０）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃１＋＃２」は図１３の「＃１」（配列番号１９）及び「＃２」（配列番号２０）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「ｓｇＲＮＡ－」は、ｓｇＲＮＡの発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表す。
【0175】
また、図１４中、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３」はタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの結果を表す。また、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの結果において、「ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ」は図３（ａ）～（ｆ）で示した計６種類のタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム発現ベクターを共導入した結果を表し、「２６３－ｉＰＡ＋７５１－ｉＰＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＳＰ」は図９（ｂ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＵ」は図９（ｃ）で示したベクターを導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＢ」は図９（ｄ）で示したベクターを導入した結果を表し、「ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ＋Ｃａｓ３」は図５で示したベクター及び図３（ｆ）で示したベクターを共導入した結果を表し、「＃１」は図１３の「＃１」（配列番号１７）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃２」は図１３の「＃２」（配列番号１８）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃１＋＃２」は図１３の「＃１」（配列番号１７）及び「＃２」（配列番号１８）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「ｃｒＲＮＡ－」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表す。
【0176】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、使用した発現ベクターの種類によらず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９より高いエクソンスキッピング活性を示すことが明らかとなった。
【0177】
なお、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターにおいて、「２６３－ｉＰＡ＋７５１－ｉＰＡ」、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＳＰ」、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＵ」、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＤＰＢ」は、「ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ」よりもエクソンスキッピング活性が低い傾向が認められたが、遺伝子を欠失させる活性が強すぎてＬｕｃ２ ｃＤＮＡまで欠失している可能性が考えられた。
【0178】
また、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、１つのｃｒＲＮＡを用いるだけで、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と２つのｓｇＲＮＡを用いたときよりも高いエクソンスキッピング活性を示すことが明らかとなった。
【0179】
《ｉＰＳ細胞を用いた検討》
続いて、ｉＰＳ細胞を用いた検討を行った。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に終止コドンが生じる変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
続いて、ｉＰＳ細胞を用いた検討を行った。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に終止コドンが生じる変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
【0180】
遺伝子導入の前日に１００，０００個／ウェルとなるように４８ウェルプレートに患者由来ｉＰＳ細胞を播種した。続いて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた検討では、上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターを２００ｎｇ、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇをｉＰＳ細胞に導入した。
【0181】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターとして、複数の発現ベクターを同時に遺伝子導入する場合、導入するベクターの数に応じて、合計質量が２００ｎｇになるよう各ベクターの量を均等に割り振った。また、２種類のｃｒＲＮＡを共導入する場合には、それぞれ５０ｎｇずつ使用した。
【0182】
Ｃａｓ９を用いた検討では、上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、Ｃａｓ９発現ベクター２００ｎｇ、ｓｇＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇをｉＰＳ細胞に導入した。また、２種類のｓｇＲＮＡを共導入する場合には、それぞれ５０ｎｇずつ使用した。
【0183】
遺伝子導入には、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。
【0184】
続いて、遺伝子導入の２日後に、市販のキット（「Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ」Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２９２０、プロメガ社）を用いてルシフェラーゼレポーター活性を解析した。
【0185】
図１５は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図１５中、「Ｒｌｕｃ」はウミシイタケルシフェラーゼの活性を表し、「Ｆｌｕｃ」はＦｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を表し、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」はＣａｓ９を遺伝子導入した結果を表す。また、Ｃａｓ９を遺伝子導入した結果において、「＃１」は図１３の「＃１」（配列番号１９）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃２」は図１３の「＃２」（配列番号２０）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃１＋＃２」は図１３の「＃１」（配列番号１９）及び「＃２」（配列番号２０）を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「ｓｇＲＮＡ－」は、ｓｇＲＮＡの発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表す。
【0186】
また、図１５中、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３」はタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの結果を表す。また、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの結果において、「２６３－ｉＰＡ＋７５１－ｉＰＡ」は図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「Ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ－ＳＰ」は図９（ｂ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを共導入した結果を表し、「ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ＋Ｃａｓ３」は図５で示したベクター及び図３（ｆ）で示したベクターを共導入した結果を表し、「＃１」は図１３の「＃１」（配列番号１７）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃２」は図１３の「＃２」（配列番号１８）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「＃１＋＃２」は図１３の「＃１」（配列番号１７）及び「＃２」（配列番号１８）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果を表し、「ｃｒＲＮＡ－」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表す。
【0187】
その結果、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた場合でも、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの方が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９より高いエクソンスキッピング活性を示すことが明らかとなった。
【0188】
［実験例７］
（ｉＰＳ細胞におけるＤＭＤエクソンスキッピングの誘導）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ｉＰＳ細胞のＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のエクソンスキッピングを試みた。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に終止コドンが生じる変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
（ｉＰＳ細胞におけるＤＭＤエクソンスキッピングの誘導）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ｉＰＳ細胞のＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のエクソンスキッピングを試みた。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に終止コドンが生じる変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
【0189】
遺伝子導入の前日に３００，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートに患者由来ｉＰＳ細胞を播種した。続いて、図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてｍＣｈｅｒｒｙ又はＥＧＦＰを持つタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターをそれぞれ３００ｎｇ、図１３の「＃１」（配列番号１７）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクター４００ｎｇをｉＰＳ細胞に導入した。
【0190】
また、図９（ａ）で示したベクターのうち、選択遺伝子としてｍＣｈｅｒｒｙ又はＥＧＦＰを持つタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターをそれぞれ３００ｎｇ、図１３の「＃２」（配列番号１８）を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクター４００ｎｇをｉＰＳ細胞に導入した検討も行った。
【0191】
遺伝子導入には、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた。
【0192】
遺伝子導入した細胞を２日間培養した後、フローサイトメトリーを用いてｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が陽性の細胞、又は、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰが共陽性の細胞をソーティングして回収し、増殖培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0193】
続いて、配列番号１７の塩基配列を標的とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入した細胞については、センス鎖プライマー（配列番号２１）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号２２）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0194】
また、配列番号１８の塩基配列を標的とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入した細胞については、センス鎖プライマー（配列番号２３）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号２４）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0195】
図１６（ａ）は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図１６（ａ）中、「ｌａｄｄｅｒ」は分子量参照用のＤＮＡマーカー（アジレントバイオロジー社）を表し、「＃１ Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、未編集のｉＰＳ細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２１と２２のプライマーを用いて行なったＰＣＲの結果を表し、「＃１ Ｅｄｉｉｔｅｄ」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと、配列番号１７を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したバルクｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号２１と２２のプライマーを用いて行なったＰＣＲの結果を表す。
【0196】
また、「＃２ Ｎｏｎ－ｅｄｉｉｔｅｄ」は、未編集のｉＰＳ細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号２３と２４のプライマーを用いて行なったＰＣＲの結果を表し、「＃２ Ｅｄｉｉｔｅｄ」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと、配列番号１８を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したバルクｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号２３と２４のプライマーを用いて行なったＰＣＲの結果を表す。
【0197】
また、図１６（ｂ）は、図１６（ａ）において矢印で示したバンドをサンガーシーケンスによって更に詳細に解析した結果を示す模式図である。図１６（ｂ）中、「＃１」及び「＃２」はｃｒＲＮＡの標的配列の位置を示す。また、破線はゲノムＤＮＡ欠失領域の大まかな位置を表す。
【0198】
その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることで、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞において、疾患の原因となる変異が存在する内在性のＤＭＤ遺伝子のエクソン４５を欠失できたことが確認された。
【0199】
［実験例８］
（ｉＰＳ細胞におけるタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤ遺伝子修復の確認）
実験例７で取得したゲノム編集済みバルクｉＰＳ細胞を９６ウェルプレートに１細胞／ウェルになるように播種し、クローンｉＰＳ細胞株を取得した。続いて、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いて、取得したクローンｉＰＳ細胞株からゲノムＤＮＡを精製し、得られたゲノムＤＮＡを用いてジェノタイピングを行った。
（ｉＰＳ細胞におけるタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤ遺伝子修復の確認）
実験例７で取得したゲノム編集済みバルクｉＰＳ細胞を９６ウェルプレートに１細胞／ウェルになるように播種し、クローンｉＰＳ細胞株を取得した。続いて、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いて、取得したクローンｉＰＳ細胞株からゲノムＤＮＡを精製し、得られたゲノムＤＮＡを用いてジェノタイピングを行った。
【0200】
図１７（ａ）及び（ｂ）は、ジェノタイピングの結果の一例を表した写真及び模式図である。図１７（ａ）は、ＤＭＤエクソンスキッピングに成功したクローンｉＰＳ細胞株におけるＤＭＤ遺伝子座の欠損部位の構造を表す模式図である。
【0201】
図１７（ａ）中、「ＤＭＤ」は、ＤＭＤ遺伝子座のエクソン４５周辺の大まかな構造を表し、「ｅｘ４５」は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号とその領域を表し、「ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ」は増幅に用いたプライマーのＤＭＤ遺伝子座における大まかな位置を表し、「ｃｒＲＮＡ」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡのイントロン４５中の標的配列（配列番号１８）のＤＭＤ遺伝子座における大まかな位置を表し、「Ｃｌｏｎｅ＃３」は、取得したクローンｉＰＳ細胞のクローン番号であり、サンガーシーケンスの結果から明らかとなった欠損領域を表す。
【0202】
また、図１７（ｂ）は、本実験で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を示す写真である。図１７（ｂ）中、「１ｋｂ ｌａｄｄｅｒ」は、分子量参照用の１ｋｂ ＤＮＡマーカー（ワトソン社）を表し、「Ｎｏｎ－ｅｄｉｔｅｄ」は、未編集のｉＰＳ細胞由来のゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号１００及び配列番号１０１のプライマーを用いて行なったＰＣＲの結果を表し（増幅サイズ６．６ｋｂ）、「Ｃｌｏｎｅ＃３」は、ＤＭＤエクソンスキッピングに成功したクローンｉＰＳ細胞株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行なったＰＣＲの結果を表す（増幅サイズ１．３ｋｂ）。
【0203】
下記表１は、図１７（ａ）及び（ｂ）に示したものと同様のジェノタイピング実験を各クローンｉＰＳ細胞株について行い、その結果、ＤＭＤエクソンスキッピングに成功していたクローンｉＰＳ細胞株についてその割合をまとめた表である。
【0204】
【表1】
【0205】
表１中、ｃｒＲＮＡ＃１は、配列番号１７を標的配列とするｃｒＲＮＡを用いてゲノム編集を行うことで得られたクローンｉＰＳ細胞株についての結果を表し、ｃｒＲＮＡ＃２は、配列番号１８を標的配列とするｃｒＲＮＡを用いてゲノム編集を行うことで得られたクローンｉＰＳ細胞株についての結果を表す。
【0206】
また、ＤＭＤエクソンスキッピングが成功したクローンｉＰＳ細胞株のうち、配列番号１７又は１８を標的配列とするｃｒＲＮＡを用いてゲノム編集を行った株をそれぞれ１つずつ選び、文献（Tanaka A., et al., Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Myoshi Myopathy in vitro, PLoS One., 8 (4), e61540, 2013）に記載された手法を用いて骨格筋細胞へと分化誘導した。続いてジストロフィンｍＲＮＡのエクソンスキッピング誘導の確認及びジストロフィンタンパク質の発現回復を確認した。
【0207】
【0208】
続いて、骨格筋細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞株から市販のキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、キアゲン社）を用いてトータルＲＮＡを精製した。続いて、市販のキット（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ、東洋紡社）を用いて、精製したトータルＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。続いて、合成したｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１０２及び配列番号１０３のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、ジストロフィン遺伝子のｃＤＮＡを増幅した。続いて、ＰＣＲ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレントバイオロジー社）により解析した。
【0209】
図１９は、ＰＣＲ産物の解析結果を示した画像及び増幅産物の構造を示す模式図である。図１９中、「ｌａｄｄｅｒ」は分子量参照用のＤ１０００ ＤＮＡマーカー（アジレントバイオロジー社）を表し、「ΔＥｘ４４」は、未編集の疾患患者由来ｉＰＳ細胞から取得したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った結果を表す。
【0210】
また、「Ｃａｓ３ ＤＭＤ＃１－２２」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと配列番号１７を標的配列とするｃｒＲＮＡを導入し、エクソンスキッピングを誘導したクローンｉＰＳ細胞株（＃１－２２）から取得したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った結果を表す。
【0211】
また、「Ｃａｓ３ ＤＭＤ＃２－３」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと配列番号１８を標的配列とするｃｒＲＮＡを導入し、エクソンスキッピングを誘導したクローンｉＰＳ細胞株（＃２－３）から取得したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った結果を表す。
【0212】
また、「Ｅｘ４４ ＫＩ」は、実験例７におけるものと同様の疾患患者由来ｉＰＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いてＤＭＤエクソン４４をノックインしたｉＰＳ細胞株（Li H. L., et al., Precise correction of the Dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9, Stem Cell Reports, 4 (1), 143-154, 2015 において取得された細胞である。）を、上述したものと同様の手法で骨格筋細胞へと分化誘導し、取得したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った結果を表す。
【0213】
続いて、骨格筋細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞株を、市販の細胞溶解液（ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で溶解して得られた細胞溶解液を、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＴＭ）アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ社）を用いて解析し、ジストロフィンタンパク質の発現を確認した。
【0214】
具体的には、１次抗体としてウサギ抗ジストロフィン抗体（＃ａｂ１５２７７、アブカム社）を用い、２次抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体（＃０４２－２０６、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ社）を用いた。
【0215】
また、タンパク質ロード量のコントロールとしてミオシン重鎖の発現量を同時に解析した。具体的には、１次抗体としてマウス抗ミオシン重鎖抗体（＃ＭＡＢ４４７０、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウス抗体（＃０４２－２０５、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ社）を用いた。
【0216】
図２０は、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＴＭ）アッセイによるタンパク質電気泳動の実験結果を示す画像である。図２０中、「ΔＥｘ４４」は、未編集の疾患患者由来ｉＰＳ細胞から取得した細胞溶解液を解析した結果を表す。また、「Ｃａｓ３ ＤＭＤ＃１－２２」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと配列番号１７を標的配列とするｃｒＲＮＡを導入し、エクソンスキッピングを誘導したクローンｉＰＳ細胞株から取得した細胞溶解液を解析した結果を表す。また、「Ｃａｓ３ ＤＭＤ＃２－３」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクターと配列番号１８を標的配列とするｃｒＲＮＡを導入し、エクソンスキッピングを誘導したクローンｉＰＳ細胞株から取得した細胞溶解液を解析した結果を表す。
【0217】
また、「Ｅｘ４４ ＫＩ」は、実験例７におけるものと同様の疾患患者由来ｉＰＳ細胞に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いてＤＭＤエクソン４４をノックインしたｉＰＳ細胞株（Li H. L., et al., Precise correction of the Dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9, Stem Cell Reports, 4 (1), 143-154, 2015 において取得された細胞である。）を、上述したものと同様の手法で骨格筋細胞へと分化誘導した細胞より取得した細胞溶解液を解析した結果を表す。
【0218】
また、「ＤＭＤ」は、ジストロフィンタンパク質の発現を解析した結果を表し、「ＭＨＣ」は、ミオシン重鎖タンパク質の発現を解析した結果を表す。
【0219】
その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞において、疾患の原因となる変異が存在する内在性のＤＭＤ遺伝子の４５番エクソンを欠損させることで、分化誘導した骨格筋細胞においてジストロフィンタンパク質の発現を回復できることが明らかとなった。
【0220】
［実験例９］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム及びタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの遺伝子破壊効率比較実験）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム又はタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子破壊を行ない、各システムによる遺伝子破壊効率を比較した。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム及びタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの遺伝子破壊効率比較実験）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム又はタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子破壊を行ない、各システムによる遺伝子破壊効率を比較した。
【0221】
図２１（ａ）は、Ｂ２Ｍ遺伝子座の大まかな構造を示す模式図である。図２１（ａ）中、「ｅｘ１」、「ｅｘ２」、「ｅｘ３」及び「ｅｘ４」は、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン番号とその領域を表し、「＃１」～「＃１０」、「＃２’」、「＃６’」、「＃９’」は、それぞれタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム用の標的配列又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム用の標的配列のＢ２Ｍ遺伝子上の位置を示す。「Ｃａｓ３－ｃｒＲＮＡ」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム用の標的配列であることを示し、「Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム用の標的配列であることを示す。
【0222】
また、「＃３」、「＃４」、「＃７」は、標的配列がＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域（エクソン）内に存在するものであり、それ以外は標的配列がＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域外に存在するものであった。また、「Ｃａｓ３－ｃｒＲＮＡ」を実線矢印で示し、「Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ」を破線矢印で示す。
【0223】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム用の標的配列として、＃１（配列番号３５）、＃２（配列番号３）、＃２’（配列番号３６）、＃３（配列番号１）、＃４（配列番号４）、＃５（配列番号５）、＃６（配列番号３７）、＃６’（配列番号３８）、＃７（配列番号２）、＃８（配列番号８）、＃９（配列番号３９）、＃９’（配列番号４０）、＃１０（配列番号４１）の１３種類の標的配列を使用した。
【0224】
また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム用の標的配列として、＃１（配列番号４２）、＃２（配列番号４３）、＃３（配列番号４４）、＃４（配列番号４５）、＃５（配列番号４６）、＃６（配列番号４７）、＃７（配列番号４８）、＃８（配列番号４９）、＃９（配列番号５０）、＃１０（配列番号５１）の１０種類の標的配列を使用した。
【0225】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムについては、設計したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を図２に示す構造を有するベクターに組み込み、以降の実験に使用した。
【0226】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したｃｒＲＮＡ発現ベクター又はｓｇＲＮＡ発現ベクターを１０００ｎｇ（２種類のｓｇＲＮＡを使用する場合は、それぞれ５００ｎｇずつ）、図９（ｄ）で示したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム発現ベクター又はＣａｓ９発現ベクター１０００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0227】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン（ＩＦＮ）－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の細胞表面への発現を誘導した。
【0228】
続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、細胞表面のＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0229】
図２１（ｂ）は、算出したＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を示すグラフである。図２１（ｂ）中、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３」は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた結果を示し、「＃１」～「＃１０」、「＃２’」、「＃６’」、「＃９’」は、それぞれ上述したｃｒＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示し、「ｃｒＲＮＡ－」は、いずれのｃｒＲＮＡも導入しなかった際の結果であることを示す。
【0230】
また、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いた結果を示し、「＃１」～「＃１０」は、それぞれ上述したｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示し、「＃１＋＃５」は、「＃１」を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクター及び「＃５」を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示し、「＃１＋＃６」は、「＃１」を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクター及び「＃６」を標的配列とするｓｇＲＮＡの発現ベクターを共導入した結果であることを示し、以下同様である。また、「ｓｇＲＮＡ－」は、いずれのｓｇＲＮＡも導入しなかった際の結果であることを示す。
【0231】
その結果、標的配列をＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域内に設計した場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの方が、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムより高い遺伝子破壊効率を示したが、標的配列をＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域（エクソン）外であるイントロン領域や制御領域、遺伝子近傍（上流または下流）領域に設計した場合、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの方が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムより高い遺伝子破壊効率を示すことが明らかとなった。また、標的配列がＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域外にある１種類のｃｒＲＮＡを用いて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊を行った場合と、標的配列がＢ２Ｍ遺伝子のコーディング領域外にある２種類のｓｇＲＮＡを同時に用いて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊を行った場合を比べると、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと同等か、それ以上のＢ２Ｍ遺伝子破壊効率を示すことが明らかとなった。
【0232】
以上のことから、編集したい領域（標的領域）が、ガイドＲＮＡの結合部位より遠方にある場合、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムより高いゲノム編集効率が得られることが示唆された。
【0233】
［実験例１０］
（マルチプレックスｃｒＲＮＡ発現ベクターを用いたタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるｉＰＳ細胞におけるＨＬＡ遺伝子の破壊実験）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡ発現ベクターにおいて、リピート配列を挟んで標的配列を複数連結することにより、１種のＲＮＡ分子を用いるだけで、複数の標的配列に対してゲノム編集ができるか否かを検討した。
（マルチプレックスｃｒＲＮＡ発現ベクターを用いたタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるｉＰＳ細胞におけるＨＬＡ遺伝子の破壊実験）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡ発現ベクターにおいて、リピート配列を挟んで標的配列を複数連結することにより、１種のＲＮＡ分子を用いるだけで、複数の標的配列に対してゲノム編集ができるか否かを検討した。
【0234】
図２２は、本実験例において作製したｃｒＲＮＡ発現ベクターの構造を示す模式図である。図２２中、「Ｕ６」は、Ｕ６プロモーターを表し、「Ｌｅａｄｅｒ」はタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡの大腸菌由来リーダー配列を表し、「Ｒｅｐｅａｔ」はｃｒＲＮＡのリピート配列を表し、「Ｔａｒｇｅｔ１」及び「Ｔａｒｇｅｔ２」は、それぞれｃｒＲＮＡの標的配列を表す。また、最も下流側のｃｒＲＮＡのリピート配列の３’末端には、Ｕ６プロモーターのターミーネーションシグナルとして「ＴＴＴＴＴＴ」（Ｔはチミジンを意味する。）を付与した。
【0235】
本実験例では、「Ｔａｒｇｅｔ１」にＨＬＡ－Ａ２４を標的とする塩基配列（配列番号５２）を、「Ｔａｒｇｅｔ２」にＨＬＡ－Ｂ７を標的とする塩基配列（配列番号５３）を組み込んで使用した。
【0236】
遺伝子導入の前日に３００，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したｃｒＲＮＡ発現ベクターを５００ｎｇ、又は、ＨＬＡ－Ａ２４を標的とする塩基配列（配列番号５２）若しくはＨＬＡ－Ｂ７を標的とする塩基配列（配列番号５３）若しくはＢ２Ｍ遺伝子を標的とした塩基配列（配列番号１）を図２に示す構造を有するベクターに組み込んだものを５００ｎｇ、図９（ｄ）で示したタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター５００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｉＰＳ細胞に導入した。
【0237】
遺伝子導入したｉＰＳ細胞は、２４時間後に終濃度０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加え、１日間インキュベートし、遺伝子導入された細胞の選択を行なった。続いて、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。
【0238】
続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２４抗体及び抗ヒトＨＬＡ－Ｂ７、Ｂ２７抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。
【0239】
具体的には、ｉＰＳ細胞を、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）６４７蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２４抗体（＃Ｋ０２０８－Ａ６４、ＭＢＬライフサイエンス社）及びＦＩＴＣ蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ｂ７、Ｂ２７抗体（＃１３０－１０６－０４９、ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２４及びＨＬＡ－Ｂ７陰性細胞の割合を算出した。
【0240】
図２３は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図２３中、横軸はＨＬＡ－Ｂ７の発現量を示し、縦軸はＨＬＡ－Ａ２４の発現量を示す。また、「未編集ｉＰＳ細胞」は未編集のｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「未染色」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２４抗体及び抗ヒトＨＬＡ－Ｂ７、Ｂ２７抗体で染色していないｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「ＨＬＡ－Ａのみ」は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２４抗体のみで染色したｉＰＳ細胞の解析結果を表し、「ＨＬＡ－Ｂのみ」は、抗ヒトＨＬＡ－Ｂ７、Ｂ２７抗体のみで染色したｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0241】
また、「ｃｒＲＮＡ－」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかったｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0242】
また、「ｃｒＲＮＡ（ＨＬＡ－Ａ）」は、ＨＬＡ－Ａ２４を標的とするｃｒＲＮＡの発現ベクターのみを用いてタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりゲノム編集を行ったｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0243】
また、「ｃｒＲＮＡ（ＨＬＡ－Ｂ）」は、ＨＬＡ－Ｂ７を標的とするｃｒＲＮＡの発現ベクターのみを用いてタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりゲノム編集を行ったｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0244】
また、「ｃｒＲＮＡ（ＨＬＡ－Ａ＋ＨＬＡ－Ｂ）」は、ＨＬＡ－Ａ２４を標的とするｃｒＲＮＡとＨＬＡ－Ｂ７を標的とするｃｒＲＮＡの双方がタンデムに並んだ構造を有するｃｒＲＮＡ発現ベクターを用いてタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりゲノム編集を行ったｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0245】
また、「ｃｒＲＮＡ（Ｂ２Ｍ）」は、Ｂ２Ｍを標的とするｃｒＲＮＡの発現ベクターを用いてタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりゲノム編集を行ったｉＰＳ細胞の解析結果を表す。
【0246】
その結果、図２２に示す、標的配列がタンデムに並んだ構造を有するｃｒＲＮＡの発現ベクターを用いて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによりゲノム編集を行った場合、１種のＲＮＡ分子を用いるだけで、複数の標的配列に対してゲノム編集を行うことができることが明らかとなった。
【0247】
［実験例１１］
（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉＰＳ細胞におけるゲノム編集効率の比較１）
《ＨＥＫ２９３Ｔ細胞》
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。
（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉＰＳ細胞におけるゲノム編集効率の比較１）
《ＨＥＫ２９３Ｔ細胞》
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。
【0248】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、実験例１で作製した、それぞれ図３（ａ）～（ｆ）に構造を示す６種類の発現ベクターを使用した。また、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0249】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ２５０ｎｇずつ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター２５０ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0250】
続いて、遺伝子導入した細胞を数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0251】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号５５）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号５６）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0252】
図２４は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図２４中、「Ｎｏ ｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかった対照の結果を表し、「ＥＭＸ１ ｃｒＲＮＡ」は、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を表す。
【0253】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクター及びｃｒＲＮＡの発現ベクターの７種類の発現ベクターを遺伝子導入することにより、ゲノム編集が誘導され、短いＰＣＲ産物が得られたことが明らかとなった。
【0254】
続いて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＤＭＤ遺伝子座のゲノム編集を行った。
【0255】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、実験例１で作製した、それぞれ図３（ａ）～（ｆ）に構造を示す６種類の発現ベクターを使用した。また、ｃｒＲＮＡ発現ベクターとして、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１７）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクター、又は、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１８）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0256】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ２５０ｎｇずつ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター２５０ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0257】
続いて、遺伝子導入した細胞を数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0258】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号１０４）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号１０５）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0259】
図２５は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図２５中、「Ｎｏ ｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかった対照の結果を表す。また、「ＤＭＤ１ ｃｒＲＮＡ」は、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０６）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を表す。また、「ＤＭＤ２ ｃｒＲＮＡ」は、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０７）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を表す。
【0260】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクター及びｃｒＲＮＡの発現ベクターの７種類の発現ベクターを遺伝子導入することにより、ゲノム編集が誘導され、短いＰＣＲ産物が得られたことが明らかとなった。この結果は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はゲノム編集効率が高いことを更に支持するものである。
【0261】
《ｉＰＳ細胞》
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ｉＰＳ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４６及び４７が欠失した変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ｉＰＳ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４６及び４７が欠失した変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
【0262】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、実験例１で作製した、それぞれ図３（ａ）～（ｆ）に構造を示す６種類の発現ベクターを使用した。また、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0263】
遺伝子導入の当日に１，０００，０００個／サンプルのｉＰＳ細胞を用意した。続いて、１サンプルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ１μｇずつ、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１μｇ、及びＥＧＦＰ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を発現するベクター２μｇを、遺伝子導入装置（ＮＥＰＡ２１、ネッパジーン社）を用いてエレクトロポレーションによりｉＰＳ細胞に導入した。
【0264】
続いて、遺伝子導入した細胞の培地に１μｇ／ｍＬピューロマイシンを添加して数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0265】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号５５）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号５６）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0266】
図２６は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図２６中、「Ｎｏ ｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかった対照の結果を表し、「ＥＭＸ１ ｃｒＲＮＡ」は、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞の結果を表す。
【0267】
その結果、ｉＰＳ細胞では、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクター及びｃｒＲＮＡの発現ベクターの７種類の発現ベクターを遺伝子導入しても、短いＰＣＲ産物が検出されず、ゲノム編集の誘導は検出できなかった。
【0268】
続いて、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ｉＰＳ細胞のＤＭＤ遺伝子座のゲノム編集を行った。ｉＰＳ細胞としては、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４６及び４７が欠失した変異を持つ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞を用いた。
【0269】
Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、実験例１で作製した、それぞれ図３（ａ）～（ｆ）に構造を示す６種類の発現ベクターを使用した。また、ｃｒＲＮＡ発現ベクターとして、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０６）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクター、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０７）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクター、又は、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0270】
遺伝子導入の当日に２００，０００個／サンプルとなるようにｉＰＳ細胞を用意し、１サンプルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ７１．４ｎｇずつ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター７１．４ｎｇを、遺伝子導入装置（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ロンザ社）を用いてエレクトロポレーションによりｉＰＳ細胞に導入した。
【0271】
続いて、遺伝子導入した細胞を数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0272】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号１０４）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号１０５）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0273】
図２７は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図２７中、「Ｎｏ ｃｒＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかった対照の結果を表す。また、「Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ（ＥＭＸ１）ｃｒＲＮＡ」は、標的外配列として、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞の結果を表す。また、「ＤＭＤ１ ｃｒＲＮＡ」は、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０６）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞の結果を表す。また、「ＤＭＤ２ ｃｒＲＮＡ」は、ＤＭＤ遺伝子座中の標的配列（配列番号１０７）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞の結果を表す。
【0274】
その結果、ｉＰＳ細胞では、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクター及びｃｒＲＮＡの発現ベクターの７種類の発現ベクターを遺伝子導入しても、短いＰＣＲ産物が検出されず、ゲノム編集の誘導は検出できなかった。
【0275】
［実験例１２］
（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉＰＳ細胞におけるゲノム編集効率の比較２）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。
（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉＰＳ細胞におけるゲノム編集効率の比較２）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のＥＭＸ１遺伝子座のゲノム編集を行った。
【0276】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入する場合、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、実験例１で作製した、それぞれ図３（ａ）～（ｆ）に構造を示す６種類の発現ベクターを使用した。また、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0277】
また、ｉＰＳ細胞に遺伝子導入する場合、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７遺伝子の発現ベクターとして、実験例２で作製した、図５に構造を示す発現ベクター（ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ）を使用した。この発現ベクターでは、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の各構成タンパク質が、Ｐ２Ａ配列で連結されていることにより、単一のｍＲＮＡから個別のタンパク質として発現される。また、Ｃａｓ３遺伝子の発現ベクターとしては、図３（ｆ）に構造を示す発現ベクターを使用した。また、ＥＭＸ１遺伝子座中の標的配列（配列番号５４）に対するｃｒＲＮＡの発現ベクターを使用した。
【0278】
遺伝子導入の前日に１２５，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、上述したタイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターをそれぞれ２００ｎｇずつ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター２００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0279】
続いて、遺伝子導入した細胞を数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0280】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号５５）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号５６）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0281】
ｉＰＳ細胞については、遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、ｐＴＬ－Ｃａｓｃａｄｅ ７００ｎｇ、Ｃａｓ３タンパク質の発現ベクター１５０ｎｇ、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１５０ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｉＰＳ細胞に導入した。
【0282】
続いて、遺伝子導入細胞の濃縮を目的として、遺伝子導入の２４時間後に終濃度１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加え、１日間遺伝子導入された細胞の選択を行なった。続いて、遺伝子導入した細胞を数日間培養した。続いて、この細胞集団より、市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0283】
続いて、センス鎖プライマー（配列番号５５）及びアンチセンス鎖プライマー（配列番号５６）を用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）によりＰＣＲを行なった。
【0284】
図２８は、上述したＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）により解析した結果を表す画像である。図２８中、「Ｌａｄｄｅｒ」は分子量参照用のＤ５０００ ＤＮＡマーカー（アジレントバイオロジー社）を表し、「２９３Ｔ」はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を表し、「ｉＰＳＣ」はｉＰＳ細胞の結果を表し、「－」はｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入しなかった対照の結果を表し、「＋」はｃｒＲＮＡの発現ベクターを導入した結果を表す。
【0285】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、Ｃａｓｃａｄｅ因子、Ｃａｓ３タンパク質の発現ベクター、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクターを導入することによりゲノム編集が誘導され、短いＰＣＲ産物が得られたことが明らかとなった。ゲノム編集効率は２６％と算出された。
【0286】
一方、ｉＰＳ細胞では、Ｃａｓｃａｄｅ因子、Ｃａｓ３タンパク質の発現ベクター、及び、ｃｒＲＮＡ発現ベクターを導入し、ピューロマイシンで短期間（１日間）、遺伝子導入された細胞を選択することにより、ゲノム編集の誘導を検出することが可能となり、短いＰＣＲ産物が得られたことが明らかとなった。ゲノム編集効率は３．６％と算出された。
【0287】
［実験例１３］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊５）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。本実験例では、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクター及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターではなく、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質のｍＲＮＡ及びＣａｓ３タンパク質のｍＲＮＡを用いた。また、ｃｒＲＮＡも発現ベクターではなく、ＲＮＡ分子として用いた。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムによるＢ２Ｍ遺伝子の破壊５）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞のゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。本実験例では、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質の発現ベクター及びＣａｓ３タンパク質の発現ベクターではなく、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質のｍＲＮＡ及びＣａｓ３タンパク質のｍＲＮＡを用いた。また、ｃｒＲＮＡも発現ベクターではなく、ＲＮＡ分子として用いた。
【0288】
本実験例では、実験例３と異なり、単一のｍＲＮＡからＣａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡ、及び、単一のｍＲＮＡからＣｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡを使用した。これらのｍＲＮＡは、市販のキット（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して試験管内で合成した。
【0289】
ｍＲＮＡ合成の際は、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰに加えて、５’キャップアナログであるＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ＴｒｉＬｉｎｋ社）とＧＴＰを４：１の割合になるよう混合したものを使用した。また、試験管内で転写を行うＴ７プロモーター配列及び５’ＵＴＲの配列とコザック配列として配列番号３３の配列を、３’ＵＴＲ及びポリＡシグナルの配列として配列番号３４の配列を用いた。ここで、３’ＵＴＲの配列は、αグロビン（Ｈｂａ－ａ１）遺伝子のＵＴＲ配列に基づいている。
【0290】
図２９（ａ）は、単一のｍＲＮＡからＣａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡのコンストラクトを示す模式図である。図２９（ｂ）は、単一のｍＲＮＡからＣｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡのコンストラクトを示す模式図である。図２９（ａ）及び（ｂ）中、ｍＲＮＡの５’末端（５’ＵＴＲよりも上流）にはＣａｐ構造又はＣａｐ類似構造が存在している。Ｃａｐ構造又はＣａｐ類似構造を有することにより、各タンパク質の発現量が高まる傾向にある。また、タンパク質の間は２Ａ配列で連結されている。ここでの２Ａ配列はＰ２Ａ配列およびＴ２Ａ配列を使用した。
【0291】
また、配列番号１３に示す塩基配列からなるｃｒＲＮＡを市販のキット（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して試験管内で合成した。合成したｃｒＲＮＡは、大腸菌ｃｒＲＮＡのリーダー配列、リピート配列、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する標的配列及びリピート配列をこの順に有していた。
【0292】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞については、遺伝子導入の前日に３００，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、単一のｍＲＮＡからＣａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡ、単一のｍＲＮＡからＣｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡ、及び、ｃｒＲＮＡを、それぞれ５００ｎｇずつ、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0293】
また、ｉＰＳ細胞については、遺伝子導入の前日に２５０，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにｉＰＳ細胞を播種した。続いて、１ウェルあたり、単一のｍＲＮＡからＣａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡ、単一のｍＲＮＡからＣｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３をそれぞれ個別のタンパク質として発現するｍＲＮＡ、及び、ｃｒＲＮＡを、それぞれ５００ｎｇずつ、遺伝子導入装置（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ロンザ社）を用いてエレクトロポレーションによりｉＰＳ細胞に導入した。
【0294】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0295】
図３０（ａ）～（ｆ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図３０（ａ）～（ｃ）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果であり、図３０（ｄ）～（ｆ）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果である。また、図３０（ａ）～（ｆ）中、横軸はＨＬＡ－Ａ２の発現量を示し、縦軸は前方散乱光の強度を示す。また、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ」は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体で染色していない細胞の解析結果を表し、「Ｎｏ ｃｒＲＮＡ」はｃｒＲＮＡを導入しなかった対照の結果を表し、「Ｂ２Ｍ ｃｒＲＮＡ」は配列番号１３に示す塩基配列からなるｃｒＲＮＡを導入した結果を表す。
【0296】
その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、実験例３よりも高効率にＢ２Ｍ遺伝子を破壊できたことが明らかとなった。また、ｉＰＳ細胞においてもＢ２Ｍ遺伝子を破壊できたことが明らかとなった。
【0297】
［実験例１４］
（ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム安定発現細胞株の樹立）
図３１は、ドキシサイクリン誘導性に、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現が誘導されるｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構造を示す模式図である。
（ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム安定発現細胞株の樹立）
図３１は、ドキシサイクリン誘導性に、タイプＩ Ｃａｓｃａｄｅ複合体の構成タンパク質及びＣａｓ３タンパク質の発現が誘導されるｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構造を示す模式図である。
【0298】
図３１に構造を示すベクターを作製してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、安定発現株を取得した。図３１に示すように、このベクターでは、ドキシサイクリン類似化合物の添加によって発現が誘導されるＴｅｔＯプロモーターの下流に、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ３を２Ａペプチドで連結した発現カセットが組み込まれている。また、ドキシサイクリン類似化合物と結合するｒｔＴＡ及びピューロマイシン耐性遺伝子は、恒常的なプロモーター（この場合はＥＦ１αプロモーター）から発現される。
【0299】
３００，０００個／ウェルとなるように１２ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、１日インキュベートした。翌日、図３１に示すベクター８００ｎｇ及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ２００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0300】
続いて、遺伝子導入から２４時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加え、１日間遺伝子導入された細胞の選択を行った。続いて、２週間以上ピューロマイシンを加えた培地で維持培養し、安定発現株を得た。
【0301】
［実験例１５］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのリーダー配列の活性比較）
図３２は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰｒｅ－ｃｒＲＮＡの構造を示す模式図である。図３２に示すように、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡは、リーダー配列、リピート配列、標的配列に相補的に結合するスペーサー配列、そしてリピート配列の順番で構成されるＰｒｅ－ｃｒＲＮＡとして転写される。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのリーダー配列の活性比較）
図３２は、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰｒｅ－ｃｒＲＮＡの構造を示す模式図である。図３２に示すように、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡは、リーダー配列、リピート配列、標的配列に相補的に結合するスペーサー配列、そしてリピート配列の順番で構成されるＰｒｅ－ｃｒＲＮＡとして転写される。
【0302】
発明者らは、大腸菌のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｕ０００９６．２）を調査し、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡリピート領域が２箇所あることを見出した。図３３は、大腸菌のタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡリピート領域の構造を示す模式図である。２か所の領域をそれぞれＬｏｃｕｓ Ａ及びＬｏｃｕｓ Ｂと名付けた。
【0303】
本実験例では、Ｌｏｃｕｓ Ａのリーダー配列を有するｃｒＲＮＡとＬｏｃｕｓ Ｂのリーダー配列を有するｃｒＲＮＡとの活性を比較した。まず、Ｌｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列（配列番号５７）を有し、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のイントロン４４中の標的配列（配列番号１７）に対するｃｒＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクター、及び、Ｌｏｃｕｓ Ｂ由来のリーダー配列（配列番号５８）を有し、ヒトジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のイントロン４４中の標的配列（配列番号１７）に対するｃｒＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターを構築した。図３４は、作製したプラスミドＤＮＡベクターの構造を示す模式図である。
【0304】
続いて、ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン４５番に対してエクソンスキッピングを誘導し、その活性の違いを比較検討した。エクソンスキッピングの効率は、実験例６と同様のエクソンスキッピングモデルルシフェラーゼアッセイにより測定した。本実験例で使用したｃｒＲＮＡは、図１３において「＃１」で表される、ヒトＤＭＤ遺伝子のイントロン４４中の標的配列の相補鎖に結合するスペーサー配列を有する。
【0305】
実験例１４で作製した、ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて検討を行った。上述したレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ－ＴＫベクター２０ｎｇ、ｃｒＲＮＡ発現ベクター１００ｎｇを、ドキシサイクリン誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、９６ウェルプレートに６０，０００個／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。遺伝子導入には、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いた。
【0306】
続いて、終濃度２μｍｏｌ／Ｌとなるようにドキシサイクリンを添加した。また、陰性対照として、ドキシサイクリンを添加しないウェルをそれぞれのサンプルに対して用意した。続いて、遺伝子導入の２日後に、市販のキット（「Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ」Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２９２０、プロメガ社）を用いてルシフェラーゼレポーター活性を解析した。
【0307】
図３５は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図３５中、「Ｒｅｎｉｌｌａ」はウミシイタケルシフェラーゼの活性を表し、「Ｆｉｒｅｆｌｙ」はＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの活性を表し、「ｄｏｘ－」はドキシサイクリンを添加していないサンプルを示し、「ｄｏｘ＋」はドキシサイクリンを添加したサンプルを示す。
【0308】
その結果、大腸菌ゲノム上に存在するリーダー配列は、Ｌｏｃｕｓ Ｂ由来だけでなく、Ｌｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列でも動物細胞でゲノム切断活性を誘導可能であることが明らかとなった。
【0309】
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムでＬｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列を使用することができることは、本発明者らが初めて見出したことである。また、Ｌｏｃｕｓ Ａは大腸菌の本来のＣＲＩＳＰＲ ｌｏｃｕｓであることから、Ｌｏｃｕｓ Ａ由来のリーダー配列は、Ｌｏｃｕｓ Ｂ由来のリーダー配列よりも、活性面で好ましいと考えられた。
【0310】
［実験例１６］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの活性に必要なｃｒＲＮＡリピート配列の検討）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが動物細胞において高いゲノム編集活性を示すには、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列の前にリーダー配列及び第１のリピート配列を有していることが好ましいとされている。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの活性に必要なｃｒＲＮＡリピート配列の検討）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが動物細胞において高いゲノム編集活性を示すには、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列の前にリーダー配列及び第１のリピート配列を有していることが好ましいとされている。
【0311】
ＲＮＡ合成コスト等を下げるため、動物細胞においてゲノム切断活性を維持したまま、どこまでｃｒＲＮＡを短くできるかを検討した。具体的には、リーダー配列及び第１のリピート配列を一部又は全部欠損したｃｒＲＮＡを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞ゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。
【0312】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、図３６（ａ）に構造を示す、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃｓｅ１タンパク質発現ベクター６００ｎｇと、図３６（ｂ）に構造を示す、Ｃａｓ３タンパク質発現ベクター又はｄＮＣａｓ３タンパク質発現ベクター２００ｎｇと、図３６（ｃ）に構造を示す、Ｃａｓ６タンパク質発現ベクター又はｄＮＣａｓ６タンパク質発現ベクター２００ｎｇと、図３６（ｄ）に構造を示す、Ｃｓｅ２タンパク質発現ベクター２００ｎｇと、配列番号５９から６５に塩基配列を示すｃｒＲＮＡを発現するベクターのいずれか１２００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0313】
ここで、ｄＮＣａｓ３は、８２番目のヒスジチンをアラニンに変異することでＤＮａｓｅ活性を欠損した配列番号６６のアミノ酸配列（塩基配列を配列番号６７に示す。）を有するＣａｓ３タンパク質を表し、ｄＮＣａｓ６は、２８番目のヒスジチンをアラニンに変異することでＲＮａｓｅ活性を欠損した配列番号６８（塩基配列を配列番号６９に示す。）のアミノ酸配列を有するＣａｓ６タンパク質を表す。
【0314】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0315】
図３７は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図３７中、縦軸はＢ２Ｍ遺伝子の機能消失によりＨＬＡ－Ａ２発現を欠失した細胞の割合（％）を示す。また、「Ｃａｓ６」はＣａｓ６タンパク質発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表し、「ｄＮＣａｓ６」はｄＮＣａｓ６タンパク質発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。
【0316】
また、「ＮＣ」はｄＮＣａｓ３タンパク質発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＬＲＳＲ」は完全長のリーダー配列および第１のリピート配列を有する、配列番号５９に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＲＳＲ」はリーダー配列を欠損した、配列番号６０に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「Ｒ（ｄ１－５）ＳＲ」はリーダー配列及び第１のリピート配列の５’側第１番目から第５番目までの５塩基を欠損した、配列番号６１に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「Ｒ（ｄ１－１１）ＳＲ」はリーダー配列及び第１のリピート配列の５’側第１番目から第１１番目までの１１塩基を欠損した、配列番号６２に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。
【0317】
また、「Ｒ（ｄ１－１５）ＳＲ」はリーダー配列及び第１のリピート配列の５’側第１番目から第１５番目までの１５塩基を欠損した配列番号６３に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「Ｒ（ｄ１－２１）ＳＲ」はリーダー配列及び第１のリピート配列の５’側第１番目から第２１番目までの２１塩基を欠損した、配列番号６４に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＳＲ」はリーダー配列及び第１のリピート配列を欠損した、配列番号６５に塩基配列を示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。
【0318】
また、図３８は、ｃｒＲＮＡ（配列番号７０）が二次構造を形成している状態を示す模式図である。
【0319】
その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが動物細胞において高いゲノム編集活性を示すには、少なくとも５’側から１６番目以降の第１リピート配列、標的配列の相補鎖に結合するスペーサー配列、第２のリピート配列をこの順に有するｃｒＲＮＡ発現ベクターを用いることが好ましいことが明らかとなった。また、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムが動物細胞においてゲノム編集活性を示すにはＣａｓ６タンパク質のＲＮａｓｅ活性が必須であることが明らかとなった。
【0320】
ｃｒＲＮＡの発現において、スペーサー配列は自然界に存在する配列を好適に使用することができる。また、発明者らは、大腸菌のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｕ０００９６．２）を調査し、図３９（ａ）～（ｅ）に二次構造を模式的に示すリピート配列群を有していることを見出した。図３９（ａ）～（ｅ）に示す塩基配列（それぞれ配列番号７１～７５）は、いずれもｃｒＲＮＡのリピート配列としてゲノム編集に使用できると考えられた。
【0321】
［実験例１７］
（ＰＡＭ配列の検討）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列として、細菌内や試験管内ではＡＴＧ，ＡＡＧ，ＡＧＧ，ＧＡＧの塩基配列が機能することが知られている（例えば、Hayes R. P., et al., Structural basis for promiscuous PAM recognition in type I-E Cascade from E. coli., Nature, 530 (7591), 499-503, 2016.; Hochstrasser M. L., et al., CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference., Proc Natl Acad Sci U S A., 111 (18), 6618-6623, 2014.; Westra E. R., CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3., Mol Cell., 46 (5), 595-605, 2012. 等を参照。）。
（ＰＡＭ配列の検討）
タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムのＰＡＭ配列として、細菌内や試験管内ではＡＴＧ，ＡＡＧ，ＡＧＧ，ＧＡＧの塩基配列が機能することが知られている（例えば、Hayes R. P., et al., Structural basis for promiscuous PAM recognition in type I-E Cascade from E. coli., Nature, 530 (7591), 499-503, 2016.; Hochstrasser M. L., et al., CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference., Proc Natl Acad Sci U S A., 111 (18), 6618-6623, 2014.; Westra E. R., CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3., Mol Cell., 46 (5), 595-605, 2012. 等を参照。）。
【0322】
動物細胞中でゲノム編集誘導のために機能するＰＡＭ配列を同定するため、様々なＰＡＭ配列を有するｃｒＲＮＡを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞ゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子を破壊した。
【0323】
遺伝子導入の前日に１５０，０００個／ウェルとなるように２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。続いて、図９（ｄ）に構造を示すタイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムの発現ベクター１０００ｎｇと、配列番号７６～８９に示す塩基配列を標的配列とするｃｒＲＮＡの発現ベクターのいずれか１０００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0324】
遺伝子導入した細胞は、１週間以上維持培養した後、免疫染色の２日前から終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで刺激し、ＨＬＡタンパク質の発現を誘導した。続いて、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて免疫染色し、ＨＬＡタンパク質の発現を検討した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＢＶ４２１蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（＃７４００８２、ＢＤバイオサイエンス社）と反応させた後、フローサイトメトリー解析により、ＨＬＡ－Ａ２陰性細胞の割合を算出した。
【0325】
図４０は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図４０中、縦軸はＢ２Ｍ遺伝子の機能消失によりＨＬＡ－Ａ２発現を欠失した細胞の割合（％）を示す。また「－」はＢ２Ｍ遺伝子を標的としない空のｃｒＲＮＡ発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＡＧ＃１、＃２」は、ＡＡＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号７６及び７７に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＧＧ＃１、＃２」は、ＡＧＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号７８及び７９に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＴＧ＃１、＃２」は、ＡＴＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８０及び８１に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＧＡＧ＃１、＃２」は、ＧＡＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８２及び８３に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＴＡＧ」は、ＴＡＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８４に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＣＡＧ」は、ＣＡＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８５に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＣＧ」は、ＡＣＧをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８６に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＡＣ」は、ＡＡＣをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８７に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＡＡ」は、ＡＡＡをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８８に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。また、「ＡＡＴ」は、ＡＡＴをＰＡＭ配列とし、標的配列を配列番号８９に示すｃｒＲＮＡの発現ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析結果を表す。
【0326】
その結果、ＰＡＭ配列がＤＤＲ（ここで、Ｄは、Ａ、Ｇ又はＴを表し、Ｒは、Ａ又はＧを表す）の塩基配列を有するｃｒＲＮＡの発現ベクターを用いた場合においてＨＬＡ－Ａ２陰性細胞を観察することができた。中でも、ＰＡＭ配列としてＲＤＧの配列を有する発現ベクターを用いた場合に、より好適に遺伝子を欠失できることが明らかとなった。特に、ＰＡＭ配列が「ＡＡＡ」の塩基配列であってもゲノム編集誘導可能であるシステムは知られていないため、有用である。
【0327】
［実験例１８］
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤマルチエクソンスキッピングの誘導）
実験例１４で作製した、ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて検討を行った。
（タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたＤＭＤマルチエクソンスキッピングの誘導）
実験例１４で作製した、ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて検討を行った。
【0328】
ドキシサイクリン誘導型タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレートに１００，０００個／ウェルとなるように播種した。また、培地中にドキシサイクリンを終濃度が２μｍｏｌ／Ｌとなるように加え、１日インキュベートした。
【0329】
翌日、ＤＭＤ遺伝子のイントロン４４を標的とするｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃１９、ＤＭＤ＃２０又はＤＭＤ＃２１。ＤＭＤ＃１９の標的配列を配列番号９０に示し、ＤＭＤ＃２０の標的配列を配列番号９１に示し、ＤＭＤ＃２１の標的配列を配列番号９２に示す。）の発現ベクター１０００ｎｇ、及び、ＤＭＤ遺伝子のイントロン５５を標的とするｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃２２、ＤＭＤ＃２３又はＤＭＤ＃２４。ＤＭＤ＃２２の標的配列を配列番号９３に示し、ＤＭＤ＃２３の標的配列を配列番号９４に示し、ＤＭＤ＃２４の標的配列を配列番号９５に示す。）の発現ベクター１０００ｎｇを遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。
【0330】
遺伝子導入した細胞は３日間維持培養した後、バルクＨＥＫ２９３Ｔ細胞より市販のキット（ＭｏｎｏＦａｓ 培養細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットＶＩ、ＧＬサイエンス社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。
【0331】
続いて、エクソン４５側プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－ＤＭＤ－Ｉｎｔ４４－ＹＫ＃１１４、配列番号９６）及びエクソン５５側プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－ＤＭＤ－Ｉｎｔ５５－ＹＫ＃１１６、配列番号９７）を用いてＱｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）を用いてＰＣＲを行なった。
【0332】
図４１は、上記で得られたＰＣＲ産物を、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｄ５０００（アジレントバイオロジー社）で電気泳動を行った結果を示す画像である。その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより欠失が生じて野生型より増幅産物の分子量が低下したと考えられたバンドが複数確認された。
【0333】
続いて、エクソン４５側プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－ＤＭＤ－Ｉｎｔ４４－ＹＫ＃１１０、配列番号９８）及びエクソン５５側プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－ＤＭＤ－Ｉｎｔ５５－ＹＫ＃１０７、配列番号９９）を用いてＱｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（東洋紡社）を用いてＰＣＲを行ない、アガロース電気泳動を行った。続いて、「ｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃２１）」及び「ｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃２３）」を遺伝子導入した試料のＰＣＲ産物のうち、およそ２．３ｋｂ以下０．５ｋｂ以上のＤＮＡバンドをアガロースゲルから切り出しＤＮＡ断片を精製し、得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニングし、得られたコロニーを用いてサンガーシーケンスにより塩基配列を解析した。
【0334】
図４２は、アガロースゲル電気泳動を行ったものと同一のＰＣＲ産物を、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレントバイオロジー社）を用いてＤ５０００テープの電気泳動により解析した結果を示す画像である。その結果、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムにより欠失が生じて野生型より増幅産物の分子量が低下したと考えられたバンドが複数確認された。
【0335】
図４３は、解析した塩基配列をソフトウエア（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）、http://software.broadinstitute.org/software/igv/）を用いてヒトＤＭＤの塩基配列にアライメントした結果を示す図である。図４３中、「ｅｘｏｎ４５」と「ｅｘｏｎ５５」は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号とその領域を表し、「Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｔ４４－ＹＫ＃１１０）」及び「Ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｔ５５－ＹＫ＃１０７）」はＰＣＲ増幅に用いたプライマーのＤＭＤ遺伝子座における大まかな位置を表し、「ｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃２１）」及び「ｃｒＲＮＡ（ＤＭＤ＃２３）」は、大規模欠損に用いたｃｒＲＮＡのＤＭＤ遺伝子座における大まかな位置を表し、左側の「＃１－１」～「＃１８」は、ＴＡクローニングにより得られた大腸菌クローン番号を示す。また、サンガーシーケンスの配列結果がＤＭＤ遺伝子座とアライメント（マッピング）された領域を長方形で示し、ＤＮＡ欠失領域を矢印が含まれる直線で示す。
【0336】
その結果、シーケンスした４０コロニーのうち、３０配列について、ヒトＤＭＤの塩基配列へのアライメントが確認された。そのうち２７配列は、塩基配列がエクソン４５の近傍及びエクソン５５の近傍の両方にまたがっていることが明らかとなった。また、１配列は、塩基配列がエクソン４５の近傍のみにアラインされた。また、２配列は、塩基配列がエクソン５５の近傍のみにアラインされた。
【0337】
以上の結果から、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを使い、更に切断方向が内向きとなるｃｒＲＮＡを２種類用いることにより、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５からエクソン５５領域の間、つまり３４０ｋｂ以上の大規模欠損をゲノム上に導入できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0338】
本発明によれば、幹細胞（特に好ましくは多能性幹細胞、更に好ましくは人工多能性幹細胞）を含む細胞に対し、ゲノムＤＮＡの標的領域に１００塩基超のヌクレオチドの欠失を効率よく導入する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【配列表】