特許 7395556 ５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸及びアミノ酸エチルエステルの結晶塩

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-01

(45)【発行日】2023-12-11

(54)【発明の名称】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸及びアミノ酸エチルエステルの結晶塩

(51)【国際特許分類】

   C07D 475/04 20060101AFI20231204BHJP

   C07C 227/42 20060101ALI20231204BHJP

   C07C 229/08 20060101ALI20231204BHJP

   C07C 323/58 20060101ALI20231204BHJP

   C07C 319/28 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 9/02 20060101ALI20231204BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20231204BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231204BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20231204BHJP

【ＦＩ】

C07D475/04

C07C227/42 CSP

C07C229/08

C07C323/58

C07C319/28

A61K31/519

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/14

A61K9/19

A61K9/16

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/02

A61K45/00

A61P7/06

A61P25/00

A61P9/00

A61P25/24

A61P25/28

A61P19/10

A61P3/02 101

A61P43/00 121

A23L33/10

【請求項の数】 40

(21)【出願番号】P 2021500079

(86)(22)【出願日】2019-07-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-11-04

(86)【国際出願番号】 EP2019067705

(87)【国際公開番号】W WO2020007843

(87)【国際公開日】2020-01-09

【審査請求日】2022-06-28

(31)【優先権主張番号】18182284.2

(32)【優先日】2018-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19168723.5

(32)【優先日】2019-04-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ－６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】モーザー、 ルドルフ

(72)【発明者】

【氏名】グレーン、 ヴィオーラ

(72)【発明者】

【氏名】ベーニ シュタム、 ルース

(72)【発明者】

【氏名】ブラッター、 フリッツ

(72)【発明者】

【氏名】シエラギエヴィッチ、 マルティン

【審査官】水島 英一郎

(56)【参考文献】

【文献】特開２０００－３２７６８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特公昭３７－０１０６９８（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】中国特許出願公開第１０７３０４２１２（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０７９２５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許第１０３６６４９４５（ＣＮ，Ｂ）

【文献】中国特許出願公開第１０４３５６１３４（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩であって、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が１：０．３～１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項2】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が、１：０．５～１：２．５（モル／モル）である請求項１に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項3】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が、１：０．７５～１：２．２５（モル／モル）である請求項１または２に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項4】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が、１：１（モル／モル）である請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項5】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が、１：２（モル／モル）である請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶塩および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項6】

前記アミノ酸エチルエステルが、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルであり、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルとのモル比が１：１．７５～１：２．２５（モル／モル）である請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項7】

前記アミノ酸エチルエステルが、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルであり、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルとのモル比が１：２（モル／モル）である請求項１～３、５および６のいずれか１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項8】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、４．０、６．４、１５．０、１５．９、１７．１、１８．４、１８．６、２１．９、２２．６、および２５．５に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項9】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、４．０、６．４、７．３、７．９、１２．５、１３．５、１３．９、１４．３、１５．０、１５．９、１７．１、１７．４、１７．９、１８．２、１８．４、１８．６、２０．１、２１．１、２１．９、２２．６、２４．３および２５．５に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項10】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、図１に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の結晶塩。

【化1】

【請求項11】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１７．８および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項12】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１５．７、１６．２、１７．８、１８．３、１８．６、１９．０、１９．２、１９．５、１９．７、２１．３、２３．２、２３．６、２５．４および２５．９に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１～７および１１のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項13】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩であり、図２に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１～７、１１および１２のいずれか１項に記載の結晶塩。

【化2】

【請求項14】

アミノ酸エチルエステルがＬ－メチオニンエチルエステルであり、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－メチオニンエチルエステルとのモル比が１：０．７５～１：１．２５（モル／モル）である請求項１～３のいずれか１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項15】

アミノ酸エチルエステルがＬ－メチオニンエチルエステルであり、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－メチオニンエチルエステルとのモル比が１：１（モル／モル）である請求項１～４および１４のいずれか１項に記載の結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物。

【請求項16】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、５．５、７．０、８．５、１４．０、１４．７、および１７．７に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～５、１４および１５のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項17】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、３．５、５．５、７．０、８．５、１３．２、１４．０、１４．７、１７．７、１８．４、２１．６、２３．０、２３．９および２７．６に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～５および１４～１６のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項18】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、図４に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）、ことを特徴とする請求項１～５および１４～１７のいずれか１項に記載の結晶塩。

【化3】

【請求項19】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、７．３、１４．０、１４．７、１５．７、および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする、請求項１～５、１４および１５のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項20】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、５．０、７．３、８．５、１０．２、１３．８、１４．０、１４．７、１５．７、１８．３、１８．７、２０．５、２０．９、２２．２、２４．１、および２４．５に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（ＣｕＫα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）、ことを特徴とする請求項１～５、１４、１５および１９のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項21】

前記塩が、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩であり、図５に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）ことを特徴とする、請求項１～５、１４、１５、１９および２０のいずれか１項に記載の結晶塩。

【化4】

【請求項22】

少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の結晶塩。

【請求項23】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の結晶塩を製造する方法であって、以下の工程：
ｉ）５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルの混合物を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で準備する工程、
ｉｉ）塩基を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で、添加する工程、
ｉｉｉ）組成物を少なくとも６０℃に加熱し、任意選択で清澄濾過を行う工程、
ｉｖ）混合物を結晶化させ、１℃～３０℃の間の温度に冷却し、任意選択で更に溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、および
ｖ）得られた固体物質を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法。

【請求項24】

工程ｉ）における５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルのモル比が１：１～１：３の範囲であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

溶媒が水であることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

工程ｉｉｉ）および／またはｉｖ）において種結晶が添加されることを特徴とする請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

アミノ酸エチルエステルがＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルであることを特徴とする請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルが塩酸塩として添加されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む請求項１～２２のいずれか１項に記載の結晶塩、並びに任意選択で１以上の許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項30】

錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能もしくは注入可能な溶液もしくは懸濁液または坐剤の形態である請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

少なくとも１つの追加の治療薬をさらに含む、請求項２９または３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与のための医薬組成物である請求項２９～３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項33】

アミノ酸エチルエステルがＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルであることを特徴とする請求項２９～３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項34】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む請求項１～２２のいずれか１項に記載の結晶塩、並びに任意選択で１以上の許容される賦形剤を含む、食品添加物。

【請求項35】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む請求項１～２２のいずれか１項に記載の結晶塩、並びに任意選択で１以上の許容される賦形剤を含む、調製物。

【請求項36】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩の、薬物の製造のための成分としての使用。

【請求項37】

アミノ酸エチルエステルがＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルであることを特徴とする請求項３６に記載の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩の使用。

【請求項38】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩の、食品添加物としての使用。

【請求項39】

貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症のホモシステイン低下の治療に使用するための、並びに／または低血漿および／または低赤血球および／または低脳脊髄液および／または低末梢もしくは中枢神経系葉酸についての食事管理に使用するための、請求項１～２２のいずれか１項に記載の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩。

【請求項40】

前記アミノ酸エチルエステルが、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルであることを特徴とする請求項３９に記載の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩であって、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が１：０．３～１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物に関する。

【背景技術】

【0002】

テトラヒドロ葉酸塩は、主に５－ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリンおよびロボロイコボリン）のカルシウム塩として、５－メチルテトラヒドロ葉酸（メタフォリン（登録商標））のカルシウム塩として、または５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸（モデュフォリン（登録商標））の硫酸塩として使用される。最も突出した使用分野は、巨赤芽球性葉酸貧血の治療のために、葉酸アンタゴニスト、特に癌治療におけるアミノプテリンおよびメトトレキセートの適合性を増加させるための解毒剤として（「葉酸拮抗剤レスキュー」）、フッ化ピリミジンの治療効果を増加させるために、および乾癬および関節リウマチのような自己免疫疾患の治療のために、例えばトリメトプリム－スルファメトキサゾールのような突然変異に対するある種の駆虫剤の適合性を増加させるために、および化学療法におけるジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性を減少させるために、使用される。

【0003】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩は特に、薬物として、および食品添加物として、ビタミン調剤として、神経管欠損の予防のために、うつ病の治療のために、およびホモシステインレベルに影響を及ぼすために使用される。

【0004】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびその塩は、極めて不安定であることが知られている。特に、それらは、酸化に対して非常に敏感であり（この点に関して、A.L.Fitzhugh、Pteridines 4（4）,187-191(1993）も参照のこと）、したがって、医薬活性成分または食品添加物に許容される純度レベルで製造することが困難である。

【0005】

５－メチルテトラヒドロ葉酸およびその塩の不安定性を克服するために、酸素をできるだけ完全に排除する、またはアスコルビン酸もしくは還元Ｌ－グルタチオンなどの酸化防止剤を添加するなどの様々な方法が使用されてきた。

【0006】

米国特許第６，４４１，１６８号は、５－メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類塩、特にカルシウム塩、その結晶化およびその使用を開示している。５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のこのような結晶性カルシウム塩の欠点は、それが４つまでの多形変異の結晶形態で存在することである。従って、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の製造方法は、非常に正確に制御されなければならない。さらに、米国特許第６，４４１，１６８号の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩は、典型的には結晶格子中に、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸１当量当たり少なくとも１当量であるが４当量までの水をそのすべての多形形態で含有する。

【0007】

ＵＳ ２,０１６,２０７,９２５Ａ１は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸と共にＬ－アスパラギンまたはＬ－アルギニンを含む噴霧乾燥または煮詰組成物を特許請求している。しかしながら、開示された組成物は単純な非化学量論的混合物であり、非晶質状態で存在する。

【0008】

薬学的に有用な化合物の新しい結晶形態は、薬学的および／またはビタミン／医学的食品の性能プロフィールを改善する機会を提供する。それは、製剤科学者が改善された特性を有する新しい投薬形態を設計するために利用可能な材料の蓄積を広げる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の根底にある技術的課題は、当該技術分野で知られている５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の結晶性カルシウム塩の欠点を克服する、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸を含む結晶形態の提供である。

【0010】

さらに、新しい結晶形態はしばしば、所望の異なる物理的性質および／または生物学的特性を示し、これは、規制の承認に必要とされる純度レベルおよび均一性まで、活性化合物の製造または処方を補助し得る。

【0011】

テトラヒドロ葉酸塩の安定性のために、貯蔵時に低い吸水性を有し、製造中に十分に乾燥させることができる化合物を提供することが常に目標である。加えて、周囲条件下で多量の水を吸収しない薬剤物質が非常に望まれている。特に、環境の相対湿度の変化による含水量の大きな変化が剤形に関して高い精度を達成することをより困難にするため、環境の相対湿度が変化したときに含水量を変化させない物質が望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含み、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が１：０．３～１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物に関する。

【0013】

この技術的課題は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩であって、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比が１：０．３～１：３．０（モル／モル）である結晶塩、および／またはその水和物および／またはその溶媒和物によって解決される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルを１：２で含む結晶塩（形態Ａ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。

【図2】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルを１：２で含む結晶塩（形態Ｂ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。

【図3】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルとの塩（実線）およびカルシウムとの塩（破線）のＤＶＳ測定の結果を示す図である

【図4】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸塩およびＬ－メチオニンエチルエステルを含む結晶塩、無水形態（形態Ａ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。

【図5】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸塩およびＬ－メチオニンエチルエステルを含む結晶塩、水和形態（形態Ｂ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。

【図6】５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの塩の、無水形態（形態Ａ）から出発した、相対湿度に対する含水量のＤＶＳ等温線プロットを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の固体形態は改善された薬理学的特徴を有し、したがって、改善された薬物生成物を調節および設計するための強化された可能性を提供する。５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エステルの結晶塩の別の有利な側面は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の高い化学的および光学的純度が１回の結晶化工程で達成され得ることである。

【0016】

薬物が経口投与される場合、高い速度論的溶解度を有し、改善された、そしてより速いバイオアベイラビリティーをもたらす場合、有利である。その結果、薬剤は、より容易に機能することができる。

【0017】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸は水にほとんど溶けない。カルシウム塩（形態III）の熱力学的に安定な形態は約２．５ｍｇ／ｍｌの水溶解度を示すことが知られており、準安定形態Ｉの溶解度は、室温で約１０ｍｇ／ｍｌである。特定のｐＨ条件下、特に環境のｐＨが所与の塩の平衡ｐＨより低い場合、塩は潜在的に遊離酸に不均化し、その結果、溶解度は実質的に低下する。したがって、中性～低いｐＨ値での特許請求された塩の熱力学的溶解度は、塩の不均化が遅い（難溶性遊離酸の形成）ために、アクセスできない。しかしながら、バイオアベイラビリティは、速度論的効果によって支配される。固形の製剤を投与した後、溶解し、最初の溶解工程の後、薬物を体液で希釈し、分配する。したがって、最初に溶解した原薬は容易に希釈され輸送されるため、速度論的溶解度はバイオアベイラビリティに影響を及ぼす重要なパラメータである。５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルのようなアミノ酸エチルエステルについては、驚くべきことに、既知のカルシウム塩（準安定形態Ｉ）に対して約５０％の速度論的溶解度が改善されることが見出された。カルシウム塩の熱力学的に安定な形態（形態III）に対する本発明の塩の速度論的溶解度の差は、おそらくさらに大きいであろう。したがって、一時的にはるかに高い原薬濃度を達成することができる。

【0018】

好ましい実施形態において、アミノ酸エチルエステルは、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルである。

【0019】

好ましくは、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸対アミノ酸エチルエステルのモル比が１：０．５～１：２．５（モル／モル）である。

【0020】

さらにより好ましくは５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸対アミノ酸エチルエステルのモル比が１：０．７５～１：１．２５（モル／モル）であり、最も好ましくはモル比は約１：１（モル／モル）である。

【0021】

あるいは５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のアミノ酸エチルエステルに対するモル比が１：１．７５～１：２．２５（モル／モル）および／またはその水和物および／またはその溶媒和物であってもよく、最も好ましくはモル比は約１：２（モル／モル）である。

【0022】

好ましくは、アミノ酸エチルエステルがＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルであり、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルとの比は約１：２（mol／mol）および／またはその水和物および／またはその溶媒和物である。

【0023】

より好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、４．０、６．４、１５．０、１５．９、１７．１、１８．４、１８．６、２１．９、２２．６、および２５．５に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0024】

最も好ましい本発明の塩は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、４．０、６．４、１５．０、１５．９、１７．１、１８．４、１８．６、２１．９、２２．６、および２５．５（形態Ａ）に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的ピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し、さらに好ましくは、本発明の塩は５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、４．０、６．４、１５．０、１５．９、１７．１、１８．４、１８．６、２１．９、２２．６、および２５．5にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0025】

好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、４．０、６．４、７．３、７．９、１２．５、１３．５、１３．９、１４．３、１５．０、１５．９、１７．１、１７．４、１７．９、１８．２、１８．４、１８．６、２０．１、２１．１、２１．９、２２．６、２４．３および２５．５に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的ピーク（２θ±0．２θ （CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ａ）、最も好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図１で示されるＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0026】

好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１７．８および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0027】

最も好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１７．８および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ｂ）、最も好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１７．８および１８．３にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0028】

好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、３．７、６．８、７．５、１３．２、１４．９、１５．７、１６．２、１７．８、１８．３、１８．６、１９．０、１９．２、１９．５、１９．７、２１．３、２３．２、２３．６、２５．４および２５．９に位置するピークから選択される少なくとも１つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し、最も好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図２（形態Ｂ）に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0029】

さらに好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、５．５、７．０、８．５、１４．０、１４．７、および１７．７に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0030】

より好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、５．５、７．０、８．５、１４．０、１４．７および１７．７に位置する以下のピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ａ）、さらにより好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、５．５、７．０、８．５、１４．０、１４．７および１７．７にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0031】

好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、３．５、５．５、７．０、８．５、１３．２、１４．０、１４．７、１７．７、１８．４、２１．６、２３．０、２３．９、および２７．６に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ａ）、最も好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図４に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ａ）。

【0032】

さらに好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、７．３、１４．０、１４．７、１５．７、および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0033】

より好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、７．３、１４．０、１４．７、１５．７、および１８．３に位置するピークから選択される少なくとも３つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ｂ）、さらにより好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、７．３、１４．０、１４．７、１５．７、および１８．３にピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0034】

好ましくは、本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、５．０、７．３、８．５、１０．２、１３．８、１４．０、１４．７、１５．７、１８．３、１８．７、２０．５、２０．９、２２．２、２４．１、および２４．５に位置するピークから選択される少なくとも1つの特徴的なピーク（２θ±０．２°２θ（CuKα放射線）で表したとき）を有するＰＸＲＤパターンを有し（形態Ｂ）、最も好ましくは本発明の塩が５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩であり、実質的に図５に示されるようなＰＸＲＤパターンを有する（形態Ｂ）。

【0035】

さらにより好ましくは、前述の結晶塩が少なくとも９９重量％以上の化学的および／または立体異性的純度を有する。

【0036】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルの塩を、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩と比較すると、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルの塩の水分含量はより少なく変化することが分かった。それに加えて、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の塩およびアミノ酸エチルエステルは、非常に低い含水率、例えば１％未満まで容易に乾燥させることができる。従って、例えば５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩については水分含量の変化が２０％～７５％の最も関連する範囲内で０．３％未満であり（実施例５、図３の実線）、一方、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩についての水分含量は約３％変化する（参考例５、図３の破線）。

【0037】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸を含み、水分含量が非常に低く、特に水を吸収／脱着する傾向が低い塩を有することは、例えば、温度／湿度が制御された環境または相対湿度が一般に非常に高い熱帯諸国で配合するために物質を取り扱う場合に有利である。

【0038】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩は、その無水形態（形態Ａ）で、典型的には５０％～６０％の相対湿度で１％未満の水を含有する。５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩はその水和形態（形態Ｂ）で、典型的には相対湿度５０～６０％で約５％の水を含有し、これは４．１％であるセスキハイドレートについての計算された水分含量のレベルである。

【0039】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の結晶塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルのようなアミノ酸エチルエステルの水吸着に対する湿度の著しく低い効果は、相対湿度条件の変化下での吸着水の量の変化が著しく少ないため、製剤中の標的剤形レベルに対する実質的に改善された制御をもたらす。

【0040】

この結果は当業者にとって非常に驚くべきものであり、米国特許第6,441,168号B１の教示を考慮すると予想することができなかった。さらに、本発明の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルの塩は、本発明の根底にある技術的課題を明らかに解決する。

【0041】

従って、本発明の塩は、これらの条件下でも改善された貯蔵安定性を示す。これらの改善された特性は、US 6,441,168 B１の教示を念頭に置いて導き出すことはできなかった。

【0042】

さらに、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の結晶塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはL－メチオニンエチルエステルのようなアミノ酸エチルエステルの速度論的溶解度は、当技術分野で公知の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩と比較して高い。実施例６によれば、１１．３mgの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の塩およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルは２．００mlの水に１分以内に溶解するが、カルシウム塩を使用する場合、９．０mgの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のみが同量の水に溶解する。室温での５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩の速度論的溶解度は約２４～３０mg／mlの塩であり、これは、１８mg／mlより大きい５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸の溶解度に相当する。これは、カルシウム塩の速度論的溶解度（１０mg／ml未満）よりもかなり大きい。結果として、本発明の塩は経口投与された場合、より良好な速度論的溶解度を示し、改善された、より速いバイオアベイラビリティをもたらす。その結果、薬剤は、より容易に機能することができる。

【0043】

本発明のさらなる態様は５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸を含む結晶塩を製造する方法であり、以下の工程：
i) ５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルの混合物を、任意選択で適当な溶媒または溶媒の混合物中で、準備する工程、
ii) 塩基を、任意選択で適切な溶媒または溶媒の混合物中で、添加する工程、
iii) 組成物を少なくとも６０℃に加熱し、任意選択で清澄濾過する工程、
iv) 混合物を結晶化させ、１℃～３０℃の間の温度に冷却し、任意選択でさらに溶媒または溶媒の混合物を添加する工程、
v) 得られた固体物質を単離し、任意選択で生成物を乾燥させる工程、
を含む方法である。

【0044】

好ましくは、工程i）における５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とアミノ酸エチルエステルとのモル比は１：１～１：３の範囲である。

【0045】

より好ましくは、溶媒は水である。

【0046】

工程iii）および／またはiv）において、種結晶を添加してもよい。

【0047】

好ましくは、アミノ酸エチルエステルは、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルである。さらにより好ましくはＬ－フェニルアラニンエチルエステルと、Ｌ－メチオニンエチルエステルは、それぞれＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩、Ｌ－メチオニンエチルエステル塩酸塩として添加する。

【0048】

また、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルの結晶塩、並びに任意選択で1以上の許容される賦形剤を含む医薬組成物、食品添加物および／または調製物は、本発明の一部である。

【0049】

好ましくは、アミノ酸エステルはＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルである。

【0050】

医薬組成物は、錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、凍結乾燥物、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能もしくは注入可能な溶液もしくは懸濁液または坐剤の形態であり得る。

【0051】

医薬組成物は少なくとも1つの追加の治療薬をさらに含んでもよく、好ましくは経口、非経口、筋肉内、脊髄内、髄腔内、歯周、局所または直腸投与のための医薬組成物である。

【0052】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩を、薬物の製造のための成分として、および／または食品添加物として使用することもまた、本発明によって包含される。好ましくは、アミノ酸エチルエステルは、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルである。

【0053】

５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびアミノ酸エチルエステルを含む結晶塩は、貧血、神経管欠損、心血管疾患、うつ病、認知障害、アルツハイマー病および骨粗鬆症におけるホモシステイン低下の治療に使用でき、ならびに／または低血漿および／または低赤血球および／または低脳脊髄液および／または低末梢もしくは中枢神経系葉酸塩の食事管理に使用することができる。好ましくは、アミノ酸エチルエステルがＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルである。

【0054】

要約すると、本発明の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルまたはＬ－メチオニンエチルエステルのようなアミノ酸エチルエステル酸の塩によって提供される特性のプロフィールは、医薬または食品添加物としての使用に有利である。特に、２０％～７５％の相対湿度の環境における水分含量の低い変化は、当業者によっては予見することができなかった。

【0055】

さらに、速度論的溶解度はより高く、これはまた、当業者によって予想され得ない。

【実施例】

【0056】

粉末Ｘ線回折
Mythen１Ｋ検出器を備えたStoe Stadi P；Cu－Ｋα１放射線；標準測定条件：伝送； ４０ ｋＶおよび４０ｍＡ管出力；湾曲Ｇｅモノクロメ－タ－；０．０２°２θステップサイズ、４８秒ステップ時間、１．５～５０．５°２θ走査範囲；検出器モ－ド：ステップ走査；１°２θ検出器ステップ；標準試料調製：１０～２０ｍｇ試料を２つのアセテ－トフォイルの間に置く；試料ホルダー： Stoe透過試料ホルダー；測定中に試料を回転させた。全ての試料の調製および測定は、周囲空気雰囲気中で行った。

【0057】

ＴＧ－ＦＴＩＲ
熱重量測定は、Bruker FTIR分光計ベクター２２（ピンホールを有する試料パン、Ｎ_２大気、熱速度１０Ｋ／分）に連結したNetzsch Thermo－Microbalance TG 209を用いて行った。

【0058】

ＤＶＳ
ＤＶＳ測定は、代表的には、ＰｒｏＵｍｉｄ(以前の"Projekt Messtechnik")、August-Nagel-Str.23, 89079 Ulm (ドイツ）製のＳＰＳ１１－１００n "Sorptions Prufsystem"を用いて実施した。

【0059】

ラマン分光法
FT－Ｒａｍａｎスペクトルは、１０６４nmで動作する近赤外Ｎｄ：ＹＡＧレーザーおよび液体窒素冷却ゲルマニウム検出器を有するBruker MultiRAM FT-RamanまたはBruker RFS 100 FT-Ramanシステム上に記録された。２cm^-1の分解能を持つ６４個のスキャンが３５００～－５０cm^-1の範囲で蓄積されたが、フィルタカットオフ効果により１００ cm^-1以上のデ－タのみが評価された。公称レ－ザ出力は、通常、１００または３００mWである。

【0060】

実施例１：ヘテロシーディングによる５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩の調製
分液漏斗中のＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩１５gと酢酸エチルエステル１００mLとの混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２００mLを加えた。混合後、酢酸エチルエステル層を水層から分離した。酢酸エチルエステル層と、水層を各１００mLの酢酸エチルエステルで３回洗浄して得られた抽出物と結合した。結合した層を５０mLの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、塩化マグネシウムで乾燥させて、４０℃で真空中で酢酸エチルエステルを蒸発させた後、１２．４４gの油状残渣を得た。９．８７gの油状残渣を、ガラス容器中の１０gの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸および３０mLの水の混合物に、７５～８０℃で窒素雰囲気下で撹拌しながら、約１０分以内に滴下した。混合物を約８０℃で約２時間撹拌し、次いで約３時間以内に約２０℃に冷却した。ガラス容器中の溶液の数滴をガラスプレートに塗布し、エタノールの数滴および１モル濃度の塩酸水溶液で希釈した。ガラス板のヘテロシーディングおよび保存のための５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸(EP 0,455,013に従って調製した）の少量の結晶性ジベンジルアミン塩を、被覆なしで夜間にわたって周囲温度で添加した後、黄色結晶が形成された。

【0061】

ガラス容器中の混合物を周囲温度で約１５時間撹拌し、次いで約１０５分以内に約２℃に冷却し、約２℃で約１時間撹拌した。次に、ガラス板上に形成された結晶をガラス容器に添加した。ガラス容器をガラス棒で引っかき、約２℃で約３時間以内にオフホワイトの濃厚懸濁液を形成した。固体生成物を濾過（吸引）により単離し、氷浴中で予備冷却した５０mLの水で洗浄した。生成物を周囲温度で真空（１０mbar）中で約６０時間乾燥させて、１３．６gの白色結晶性固体を得た。^１H‐NMR分光法により、５－メチル-（６Ｓ）-テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルの比率１：１．８を決定した。

【0062】

実施例２：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩のシーディングによる調製
全ての操作は窒素雰囲気下で行った。３．００グラムの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸（（６Ｓ）－含有量９８．４％）および２０mlの水の混合物に、２０mlの水中の４．４９グラムのＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩の溶液を、撹拌しながら室温で添加した。懸濁液を約７７℃に加熱し、１．３mLの水酸化ナトリウム水溶液（分析：水酸化ナトリウム３２％w／w）を添加することにより、透明な溶液を得た。加熱浴を取り除き、溶液を約１時間以内に約２７℃に冷却させた。冷却しながら、溶液に、約７２℃および約２７℃で、少量の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩を播種し、濃縮懸濁液に徐々に変化させた。濃厚な懸濁液を周囲温度で約２０時間撹拌した。固体生成物を、フリットガラスフィルターを使用する濾過によって単離し、そして毎回１０mLの冷水で２回洗浄した。固体を減圧乾燥機中で約４０℃／１０ミリバールで乾燥させ、¹Ｈ-ＮＭＲによって試験し、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸・Ｌ－フェニルアラニンエチルエステル１：２塩として同定した。粉末Ｘ線回折を実施し、実質的に図１に示すようなＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩形態ＡのＰＸＲＤパターンを得た。ＰＸＲＤによれば、試料は少量のＮａＣｌを含んでいた。ＨＰＬＣ分析は純度が９８．９％面積であり、光学純度が９９．６％（６Ｓ）－ジアステレオ異性体に増加したことを示した。

【0063】

実施例３：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩の洗浄
実施例２で得られた固体物質０．４１gを濾過遠心分離装置に秤量し、水２．０mLを加え、続いて周囲条件下で遠心分離した。この洗浄工程を、０．５mLの水を用いてさらに２回繰り返した。次に、湿った濾過ケーキをフリットガラス濾過に移し、周囲空気（約２２℃／約２２％ ＲＨ.)をガラス濾過を通して約１０分間引くことによって空気乾燥させた。乾燥した物質を^１Ｈ-ＮＭＲで調べ、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸Ｌ－フェニルアラニンエチルエステル1：２塩として同定した。TG－FTIRによる試料の分析では、約５．９％(w/w)の水分含有量を示した。サンプルのアリコートを、約２５％の相対湿度で室温でＰＸＲＤのための２つのアセテート箔の間に調製した。粉末Ｘ線回折を行い、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステル塩形態ＢのＰＸＲＤパターンを得た。図２に示すＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩形態ＢのＰＸＲＤパターンではＮａＣｌは検出されず、表１に示した２θ角でピークを示した。

【0064】

【表1-1】

【0065】

【表1-2】

【0066】

【表1-3】

【0067】

実施例４：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩の真空乾燥
実施例３による結晶性材料約１００mgを、約５０℃および約１０mbarで約２時間、真空乾燥した。試料を真空乾燥機から回収したとき、周囲温度は約２３℃であり、相対湿度は２４％であった。TG－FTIRによる試料の分析では、約２．５％w／wの水分含有量を示した。試料のアリコートを、室温および相対湿度約２５％でＰＸＲＤのための２つのアセテート箔の間に調製した。粉末Ｘ線回折を行い、Ｌ－フェニルアラニンエチルエステル塩形態ＡのＰＸＲＤパターンを得た。ＰＸＲＤパターンではNaClは検出されなかった。Ｌ－フェニルアラニンエチルエステル塩形態Ａの粉末Ｘ線回折パターンを図１に示し、表２に列挙した２θ角でピークを示した。

【0068】

【表2-1】

【0069】

【表2-2】

【0070】

実施例５：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩形態Ｂを用いた動的水蒸気収着実験
実施例２で得た５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩形態Ｂ２２mgを、ＤＶＳ測定のためにアルミニウムサンプルパンに秤量した。ＤＶＳ測定を行った。相対湿度（ＲＨ）スキャンでは、１時間当たり５％の変化率を使用した。試料パンを装置に入れ、以下の工程に従って、規定の相対湿度変化プログラムを開始した：
・ ＲＨを５０％で２時間維持し、
(2) 毎時５％の速度でＲＨを５０→２０％へ走査し、ＲＨを２０％で１０時間維持し、
(3) 毎時５％の速度でＲＨを２０→７５％へ走査し、ＲＨを７５％で１０時間維持し、
(4) 毎時５％の速度でＲＨを７５ →５０％へ走査し、ＲＨを５０％で２時間維持した。

【0071】

これと並行して、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩を基準として、全く同じプロトコールを適用し、両者の結果を図３に示した。試験中、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸とＬ－フェニルアラニンエチルエステルの塩の相対試料質量（実線）の変化は０．３％未満で、カルシウム塩の相対試料質量（破線）は約３％変化した。

【0072】

実施例６：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの結晶塩の速度論的溶解度
実施例４で得た５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－フェニルアラニンエチルエステルの無水形態の結晶塩４２．３mgを、スクリューキャップ付きの７mLガラスバイアル中に秤量した。２．００mLの精製／脱イオン水（例えば、ガスクロマトグラフィー用水）を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加した。混合物を室温で１分間激しく撹拌した。１分後、濁った溶液が観察され、試料の大部分が溶解したことが示唆された。溶液を遠心濾過によって濾過し、１．５０mLの水溶液を風袋を量ったガラスバイアル（約１０mL容量）に移した。水を空気乾燥機中で４０℃で約１５時間、次いで５０℃で約８時間蒸発させ、続いて５０℃、真空下（１０～２０mbar）で約１３時間で乾燥を完了させた。溶解度は、固体残渣の重量評価によって決定した。溶解度は、１mL当たり５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸１１．３mgであった。

【0073】

実施例７：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩、無水形態（形態Ａ）の調製
１５gの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸（分析： ９６．２％w／w、６Ｓ－ジアステレオ異性体： ９８．１％）を、窒素雰囲気下で１００gの水に添加した。１６．８gのＬ－メチオニンエチルエステル塩酸塩および３０gの水を添加した後、氷浴中で冷却することによって温度を２５℃未満に保ちながら、水酸化ナトリウム水溶液（３０％w／w）を添加することによってｐＨをｐＨ＝７．０に調整した。得られた溶液を６６℃に加熱し、１モル濃度の塩酸水溶液を加えてｐＨを５．４に調整した。混合物に５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸Ｌ－イソロイシンエチルエステル塩を播種し、１モルの塩酸を添加することによってｐＨを５．４に維持しながら２０℃に冷却した。結晶化した生成物を吸引により単離し、４４gの水で洗浄し、これを１℃に予備冷却した。材料を真空中２０℃で６４時間乾燥させて、理論収率の７４％に相当する１４．９gの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸Ｌ－メチオニンエチルエステル塩を得た（修正分析）。単離された生成物は、９８．６％面積の純度、１：１塩に相当する７１．９％ w/wの５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸、１．２％w／w、および９９．９％の６Ｓ－ジアステレオ異性体純度を示した。

【0074】

【表3-1】

【0075】

【表3-2】

【0076】

【表3-3】

【0077】

実施例８：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸およびＬ－メチオニンエチルエステルの結晶塩の調製、水和形態（形態Ｂ）
実施例７に従って調製した試料を、実施例５に開示したＤＶＳ測定に従って処理した。結晶性の５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸塩およびＬ－メチオニンエチルエステル、水和形態（形態Ｂ）を得た。

【0078】

Ｌ－メチオニンエチルエステル、水和形態（形態Ｂ）の粉末Ｘ線回折パターンを図５に示し、表４に列挙するような２θ角でピークを示した。

【0079】

【表4-1】

【0080】

【表4-2】

【0081】

【表4-3】

【0082】

参考例１：５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸のカルシウム塩の速度論的溶解度
無水形態の結晶性５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸カルシウム塩４２．５mgを、スクリューキャップ付きの７mLガラスバイアル中に秤量した。２．００mLの精製／脱イオン水（例えば、ガスクロマトグラフィー用水）を、調整可能な容量ピペットを用いて固体に添加した。混合物を室温で１分間激しく撹拌した。１分後、懸濁液が観察された。懸濁液を遠心濾過によって濾過し、１．５０mLの水溶液を風袋を量ったガラスバイアル（約１０mL容量）に移した。水を空気乾燥機中で４０℃で約１５時間、次いで５０℃で約８時間蒸発させ、続いて５０℃で真空下（１０～２０mbar）で約１３時間乾燥を完了させた。溶解度は、固体残渣の重量評価によって決定した。溶解度は、５－メチル－（６Ｓ）－テトラヒドロ葉酸９．０mg／mLであった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】