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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-18
(45)【発行日】2023-12-26
(54)【発明の名称】クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231219BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20231219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231219BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20231219BHJP
A61K 39/08 20060101ALI20231219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231219BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K9/19
A61K39/08
A61K39/395 R
A61P31/04
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2023107219
(22)【出願日】2023-06-29
(62)【分割の表示】P 2022566303の分割
【原出願日】2022-06-30
(65)【公開番号】P2023123746
(43)【公開日】2023-09-05
【審査請求日】2023-06-29
(31)【優先権主張番号】P 2021110421
(32)【優先日】2021-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業ＡＭＥＤ－ＣＲＥＳＴ「微生物叢と宿主の相互作用・共生の理解と、それに基づく疾患発症のメカニズム解明」「腸管ＩｇＡ抗体による腸内細菌叢制御機構の解明」委託研究開発、産業技術力強化法１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504143441
【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】新藏 礼子
(72)【発明者】
【氏名】森 智行
(72)【発明者】
【氏名】玉野 竜太郎
(72)【発明者】
【氏名】堂前 直
(72)【発明者】
【氏名】箱嶋 敏雄
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００３／０００３１０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／１４２０８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－００１９８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】日本臨床免疫学会会誌，2017年，Vol.40, No.6，p.408-415
【文献】The Japanese Journal of Antibiotics，2017年，Vol.70, No.1，p.1-13
【文献】Nature Microbiology，2016年，Vol.1，Article No.16103
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ０７Ｋ １６／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＣＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が、
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、
Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
ＧＶＹＹＣＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ４はアラニンまたはセリンであり、Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＡを含むものを除く、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに、
配列番号５３～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
配列番号５３～５５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（１）
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む；
（２）
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む；
（３）
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む；
（４）
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む；
（５）
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む；または
（６）
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項7】
請求項６に記載される核酸を含む発現ベクター。
【請求項8】
請求項６に記載される核酸、または請求項７に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物。
【請求項10】
凍結乾燥状態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌））に結合する抗体およびその抗原結合断片並びにこれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腸管内は、生体にとっては言わば「体外」に当たるため、非常に多種、且つ多数の腸内常在細菌、ウイルス、食物由来等の抗原に、常に晒された状態となっている。この様な腸内常在細菌は、腸内細菌叢を形成している。
【0003】
この腸内細菌叢は、腸上皮細胞等から構成される粘膜面を介して、生体に対して様々な機能を果たしていることが明らかになっており、腸内細菌が存在しないと腸管免疫系が正常に発達しないことも分かっている（非特許文献１～３）。
【0004】
腸内細菌叢が変化して宿主との共生関係が崩れると、腸管免疫系が過剰に刺激されてその恒常性が破綻し、延いては炎症性腸疾患、大腸がん、喘息、アレルギー、肥満等といった多くの疾患が誘発されてしまう。この様なことから、腸管免疫系は病原体等を排除するだけではなく、免疫系全体の恒常性の維持に重要な役割を担っていることが知られている（非特許文献４～７）。
【0005】
従来、抗生物質を用いて腸内細菌叢を制御しようという試みが多数行われてきたものの、抗生剤耐性菌の問題で効かなくなることが問題点として挙げられている。したがって、従来の試みにも関わらず、依然としてディフィシル腸炎や、そのほかの腸内細菌叢に関連する炎症性腸疾患で苦しむ患者が多数存在する。また、比較的新たなアプローチとして、糞便移植などが試みられているものの、その治療効果は安定していない。その結果、すでにいくつかの試みでは治療法としての開発が中止されている。また、従来、腸内細菌叢の放出する毒素に対する抗体を治療薬として利用することが研究され、商品化されている。しかしながら、当該抗体医薬は、あくまで毒素に対するものであるから、これを用いた治療法は対処療法でしかない。したがって、腸内細菌叢に関連する炎症性腸疾患を根本的に治療するための医薬の開発が望まれていた。
【0006】
炎症性腸疾患に関係するＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌は、院内感染を引き起こす菌として、ＭＲＳＡとともに注意が必要な菌である。実際、米国の統計では、毎年４０～５０万人程度が感染し、１５０００～２００００人程度が亡くなっている。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌感染は多くの場合、抗生物質を長期投与している患者に発生すること、一度罹患すると、再発生する確率が１５－３５％と高い疾患である点で、炎症性腸疾患関連細菌の中でも、とりわけ有効な治療が求められている。現状ではバンコマイシンなど強力な抗生物質による治療が行われているが、そもそも菌の毒素は残ってしまうこと、抗生物質耐性を有する菌の発生を助長することから、代替手法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｃｅｒｆ－Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ Ｎ，ａｎｄ Ｇａｂｏｒｉａｕ－Ｒｏｕｔｈｉａｕ Ｖ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０；１０：７３５
【文献】Ｈｏｏｐｅｒ ＬＶ，ａｎｄ Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ ＡＪ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０；１０：１５９
【文献】Ｒｏｕｎｄ ＪＬ，ａｎｄ Ｍａｚｍａｎｉａｎ ＳＫ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０；１０７：１２２０４
【文献】Ｖｉｊａｙ－Ｋｕｍａｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０；３２８：２２８
【文献】Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１１；１７：１５８５
【文献】Ｂｒｙ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；２７３：１３８０
【文献】Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００６；４４４：１０２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、腸内細菌叢を制御することを目的に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体を含む腸内細菌に結合する抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の発明者らが鋭意研究を進めた結果、腸内細菌、特にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体およびその他の腸内細菌の細菌体に結合する抗体を見出した。
【0010】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0011】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0012】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0013】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0014】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0015】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0016】
本発明は一態様において、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0017】
本発明は一態様において、
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が、
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含む
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が、
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含む
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0018】
本発明は一態様において、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【0019】
本発明は一態様において、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【0020】
本発明は一態様において、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、または当該核酸を含む発現ベクターを含む細胞を提供する。
【0021】
本発明は一態様において、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物を提供する。
【0022】
本発明は一態様において、個体における炎症性腸疾患に関連するクロストリジウム・ディフィシル細菌の増殖を抑制する方法であって、有効量の前記医薬組成物を、前記個体に投与することを含む方法を提供する。
【0023】
本発明は一態様において、
１）腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程、
２）前記ハイブリドーマを培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
３）前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法を提供する。
１）腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞と、それ以外の種類の細胞を混合して融合させ、ハイブリドーマを作製する工程、
２）前記ハイブリドーマを培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
３）前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法を提供する。
【0024】
本発明はより具体的には以下を提供する。
[項目１]
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
ａ）
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；
ｃ）
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；または
ｄ）
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合する抗体またはその抗原結合断片。
[項目２]
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目３]
配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目４]
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目５]
配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目６]
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が、
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目７]
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ5ＳＶＳＬＧＤＲＸ6のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ4はアラニンまたはセリンであり、Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＡを含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目８]
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに、
配列番号５３～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目９]
項目１～８のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
[項目１０]
項目９に記載される核酸を含む発現ベクター。
[項目１１]
項目９に記載される核酸、または項目１０に記載の発現ベクターを含む細胞。
[項目１２]
項目１～８のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物。
[項目１３]
凍結乾燥状態である、項目１２に記載の医薬組成物。
[項目１４]
１）腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から抗体産生不死化細胞を作製する工程、
２）前記抗体産生不死化細胞を培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
３）前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
[項目１５]
前記工程２が、担体に固定された細菌体に対して結合する抗体を産生する細胞を決定することにより行われる、項目１４に記載のクロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
[項目１]
クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合し、
ａ）
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；
ｂ）
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；
ｃ）
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片；または
ｄ）
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合する抗体またはその抗原結合断片。
[項目２]
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目３]
配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目４]
配列番号１７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目５]
配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目６]
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が、
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目７]
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ5ＳＶＳＬＧＤＲＸ6のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ4はアラニンまたはセリンであり、Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＡを含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目８]
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに、
配列番号５３～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く、項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
[項目９]
項目１～８のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
[項目１０]
項目９に記載される核酸を含む発現ベクター。
[項目１１]
項目９に記載される核酸、または項目１０に記載の発現ベクターを含む細胞。
[項目１２]
項目１～８のいずれか一項に記載される抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または添加物を含む医薬組成物。
[項目１３]
凍結乾燥状態である、項目１２に記載の医薬組成物。
[項目１４]
１）腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から抗体産生不死化細胞を作製する工程、
２）前記抗体産生不死化細胞を培養し、クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程、および
３）前記クロストリジウム・ディフィシル細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程
を含む、クロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
[項目１５]
前記工程２が、担体に固定された細菌体に対して結合する抗体を産生する細胞を決定することにより行われる、項目１４に記載のクロストリジウム・ディフィシル細菌体に結合する抗体の製造方法。
【発明の効果】
【0025】
本発明は、腸内細菌、特にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体およびその他の腸内細菌の細菌体に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびにその使用を提供するという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図2】図２は、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体によるＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染抑制効果を示す図である。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体として、ＳＮＫ０００２ＭおよびＷ２７Ｇ２を用いた結果を示す。
【図3】図３は、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体によるＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染抑制効果を示す図である。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染後４日後（左パネル）および１０日後（右パネル）における、糞便中のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ生菌数を示す。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体として、ＳＮＫ０００２ＭおよびＷ２７Ｇ２を用いた結果を示す。
【図4】図４は、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の、大腸ガン原因菌と考えられているフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）に対する増殖抑制効果を示す図である。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体として、抗体ＳＮＫ０００１Ｍ、ＳＮＫ０００３Ａ、ＳＮＫ０００１ＭＲ、ＳＮＫ０００２ＭＲ、ＳＮＫ０００１ＡＲ、ＳＮＫ０００２ＡＲおよびＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１を用いた結果を示す。
【図5】図５はＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の抗原分子を特定した際の２次元電気泳動データを示す図である。３種のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像中の同一のスポットを赤矢印で示す。当該スポットから得られた試料について、質量分析を実施した。
【図6】図６は、各種合成ペプチドに対するＷ２７Ｇ２抗体のウェスタンブロットとＣＢＢ染色の結果を示す図である。グレーの文字は各細菌種で共通のアミノ酸配列を示す。下線はＷ２７Ｇ２抗体が認識した合成ペプチドを示す。
【図7】図７は、各種合成ペプチドに対するＷ２７Ｇ２抗体のウェスタンブロットとＣＢＢ染色の結果を示す図である。グレーの文字は各細菌種で共通のアミノ酸配列を示す。下線はＷ２７Ｇ２抗体が認識した合成ペプチドを示す。
【図15】図１５はＲＳ変異体リコンビナント精製抗体を非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色を行った結果を示す図である。レーン１は、Ｗ２７Ｇ２ハイブリドーマ培養液からヒドロキシアパタイトカラムによって粗精製された抗体サンプルの結果を示す。レーン２～１４は、ＣＨＯ細胞によって産生された各種ＲＳ変異体リコンビナント精製抗体（Ｗ２７Ｇ２抗体に対して、抗原特異性を実質的に変更しないように重鎖または軽鎖に変異を導入して、ＣＨＯ細胞で産生された抗体を、ＲＳ変異体リコンビナント精製抗体。図１５において詳細は省く）サンプルの結果を示す。
【図17】図１７は、Ｗ２７Ｇ２抗体および各種ＲＳ変異体リコンビナント精製抗体について、複数の細菌の総タンパク質に対する特異的結合特性を示す図である。Ｗ２７Ｇ２抗体として、Ｗ２７Ｇ２－ＣＨＴ（Ｗ２７ハイブリドーマ培養上清をヒドロキシアパタイトカラムで粗精製したもの）、Ｗ２７Ｇ２－ＧＦ（Ｗ２７ＣＨＴをさらにゲル濾過カラムで多量体画分を精製したもの）を用い、ＲＳ変異体リコンビナント精製抗体として、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００５およびＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００５を使用した。
【図19】図１９は、二つのリコンビナントＩｇＡ抗体、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（ｒＷ２７）およびＳＮＫ０００２ＡＲがそれぞれ、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスの体重減少および生存率低下を抑制したことを示す図である。
【図20】図２０は、二つのリコンビナントＩｇＡ抗体、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（ｒＷ２７およびＳＮＫ０００２ＡＲ並びにＶａｎｃｏｍｙｃｉｎの投与後の、便中のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌含有量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
（定義）
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
【0028】
本明細書において、「抗体」とは最も広い意味において使用され、意図された抗原結合活性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。全長抗体は主としてポリペプチドで構成される重鎖及び軽鎖を含む。重鎖および軽鎖は、それぞれ抗原を認識する可変領域と呼ばれる部位を含み、当該部位は一般的に、それぞれ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と呼ばれる。当該可変領域は、さらに詳細に抗原を認識する部位として特定される、それぞれＣＤＲ１～３と呼ばれる部位をアミノ末端から順に有する。なお、これらのＣＤＲ１～３は、より詳細に重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３等とも呼ばれる。また、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１～３以外の領域は、それぞれアミノ末端から順に、重鎖ＦＲ１～４及び軽鎖ＦＲ１～４と呼ばれる。抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなる形態のほか、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる抗体（１本鎖抗体とも呼ばれる）の形態であってもよい。
【0029】
抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＹ等、あるいはサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２等であってよい。
【0030】
抗体は同一種に由来するアミノ酸配列を有していても異種に由来するアミノ酸を有していてもよい。同一種由来の場合、例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジー由来、ラクダ由来、ラマ由来等が挙げられる。
【0031】
異種由来の場合も、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、ラクダ、ラマ等の何れか２つ以上に由来する抗体が挙げられる。
【0032】
本明細書において、抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原に特異的に結合する能力は、その一部からなる断片によっても維持されうることがわかっている。一態様として、抗体の「抗原結合断片」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域の一部であるＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得るが、これらに限定されない。
【0033】
本発明の抗体は、ＣＤＲグラフト化された抗体であってもよい。一例において、ＣＤＲグラフト化された抗体では、１つの動物種に由来する抗体のＣＤＲ領域の一部または全部の配列が、別の動物種のＣＤＲ配列で置換されている。例えば、１つ以上のマウス抗体のＣＤＲがヒト抗体のＣＤＲ配列で置換されている。
【0034】
抗体の重鎖可変領域中の重鎖CDR１～３および軽鎖可変領域中の軽鎖CDR１～３を同定する際には当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、例えば当業者に周知の「Ｋａｂａｔ定義」（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９７１、Ｖｏｌ．１９０、ｐｐ．３８２－３９１およびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．らＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、１９９１、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ｐｐ．９１－３２４２）、「Ｃｈｏｔｈｉａ定義」（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、Ｖｏｌ．３４２、ｐｐ．８７７－８８３）、「接触定義」（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６、Ｖｏｌ．２６２、ｐｐ．７３２－７４５）などを用いることができる。抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに、公共データベースの情報に基づいてＣＤＲを同定してもよい。
【0035】
本明細書において「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列又は塩基配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列又は塩基配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列又は塩基配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性のレベルは、通常は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメーターを用いて決定される。または、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（例えば、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８７：２２６４－２２６８（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０：５８７３－７（１９９３）等）を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ＧｉｓｈＷ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ，Ｍｙｅｒｓ ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０）等）。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照することができる。例えば、あるアミノ酸配列Ａが、他のアミノ酸配列Ｂと特定の％同一であるとは、アミノ酸配列Ａとアミノ酸配列Ｂが当該％の同一性を有することを意味する。
【0036】
本明細書において、「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体等の特徴を示す修飾語である。このような抗体の集団に含まれる個々の抗体は、微量に存在し得る、可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。
【0037】
本明細書において「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される技術を意味する。
【0038】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換技術にあたる。
【0039】
本明細書において、「腸内細菌」とは、生体内の腸内に常在する細菌であれば特に限定はされない。この様な腸内細菌としては、生体内で腸内細菌叢を形成し、腸内免疫系の恒常性の維持に関与する細菌が挙げられる。
【0040】
具体的な腸内細菌としては、特に限定されるものでは無いが、例えば、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌、
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌
等が挙げられる。
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌、
Ｍｅｇａｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｂｌａｕｔｉａ属に属する細菌、
Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、
Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属に属する細菌、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する細菌、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する細菌、
Ｅｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ属に属する細菌、
Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌
等が挙げられる。
【0041】
（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体またはその抗原結合断片）
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に結合する。典型的には、本発明の抗体は培養上清中に存在する破壊されていないＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に結合する。
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に結合する。典型的には、本発明の抗体は培養上清中に存在する破壊されていないＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に結合する。
【0042】
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、ハイブリドーマなどのB細胞由来の抗体産生細胞から産生されたものを使用してもよく、遺伝子組み換え技術を用いて、当該抗体をコードする核酸を免疫系以外の細胞に導入して産生したものを、リコンビナント抗体として使用してもよい。
【0043】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0044】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
【0045】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
配列番号７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【0046】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、脾臓由来Ｂ細胞から得られたハイブリドーマが産生性するＩｇＭ抗体ＳＮＫ０００１Ｍである。抗体ＳＮＫ０００１Ｍをコードする核酸配列を決定し、組み換え技術を適用して産生されたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００１ＭＲ、およびＩｇＡ抗体としたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００１ＡＲも同様に用いることができる。
抗体ＳＮＫ０００１ＡＲは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
抗体ＳＮＫ０００１ＡＲは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
【0047】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0048】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
【0049】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
配列番号１７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【0050】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、脾臓由来Ｂ細胞から得られたハイブリドーマが産生性するＩｇＭ抗体ＳＮＫ０００２Ｍである。抗体ＳＮＫ０００２Ｍをコードする核酸配列を決定し、組み換え技術を適用して産生されたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００２ＭＲ、およびＩｇＡ抗体としたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００２ＡＲも同様に用いることができる。
抗体ＳＮＫ０００２ＡＲは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
抗体ＳＮＫ０００２ＡＲは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
【0051】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0052】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を含む。
【0053】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
配列番号２７で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列または、これと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【0054】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、腸管粘膜固有層由来Ｂ細胞から得られたハイブリドーマが産生性するＩｇＡ抗体ＳＮＫ０００３Ａである。抗体ＳＮＫ０００３Ｍをコードする核酸配列を決定し、組み換え技術を適用して産生されたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００３ＭＲ、およびＩｇＡ抗体としたリコンビナント精製抗体ＳＮＫ０００３ＡＲも同様に用いることができる。
抗体ＳＮＫ０００３Ａは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
抗体ＳＮＫ０００３Ａは、以下のアミノ酸配列構成を有している。
【0055】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳ（配列番号７２）およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥ（配列番号７３）に結合する抗体である。
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体に対して、
重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＦＲ１から選択される少なくとも一つの領域において、少なくとも一つのアミノ酸変異を有し、
大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳ（配列番号７２）およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥ（配列番号７３）に結合する抗体である。
【0056】
上記抗体の有する少なくとも一つのアミノ酸変異は、上記参照抗体のアミノ酸配列を有する抗体と大腸菌ＳＨＭＴタンパク質、および参照抗体のアミノ酸配列を有する抗体とＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質の結合体の立体構造解析の結果を利用することにより、当業者に利用可能な技術を適用することによって特定することができる。参照抗体に対するアミノ酸変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上であってよい。
【0057】
このような参照抗体は、重鎖可変領域としてＷ２７Ｇ２＿ＨＶ（配列番号３７）、軽鎖可変領域としてＷ２７Ｇ２＿ＬＶ（配列番号３８）を有する抗体であれば特に限定されない。例えば、ＩｇＧ抗体（Ｗ２７ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ）を用いることができる。抗体Ｗ２７ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲは、腸管粘膜固有層由来のB細胞から得られたハイブリドーマの産生する抗体Ｗ２７Ｇ２と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有している。
【0058】
特定された変異を有する抗体が実際に大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに結合することは、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロットなど、当業者に周知の方法によって確認することができる。
【0059】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く抗体である。
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はそれぞれ独立に中性極性アミノ酸または酸性極性アミノ酸であり、Ｘ４は非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸であり、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く抗体である。
【0060】
上記抗体は、３次元構造解析により、大腸菌ＳＨＭＴタンパク質中のアミノ酸配列ＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭタンパク質中のアミノ酸配列ＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥに対して、Ｗ２７Ｇ２抗体と同様の結合様式を有するように設計されたものであり、実際にこれら細菌に対してＷ２７Ｇ２抗体と同様の結合様式、および、細菌増殖抑制効果を奏する。
【0061】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ４はアラニンまたはセリンであり、
Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く抗体である。
Ｘ１ＹＹＩＨのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＤＰＥＮＸ２Ｘ３ＴＴＹＡＰＫＦＱのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
ＹＣＡＲＳＴＶＬのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域、ならびに
ＲＸ４ＳＱＳＩＶＨＴＮＧのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＫＬＬＩＹＫＶのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
ＧＶＹＹＦＱＧＳのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む軽鎖可変領域を含み、
軽鎖ＦＲ１が
ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡのアミノ酸配列または
ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１、Ｘ２はそれぞれ独立にアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ３はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｘ４はアラニンまたはセリンであり、
Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである抗体であって、
Ｘ１がアスパラギン酸、Ｘ２がアスパラギン酸、Ｘ３がグルタミン酸であり、Ｘ４がアラニンであり、かつ軽鎖ＦＲ１が配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡを含むものを除く抗体である。
【0062】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0063】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0064】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0065】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0066】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0067】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0068】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0069】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0070】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の重鎖は、
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0071】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の軽鎖は、
配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0072】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の軽鎖は、
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0073】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の軽鎖は、
配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
を含む。
【0074】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域にＰｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む。当該Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体分子またはその抗原結合断片は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌカラムを用いて精製することが可能となる。
【0075】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に非極性アミノ酸である。
【0076】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、ＳＰＡＳＸ５ＳＶＳＬＧＤＲＸ６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｘ５はロイシンまたはメチオニンであり、Ｘ６はアラニンまたはバリンである。
【0077】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５３～５５かなる群から選択される１つに表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0078】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５４に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子が結合するように、Ｗ２７Ｇ２抗体の軽鎖ＦＲ１領域の配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡ（配列番号５６）に変異を導入したものである。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子が結合するように、Ｗ２７Ｇ２抗体の軽鎖ＦＲ１領域の配列ＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡ（配列番号５６）に変異を導入したものである。
【0079】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５５に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号５４に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ１領域にさらに変異を導入したものである。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号５４に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ１領域にさらに変異を導入したものである。
【0080】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含む抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５８に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号５４に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ１領域にさらに変異を導入したものである。
当該配列は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと抗体分子がより強固に結合するように、配列番号５４に表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ１領域にさらに変異を導入したものである。
【0081】
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、上記の重鎖および軽鎖のいずれの組み合わせを有していてもよく、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌと結合する配列を含んでも含まなくてもよい。
【0082】
一態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに、
配列番号５３～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く抗体である。
配列番号３１または４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３２、４２～４４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
を含む重鎖可変領域；
配列番号３４または５２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；ならびに、
配列番号５３～５６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＦＲ１、
を含む軽鎖可変領域を含む抗体であって、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むものを除く抗体である。
【0083】
例えば、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、下記の重鎖可変領域のいずれかと、軽鎖可変領域のいずれかとの組み合わせを含む。
【0084】
好ましくは、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、下記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む。
【0085】
好ましくは、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、下記を含む。
Ｗ２７Ｇ２抗体に対して、抗原特異性を実質的に変更しないように重鎖または軽鎖に変異を導入して、ＣＨＯ細胞で産生された抗体を、ＲＳ変異体リコンビナント精製抗体と呼ぶ。これらのＲＳ変異体リコンビナント精製抗体は、さらにプロテインＬへの結合のための変異を有している。
【0086】
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に対して結合する他、他の疾患関連細菌に対しても結合する多重特異性を有することができる。例えば、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、さらに、大腸ガン原因菌と考えられているＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍにも結合し、好ましくはその増殖を抑制する。
【0087】
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、その抗原結合特性を失わない範囲で、構成アミノ酸配列、例えばその重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ１～３または軽鎖ＣＤＲ１～３に変異を有することができる。当該変異は、置換、欠失、挿入等であってもよく、これらに限定されない。例えば置換であれば保存的な置換技術を採用することができる。さらに、３次元構造解析などを用いて、抗体と抗原の結合様式を詳細に解析することにより、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体は、その抗原結合特性を失わない範囲で様々な変異を導入することができる。
【0088】
（核酸）
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、リボヌクレオチドであっても、デオキシヌクレオチドであってもよい。また、当該核酸の形態は特に限定されず、１本鎖の形態であっても、２本鎖の形態であってもよい。当該核酸配列の利用するコドンは特に限定されず、目的に応じて各種コドンを適宜選択して使用することができる。例えば、製造時に採用する宿主細胞の種類に応じて、コドン頻度などを考慮して適宜選択することができる。一態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片を発現し、製造することに利用される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、リボヌクレオチドであっても、デオキシヌクレオチドであってもよい。また、当該核酸の形態は特に限定されず、１本鎖の形態であっても、２本鎖の形態であってもよい。当該核酸配列の利用するコドンは特に限定されず、目的に応じて各種コドンを適宜選択して使用することができる。例えば、製造時に採用する宿主細胞の種類に応じて、コドン頻度などを考慮して適宜選択することができる。一態様において、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片を発現し、製造することに利用される。
【0089】
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする塩基核酸が抗原結合断片をコードする場合、例えば、別個の核酸分子によってＦｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨをコードしてもよく、組み換え技術を利用し、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を単一の核酸によってコードしてもよい。
【0090】
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする塩基核酸に関する配列情報を以下に例示する。
【0091】
（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の製造方法）
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の製造方法は、下記の工程１～３を含むことを特徴とする。
（工程１）
腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程。
（工程２）
上記工程１にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程。
（工程３）
前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程。
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体に結合する抗体の製造方法は、下記の工程１～３を含むことを特徴とする。
（工程１）
腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程。
（工程２）
上記工程１にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程。
（工程３）
前記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞から抗体を回収する工程。
【0092】
本発明に係る、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法には、工程３の後に、後述するような重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を必要に応じて、これらを適宜組み合わせた構成とするために、例えば、プロテアーゼ等によって処理する工程、ジスルフィド結合等の化学的結合が可能となるような、官能基を導入する工程、並びにそれに次いで前記官能基を介して前記化学的結合を形成させる工程等が含まれていてもよい。
【0093】
本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における上記工程１～３について、以下に詳述する。
【0094】
（工程１について）
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程１は、腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程である。
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程１は、腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から、抗体産生不死化細胞を作製する工程である。
【0095】
腸管粘膜固有層（Ｌａｍｉｎａ Ｐｒｏｐｒｉａ）とは、特に限定はされないが、例えば食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸等を含む。）、大腸（盲腸、結腸、直腸等を含む。）等に存在する粘膜を構成する層の１つであって、上皮細胞を含む層と粘膜基板（Ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ ｍｕｃｏｓａｅ）との間に位置する層であればよい。中でも、リンパ系組織、毛細血管、リンパ管等を含んでいる、小腸に存在する腸管粘膜固有層が好ましい。
【0096】
脾臓の細胞としては、特に限定されないが、Ｂ細胞を含んだ細胞を使用することができる。
【0097】
腸管粘膜固有層または脾臓からＢ細胞を採取する方法は、特に限定はされないが、例えば腸管を採取し、得られた腸管を洗浄後に切開して粘膜層を露出させる。次いで、適当な濃度のＥＤＴＡを含む生理食塩水中で振盪させて上皮細胞を遊離させて除去する。その後、適当な濃度のコラゲナーゼ等といった消化酵素で処理することによって、Ｂ細胞を回収する方法が挙げられる。これ以外の公知の方法を採用してもよくまた、市販の腸管粘膜固有層または脾臓由来のＢ細胞を購入して入手してもよい。
【0098】
腸管粘膜固有層または脾臓の由来、すなわち上記Ｂ細胞の由来は、特に限定はされないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、ラクダ、ラマ等が挙げられる。
【0099】
腸管粘膜固有層または脾臓から採取されたＢ細胞から抗体産生不死化細胞を作成する工程には、当業者の公知の任意の方法を用いることができる。例えば、抗体産生不死化細胞として、当該Ｂ細胞とB細胞以外の種類を融合させて製造したハイブリドーマを作成することができ、また、Ｂ細胞にＥＢウイルス等を感染させることにより、不死化B細胞を作成することができるがこれらに限定されない。
【0100】
Ｂ細胞とB細胞以外の種類を融合させてハイブリドーマを製造する場合、当該B細胞以外の細胞の種類（本明細書において、「他の細胞」と呼ぶことがある。）とは、該Ｂ細胞と接触することによって融合してハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマが上述したＢ細胞が発揮する、抗体を産生する機能を失わないものであれば特に限定されない。
【0101】
この様な他の細胞として、前記Ｂ細胞と融合してハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマが不死化機能を獲得できるような細胞が好ましく、具体的にはガン細胞、中でも、ミエローマ等といった骨髄種に由来する細胞等が挙げられる。好ましい他の細胞は、ミエローマ、例えばマウスＮＳ１細胞である。
【0102】
他の細胞の由来は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー、ラクダ、ラマ等が挙げられる。
【0103】
融合とは、前記Ｂ細胞と他の細胞が一体不可分に合一することを意味する。ここで、一体不可分とは、融合した後の細胞が増殖する際の現象である細胞分裂は除外するものである。このようにして、融合した細胞が、本明細書におけるハイブリドーマの一例として挙げられる。
【0104】
混合及び融合時の条件は特に限定されず、細胞を融合する方法において通常用いられる条件を適宜採用すればよい。例えば、Ｂ細胞、又は他の細胞を培養する際に用いられる条件を適宜改変して行えばよい。このような方法として、例えば適当な培地中において、Ｂ細胞とＢ細胞以外の種類の細胞とを混合してポリエチレングリコール等の存在下でこれらを接触させる方法；上記混合の後に電気刺激を与える方法；センダイウイルス等のウイルスを用いる方法等の後に、これを３７℃、５％の二酸化炭素の条件下でインキュベートする方法が挙げられる。
【0105】
融合にかかる時間も、特に限定されるものではなく、融合そのものが完了するまでの時間を適宜設定すればよい。融合が完了したことを確認する方法は、通常の細胞の融合を行う際に用いられる、公知の方法を適宜改変して行えばよい。このような方法として、例えば顕微鏡下にて融合の進行度合いを観察する方法が挙げられ、公知のキットを適宜選択して、その使用条件に沿って細胞を融合してもよい。
【0106】
（工程２について）
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程２は、上記工程１にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程である。
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程２は、上記工程１にて作製した抗体産生不死化細胞を培養し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞を決定する工程である。
【0107】
好ましくは、工程２は、担体に固定されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体全体に対して結合する抗体を産生する細胞を決定することにより行われる。好ましくは、固定されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体は溶菌処理を受けていない。例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体はＮａ２ＣＯ３バッファーで懸濁された状態でＥＬＩＳＡプレートなどの担体に固定される。
【0108】
本発明の工程２の前に、工程１にて得られる抗体産生不死化細胞を、モノクローナル抗体を製造する際に通常用いられるような限界希釈法等のサブクローニング工程等に供していてもよい。
【0109】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する抗体産生不死化細胞は、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＦＩＡ等による手段、ＦＡＣＳによる手段等用いて決定することができる。
【0110】
また、上述の方法にて決定したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体産生不死化細胞を決定した後に、さらに別の腸内細菌とも結合する抗体を産生する抗体産生不死化細胞を決定する工程を含んでもよい。
【0111】
（工程３について）
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程３は、上記工程２で決定された、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞から、抗体を回収する工程である。
工程３における具体的な回収方法は、特に限定はされないが、例えばＩｇＡ抗体を産生する細胞の培養液の上清を回収する方法、前記細胞の溶解液を回収する方法が挙げられる。細胞の溶解液は、超音波破砕、フレンチプレス等といった公知の機械的手段及び／又は界面活性剤、細胞壁消化酵素、細胞膜消化酵素を用いた公知の化学的処理による方法を適宜組み合わせて細胞を溶解し、その後固液分離工程に供した後の液相画分を回収して本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を製造することができる。
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程３は、上記工程２で決定された、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する細胞から、抗体を回収する工程である。
工程３における具体的な回収方法は、特に限定はされないが、例えばＩｇＡ抗体を産生する細胞の培養液の上清を回収する方法、前記細胞の溶解液を回収する方法が挙げられる。細胞の溶解液は、超音波破砕、フレンチプレス等といった公知の機械的手段及び／又は界面活性剤、細胞壁消化酵素、細胞膜消化酵素を用いた公知の化学的処理による方法を適宜組み合わせて細胞を溶解し、その後固液分離工程に供した後の液相画分を回収して本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を製造することができる。
【0112】
上述の抗体産生不死化細胞から抗体分子を回収する前に、当該抗体産生不死化細胞を適当な培地を用いて一定期間培養した後に、上述のようにその上清を回収する方法、又は細胞の溶解液から回収する方法に供してもよい。この他にも、上述の抗体産生不死化細胞を免疫不全マウス等の動物個体に腹腔内投与し、斯かる個体の腹水から抗体を回収してもよい。
【0113】
なお、上述の方法で回収したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体は、適宜公知の精製工程に供してもよい。具体的な精製手段は、特に限定はされないが、例えばアセトン、硫酸アンモニウム等を用いた沈殿による精製手段；アフィニティ、陰イオン交換、陽イオン交換、サイズ排除、逆相等のカラムクロマトを用いた精製手段等といった、公知のタンパク質の精製手段を適宜組み合わせて採用すればよい。
【0114】
（リコンビナント抗体を製造する方法）
別の態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合することの確認された抗体をコードする核酸を、モノクローナル抗体を産生し得る細胞に導入し、当該細胞を培養して、その細胞抽出液又は培養上清から、モノクローナル抗体を回収し、必要に応じて精製する方法が挙げられる。
別の態様において、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合することの確認された抗体をコードする核酸を、モノクローナル抗体を産生し得る細胞に導入し、当該細胞を培養して、その細胞抽出液又は培養上清から、モノクローナル抗体を回収し、必要に応じて精製する方法が挙げられる。
【0115】
抗体がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合することを確認するためには、当業者に周知の手段を用いることができ、例えば、抗体分子または当該抗体を産生する細胞を、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＦＩＡ等による手段、ＦＡＣＳによる手段等を用いて同定することにより確認することができる。
【0116】
上記モノクローナル抗体を産生し得る細胞とは、通常、哺乳類等に由来する高次構造を形成することによって機能を発揮する各種タンパク質を産生し得る細胞であれば、特に限定はされないが、例えばＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ等）、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳類由来の細胞、Ｓｆ９等といった昆虫由来の細胞等といった公知の細胞を適宜選択すればよい。一態様において、酵母細胞、糸状菌細胞、大豆、シロイヌナズナなどの植物細胞を用いてモノクローナル抗体を産生することもできる。
【0117】
具体的な核酸の導入方法、当該核酸を導入した細胞の培養条件、回収方法、精製方法については、用いる細胞の種類等によって区々であり、特に限定されず、公知の方法を適宜改変し、組み合わせることで、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を製造することができる。
【0118】
一態様において、これら細胞内でモノクローナル抗体を産生したのち、これら細胞から培養液中に分泌されたモノクローナル抗体を、培養液とともに乾燥あるいは凍結乾燥することで、または、これら細胞中に蓄積したモノクローナル抗体を、これら細胞とともに粉砕、乾燥または凍結乾燥することで、経腸摂取に適した抗体含有組成物としてモノクローナル抗体を製造することもできる（Virdi et al., Nat. Biotechnol., 2019, Vol.37, pp.527-530）。一態様において、経腸摂取に適した抗体含有組成物を産生する細胞は、酵母細胞、糸状菌細胞、大豆、シロイヌナズナなどの植物細胞であることが好ましく、産生されるモノクローナル抗体はVHH断片がIgAFcに融合された形態であることが好ましい。
【0119】
本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体がキメラ抗体である場合、上述の核酸に関し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列、並びに異種由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を作製し、作製した重鎖可変領域をコードする塩基配列と重鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を結合させ、また作製した軽鎖可変領域をコードする塩基配列と軽鎖定常領域をコードする塩基配列を有する核酸を結合させ、結合させたこれら核酸を上述のように抗体を産生し得る細胞に導入すればよい。
【0120】
更に、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体が、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ１～３がマウスに由来するアミノ酸配列を有し、それ以外の領域がヒトに由来するアミノ酸配列を有するといった態様の抗体である場合（これを、ヒト化抗体と称することもある。）の製造方法も、上述のキメラ抗体と同様に、重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ１～３をコードする塩基配列、並びにそれら以外の領域をコードする塩基配列を有する核酸を作製し、重鎖および軽鎖を構成するように核酸を再結合し、これらを上述のようにモノクローナルＩｇＡ抗体を産生し得る細胞に導入すればよい。抗体の結合能の保持のため、一部の塩基を他の塩基に置換する必要がある場合もある。
【0121】
（抗体産生不死化細胞）
本発明に係る抗体産生不死化細胞は、上述の本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する不死化細胞である。
本発明に係る抗体産生不死化細胞は、上述の本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を産生する不死化細胞である。
【0122】
具体的な抗体産生不死化細胞とは、上述の〔Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法〕における工程１で得られるものである。すなわち、上述の本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の製造方法における工程１にて記載したＢ細胞を、それ以外の種類、すなわちＢ細胞以外の種類の細胞を混合させて融合した細胞、あるいは、ＥＢウイルス等を感染させることにより不死化B細胞とした細胞である。
【0123】
ハイブリドーマは、同一種由来のハイブリドーマであっても、異種由来のハイブリドーマであってもよい。同一種由来のハイブリドーマは、上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕において、前記Ｂ細胞と前記Ｂ細胞以外の種類の細胞の由来種を同一にすればよく、異種由来のハイブリドーマは、前記Ｂ細胞と前記Ｂ細胞以外の種類の細胞の由来種を異なるものにすればよい。
【0124】
同一種由来のハイブリドーマとしては、例えば上述〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕における工程１に記載した由来のうち、Ｂ細胞及びＢ細胞以外の種類の細胞の由来において重複するものから適宜選択すればよい。例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスター由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジー由来、ラクダ由来、ラマ由来等の同一種由来ハイブリドーマが挙げられる。
【0125】
異種由来のハイブリドーマとしては、例えば上述の〔モノクローナルＩｇＡ抗体の製造方法〕における工程１に記載した由来のうち、Ｂ細胞及びＢ細胞以外の種類の細胞の由来において記載した由来から、それぞれ適宜選択したものを組み合わせればよい。例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジー等の由来を適宜組み合わせた異種由来のハイブリドーマが挙げられる。
【0126】
（医薬組成物）
本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【0127】
本発明に係る医薬組成物は、特に限定はされないが、例えばＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と関連する疾患の治療のために好適に用いることができる。
【0128】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と関連する疾患とは、特に限定はされないが、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、自己免疫疾患、新生児壊死性腸炎等が挙げられ、中でも炎症性腸疾患が好ましい。
【0129】
このような本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を有効量含んでいればよく、例えば、医薬組成物１００重量％中の本発明に係る抗体の含有割合が０．００１～９９．９９重量％の範囲になるように、対象とする腸内疾患の種類、剤型、投与方法、投与対象、投与対象者の症状の度合い、並びに投与によって発揮される効果の程度等を勘案して、適宜設定することができる。
【0130】
本明細書にて使用する用語「有効量」とは、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片が腸内疾患等に対する治療効果を発揮できる量をいう。
【0131】
本発明に係る医薬組成物には、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体と共に、薬学的に許容可能な担体或いは添加物を配合しても良い。薬学的に許容可能な担体或いは添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、または甘味料を意味し、公知のものを採用すればよい。
【0132】
本発明に係る医薬組成物は、上述のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患に罹患した個体に投与する工程を含む腸内疾患の治療方法における利用可能性を有している。また、上述のような腸内疾患の病態や症状を発症していないものの、腸内疾患の素因を持ち得る個体に投与する工程を含む腸内疾患の予防方法における利用可能性も有している。これらの個体を、本発明に係る医薬組成物の投与対象とすればよい。
【0133】
この様な投与対象となる個体は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等が挙げられる。
【0134】
当該医薬組成物の投与量並びに投与方法は、投与対象となる個体が罹患する腸内疾患の種類、性別、種、年齢、全身状態、疾患の重篤度、所望する効果の程度等に区々ではある。投与量としては、通常は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で適宜設定すればよい。
【0135】
また、投与方法については、特に限定はされないが、消化管に直接投与することが好ましく、このような投与方法として、例えば経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経腸投与等が挙げられる。
【0136】
なお、経腸投与とは、肛門を介した投与には限られず、例えば胃瘻等の様に個体外からチューブ等を消化管に挿入して、それを経由した投与も含まれる。消化管を挿入する位置は腸に限らず、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸等を含む。）、大腸（盲腸、結腸、直腸等を含む。）等が挙げられる。
【0137】
なお、このような本発明に係る医薬組成物の投与は、上記の量を１日に１度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２～３週毎、毎月、隔月または２～３ヶ月毎でもよい。
【0138】
（経口又は経腸組成物）
本発明に係る経口又は経腸組成物は、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。この様な経口又は経腸組成物を使用することによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する疾患を治療することができる。
本発明に係る経口又は経腸組成物は、本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。この様な経口又は経腸組成物を使用することによって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する疾患を治療することができる。
【0139】
この様な経口又は経腸組成物における上記Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の配合割合は、特に限定はされず、経口又は経腸組成物の形態、用途等に応じて適宜調整すればよいが、通常は経口又は経腸組成物の総量に対して、０．００１～９９重量％程度とすればよい。
【0140】
本発明に係る経口又は経腸組成物の使用対象とする個体は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等が挙げられる。
【0141】
本発明に係る経口又は経腸組成物に含有されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体は、整腸組成物、腸内環境改善組成物、腸内環境最適化組成物、又は腸内腐敗防止組成物として特に有用である。
【0142】
本発明に係る経口又は経腸組成物の使用量は、上述のような経口又は経腸組成物の効果が発揮される範囲であれば、特に限定はされず、更に経口又は経腸組成物を摂取する個体の種類や、目的とする効果、その目的とする度合い、並びにその他の諸条件などに応じて設定すればよい。具体的には本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体の量に換算して、通常は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日程度とすればよく、これを１日１回～数回に分けて摂取してもよい。
【0143】
なお、経腸とは肛門を介した投与に限られない。例えば、本発明の経腸組成物を、公知の成分と共に配合して腸内洗浄液として使用することも可能である。
【0144】
本発明に係る経口又は経腸組成物は、腸内細菌の異常増殖及び／又は腸内細菌叢の病的変化を抑制する効果を発揮する本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体を含むものであり、このような効果を発揮することを期待して食品の分野、飼料の分野に好適に用いることができる。従って、本発明の経口又は経腸組成物は、食品組成物又は飼料組成物とすることができる。
【0145】
上述の食品組成物は、本発明の経口又は経腸組成物を食品の分野に専ら好適に用いる組成物である。このような食品組成物は、整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された食品組成物として提供することができる。
【0146】
上述の食品組成物としては、一般の食品の他、条件付き特定保健用食品を含む特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等を挙げることができる。
【0147】
上述の食品組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、乳飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺等の麺類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物、パン、シリアル等を例示できる。また、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、トローチ、タブレット、シロップ等の形態が挙げられる。
【0148】
上述の飼料組成物は、本発明の飼料組成物を飼料の分野に専ら用いられる組成物である。このような飼料組成物は、整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された食品組成物として提供することができる。
【0149】
上述の飼料組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば上述した本発明に係る飼料組成物が発揮する効果が損なわれない限りにおいて、通常の飼料に混合、又は必要に応じて通常の飼料に配合可能な成分と共に混合して飼料組成物とすればよく、飼料組成物そのものを飼料としてもよい。
【0150】
(疾患の治療方法)
本発明に係る疾患の治療方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患の治療方法であって、上述の本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本発明に係る医薬組成物、又は本発明に係る経口組成物の有効量を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患に罹患したヒトに投与する工程を含む方法である。
本発明に係る疾患の治療方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患の治療方法であって、上述の本発明に係るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌体と結合する抗体もしくはその抗原結合断片、本発明に係る医薬組成物、又は本発明に係る経口組成物の有効量を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患に罹患したヒトに投与する工程を含む方法である。
【0151】
上述のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する腸内疾患に罹患したヒトとは、上記〔本発明に係る医薬組成物〕にて説明した投与対象とすればよい。また、具体的な投与方法、投与量についても上記〔本発明に係る医薬組成物〕にて説明したものとすればよい。
【実施例】
【0152】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず本開示を限定するものではない。
【0153】
（方法と材料）
１．マウス
８－２５週齢のＣ５７ＢＬ／６、もしくはＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。これらをＳＰＦ飼育し、またはこれらのマウスにヒト腸内細菌叢を移植し、あるいは特定の病原菌を感染させた。
１．マウス
８－２５週齢のＣ５７ＢＬ／６、もしくはＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。これらをＳＰＦ飼育し、またはこれらのマウスにヒト腸内細菌叢を移植し、あるいは特定の病原菌を感染させた。
【0154】
実施例１：細菌に結合する抗体のスクリーニング
（１－１）小腸および大腸粘膜固有層細胞の分離
マウスを安楽死させた後、開腹し小腸全長を摘出した。摘出した小腸から結合組織とパイエル板を取り除いた後、小腸を縦切開し、小腸内容物をＰＢＳで洗浄した。次に、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ ５０ｍｌが満たされている１００ｍｌビーカーに洗浄した小腸を１ｃｍ程度の長さに切断して加えた。３７℃で２０分間振盪した後、ストレイナーに小腸断片を集め、ＥＤＴＡを含むＰＢＳを破棄した。５０ｍｌチューブに小腸断片を加え２０ｍｌのＰＢＳを加え１０秒間激しく振盪した後、再びストレイナーに小腸断片を集め、ＰＢＳを破棄した。この作業を２回繰り返し、小腸組織から小腸上皮細胞のみを取り除いた。次に、１００ｍｌビーカーに３７℃に温めた消化酵素液（１００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０、５ｍｌ ＦＣＳ（最終濃度５％）、５０μｌの２－メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、０．１５ｇのコラゲナーゼ、１ｍｌのジスパーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）（最終濃度０．５Ｕ／ｍｌ）にて調整）を５０ｍｌ加え、小腸組織をさらに細かく切り加え、３７℃で３０分間振盪した。その後１００ｍｌビーカーを静置し小腸組織を沈めた後、上清を新しい５０ｍｌチューブに移した。この消化酵素液を用いた消化工程を２０分間１回繰り返した。消化液を１，５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、上清を破棄した。沈殿物として得られた粘膜固有層細胞を２％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０で一回洗浄した後に、２ｍｌの２％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０に懸濁し氷上に保存した。２回目の消化工程の反応を行った上清についても同様の作業を行い１回目の細胞懸濁液と２回目の細胞懸濁液を合わせ、フィルターに通し組織片を取り除き、小腸（大腸）粘膜固有層細胞とした。
（１－１）小腸および大腸粘膜固有層細胞の分離
マウスを安楽死させた後、開腹し小腸全長を摘出した。摘出した小腸から結合組織とパイエル板を取り除いた後、小腸を縦切開し、小腸内容物をＰＢＳで洗浄した。次に、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ ５０ｍｌが満たされている１００ｍｌビーカーに洗浄した小腸を１ｃｍ程度の長さに切断して加えた。３７℃で２０分間振盪した後、ストレイナーに小腸断片を集め、ＥＤＴＡを含むＰＢＳを破棄した。５０ｍｌチューブに小腸断片を加え２０ｍｌのＰＢＳを加え１０秒間激しく振盪した後、再びストレイナーに小腸断片を集め、ＰＢＳを破棄した。この作業を２回繰り返し、小腸組織から小腸上皮細胞のみを取り除いた。次に、１００ｍｌビーカーに３７℃に温めた消化酵素液（１００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０、５ｍｌ ＦＣＳ（最終濃度５％）、５０μｌの２－メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、０．１５ｇのコラゲナーゼ、１ｍｌのジスパーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）（最終濃度０．５Ｕ／ｍｌ）にて調整）を５０ｍｌ加え、小腸組織をさらに細かく切り加え、３７℃で３０分間振盪した。その後１００ｍｌビーカーを静置し小腸組織を沈めた後、上清を新しい５０ｍｌチューブに移した。この消化酵素液を用いた消化工程を２０分間１回繰り返した。消化液を１，５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心し、上清を破棄した。沈殿物として得られた粘膜固有層細胞を２％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０で一回洗浄した後に、２ｍｌの２％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０に懸濁し氷上に保存した。２回目の消化工程の反応を行った上清についても同様の作業を行い１回目の細胞懸濁液と２回目の細胞懸濁液を合わせ、フィルターに通し組織片を取り除き、小腸（大腸）粘膜固有層細胞とした。
【0155】
（１－２）抗体産生ハイブリドーマの作製とクローニング
小腸（大腸）粘膜固有細胞もしくは脾臓細胞とマウスミエローマ細胞であるＮＳ１細胞を融合してハイブリドーマの作製を行った。細胞融合はＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ｋｉｔの試薬と手順に従って行った。得られたハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってメチルセルロース含有培地で増殖させ、クローンを肉眼でピックアップして、９６穴プレートでさらに各クローンを増殖させた。その後、クローニングしたハイブリドーマから凍結細胞ストックを作製すると同時に培養上清を取得した。上清中に含まれる抗体について、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により抗体のアイソタイプを確認し、その後に上清中に含まれる抗体の抗体価を測定し、各アイソタイプ抗体産生ハイブリドーマとして分離した。ＥＬＩＳＡで使用した抗体はプレートへのコーティングにＡｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、もしくはＡｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２μｇ／ｍｌ、検出用にＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、もしくは Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．５μｇ／ｍｌで使用した。コントロール抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＡκ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＥ－ＣＦ５９４ ｍｏｕｓｅ ＩｇＭκＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ）をそれぞれ使用した。測定は、ＴｒｉＳｔａｒ２ ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、ＯＤ４０５ ｎｍを測定した。以上の操作により、合計で５００以上のハイブリドーマクローンを取得した。
小腸（大腸）粘膜固有細胞もしくは脾臓細胞とマウスミエローマ細胞であるＮＳ１細胞を融合してハイブリドーマの作製を行った。細胞融合はＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ｋｉｔの試薬と手順に従って行った。得られたハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってメチルセルロース含有培地で増殖させ、クローンを肉眼でピックアップして、９６穴プレートでさらに各クローンを増殖させた。その後、クローニングしたハイブリドーマから凍結細胞ストックを作製すると同時に培養上清を取得した。上清中に含まれる抗体について、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により抗体のアイソタイプを確認し、その後に上清中に含まれる抗体の抗体価を測定し、各アイソタイプ抗体産生ハイブリドーマとして分離した。ＥＬＩＳＡで使用した抗体はプレートへのコーティングにＡｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、もしくはＡｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２μｇ／ｍｌ、検出用にＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、もしくは Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．５μｇ／ｍｌで使用した。コントロール抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＡκ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＥ－ＣＦ５９４ ｍｏｕｓｅ ＩｇＭκＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ）をそれぞれ使用した。測定は、ＴｒｉＳｔａｒ２ ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、ＯＤ４０５ ｎｍを測定した。以上の操作により、合計で５００以上のハイブリドーマクローンを取得した。
【0156】
（１－３）各腸内細菌に対するハイブリドーマＩｇＡ抗体の結合力の解析
各腸内細菌に結合する抗体をスクリーニングするために、各細菌に対するＥＬＩＳＡを行った。特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌に対して実施したスクリーニング法を記述する。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを３７℃嫌気培養（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉａ、８０％ Ｎ２、１０％ Ｈ２、１０％ ＣＯ２）を行い、遠心分離により集めた。０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３バッファーに細菌を懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。１％ ＢＳＡ添加ＰＢＳによるブロッキング後に、９６穴プレート中の各抗体培養上清を加え、室温で約１時間反応させた。その後、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳで洗浄し、各抗体アイソタイプに対応した２次検出抗体（上述）を加え反応後、Ａｌｋａｌｉ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔａｂｌｅｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して発色反応を行った。十分な反応のために、発色後のＥＬＩＳＡプレートを４度で一晩反応させ、ＴｒｉＳｔａｒ２ ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、ＯＤ４０５ｎｍを測定した。ＯＤ４０５ｎｍが２．０以上を示したクローンをＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に結合する抗体とした。
各腸内細菌に結合する抗体をスクリーニングするために、各細菌に対するＥＬＩＳＡを行った。特に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）菌に対して実施したスクリーニング法を記述する。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを３７℃嫌気培養（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉａ、８０％ Ｎ２、１０％ Ｈ２、１０％ ＣＯ２）を行い、遠心分離により集めた。０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３バッファーに細菌を懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。１％ ＢＳＡ添加ＰＢＳによるブロッキング後に、９６穴プレート中の各抗体培養上清を加え、室温で約１時間反応させた。その後、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳで洗浄し、各抗体アイソタイプに対応した２次検出抗体（上述）を加え反応後、Ａｌｋａｌｉ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔａｂｌｅｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して発色反応を行った。十分な反応のために、発色後のＥＬＩＳＡプレートを４度で一晩反応させ、ＴｒｉＳｔａｒ２ ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、ＯＤ４０５ｎｍを測定した。ＯＤ４０５ｎｍが２．０以上を示したクローンをＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に結合する抗体とした。
【0157】
選択されたクローンを拡大培養し（約１００ｍＬ培養）、培養液からＩｇＭとＩｇＡ抗体の場合はＰｒｏｔｅｉｎ Ｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、ＩｇＧ抗体の場合はＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて抗体を精製した。抗体の溶出は、１０ｍＭ クエン酸バッファー（ｐＨ２．５）を使用し、溶出液はすぐに１ Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ９．０）で中和し、その後にＡｍｉｃｏｎ（１００ｋＤａ）により濃縮後、透析膜（１００ｋＤａポアサイズ）に入れて透析を行い、ＰＢＳに置換した。透析後にクリーンベンチ内で抗体液を回収後、シリンジフィルター（０．２２μｍ）により抗体を滅菌し、４℃保存とした。抗体の濃度は上述と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡにより選択したクローンのＲＮＡを抽出し、抗体遺伝子全長をクローニングし、リコンビナント抗体の作製に用いた。
【0158】
（１－４）ハイブリドーマ由来抗体の抗体遺伝子全長のクローニング
各クローンの細胞からＩｓｏｇｅｎＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用しＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成し、抗体のＶＨ領域に対する７種類のプライマー（ＭＨ１－７）とＣα領域、Ｃγ領域もしくはＣγ領域特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。軽鎖に関してはＶκプライマーとＣκプライマーでＰＣＲを行った。プライマーの塩基配列は表１に示した。増幅されたＶＨ領域ＰＣＲ産物またはＶκ領域ＰＣＲ産物を直接シークエンスし、各クローンの可変領域遺伝子配列を取得した。これをＩｇ ｂｌａｓｔ で検索し、特定のＶＨもしくはＶκ遺伝子のさらに上流配列（シグナル配列を含む）を取得し、その最上流配列をもとにＰＣＲプライマーを作製し、各Ｃ領域分泌型配列の３’端のリバースプライマーとともにＰＣＲを実施し、Ｈ鎖とＬ鎖の全長遺伝子塩基配列を得た。これをもとにｐｃＤＮＡ ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＨ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖（データベースから塩基配列を検索しハイブリドーマのｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより遺伝子配列全長を取得）にクローニングした。
表 １． ハイブリドーマ由来抗体の抗体遺伝子可変領域増幅用プライマーの塩基配列
表中の塩基配列において、ＳはＧまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、ＷはＡまたはＴ、ＶはＧ、ＣまたはＡを表す。
上記の発現ベクターをＥｘｐｉ ＣＨＯＳ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＨ：Ｌ：Ｊ＝２：２：１の量比となるようにキットのプロトコルに従ってトランスフェクションを行った。（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）トランスフェクション後１０－１２日目に培養上清を回収し、上記と同様にＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにより抗体を精製、濃縮、ＰＢＳに透析で置換後にフィルター滅菌を行い、抗体価測定や活性試験に使用した。
各クローンの細胞からＩｓｏｇｅｎＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用しＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成し、抗体のＶＨ領域に対する７種類のプライマー（ＭＨ１－７）とＣα領域、Ｃγ領域もしくはＣγ領域特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。軽鎖に関してはＶκプライマーとＣκプライマーでＰＣＲを行った。プライマーの塩基配列は表１に示した。増幅されたＶＨ領域ＰＣＲ産物またはＶκ領域ＰＣＲ産物を直接シークエンスし、各クローンの可変領域遺伝子配列を取得した。これをＩｇ ｂｌａｓｔ で検索し、特定のＶＨもしくはＶκ遺伝子のさらに上流配列（シグナル配列を含む）を取得し、その最上流配列をもとにＰＣＲプライマーを作製し、各Ｃ領域分泌型配列の３’端のリバースプライマーとともにＰＣＲを実施し、Ｈ鎖とＬ鎖の全長遺伝子塩基配列を得た。これをもとにｐｃＤＮＡ ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＨ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖（データベースから塩基配列を検索しハイブリドーマのｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより遺伝子配列全長を取得）にクローニングした。
表中の塩基配列において、ＳはＧまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴ、ＷはＡまたはＴ、ＶはＧ、ＣまたはＡを表す。
上記の発現ベクターをＥｘｐｉ ＣＨＯＳ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＨ：Ｌ：Ｊ＝２：２：１の量比となるようにキットのプロトコルに従ってトランスフェクションを行った。（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）トランスフェクション後１０－１２日目に培養上清を回収し、上記と同様にＰｒｏｔｅｉｎＬカラムにより抗体を精製、濃縮、ＰＢＳに透析で置換後にフィルター滅菌を行い、抗体価測定や活性試験に使用した。
【0159】
実施例２：細菌増殖抑制試験
（材料と方法）
実施例１と同様の条件にて、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌を一晩３７℃で嫌気培養した。培養液を遠心分離し、細菌を集菌後、培養液で２回洗浄を行った。細菌液を培養液で１０倍に希釈後に、ＳＹＴＯ２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に含まれるＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓを加え、フローサイトメトリーによりＳＹＴＯ２４陽性の生細菌数をＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓとの比較から算出した。培養液で細菌１０，０００ ｃｅｌｌｓ／５μｌになるように希釈した。エッペンチューブに細菌希釈液５μｌ加え、さらにＰＢＳ（嫌気化済）、または精製した試験抗体（嫌気化済）を２５μｌ（抗体濃度 １ｍｇ／ｍｌ）加え、３７℃ １時間静置培養した。その後、培養液を３０μｌ加え、３７℃ ２０時間静置嫌気培養を行った（抗体最終濃度は０．４２ｍｇ／ｍｌ）。
２０時間培養後、上記と同様にＳＹＴＯ２４とＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓを加えてフローサイトメトリーにより生細菌数を測定した。ＰＢＳサンプル（抗体の添加なし）と比較して、生細菌数が３０％以下に減少した抗体を増殖抑制効果ありとして、次のマウス感染実験に使用した。
（材料と方法）
実施例１と同様の条件にて、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌を一晩３７℃で嫌気培養した。培養液を遠心分離し、細菌を集菌後、培養液で２回洗浄を行った。細菌液を培養液で１０倍に希釈後に、ＳＹＴＯ２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に含まれるＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓを加え、フローサイトメトリーによりＳＹＴＯ２４陽性の生細菌数をＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓとの比較から算出した。培養液で細菌１０，０００ ｃｅｌｌｓ／５μｌになるように希釈した。エッペンチューブに細菌希釈液５μｌ加え、さらにＰＢＳ（嫌気化済）、または精製した試験抗体（嫌気化済）を２５μｌ（抗体濃度 １ｍｇ／ｍｌ）加え、３７℃ １時間静置培養した。その後、培養液を３０μｌ加え、３７℃ ２０時間静置嫌気培養を行った（抗体最終濃度は０．４２ｍｇ／ｍｌ）。
２０時間培養後、上記と同様にＳＹＴＯ２４とＣｏｕｎｔｉｎｇ ｂｅａｄｓを加えてフローサイトメトリーにより生細菌数を測定した。ＰＢＳサンプル（抗体の添加なし）と比較して、生細菌数が３０％以下に減少した抗体を増殖抑制効果ありとして、次のマウス感染実験に使用した。
【0160】
抗体ＳＮＫ０００１ＭＲ、ＳＮＫ０００２ＭＲ、ＳＮＫ０００１ＡＲ、ＳＭＫ０００２ＡＲ、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００４、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１およびＳＮＫ０００３Ａの７種の抗体を増殖抑制試験に用いた。抗体ＳＮＫ０００１ＭＲとＳＮＫ０００２ＲはＩｇＭ産生ハイブリドーマ（ＳＮＫ０００１ＭとＳＮＫ０００２Ｍ） から抽出した抗体遺伝子配列情報をもとに得られた発現ベクター（Ｈ鎖とＬ鎖）をＣＨＯ細胞に遺伝子導入をして作製したリコンビナントＩｇＭ抗体である。ＳＮＫ０００３ＡはＩｇＡ産生ハイブリドーマ由来のＩｇＡ抗体である。ＳＮＫ０００１ＡＲとＳＮＫ０００２ＡＲはＳＮＫ０００１ＭとＳＮＫ０００２Ｍハイブリドーマ由来の抗体遺伝子可変領域の遺伝子配列とＩｇＡ抗体定常領域遺伝子配列を結合させた発現ベクターを作製し、さらにＪ鎖発現ベクターも構築して、ＣＨＯ細胞に３種の発現ベクター（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖）を遺伝子導入して作製したリコンビナント多量体ＩｇＡ抗体である。ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００４とＲＳ＿Ｈ００＿Ｌ００１は発明者がＷＯ２０１４／１４２０８４等で報告した、腸管粘膜固有層細胞から得られたＷ２７産生ハイブリドーマの産生するＷ２７抗体の遺伝子配列をもとに遺伝子を合成して、組み換え技術を適用して得たリコンビナント多量体ＩｇＡ抗体である。いずれのリコンビナント抗体も上述の方法でＰｒｏｔｅｉｎ Ｌカラムにより精製を行った。これらの抗体は実施例１と同様の試験により、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに結合することが確認されている。
【0161】
（結果）
結果を図１に示す。試験したいずれの抗体も、陰性対照（ＰＢＳ）に比して著明なＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ増殖抑制能を示した。
結果を図１に示す。試験したいずれの抗体も、陰性対照（ＰＢＳ）に比して著明なＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ増殖抑制能を示した。
【0162】
実施例３：Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌マウス感染実験
（材料と方法）
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株（ＶＰＩ１０４８３）は芽胞液を作製し小分けにして－８０度保存した。芽胞液を解凍して培養後にＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌選択培地プレート（ＴＣＣＦＡプレート）に播種して得られる生細菌数をあらかじめ求めた。
芽胞の作製方法は以下のようである。
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをＳＭＣ培地にプレーティングし、３７ ℃で７日間嫌気培養した。プレートに氷冷滅菌水３ ｍｌを加えて、セルスクレーパーでコロニーを掻き取り、５０ ｍｌチューブに移した。さらに氷冷滅菌水３ ｍｌでプレートを洗浄し、洗浄液も同じチューブへ移した。８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心した後に、上清を捨てて氷冷滅菌水２０ ｍｌで菌体を懸濁した。再び８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心後、上清を捨てて氷冷滅菌水１０ ｍｌで懸濁した。懸濁後、エタノール１０ ｍｌを加えてボルテックスで攪拌させて、室温で１時間静置した。８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心し、上清を捨てて氷冷滅菌水２０ ｍｌで菌体を懸濁した。この操作を２回繰り返し、上清を廃棄してから、氷冷滅菌水 ５ ｍｌで懸濁した。１．５ ｍｌチューブに１００ μｌずつ分注し、－８０℃で保存した。ＳＭＣ培地組成を以下に示す。
ＳＭＣ培地組成
上記試薬を滅菌蒸留水２００ ｍｌに溶解し、オートクレーブ滅菌した。６０ ℃くらいまで冷めたら、１０ ％（ｗ／ｖ）Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ６００ μｌを加え、１０ ｃｍプレートに適量ずつ分注した。
（材料と方法）
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株（ＶＰＩ１０４８３）は芽胞液を作製し小分けにして－８０度保存した。芽胞液を解凍して培養後にＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌選択培地プレート（ＴＣＣＦＡプレート）に播種して得られる生細菌数をあらかじめ求めた。
芽胞の作製方法は以下のようである。
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをＳＭＣ培地にプレーティングし、３７ ℃で７日間嫌気培養した。プレートに氷冷滅菌水３ ｍｌを加えて、セルスクレーパーでコロニーを掻き取り、５０ ｍｌチューブに移した。さらに氷冷滅菌水３ ｍｌでプレートを洗浄し、洗浄液も同じチューブへ移した。８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心した後に、上清を捨てて氷冷滅菌水２０ ｍｌで菌体を懸濁した。再び８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心後、上清を捨てて氷冷滅菌水１０ ｍｌで懸濁した。懸濁後、エタノール１０ ｍｌを加えてボルテックスで攪拌させて、室温で１時間静置した。８，０００ ｇ、４ ℃で１０分間遠心し、上清を捨てて氷冷滅菌水２０ ｍｌで菌体を懸濁した。この操作を２回繰り返し、上清を廃棄してから、氷冷滅菌水 ５ ｍｌで懸濁した。１．５ ｍｌチューブに１００ μｌずつ分注し、－８０℃で保存した。ＳＭＣ培地組成を以下に示す。
ＳＭＣ培地組成
【0163】
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌選択培地プレートは、下記表１の試薬を滅菌蒸留水４００ ｍｌに溶解し、オートクレーブ滅菌した。６０℃まで自然冷却させ、Ｃｙｃｌｏｓｅｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（５０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌとＣｅｆｏｘｉｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１．６ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、１０ｃｍプレートに適量ずつ分注して作成した。
【0164】
（表１）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ選択培地組成
【0165】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を日本クレアから購入し、感染実験用滅菌アイソレーター内で一週間馴化後、３種混合抗生剤（ゲンタマイシン：５００ｍｇ／ｋｇ、カナマイシン：１５０ｍｇ／ｋｇ、メトロニダゾール：５０ｍｇ／ｋｇ）を、ゾンデを用いて４日間経口投与を行った。４日後に各マウスの体重を測定し、抗生剤投与により体重減少が起こった個体は除外し、残りのマウスをランダムに群わけした。抗生剤投与終了の次の日に、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌芽胞（１Ｘ１０３ｃｆｕ）をゾンデで各マウスに経口感染させた。６時間後に試験抗体を１００μｇずつゾンデで経口投与を行った。その後、計７日間、１日一回１００μｇずつ抗体投与を行った。８日目以降は抗体投与を行わずに経過観察した。この間、マウスの体重測定、便の性状観察、便の採取を行った。感染後、４日目と１０日目に採取した便は重量に応じた量のＰＢＳを加えて懸濁し、その後にＰＢＳでさらに段階希釈を行った。これらの希釈細菌液をＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌選択培地プレートに播種し、嫌気培養を行い便１ｇ中の生菌数を求めた。
【0166】
（結果）
Ｗ２７Ｇ２またはＳＮＫ０００２Ｍ抗体を投与したマウス群では、陰性対照（ＰＢＳ投与群）に比して、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌芽胞液投与後の体重減少が抑制された（図２）。
また、便中のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ生菌について、４日目の便に十分な数の生菌数を観察したことから各マウスへの感染は成立していることが確認された。１０日目の便について、Ｗ２７Ｇ２抗体またはＳＮＫ０００２Ｍ抗体を投与したマウス群では生菌数が激減していたことから、これらの抗体により菌の増殖が有意に生体内でも抑制されたことが確認された（図３）。
Ｗ２７Ｇ２またはＳＮＫ０００２Ｍ抗体を投与したマウス群では、陰性対照（ＰＢＳ投与群）に比して、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌芽胞液投与後の体重減少が抑制された（図２）。
また、便中のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ生菌について、４日目の便に十分な数の生菌数を観察したことから各マウスへの感染は成立していることが確認された。１０日目の便について、Ｗ２７Ｇ２抗体またはＳＮＫ０００２Ｍ抗体を投与したマウス群では生菌数が激減していたことから、これらの抗体により菌の増殖が有意に生体内でも抑制されたことが確認された（図３）。
【0167】
実施例４：Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌以外の細菌に対する効果
上記Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に結合する抗体について、実施例１で用いたＥＬＩＳＡと同様の方法により、他の細菌に対する結合特性および当該細菌に対する効果を調べた。例として、大腸ガン原因菌と考えられているＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍに対する結合特性および効果を調べた結果を提示する。細菌を嫌気培養後、フローサイトメトリーを用いて菌数を１，０００ ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅにそろえて各試験抗体と反応させ、抗体による増殖抑制効果を検証した。加えた抗体の最終濃度と培養時間は実施例２と同様であった。抗体と菌を反応後、培養液を加えてさらに２０時間培養後に生菌数を測定した。
上記Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に結合する抗体について、実施例１で用いたＥＬＩＳＡと同様の方法により、他の細菌に対する結合特性および当該細菌に対する効果を調べた。例として、大腸ガン原因菌と考えられているＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍに対する結合特性および効果を調べた結果を提示する。細菌を嫌気培養後、フローサイトメトリーを用いて菌数を１，０００ ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅにそろえて各試験抗体と反応させ、抗体による増殖抑制効果を検証した。加えた抗体の最終濃度と培養時間は実施例２と同様であった。抗体と菌を反応後、培養液を加えてさらに２０時間培養後に生菌数を測定した。
【0168】
（結果）
抗体ＳＮＫ０００１Ｍ、ＳＮＫ０００１ＭＲ、ＳＮＫ０００１ＡＲ、ＳＮＫ０００２ＭＲ、ＳＮＫ０００２ＡＲ、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１、およびＳＮＫ０００３Ａは、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍに対して著明な増殖抑制効果を示した（図４）。一方で、ＳＮＫ０００４ＡやＳＮＫ０００５Ａは増殖抑制効果を示さなかった（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）。
抗体ＳＮＫ０００１Ｍ、ＳＮＫ０００１ＭＲ、ＳＮＫ０００１ＡＲ、ＳＮＫ０００２ＭＲ、ＳＮＫ０００２ＡＲ、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１、およびＳＮＫ０００３Ａは、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍに対して著明な増殖抑制効果を示した（図４）。一方で、ＳＮＫ０００４ＡやＳＮＫ０００５Ａは増殖抑制効果を示さなかった（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【0169】
実施例５：Ｗ２７抗体のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原分子の特定
Ｗ２７抗体は大腸菌のｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＨＭＴ）に結合することが確認されている（ＷＯ２０１４／１４２０８４等）、以下の方法により、Ｗ２７抗体が大腸菌のＳＨＭＴに結合することを確認するとともに、Ｗ２７抗体のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原分子を特定した。なお、Ｗ２７Ｇ２抗体はＷ２７抗体と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。
（材料と方法）
大腸菌を２５ｍｌのＬＢ培地で１６時間静置培養した。２，１５０ｇで５分間遠心して集菌した。上清を取り除いた後に、１ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（滅菌１×ＰＢＳ，１０％ ＮＰ－４０，×１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ））で懸濁して、超音波破砕後、氷上で３０分間静置した。細菌溶解液を新しいチューブに２００μｌずつ分注した後に２－ＭＥ ５０μｌ、１０％ ＳＤＳ ２００μｌを加えて変性（９５℃，１０ｍｉｎ）した。２－ＭＥとＳＤＳを希釈するために希釈液（滅菌１×ＰＢＳ，０．１％ ＮＰ－４０，×１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を８００μｌ加えた。タンパク質溶液を可溶性と不溶性分画に分離するため、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心を行なった。可溶性画分を使用して、２Ｄ－ＰＡＧＥを行なって標的タンパク質のスポットの同定を行なった。
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌についても同様の方法で細菌溶解液を調製し、可溶性画分を使用して、２Ｄ－ＰＡＧＥを行った。
Ｗ２７抗体は大腸菌のｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＨＭＴ）に結合することが確認されている（ＷＯ２０１４／１４２０８４等）、以下の方法により、Ｗ２７抗体が大腸菌のＳＨＭＴに結合することを確認するとともに、Ｗ２７抗体のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原分子を特定した。なお、Ｗ２７Ｇ２抗体はＷ２７抗体と同一の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。
（材料と方法）
大腸菌を２５ｍｌのＬＢ培地で１６時間静置培養した。２，１５０ｇで５分間遠心して集菌した。上清を取り除いた後に、１ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（滅菌１×ＰＢＳ，１０％ ＮＰ－４０，×１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ））で懸濁して、超音波破砕後、氷上で３０分間静置した。細菌溶解液を新しいチューブに２００μｌずつ分注した後に２－ＭＥ ５０μｌ、１０％ ＳＤＳ ２００μｌを加えて変性（９５℃，１０ｍｉｎ）した。２－ＭＥとＳＤＳを希釈するために希釈液（滅菌１×ＰＢＳ，０．１％ ＮＰ－４０，×１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を８００μｌ加えた。タンパク質溶液を可溶性と不溶性分画に分離するため、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心を行なった。可溶性画分を使用して、２Ｄ－ＰＡＧＥを行なって標的タンパク質のスポットの同定を行なった。
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌についても同様の方法で細菌溶解液を調製し、可溶性画分を使用して、２Ｄ－ＰＡＧＥを行った。
【0170】
２Ｄ－ＰＡＧＥの方法を以下に述べる。まず、２Ｄ－ＰＡＧＥのサンプルを作製するために、上記の免疫沈降産物の２倍量の冷却アセトンを加えて－２０℃で２０分間の静置後、遠心（１６，６３０ｇ，１０ｍｉｎ）により上清を取り除き乾燥させた。１次元目電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８），５Ｍ Ｕｒｅａ，１Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＣＨＡＰＳ，１％ ＮＰ－４０）に溶解し、１／１０量の１Ｍ Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅを加えてから室温で１０分間静置し、２Ｄ－ＰＡＧＥの１次元用サンプルとした。２次元目の泳動は、ウェスタンブロットと銀染色を行なうためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを２枚使用した。ｐＨ３～８ ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＴＭ ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１次元目電気泳動後、２次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥをした後にウェスタンブロットと銀染色をそれぞれのゲルに対して行なった。Ｗ２７抗体が認識するスポットを特定しやすくするために、ブロッティング後のメンブレンをＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎで染色し、メンブレン上のすべてのタンパク質の位置を確認した。この染色をＳｔａｉｎ Ｅｒａｓｅｒで消去後にＷ２７抗体を反応させてウェスタンブロットによるスポットを確認した。銀染色はシルベストステイン ワン（Ｎａｃａｌａｉ）を使用し、プロトコルに従った。この三種類（Ｗ２７によるウェスタンブロット、ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ、銀染色）の結果を比較してＷ２７抗体が特異的に認識しているスポットを切り出してゲル内酵素消化を行なった。
【0171】
ゲル内酵素消化の方法を以下に述べる。切り出したゲル片にＭｉｌｌｉＱ水を４００μｌ加えて１０分間振盪した後に上清を除いた。この操作を２回繰り返した後、１００％ アセトニトリル ２００μｌを加えて１０分間振盪した。上清を取り除いた後に減圧乾燥を２０分間行い、プロテアーゼ溶液（５０ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｃａｒｂｏｎａｔｅ，１０μｌ／ｍｌ Ｔｒｙｐｓｉｎ）を２０μｌ加えて、氷上で３０分間膨潤させることでゲル片にトリプシンを吸収させた。余分なプロテアーゼ溶液を取り除き、反応液（５０ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）を１００μｌ加えて、３７℃で一晩酵素消化を行なった。反応液に抽出液（５％ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ，５０％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）をさらに５０μｌ加えて３０分間振盪した。回収した溶液に０．１％ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄを２００μｌ加えて、サンプル量が半量程度になるまで減圧乾燥を行なった。サンプルをスピンフィルター（ＵｌｔｒａＦｒｅｅ ０．１μｍ ＰＶＤＦ）に移して遠心（２，４６０ｇ，５ｍｉｎ，４℃）した。下層に落ちた溶液をバイアルに移し変えてＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で解析を行なった。アミノ酸配列の同定はＭａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈを用いた。
【0172】
（結果）
上記の方法により、Ｗ２７抗体の抗原分子として大腸菌のＳＨＭＴ、およびＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の２，３－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ（ｉＰＧＭ）を特定した。一例として、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の抗原分子を特定した際の２次元電気泳動データを図５に示す。
上記の方法により、Ｗ２７抗体の抗原分子として大腸菌のＳＨＭＴ、およびＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の２，３－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ（ｉＰＧＭ）を特定した。一例として、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の抗原分子を特定した際の２次元電気泳動データを図５に示す。
【0173】
実施例６：Ｗ２７抗体の抗原分子のエピトープ決定
Ｗ２７抗体は大腸菌のＳＨＭＴのＮ末２５－３０アミノ酸にエピトープがあることが特定されている（論文発表済み）。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭに関してもトランケーションタンパクを作製しようと試みたが、タンパク発現の効率が著しく低下するためウェスタンブロット解析でＷ２７抗体の反応を確認することができなかった。
そこで、Ｗ２７抗体はＥ． ｃｏｌｉのｉＰＧＭを認識しないことをウェスタンブロットで確認し、Ｗ２７抗体が認識するＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭおよびＥ． ｃｏｌｉのｉＰＧＭのキメラタンパク質を発現するプラスミドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて作製した。データベース上の各細菌のｉＰＧＭ遺伝子配列情報からプライマーを作成した（表）。キメラタンパク質をＤＨ５αで過剰発現させ、Ｗ２７抗体の認識をウェスタンブロットで確認しエピトープ配列の場所を絞り込んだ。
Ｗ２７抗体は大腸菌のＳＨＭＴのＮ末２５－３０アミノ酸にエピトープがあることが特定されている（論文発表済み）。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭに関してもトランケーションタンパクを作製しようと試みたが、タンパク発現の効率が著しく低下するためウェスタンブロット解析でＷ２７抗体の反応を確認することができなかった。
そこで、Ｗ２７抗体はＥ． ｃｏｌｉのｉＰＧＭを認識しないことをウェスタンブロットで確認し、Ｗ２７抗体が認識するＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭおよびＥ． ｃｏｌｉのｉＰＧＭのキメラタンパク質を発現するプラスミドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて作製した。データベース上の各細菌のｉＰＧＭ遺伝子配列情報からプライマーを作成した（表）。キメラタンパク質をＤＨ５αで過剰発現させ、Ｗ２７抗体の認識をウェスタンブロットで確認しエピトープ配列の場所を絞り込んだ。
【0174】
表２：Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングに用いたプライマー塩基配列
【0175】
分析の結果、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｉＰＧＭでは、Ｃ末の４９０～５１０番目のアミノ酸がエピトープとして重要であった。エピトープであることをさらに確認するために各エピトープ候補を含むペプチド（ＢＳＡコンジュゲート）をＳＩＧＭＡに外注した。ペプチドだけでは分子量が小さいため、ウェスタンブロットで確認できるように各ペプチドにＢＳＡをコンジュゲートした。ペプチドに４×ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、Ｗ２７抗体によるウェスタンブロットを行ない、いずれの合成ペプチドに反応するのかを確認した。結果を図６および７に示す。
上記試験の結果、大腸菌のＳＨＭＴのエピトープ配列はＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳＥＮ、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ のエピトープ配列はＡＰＴＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥＥＭＴＧＨＳＬＩＳＫであることが判明した。
上記試験の結果、大腸菌のＳＨＭＴのエピトープ配列はＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳＥＮ、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ のエピトープ配列はＡＰＴＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥＥＭＴＧＨＳＬＩＳＫであることが判明した。
【0176】
Ｗ２７抗体が認識する大腸菌のＳＨＭＴのエピトープを共有する細菌をデータベース解析したところ、ＥＥＨＩ配列を持つ細菌はほとんどＰｒｏｔｅａｂａｃｔｅｒｉａに属する細菌であり、病原菌を多く含んでいた（図８）。乳酸菌やヒトのＳＨＭＴの同じ部分のアミノ酸配列は異なっており、この違いをＷ２７抗体は認識していると考えられた。（Ｏｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １，１６１０３，２０１６）
【0177】
実施例７：Ｗ２７抗体と抗原分子の結晶構造解析
（７－１）ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂの調製と精製
Ｗ２７抗体の抗原認識を調べるために、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞により発現させたＷ２７リコンビナントＩｇＧ抗体を作製した。これは、結晶構造解析に向けて抗原結合部位（Ｆａｂ）を大量に確保する必要があったためである。粗精製されたＩｇＧ Ｗ２７ を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍｌに調整した後、０．０５ｍｇ／ｍｌのパパイン（ナカライテスク）で、２０℃で２４時間消化してＦｃ領域とＦａｂ領域に消化した。その後、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いた 陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。Ｂｕｆｆｅｒは、１０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）（ｂｕｆｆｅｒ Ａ）と、１０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０），３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）を使って、ｂｕｆｆｅｒ Ｂ濃度を徐々に上昇させたリニアグラジエント溶出でＦａｂとＦｃを分離精製した。その後、Ｆａｂを多く含むフラクションは、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２０００ ｐｇゲルろ過カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製を行った。ゲルろ過のｂｕｆｆｅｒには５ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．５），１００ｍＭ ＮａＣｌ（ゲルろ過ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製の後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したカラムで微量のＦｃの夾雑を吸着させて除き、素通り画分にあるＦａｂを回収した。精製したＦａｂは、ゲルろ過ｂｕｆｆｅｒの条件でＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で４８．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮したあと、エッペンドルフチューブに２０μｌずつ分注して液体窒素で瞬間凍結させ、使用するまで－８０℃に保存した。収量は、５０ｍｇのＩｇＧ Ｗ２７から１７．４ｍｇのＦａｂを得た。
（７－１）ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂの調製と精製
Ｗ２７抗体の抗原認識を調べるために、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞により発現させたＷ２７リコンビナントＩｇＧ抗体を作製した。これは、結晶構造解析に向けて抗原結合部位（Ｆａｂ）を大量に確保する必要があったためである。粗精製されたＩｇＧ Ｗ２７ を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍｌに調整した後、０．０５ｍｇ／ｍｌのパパイン（ナカライテスク）で、２０℃で２４時間消化してＦｃ領域とＦａｂ領域に消化した。その後、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いた 陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した。Ｂｕｆｆｅｒは、１０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）（ｂｕｆｆｅｒ Ａ）と、１０ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０），３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）を使って、ｂｕｆｆｅｒ Ｂ濃度を徐々に上昇させたリニアグラジエント溶出でＦａｂとＦｃを分離精製した。その後、Ｆａｂを多く含むフラクションは、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２０００ ｐｇゲルろ過カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製を行った。ゲルろ過のｂｕｆｆｅｒには５ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．５），１００ｍＭ ＮａＣｌ（ゲルろ過ｂｕｆｆｅｒ）を使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製の後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したカラムで微量のＦｃの夾雑を吸着させて除き、素通り画分にあるＦａｂを回収した。精製したＦａｂは、ゲルろ過ｂｕｆｆｅｒの条件でＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で４８．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮したあと、エッペンドルフチューブに２０μｌずつ分注して液体窒素で瞬間凍結させ、使用するまで－８０℃に保存した。収量は、５０ｍｇのＩｇＧ Ｗ２７から１７．４ｍｇのＦａｂを得た。
【0178】
（７－２）Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）の発現と精製（結晶構造解析用）
Ｅ． ｃｏｌｉ由来ＳＨＭＴ（２５－４５）をコードするｃＤＮＡ領域をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて増幅した後、プラスミドｐＧＥＸ６Ｐ－３（Ｃｙｔｉｖａ）を改良したプラスミドｐＧＥＸＭ（Ｋｉｍ ＳＹ，ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｓｃｉ Ｒｅｐ １１（１）：２１２０）のＳｍａ ＩとＮｏｔＩマルチクローニングサイトにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で組み込んで発現プラスミドを構築した。作成した発現プラスミドを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２株（Ｍｅｒｃｋ）に形質転換した。なお、ＳＨＭＴ（２５－４５）はＧｕｌｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）融合タンパク質（以下、ＧＳＴ－ＳＨＭＴ（２５－４５）と記載する。）として発現した。また、ＧＳＴと目的タンパク質の間には、ヒトライノウイルス ３Ｃプロテアーゼ（以下、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ）による切断配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（切断部位はＱとＧの間である）が挿入されているので、発現させたＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴと目的タンパク質との間をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼで切り離すことができる。最終精製産物となるＥ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）のアミノ酸配列は、ＧＰＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳＥＮＹＴＳＰＲＶＭＱである。
Ｅ． ｃｏｌｉ由来ＳＨＭＴ（２５－４５）をコードするｃＤＮＡ領域をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて増幅した後、プラスミドｐＧＥＸ６Ｐ－３（Ｃｙｔｉｖａ）を改良したプラスミドｐＧＥＸＭ（Ｋｉｍ ＳＹ，ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｓｃｉ Ｒｅｐ １１（１）：２１２０）のＳｍａ ＩとＮｏｔＩマルチクローニングサイトにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で組み込んで発現プラスミドを構築した。作成した発現プラスミドを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２株（Ｍｅｒｃｋ）に形質転換した。なお、ＳＨＭＴ（２５－４５）はＧｕｌｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）融合タンパク質（以下、ＧＳＴ－ＳＨＭＴ（２５－４５）と記載する。）として発現した。また、ＧＳＴと目的タンパク質の間には、ヒトライノウイルス ３Ｃプロテアーゼ（以下、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ）による切断配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ（切断部位はＱとＧの間である）が挿入されているので、発現させたＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴと目的タンパク質との間をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼで切り離すことができる。最終精製産物となるＥ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）のアミノ酸配列は、ＧＰＲＱＥＥＨＩＥＬＩＡＳＥＮＹＴＳＰＲＶＭＱである。
【0179】
大腸菌は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、０．５％（Ｗ／Ｖ）グリセリン、０．０５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．２％（Ｗ／Ｖ）ラクトース、 １ｍＭ 硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地を使用して、３７°Ｃで培養を開始した。培地の濁度が０．６（波長６００ ｎｍで測定）に達した時、培地を冷却後、終濃度が０．１ｍＭとなるように１ Ｍ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（以下、ＩＰＴＧ）を加えて、目的タンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後、さらに１８°Ｃで２４時間培養を行った。培養液中の菌体は４，０００ ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２－Ｍ１ ＪＡ１０ ｒｏｔｏｒ）で、４°Ｃで２０分遠心して集菌した。集菌した菌体は精製に使用するまで－３０°Ｃで保存した。
【0180】
ＳＨＭＴの精製は、以下のようにして行った。菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌに懸濁して、４°Ｃで超音波破砕を行った後、４°Ｃ、２０，０００ ｒｐｍで４０分間、遠心を行った後、不溶性画分を除去して、上清の可溶性画分を次の精製に用いた。可溶性画分からのＧＳＴ－ＳＨＭＴ（２５－４５）の精製は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂（以下、ＧＳ４Ｂ）（Ｃｙｔｉｖａ）を使用したアフィニティーカラムを用いて行った。破砕後の可溶性画分を、ＧＳ４Ｂが充填されたアフィニティーカラムへ供して、ＧＳＴ－ＳＨＭＴ（２５－４５）を吸着後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ（以下、洗浄ｂｕｆｆｅｒ）で、十分にＧＳ４Ｂを洗浄した。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅでＧＳＴ－ＳＨＭＴ（２５－４５）を樹脂から溶出させた。溶出液に ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて４°Ｃで１８時間消化を行いＧＳＴとＳＨＭＴ（２５－４５）に切断し、ＧＳＴを除去した。このＳＨＭＴ（２５－４５）は、Ｎ末端にＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼの認識配列の一部を含むＧＰ配列が余分に付加される。ＧＳＴ切断後のＳＨＭＴ（２５－４５）は、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇゲル濾過カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、５ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌの条件でゲル濾過精製を行った。精製したＳＨＭＴ（２５－４５）は、５ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．５），１００ｍＭ ＮａＣｌ（ゲルろ過ｂｕｆｆｅｒ）の条件でＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ｗｉｔｈ １Ｋで４．７２ｍｇ／ｍｌまで濃縮したあと、エッペンドルフチューブに２０μｌに分注して液体窒素で瞬間凍結させ、使用するまで－８０℃に保存した。収量は、２Ｌ培養の菌体から結晶化に用いるＳＨＭＴ（２５－４５）５．９ｍｇのペプチドを得た。
【0181】
（７－３）Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）の発現と精製（結晶構造解析用）
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ 由来ｉＰＧＭ（４８６－５０９）（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９））のｃＤＮＡのｐＧＥＸベクターへのクローニングはＳＨＭＴとほぼ同様の手法で行った。この際、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）にはチロシンやトリプトファンが存在せず精製過程において２８０ｎｍの波長で吸光が観察できないため、Ｎ末端にチロシン１残基を付加してクローニングした。このｉＰＧＭ（４８６－５０９）は、Ｎ末端にＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼの認識配列の一部を含むＧＰＹ配列が余分に付加される。最終精製産物となるＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）のアミノ酸配列は、ＧＰＹＡＰＴＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥＥＭＴＧ ＨＳＬＩＳＫである。形質転換、培養、精製に関する手順はＳＨＭＴ（２５－４５）と同様に行い、４Ｌ培養の菌体から結晶化に用いるｉＰＧＭ（４８６－５０９）４８．５２ｍｇを得た。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ 由来ｉＰＧＭ（４８６－５０９）（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９））のｃＤＮＡのｐＧＥＸベクターへのクローニングはＳＨＭＴとほぼ同様の手法で行った。この際、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）にはチロシンやトリプトファンが存在せず精製過程において２８０ｎｍの波長で吸光が観察できないため、Ｎ末端にチロシン１残基を付加してクローニングした。このｉＰＧＭ（４８６－５０９）は、Ｎ末端にＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼの認識配列の一部を含むＧＰＹ配列が余分に付加される。最終精製産物となるＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）のアミノ酸配列は、ＧＰＹＡＰＴＶＬＤＭＭＫＬＥＫＰＥＥＭＴＧ ＨＳＬＩＳＫである。形質転換、培養、精製に関する手順はＳＨＭＴ（２５－４５）と同様に行い、４Ｌ培養の菌体から結晶化に用いるｉＰＧＭ（４８６－５０９）４８．５２ｍｇを得た。
【0182】
（７－４）ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）複合体の結晶化スクリーニング
精製したＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ ＦａｂとＥ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）を用いてモル比１：５（０．２ｍＭ：１．０ｍＭ）で混合液を作成して結晶化スクリーニングを行った。
結晶化条件のスクリーニングは、市販の結晶化スクリーニングキットであるＪＣＳＧ ｃｏｒｅ ｓｕｉｔｅ Ｉ－ＩＶ，ＰＡＣＴ ｓｕｉｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ）と結晶化ロボットｍｏｓｑｕｉｔｏ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて行った。結晶化プレート（ＶＩＯＬＡＭＯ）に平衡化用の沈殿剤を充填し、沈殿剤とタンパク質溶液１：１の体積比（０．２μｌ：０．２μｌ）で混合した液滴（ドロップ）を作成して、シッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の探索をした。結晶化スクリーニングに使用したタンパク質溶液は、あらかじめ遠心分離で不溶性画分を取り除いたものを使用した。温度条件は４℃と２０℃でインキュベートした。
精製したＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ ＦａｂとＥ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）を用いてモル比１：５（０．２ｍＭ：１．０ｍＭ）で混合液を作成して結晶化スクリーニングを行った。
結晶化条件のスクリーニングは、市販の結晶化スクリーニングキットであるＪＣＳＧ ｃｏｒｅ ｓｕｉｔｅ Ｉ－ＩＶ，ＰＡＣＴ ｓｕｉｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ）と結晶化ロボットｍｏｓｑｕｉｔｏ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて行った。結晶化プレート（ＶＩＯＬＡＭＯ）に平衡化用の沈殿剤を充填し、沈殿剤とタンパク質溶液１：１の体積比（０．２μｌ：０．２μｌ）で混合した液滴（ドロップ）を作成して、シッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の探索をした。結晶化スクリーニングに使用したタンパク質溶液は、あらかじめ遠心分離で不溶性画分を取り除いたものを使用した。温度条件は４℃と２０℃でインキュベートした。
【0183】
（７－５）ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）複合体の結晶化条件の最適化
結晶化スクリーニングによって得られた結晶の条件をもとにｐＨとＰＥＧの濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２％ ＰＥＧ１００００をリザーバー溶液とした。ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ：０．２ｍＭ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）：０．６ｍＭで混ぜたタンパク液とリザーバーを０．２μｌ：０．２μｌ、で混ぜた後、温度条件は２０℃、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で７日後に観察した。スケールバーは１００μｍを示す（図９）。
結晶化スクリーニングによって得られた結晶の条件をもとにｐＨとＰＥＧの濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２％ ＰＥＧ１００００をリザーバー溶液とした。ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ：０．２ｍＭ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）：０．６ｍＭで混ぜたタンパク液とリザーバーを０．２μｌ：０．２μｌ、で混ぜた後、温度条件は２０℃、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で７日後に観察した。スケールバーは１００μｍを示す（図９）。
【0184】
（７－６）ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）複合体のＸ線回折実験と三次元構造決定
上記の結晶化条件の最適化において得られたＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）複合体結晶は、０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２．０％ ＰＥＧ１００００，２０．０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌを抗凍結剤（クライオプロテクタント）として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ４４ＸＵにて測定を行った。取得した回折データをＸＤＳプログラムで処理した後、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はＰ２１２１２１、格子定数はａ＝６０．４Å，ｂ＝１４０．７Å，ｃ＝１８０．７Å，α＝９０°，β＝９０°，γ＝９０°、非対称単位中にＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）が３分子存在していた。構造の精密化は、プログラムｒｅｆｍａｃ ５、ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ、ｃｏｏｔを組み合わせて使用して行った、Ｒｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅはそれぞれ２２．８％、２５．７％で精密化を終了した。構造図はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。
上記の結晶化条件の最適化において得られたＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）複合体結晶は、０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２．０％ ＰＥＧ１００００，２０．０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌを抗凍結剤（クライオプロテクタント）として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ４４ＸＵにて測定を行った。取得した回折データをＸＤＳプログラムで処理した後、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はＰ２１２１２１、格子定数はａ＝６０．４Å，ｂ＝１４０．７Å，ｃ＝１８０．７Å，α＝９０°，β＝９０°，γ＝９０°、非対称単位中にＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）が３分子存在していた。構造の精密化は、プログラムｒｅｆｍａｃ ５、ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ、ｃｏｏｔを組み合わせて使用して行った、Ｒｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅはそれぞれ２２．８％、２５．７％で精密化を終了した。構造図はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。
【0185】
（７－７）ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）複合体の結晶化条件の最適化
ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂ Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）の結晶化は、構造解析されたＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）結晶化条件（０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２％ ＰＥＧ１００００）をもとにｐＨ，ＰＥＧ１００００の濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は０．２ Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１ Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．５，２３％ ＰＥＧ１００００をリザーバー溶液とした。ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ：０．２５ｍＭ、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）：１．０ｍＭで混ぜたタンパク液とリザーバーの混合比は０．２μｌ：０．２μｌ、温度条件は２０℃、スケールバーは１００μｍ、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で１０日後に観察した（図１０）。
ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂ Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）の結晶化は、構造解析されたＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂ－Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＨＭＴ（２５－４５）結晶化条件（０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．３，２２％ ＰＥＧ１００００）をもとにｐＨ，ＰＥＧ１００００の濃度をそれぞれ変化させた沈殿剤を調製して、シッティングドロップ蒸気拡散法で行った。
結晶化条件は０．２ Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１ Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．５，２３％ ＰＥＧ１００００をリザーバー溶液とした。ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ：０．２５ｍＭ、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）：１．０ｍＭで混ぜたタンパク液とリザーバーの混合比は０．２μｌ：０．２μｌ、温度条件は２０℃、スケールバーは１００μｍ、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化で１０日後に観察した（図１０）。
【0186】
（７－８）ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）複合体のＸ線回折実験と三次元構造決定
結晶化条件の最適化において得られたＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）複合体結晶は０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．５，２３．０％ ＰＥＧ１００００，２０．０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌを抗凍結剤（クライオプロテクタント）として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ４１ＸＵにて測定を行った。取得した回折データをＸＤＳプログラムで処理した後、ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はＰ２１２１２１、格子定数はａ＝６０．４２３Å，ｂ＝１４０．１８５Å，ｃ＝１８５．９５６Å，α＝９０°，β＝９０°，γ＝９０°、非対称単位中にＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）が３分子存在していた。構造の精密化は、プログラムｒｅｆｍａｃ ５、ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ、ｃｏｏｔを組み合わせて使用して行った、Ｒｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅはそれぞれ２２．２％、２５．２％で精密化を終了した。構造図はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。
結晶化条件の最適化において得られたＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）複合体結晶は０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ，０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｐＨ６．５，２３．０％ ＰＥＧ１００００，２０．０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌを抗凍結剤（クライオプロテクタント）として、液体窒素中で凍結した。その後、兵庫県の大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８のＢＬ４１ＸＵにて測定を行った。取得した回折データをＸＤＳプログラムで処理した後、ＩｇＧ Ｗ２７ Ｆａｂの構造情報を用いて分子置換法により位相決定を行った。空間群はＰ２１２１２１、格子定数はａ＝６０．４２３Å，ｂ＝１４０．１８５Å，ｃ＝１８５．９５６Å，α＝９０°，β＝９０°，γ＝９０°、非対称単位中にＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ Ｆａｂ－Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉＰＧＭ（４８６－５０９）が３分子存在していた。構造の精密化は、プログラムｒｅｆｍａｃ ５、ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ、ｃｏｏｔを組み合わせて使用して行った、Ｒｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅはそれぞれ２２．２％、２５．２％で精密化を終了した。構造図はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。
【0187】
以上の一連の実験の結果、エピトープペプチドとＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ０００ＧＲ抗体の相互作用の詳細が明らかとなった（図１１、１２）。
具体的には、ＳＨＭＴとｉＰＧＭのエピトープペプチドは、互いに逆向きに結合し、そのエピトープのアミノ酸配列は下記のような類似性を示していた。
これらの情報を元に、アミノ酸残基の種類だけでなく、アミノ酸側鎖が相互作用に及ぼす効果も判断可能となった。構造解析から得られたこれらの情報をもとに、抗原結合に影響を与えないアミノ酸変異を選んで、一連のＲＳ変異型抗体を作成したところ、下記に詳述するように、そのすべてがＷ２７Ｇ２抗体と同等の活性を保持することが明らかとなった。したがって、本発明の構造解析結果を用いて、Ｗ２７Ｇ２抗体と同等の活性を保持する様々なＲＳ変異型リコンビナント抗体の作成が可能となった。
具体的には、ＳＨＭＴとｉＰＧＭのエピトープペプチドは、互いに逆向きに結合し、そのエピトープのアミノ酸配列は下記のような類似性を示していた。
【0188】
実施例８：遺伝子改変リコンビナント抗体の作製
ＲＳ変異体作製はＨ鎖発現ベクターとＬ鎖ベクターを鋳型として、それぞれの変異に応じた塩基配列を含んだｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ベクター全長を増幅した。その後、鋳型ベクターＤＮＡをＤｐｎＩ処理後、イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを精製し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換を行った。得られたクローンからプラスミドを抽出し、目的の変異が導入されたクローンを選択し、ＥｘｐｉＣＨＯに遺伝子導入して変異型リコンビナント抗体を得た。
作成した変異型リコンビナント抗体の一部について、これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１３、１４に示す。
それぞれのＲＳ変異型リコンビナント精製抗体を非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシーブルー染色により、２量体が主に産生されていることを確認した（図１５）。
ＲＳ変異体作製はＨ鎖発現ベクターとＬ鎖ベクターを鋳型として、それぞれの変異に応じた塩基配列を含んだｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ベクター全長を増幅した。その後、鋳型ベクターＤＮＡをＤｐｎＩ処理後、イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを精製し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換を行った。得られたクローンからプラスミドを抽出し、目的の変異が導入されたクローンを選択し、ＥｘｐｉＣＨＯに遺伝子導入して変異型リコンビナント抗体を得た。
作成した変異型リコンビナント抗体の一部について、これらの重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１３、１４に示す。
それぞれのＲＳ変異型リコンビナント精製抗体を非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥとクマシーブルー染色により、２量体が主に産生されていることを確認した（図１５）。
【0189】
実施例９：リコンビナントＲＳ改変抗体の抗原認識活性
リコンビナントＲＳ改変抗体について、Ｗ２７Ｇ２抗体の抗原分子である大腸菌のｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＨＭＴ）に対する結合力をＥＬＩＳＡで測定した。
（材料と方法）
大腸菌の野生型ＳＨＭＴとＳＨＭＴｍｕｔａｎｔをＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌に過剰発現させたて精製した。これらを２μｇ／ｍｌとなるように０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３バッファーに懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートに固着させ、各変異型精製抗体の希釈系列を作製して加え、上記の細菌に対する結合力を測定するＥＬＩＳＡと同じ方法で結合力を検出した。
（結果）
代表例として６種（ＲＳ＿Ｈ００＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００２、ＲＳ＿Ｈ００＿Ｌ００５、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００５およびＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００４）の変異型精製抗体について試験したところ、これらの抗体はハイブリドーマ由来Ｗ２７Ｇ２抗体（ゲル濾過精製）とほぼ同程度に大腸菌野生型ＳＨＭＴに結合すること、さらにＳＨＭＴｍｕｔａｎｔには結合しないことが確認された（図１６）。
リコンビナントＲＳ改変抗体について、Ｗ２７Ｇ２抗体の抗原分子である大腸菌のｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＨＭＴ）に対する結合力をＥＬＩＳＡで測定した。
（材料と方法）
大腸菌の野生型ＳＨＭＴとＳＨＭＴｍｕｔａｎｔをＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌に過剰発現させたて精製した。これらを２μｇ／ｍｌとなるように０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３バッファーに懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートに固着させ、各変異型精製抗体の希釈系列を作製して加え、上記の細菌に対する結合力を測定するＥＬＩＳＡと同じ方法で結合力を検出した。
（結果）
代表例として６種（ＲＳ＿Ｈ００＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００２、ＲＳ＿Ｈ００＿Ｌ００５、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００５およびＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００４）の変異型精製抗体について試験したところ、これらの抗体はハイブリドーマ由来Ｗ２７Ｇ２抗体（ゲル濾過精製）とほぼ同程度に大腸菌野生型ＳＨＭＴに結合すること、さらにＳＨＭＴｍｕｔａｎｔには結合しないことが確認された（図１６）。
【0190】
Ｗ２７Ｇ２抗体は複数の細菌の異なる抗原分子を認識する抗体であることがわかっている。図１７に示すウエスタン解析が示すように、複数の細菌（病原菌を含む）から総タンパク質を抽出し、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後にニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。一次抗体として、Ｗ２７Ｇ２ＣＨＴ（Ｗ２７Ｇ２ハイブリドーマ培養上清をヒドロキシアパタイトカラムで粗精製）、Ｗ２７Ｇ２ＧＦ（Ｗ２７Ｇ２ＣＨＴをさらにゲル濾過カラムで多量体画分を精製）、３種のリコンビナント精製抗体（ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００５、ＲＳ＿Ｈ００７＿Ｌ００５）をそれぞれ２μｇ／ｍｌの濃度で反応させた。２次抗体はＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、さらに３次抗体としてＩＲ８００－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ＩｇＧ（ＬＩ－ＣＯＲ）を反応させ、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｓｃａｎｎｅｒでシグナルを検出した。各ウェルにロードしたサンプルのタンパク質量の測定のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ泳動後のゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ（Ｎａｃａｌａｉ）を使用し染色した。ハイブリドーマ由来Ｗ２７Ｇ２抗体とリコンビナント精製抗体は同じパターンの抗原分子を認識していることから、変異導入後の抗原認識に変化がないことを確認した。
【0191】
実施例１０：リコンビナント遺伝子改変抗体の大腸菌増殖抑制効果の確認
大腸菌ＢＷ３８０２９株をＬＢ培地で１６時間、３７℃静置嫌気培養した。８，０００ｇで５分間遠心を行って集菌した。滅菌嫌気ＬＢで洗浄後、フローサイトメーターで生菌数を計測した。
上記の測定結果をもとに細菌を３００個／５μｌとなるようにＬＢ培地で希釈し、各抗体またはＰＢＳを２５μｌ加え、さらにＭ９最小培地を３０μｌ加えて２０時間後にフローサイトメーターにより上記の方法で細菌数を計測した。抗体の最終濃度は０．４２ｍｇ／ｍｌとした。
大腸菌ＢＷ３８０２９株をＬＢ培地で１６時間、３７℃静置嫌気培養した。８，０００ｇで５分間遠心を行って集菌した。滅菌嫌気ＬＢで洗浄後、フローサイトメーターで生菌数を計測した。
上記の測定結果をもとに細菌を３００個／５μｌとなるようにＬＢ培地で希釈し、各抗体またはＰＢＳを２５μｌ加え、さらにＭ９最小培地を３０μｌ加えて２０時間後にフローサイトメーターにより上記の方法で細菌数を計測した。抗体の最終濃度は０．４２ｍｇ／ｍｌとした。
【0192】
（結果）
各種の変異型リコンビナント抗体はいずれも、陰性対照（ＰＢＳ添加）サンプルに比べて大腸菌の増殖を抑制した（図１８）。
各種の変異型リコンビナント抗体はいずれも、陰性対照（ＰＢＳ添加）サンプルに比べて大腸菌の増殖を抑制した（図１８）。
【0193】
以上のすべての実験から、上記３次元構造解析結果に基づいて作製したＲＳ変異型リコンビナント抗体は、元のハイブリドーマＷ２７Ｇ２抗体と同様の性質を保持することが明らかとなった。
【0194】
実施例１１：Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対するリコンビナントＩｇＡ抗体の効果
実施例３において、ハイブリドーマ由来の抗体のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対する効果を調べたが、リコンビナントＩｇＡ抗体についても、同様のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対する効果確認実験を行った。リコンビナントＩｇＡ抗体として、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（図１９においてｒＷ２７として示す）および抗体ＳＮＫ０００２ＡＲを用いた。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対して、リコンビナントＩｇＡ抗体、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（ｒＷ２７）およびＳＮＫ０００２ＡＲをそれぞれ投与したところ、両者ともＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスの体重減少を有意に抑制した（図１９）。興味深いことに、抗体の代わりにＶａｎｃｏｍｙｃｉｎが投与されたマウスは、投与中はまったく体重の減少が見られなかったものの、投与終了後に顕著な体重減少が見られ、生存率も低下した（図１９）。当該減少の原因の一つとして、グラム陽性細菌が感受性を示すＶａｎｃｏｍｙｃｉｎの投与により、グラム陰性細菌が選択的に腸管内で増加してｄｙｓｂｉｏｓｉｓの状態が起こり、Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与中止後に残存していたＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が増殖して上記の病態を示した可能性が考えられた。
実施例３において、ハイブリドーマ由来の抗体のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対する効果を調べたが、リコンビナントＩｇＡ抗体についても、同様のＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対する効果確認実験を行った。リコンビナントＩｇＡ抗体として、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（図１９においてｒＷ２７として示す）および抗体ＳＮＫ０００２ＡＲを用いた。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスに対して、リコンビナントＩｇＡ抗体、抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（ｒＷ２７）およびＳＮＫ０００２ＡＲをそれぞれ投与したところ、両者ともＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染マウスの体重減少を有意に抑制した（図１９）。興味深いことに、抗体の代わりにＶａｎｃｏｍｙｃｉｎが投与されたマウスは、投与中はまったく体重の減少が見られなかったものの、投与終了後に顕著な体重減少が見られ、生存率も低下した（図１９）。当該減少の原因の一つとして、グラム陽性細菌が感受性を示すＶａｎｃｏｍｙｃｉｎの投与により、グラム陰性細菌が選択的に腸管内で増加してｄｙｓｂｉｏｓｉｓの状態が起こり、Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与中止後に残存していたＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が増殖して上記の病態を示した可能性が考えられた。
【0195】
Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の増殖状態を確認するために、投与後の各時点における便の懸濁希釈液をＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ選択培地に播種し、嫌気培養を行い、コロニーを計測した。その結果、図２０に示すように、予想どおり、Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与マウスでは投与中止後のＤａｙ１４にＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが増加していた。一方で、２種のＩｇＡ抗体をそれぞれ投与したマウスではＤａｙ１４では便中にＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは検出されず、Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ排除に成功したことが確認された。
【0196】
次に、実際にＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与によりｄｙｓｂｉｏｓｉｓが生じたかどうかを１６Ｓ ｒＲＮＡ解析で検討した。途中で死亡したマウスは死亡時に便を採取した。生存したマウスはＤａｙ１４の時点の便を採取して解析した。また、ｒＷ２７ ＩｇＧ抗体も作製してマウスに投与し、菌叢を比較した。その結果を図２１と図２２に示す。図２１はｏｒｄｅｒ ｌｅｖｅｌの相対的存在比率の解析結果である。本解析では、対照としてリコンビナントＩｇＧ抗体ｒＷ２７ ＩｇＧ抗体（重鎖Ｈ０００および軽鎖Ｌ００１の可変領域の配列とマウスのＩｇＧ１およびマウスのＩｇｋ（ｋａｐｐａ）の配列を繋いだリコンビナントＩｇＧ抗体）を投与した結果得られたデータも解析に加えた。
【0197】
一番大きな変化はｒＷ２７ ＩｇＧ抗体とＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与群ではＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓがかなり増加していることである。上述のようにＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ投与により、グラム陰性菌が増加したと考えられる。それに対して、抗体投与なし、あるいは２種のリコンビナントＩｇＡ抗体をそれぞれ投与した群では大きな細菌叢変化はなく、もともとの優位菌種であるＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｌｅｓが優位の菌叢が維持されていた。この変化をβ－ｄｉｖｅｒｓｉｔｙで示した結果が図２２である。ＶａｎｃｏｍｙｃｉｎとｒＷ２７ＩｇＧ群はＰＢＳ、リコンビナントＩｇＡ抗体ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１（ｒＷ２７）およびＳＮＫ０００２ＡＲ群と比較して、明確に菌叢が変化していることがわかる。ヒトのＣ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ腸炎の第一選択薬であるＶａｎｃｏｍｙｃｉｎは症状緩和に有効であることは明白であるが、このようにｄｙｓｂｉｏｓｉｓの原因にもなり、それによって腸炎を繰り返す可能性が考えられる。Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ腸炎へのＩｇＡ抗体とＶａｎｃｏｍｙｃｉｎの併用療法は、根治療法となることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【0198】
本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に結合し、その増殖を抑制する抗体を提供することにより、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に関連する疾患の治療に利用される他、生体試料などにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌を検出するための試験などにも利用することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】