特許 7411832 抗ＴＧＦベータ抗体およびそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-12-27

(45)【発行日】2024-01-11

(54)【発明の名称】抗ＴＧＦベータ抗体およびそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231228BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231228BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20231228BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231228BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/22

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P43/00 111

A61P1/04

A61P1/16

A61P13/02

A61P13/12

A61P25/00

A61P37/04

【請求項の数】 11

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023003484

(22)【出願日】2023-01-13

(62)【分割の表示】P 2019539214の分割

【原出願日】2018-01-19

(65)【公開番号】P2023052376

(43)【公開日】2023-04-11

【審査請求日】2023-01-13

(31)【優先権主張番号】62/448,800

(32)【優先日】2017-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17305061.8

(32)【優先日】2017-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ゲイリー・シャピロ

(72)【発明者】

【氏名】ケビン・ブローワー

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・フィン

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・シー・グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】ラオ・コドゥリ

(72)【発明者】

【氏名】フェン・リウ

(72)【発明者】

【氏名】ナタリア・マリコフ

(72)【発明者】

【氏名】パーミンンダー・マンクゥ

(72)【発明者】

【氏名】ジャック・アール・ポラード

(72)【発明者】

【氏名】ファーウェイ・チウ

(72)【発明者】

【氏名】ヨアヒム・タイルハーバー

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・ウィンター

(72)【発明者】

【氏名】マルセラ・ユー

【審査官】上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１９０９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１４１２４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５１４２８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２８９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２８９３１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】CLINICAL IMMUNOLOGY，2001年02月，VOL:98, No:2，PAGE(S):164 - 174

【文献】Molecular Immunology，1993年，Vol.30, No.1，pp.105-108

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／２２

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および配列番号２における軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ヒトＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３に特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子であって、前記抗体は、２２８位（ＥＵナンバリング）にプロリンを有するヒトＩｇＧ_４定常領域を含む、前記単離された核酸分子。

【請求項2】

前記抗体は、配列番号１の１～１２０残基に相当する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列および配列番号２の１～１０８残基に相当する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項3】

前記抗体は、以下の：
ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）への分化を阻害する；
ｂ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｃ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のクラスタリングを増加させる；
ｄ）ＭＩＰ－２のレベルを増加させる；および
ｅ）ＫＣ／ＧＲＯのレベルを増加させる
特性の１つまたはそれ以上を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項4】

請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項5】

請求項１に記載の抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を含む、哺乳動物宿主細胞。

【請求項6】

ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で請求項５に記載の哺乳動物宿主細胞を培養する工程と、
培養から抗体を単離する工程と
を含む、抗体を産生する方法。

【請求項7】

モノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子であって、重鎖と軽鎖のアミノ酸
配列は、それぞれ、配列番号１および２を含む、前記単離された核酸分子。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項9】

請求項７に記載の抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を含む、哺乳動物宿主細胞。

【請求項10】

ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で請求項９に記載の哺乳動物宿主細胞を培養する工程と、
培養から抗体を単離する工程と
を含む、抗体を産生する方法。

【請求項11】

医薬組成物を産生する方法であって、
配列番号１における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および配列番号２における軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ヒトＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、２２８位（ＥＵナンバリング）にプロリンを有するヒトＩｇＧ_４定常領域を含む前記抗体を提供する工程と、
抗体を薬学的に許容される担体と混合する工程と
を含む前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、両方とも２０１７年１月２０日に出願した米国仮出願第６２／４４８，８００号および欧州出願第１７３０５０６１．８号の優先権を主張するものである。２つの優先権出願の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に出願され、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、配列表を含む。２０１８年１月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０１１＿ＳＬ.ｔｘｔと名付けられ、サイズは３０，４５８
バイトである。

【背景技術】

【0003】

トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、増殖、分化、生存、遊走、および上皮間葉転換を含む多くの重要な細胞の機能を制御するサイトカインである。それは、細胞外マトリックス形成、創傷治癒、胚発生、骨発生、造血、免疫および炎症応答、および悪性形質転換のような種々の生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦ－βの調節解除は、病的状態、例えば先天性欠損、がん、慢性炎症、ならびに自己免疫および線維性疾患をもたらす。

【0004】

ＴＧＦ－βは、公知の３つのアイソフォーム－ＴＧＦ－β１、２、および３がある。３つのアイソフォーム全てが、最初に前駆ペプチドとして転写される。切断後、成熟Ｃ末端はＮ末端と結合したままであり（潜在関連ペプチドまたはＬＡＰと呼ばれる）、細胞から分泌される小さい潜在型複合体（ＳＬＣ）を形成する。ＳＬＣがＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合できないために、受容体エンゲージメントが妨げられる。Ｎ－およびＣ－末端の解離による活性化は、タンパク質切断、酸性ｐＨ、またはインテグリン構造変化（非特許文献１）を含む、いくつかのメカニズムの１つによって生じる。

【0005】

ＴＧＦ－β１、２および３は、その機能が多面的であり、細胞および組織型にわたって異なるパターンで発現される。それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が類似しているが、特定の細胞型における個々のノックアウトは、それらが同じ受容体に結合する能力を共有するにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏでの同一ではない役割を示唆する（非特許文献２）。ＴＧＦ－βがＴＧＦβＲＩＩに結合すると、受容体の構成的なキナーゼ活性は、ＴＧＦ－βＲＩをリン酸化および活性化し、ＳＭＡＤ２／３をリン酸化し、ＳＭＡＤ４への結合、核への局在、およびＴＧＦ－β応答遺伝子の転写を可能にする。同文献。この古典的シグナル伝達カスケードに加えて、非古典的な経路は、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＪＵＮ、ＪＮＫ、およびＮＦ－κＢを含む他の因子を介してシグナルを伝達する。ＴＧＦ－βシグナル伝達もまた、ＷＮＴ、ヘッジホッグ、ノッチ、ＩＮＦ、ＴＮＦ、およびＲＡＳを含む他の経路によって調節される。したがって、ＴＧＦ－βシグナル伝達の最終結果は、細胞の状態および環境を統合するこれらのシグナル伝達経路の全てのクロストークである。同文献。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Connolly et al., Int J Biol Sci (2012) 8(7):964-78

【文献】Akhurst et al., Nat Rev Drug Discov (2012) 11(10):790-811

【文献】Bedinger et al., mAbs. (2016) 8(2):389-404

【文献】Larkin et al., N Engl J Med (2015) 373:23-34

【文献】Redman et al., BMC Med (2016) 14:20-30

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＴＧＦ－βの多様な機能を考慮すると、ヒト患者に安全な汎ＴＧＦ－β特異的治療抗体の必要性がある（非特許文献３）。しかしながら、ＴＧＦ－βは種間で高度に保存されている。結果として、マウスのような動物におけるヒトＴＧＦ－βに対する抗体の産生は困難な仕事である。

【0008】

現在有効な処置がない患者の医学的必要性もある。例えば、抗ＰＤ１抗体ニボルマブ単独治療によって処置される第ＩＩＩ相Ｃｈｅｃｋｍａｔｅ－０６７研究において、進行性メラノーマ患者の５０％より多くが治療への完全または部分的な応答を示さなかった（非特許文献４；非特許文献５）。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、ヒトＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３に特異的（すなわち、汎ＴＧＦ－β特異的）に結合する改善したモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、製造中にハーフ抗体（すなわち、重鎖１つおよび軽鎖１つを有する二量体複合体）を形成しにくい。それらはまた、半減期の延長のような優れた薬物動態プロファイルを示し、したがって患者に改善した臨床的有用性を与えることができる。本発明者らはまた、本発明の抗体および抗原結合断片によって引き起こされるようなＴＧＦ－β阻害が、腫瘍において免疫抑制微小環境を緩和し、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＤ－１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）および２（ＰＤ－Ｌ２）を標的化する治療のような免疫治療の効能を増強することを発見した。

【0010】

一態様では、本発明は、配列番号１における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および配列番号２における軽鎖ＣＤＲ１～３を含み、ヒトＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を提供し、ここで該抗体は２２８位（ＥＵナンバリング）に変異を有するヒトＩｇＧ_４定常領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、セリンからプロリンへの変異（Ｓ２２８Ｐ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１の１～１２０残基に相当する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列および配列番号２の１～１０８残基に相当する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む。本発明はまた、上記抗体のＦ（ａｂ’）_２抗原結合断片を特徴とする。

【0011】

好ましい実施形態では、本発明の抗体または断片は、フレソリムマブと比較すると、半減期の延長、暴露の増加、または両方を示す。例えば、増加は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％またはそれ以上の増加である。本発明の抗体または断片のような薬物の暴露は、時間に対する体内薬物の濃度の関数である。体内の薬物の濃度は、血液、血漿、または血清中の薬物のレベルによって示されることが多い。薬物の半減期およびエクスポージャー（バイオエクスポージャー（ｂｉｏ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ））は、以下の実施例７に示したように、周知の方法によって測定される。

【0012】

本発明は、本発明の抗体を含む組成物をさらに提供し、ここで該組成物は、１％より少ないハーフ抗体を含む。ハーフ抗体形成は、例えば、非還元条件下でのＳＤＳ－キャピラリー電気泳動または非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、続いてデンシトメトリー、またはＲＰ－ＨＰＬＣを使用することによる、モノクローナル抗体調製物の純度分析によって決定さ
れる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９９３） ３０（１）：１０５－８； Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７） ６：４０７－４１５； Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００１） ３８（１）：１－８； ａｎｄ Ｓｏｌａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ （２００６） ７８：６５８３－９４）。いくつかの実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含む医薬組成物である。

【0013】

別の態様では、本発明は、治療量の本発明の抗体または断片を患者に投与する工程を含む、それを必要としている患者（ヒト）においてＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、免疫介在性疾患（例えば、強皮症）、線維性状態（例えば、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）のような腎臓の線維性状態、または突発性肺線維症のような肺の線維性状態）または先天性もしくは骨欠損（例えば、骨形成不全症）を有する。いくつかの実施形態では、患者はがんを有する。いくつかの実施形態では、本方法で使用した抗体または断片は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）への分化を阻害する。抗体または断片は、免疫抑制腫瘍微小環境を緩和し得る。抗体または断片のこの作用は、免疫システムの活性化および免疫治療の効能の増強を助ける。本明細書に記載の処置方法の効能は、例えば、患者において（例えば、患者の腫瘍組織において）以下の１つまたはそれ以上によって示される：（１）ＭＩＰ２および／またはＫＣ／ＧＲＯレベルの増加、（２）ＩＮＦ－γ－陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のようなＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化または腫瘍組織への浸潤、および（３）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のクラスタリングにおける増加。

【0014】

本発明は、（１）治療有効量の本発明の抗体または断片、および（２）治療有効量の免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を患者に投与する工程を含む、患者（ヒト）においてがんを処置する方法をさらに提供する。これら２つの薬剤は、同時に（例えば、単一組成物中または別々の組成物中で）、またはいずれかの順序で順に投与される。２つの薬剤は、例えば、同じ日に投与される。いくつかの実施形態では、治療剤（１）は治療剤（２）の前（例えば１日または数日前）に患者に投与される。

【0015】

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２である。さらなる実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である。さらなる実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、（１）配列番号５における重鎖ＣＤＲ１～３および配列番号６における軽鎖ＣＤＲ１～３、（２）配列番号５の１～１１７残基に相当するＶ_Ｈアミノ酸配列および配列番号６の１～１０７残基に相当するＶ_Ｌアミノ酸配列、または（３）配列番号５に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号６に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む。特定の一実施形態では、本方法は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＧＦ－β抗体、ならびに配列番号５に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号６に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＰＤ－１抗体をがん患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１抗体単独治療に難治性である。患者は進行性もしくは転移性のメラノーマ、または有棘細胞癌を有し得る。

【0016】

いくつかのレジメンでは、抗ＴＧＦ－β抗体および抗ＰＤ－１抗体は、患者に２週間毎または３週間毎に投与される。いくつかのレジメンでは、２つの薬剤はそれぞれ、用量０．０１～４０（例えば、０．０２～２０、０．０５～１５、または０．０５～２０）ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。

【0017】

本発明はまた、免疫チェックポイント阻害剤および本発明の抗体または断片を患者に投与する工程を含む、それを必要としている患者において免疫応答を増大する方法も提供す
る。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（１）配列番号５におけるＨＣＤＲ１～３および配列番号６におけるＬＣＤＲ１～３；（２）それぞれ、配列番号５の１～１１７残基および配列番号６の１～１０７残基に相当するＶＨおよびＶＬ；または（３）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含むもののような、抗ＰＤ－１抗体である。

【0018】

本発明の方法は、限定はされないが、メラノーマ（例えば、転移性または進行性）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、有棘細胞癌、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、尿路上皮がん、および腎臓がん（例えば、腎細胞癌）を含む、様々ながんの処置に使用される。いくつかの実施形態では、患者は、間葉系腫瘍または固形腫瘍の間葉系サブタイプを有する。そのような固形腫瘍の例としては、大腸（例えば、結腸直腸がん）、卵巣、頭頚部（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、肝臓（例えば、肝細胞癌）、および尿路上皮システムにおけるものが挙げられる。

【0019】

いくつかの実施形態では、間葉系腫瘍を含むがんは、ＡＣＴＡ２（平滑筋α２アクチン）、ＶＩＭ（ビメンチン）、ＭＧＰ（マトリックスＧｌａタンパク質）、ＺＷＩＮＴ（ＺＷ１０相互作用動原体タンパク質）、およびＺＥＢ２（ジンクフィンガーＥ－ｂｏｘ結合ホメオボックス２）の１つまたはそれ以上の過剰発現により特徴づけられる。そのようなバイオマーカーの発現レベルは、例えば、腫瘍生検または循環腫瘍細胞のような患者からの生体サンプルにおけるｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで決定される。

【0020】

本発明はまた、本明細書に記載の状態の処置における使用のための上述の抗体、断片、または組成物ならびに、本明細書に記載の状態の処置のための薬剤の製造における上述の抗体、断片、または組成物の使用も提供する。

【0021】

本発明の抗体の重もしくは軽鎖、または両方をコードする核酸発現ベクター；抗体の重鎖および軽鎖コード配列を含む宿主細胞：ならびに適切な培養培地中で宿主細胞を培養し、抗体遺伝子を発現し、次いで抗体を回収する工程を含む宿主細胞を使用する抗体を作製する方法も本発明に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】ヒトＴＧＦ－β１（Ａ）、ヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）、ヒトＴＧＦ－β３（Ｃ）、マウスＴＧＦ－β１（Ｄ）、またはマウスＴＧＦ－β２（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌによって処置されたミンク肺（Ｍｖ １Ｌｕ）細胞の増殖におけるＡｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の効果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌである。

【図1B】ヒトＴＧＦ－β１（Ａ）、ヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）、ヒトＴＧＦ－β３（Ｃ）、マウスＴＧＦ－β１（Ｄ）、またはマウスＴＧＦ－β２（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌによって処置されたミンク肺（Ｍｖ １Ｌｕ）細胞の増殖におけるＡｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の効果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌである。

【図1C】ヒトＴＧＦ－β１（Ａ）、ヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）、ヒトＴＧＦ－β３（Ｃ）、マウスＴＧＦ－β１（Ｄ）、またはマウスＴＧＦ－β２（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌによって処置されたミンク肺（Ｍｖ １Ｌｕ）細胞の増殖におけるＡｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の効果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌである。

【図1D】ヒトＴＧＦ－β１（Ａ）、ヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）、ヒトＴＧＦ－β３（Ｃ）、マウスＴＧＦ－β１（Ｄ）、またはマウスＴＧＦ－β２（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌによって処置されたミンク肺（Ｍｖ １Ｌｕ）細胞の増殖におけるＡｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の効果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌである。

【図1E】ヒトＴＧＦ－β１（Ａ）、ヒトＴＧＦ－β２（Ｂ）、ヒトＴＧＦ－β３（Ｃ）、マウスＴＧＦ－β１（Ｄ）、またはマウスＴＧＦ－β２（Ｅ）１ｎｇ／ｍｌによって処置されたミンク肺（Ｍｖ １Ｌｕ）細胞の増殖におけるＡｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の効果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌである。

【図2】ヒト誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）分化へのＡｂ１ ５０μｇ／ｍｌの効果を示す棒グラフである。Ｔ細胞に提供された刺激は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体プラスＩＬ－２であった。

【図3】ヒトＴＧＦ－β１ ２ｎｇ／ｍｌによって処置されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞培養におけるヒト誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）分化へのＡｂ１の効果を示す棒グラフである。Ｔ細胞に提供された刺激は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体プラスＩＬ－２であった。

【図4】Ｔ細胞刺激および抗ＰＤ－１処置後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＮＦＡＴｃ駆動ルシフェラーゼ発現へのＡｂ１（３０μｇ／ｍｌ）およびヒトＴＧＦ－β１（１８ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す棒グラフである。

【図5】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する示した処置群における中央絶対偏差（ＭＡＤ）による値腫瘍体積中央値を示すグラフである。ビヒクル：ＰＢＳ。「抗ＰＤ－１」：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ（以下の発明を実施するための形態を参照）。「Ａｂ１のアイソタイプコントロール」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。

【図6】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する示した処置の２７日目のベースラインからの腫瘍体積変化を示す散布図である。コントロール：ＰＢＳ。「抗ＰＤ－１ ＲＰＭ１１４ｍｌｇＧ１」：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7A】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7B】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7C】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7D】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7E】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図7F】Ｃ５７ＢＬ／６ ＭＣ３８大腸マウスモデルを使用する各示した処置群の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。グラフ中の各線は、１匹の動物を表す。「ｍｐｋ」：ｍｇ／ｋｇ。「Ａｂ１アイソタイプＣｔｒｌ」：抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ４。αＰＤ１：ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ。

【図8】ＬｏＶｏ腫瘍ライセートにおける活性なＴＧＦ－β１濃度へのＡｂ１の効果を示すグラフである。

【図9A】単回用量で５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体を与えられたラットの５つの群における経時的なＡｂ１およびフレソリムマブの血清中濃度を示すグラフである。群（Ｇｒ．）１～３は、フレソリムマブの３つの異なるバッチ（Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３）を与えられた。群４および５は、Ａｂ１の２つの異なるバッチ（Ｂ１およびＢ２）を与えられた。

【図9B】単回用量で１ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体を与えられたサルにおける経時的なＡｂ１およびフレソリムマブの血清中濃度を示すグラフである。

【図9C】用量あたり１ｍｇ／ｋｇのＡｂ１の５回の毎週用量または示した研究期間、投与あたり１ｍｇ／ｋｇのフレソリムマブの隔週投与を与えられたサルにおける経時的なＡｂ１およびフレソリムマブの血清中濃度を示すグラフである。

【図9D】単回用量で１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体を与えられたサルにおける経時的なＡｂ１およびフレソリムマブの血清中濃度を示すグラフである。

【図9E】用量あたり１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ１の５回の毎週用量または示した研究期間、投与あたり１０ｍｇ／ｋｇのフレソリムマブの隔週投与を与えられたサルにおける経時的なＡｂ１およびフレソリムマブの血清中濃度を示すグラフである。

【図10A】Ａｂ１（＋／－抗ＰＤ１）による処置後のＭＣ３８腫瘍におけるＴＧＦ－β１のレベルの変化を示すグラフである。

【図10B】Ａｂ１（＋／－抗ＰＤ１）による処置後のＭＣ３８腫瘍におけるＭＩＰ－２のレベルの変化を示すグラフである。

【図10C】Ａｂ１（＋／－抗ＰＤ１）による処置後のＭＣ３８腫瘍におけるＫＣ／ＧＲＯのレベルの変化を示すグラフである。

【図11A】ＣＤ８^ｐｏｓ細胞のＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色およびＩＦＮ－γ染色を定量するグラフである。

【図11B】Ａｂ１がＴＧＦβ処置したＣＤ８^＋Ｔ細胞において増殖とＩＦＮ－γ産生の両方を回復したことを示すグラフである。

【図12A】大腸がん、白血病、肺がん、リンパ腫、乳がん、メラノーマ、中皮腫、および腎がんの同系マウス腫瘍モデルの一覧にわたるＣＤ８^＋Ｔ細胞の相対的存在量（ｌｏｇ２変換）を示すグラフである。

【図12B】大腸がん、白血病、肺がん、リンパ腫、乳がん、メラノーマ、中皮腫、および腎がんの同系マウス腫瘍モデルの一覧にわたるＴＧＦβ経路の活性化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、先の公知の抗体よりもハーフ抗体を形成しにくく、体内でのより高い暴露のような優れた薬物動態プロファイルも有する、改善した汎ＴＧＦ－β特異的モノクローナル抗体を特徴とする。本抗体は、まとめて「Ａｂ１および関連抗体」と呼ばれ、これらは配列番号１における重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１～３および配列番号２における軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１～３を有し、ヒンジ領域の２２８残基（ＥＵナンバリング）がセリンからプロリンに変異しているヒトＩｇＧ_４定常領域を有する、共通の構造特徴を共有する。Ｐ２２８は、以下に示した配列番号１の配列において四角内およびボールド体である。

【0024】

抗体Ａｂ１は、非グリコシル化の場合、推定分子量１４４ＫＤである。その重および軽鎖アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および２である。これら２つの配列を以下に示す。可変ドメインはイタリック体である。ＣＤＲは四角内に示す。重鎖の定常ドメイン内のグリコシル化部位はボールド体である（Ｎ２９７）。

【0025】

【化1】

【0026】

いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦ－β抗体のような本発明の抗体は、重鎖にＣ末端リジンを持たない。Ｃ末端リジンは、製造中に、または組換え技術により取り除かれる（すなわち、重鎖のコード配列はＣ末端リジンのコドンを含まない）。したがって、Ｃ末端リジンのない配列番号１の重鎖アミノ酸配列を含む抗体も本発明内で考慮する。

【0027】

Ａｂ１および関連抗体は、ヒトＴＧＦ－β１、－β２、および－β３に特異的に結合する。「特異的に」により、本発明者らは、結合が、例えば、表面プラズモン共鳴（例えば、以下の実施例１を参照）またはＢｉｏ－Ｌａｙｅｒインターフェロメトリーによって決定される、１０^－８Ｍ（例えば、１～５ｎＭ）より小さいような、１０^－７Ｍより小さいＫ_Ｄを有することを意味する。Ａｂ１および関連抗体はまた、ミンク肺上皮細胞アッセイ（例えば、以下の実施例２を参照）でアッセイした場合に強いＴＧＦ－β中和能、またはＡ５４９細胞ＩＬ－１１誘導アッセイにおいて決定される約０．０５から１μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有し得る（例えば、その開示がその全体を参照によって本明細書に組み入れる、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８６４６９号の実施例６を参照）。

【0028】

Ａｂ１および関連抗体のこれらの抗原結合および中和特性は、先の抗ＴＧＦ－β抗体フレソリムマブ（国際公開第２００６／０８６４６９号に記載の生殖系ＩｇＧ_４ ＰＥＴ１０７３Ｇ１２抗体）に匹敵する。リーダー配列を含むフレソリムマブの重および軽鎖配列は、それぞれ配列番号３および４に示される。配列番号３に示されるように、フレソリムマブは、２２８位（ＥＵナンバリング、配列番号３において実際の２４７位に相当する）にプロリンを持たない。Ａｂ１および関連抗体は、フレソリムマブよりもいくつかの改善された特性を有する。

【0029】

製造中に、フレソリムマブは、非還元変性条件下で、多くて６～１８％のハーフ抗体を形成できる（すなわち、２つの軽鎖と複合体を形成した２つの重鎖を有する４量体よりも、１つの重鎖および１つの軽鎖を有する２量体）。対照的に、Ａｂ１は実質的に少ないハーフ抗体（＜１％）を産生する。したがって、Ａｂ１および関連抗体は、製造中により純粋な薬物製品を生じる。

【0030】

さらに、Ａｂ１および関連抗体は、フレソリムマブよりも改善した薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有することができる。それらは、フレソリムマブよりもずっと長い半減期および低い排出速度による線形ＰＫ挙動を有することができ、フレソリムマブよりもｉｎ ｖｉｖｏで約１．７倍高い暴露をもたらす。例えば、ラットにおいて、Ａｂ１は、フレソリムマブの４．３日と比較して平均７．１日の半減期、およびフレソリムマブの０．５１ｍｌ／ｈｒ／ｋｇと比較して０．３０ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの排出速度（ＣＬ）を有することが示されている（実施例７、以下）。カニクイザルにおいて、Ａｂ１は、フレソリムマブ
の４．５日と比較して平均１３日の半減期、およびフレソリムマブの０．６６ｍｌ／ｈｒ／ｋｇと比較して０．４０ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの排出速度（ＣＬ）を有することが示されている。同文献。これらの改善したＰＫ特性は、Ａｂ１および関連抗体が、フレソリムマブより少ない投与量および／または低頻度で患者に与えられ、同じまたはより良い臨床的効能を達成し、より少ない有害副作用および少ない抗薬物抗体反応を起こし、したがって、必要であればより長い期間の処置を可能にすることが示される。

【0031】

さらに、非ヒト霊長類におけるフレソリムマブの毒性研究中に、薬物暴露と貧血症のような有害事象との間の相関が観察された。しかしながら、等しいまたはより高い暴露でさえも、Ａｂ１により行われた同様の研究ではそのような事象は観察されなかった。

【0032】

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、Ａｂ１および関連抗体の重鎖における２２８残基の変異は安定性の増加ならびに改善したＰＫおよび毒性プロファイルをもたらすと仮定する。

【0033】

Ａｂ１および関連抗体の定常ドメインは、例えばＫａｂａｔ残基Ｌ２４８において（例えば、Ｌ２４８Ｅ変異を導入することにより）、必要に応じてさらに改変され、分子の何らかの望ましくないエフェクター機能を減らす。

【0034】

本明細書で使用する場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖（約５０～７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含む４量体タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）から構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される領域が散在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分される。各Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、以下の順にアミノ末端からカルボキシル末端に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。各領域へのアミノ酸の割り当ては、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003))；またはＫａｂａｔの定義、Sequences of Proteins of
Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991))；Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；またはChothia et al., Nature 342:878-883 (1989)に従う。

【0035】

用語「ヒト抗体」は、可変ドメインおよび定常領域配列がヒト配列由来である抗体を指す。用語はヒト遺伝子由来の配列を有する抗体を包含するが、それらの配列は改変され、例えば免疫原性を減少、親和性を増加、および安定性を増加させる。用語は非ヒト細胞において組換えによって産生された抗体を包含し、ヒト細胞では典型的ではないグリコシル化を付与し得る。

【0036】

用語「キメラ抗体」は、２つの異なる動物種からの配列を含む抗体を指す。例えば、キメラ抗体は、別の種（例えばヒト、ウサギ、またはラット）由来の抗体の定常領域に結合するマウス抗体（すなわち、ハイブリドーマ技術を使用して免疫したマウスから得た抗体のように、マウス抗体遺伝子によってコードされる抗体）のＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含むことができる。

【0037】

用語、抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を指す。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片はＦ（ａｂ’）_２断片であり、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である（Ｆａｂは、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価の抗体断片で
ある）。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片はまた、Ｃ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３ドメインも含み得る。

【0038】

本明細書に記載の抗体および抗原結合断片は単離される。用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」または「単離された抗体」は、その起源または派生の源によって、（１）その自然の状態でそれを伴う自然に関連する成分と関連しない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）自然には生じない、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体を指す。したがって、化学的に合成されたまたはそれが自然に生じる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その自然に関連する成分から「単離される」であろう。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって自然に関連する成分を実質的に含まないようにもされる。

【0039】

Ｉ．Ａｂ１および関連抗体の使用
ＴＧＦ－β受容体は免疫細胞上に広く発現され、自然および獲得免疫系の両方においてＴＧＦ－βの広範な効果をもたらす。ＴＧＦ－βは、多くの疾患状態、例えば、先天性欠損症、がん、慢性炎症、自己免疫、および線維性疾患と関連する。治療量のＡｂ１または関連抗体はこれらの状態の処置に使用される。「治療有効」量は、処置した状態の１つまたはそれ以上の兆候を緩和する本明細書に言及したＡｂ１、関連抗体、または別の治療剤の量を指す。この量は、処置される状態または患者に基づいて変わり、十分に確立された原理を使用して医療専門家によって決定される。

【0040】

いくつかの実施形態では、Ａｂ１または関連抗体は、４０、２０、または１５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下（１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍｇ／ｋｇのような）で投与される。いくつかのさらなる実施形態では、用量は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｍｇ／ｋｇであってよい。投与頻度は、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、または５日毎、毎週、隔週、または３週間毎、毎月、または２月毎であってよい。抗体は、状態および製剤に適した、静脈内（例えば、０．５～８時間にわたる静脈点滴）、皮下、局所、または任意の他の投与経路によって投与される。

【0041】

Ａｂ１および関連抗体は、ヒト抗体遺伝子に由来し、したがってヒトにおいて低い免疫原性を有する。Ａｂ１の毒性研究は、以下の実施例８に詳述する。ラットにおいて、特定の心臓および肺への副作用が観察された。したがって、患者をＡｂ１または関連抗体によって処置する場合、患者は有害事象をモニターされる。

【0042】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体の効能は、患者において（例えば、患者の腫瘍組織のような患部組織において）、以下の１つまたはそれ以上によって示される：（１）ＴＧＦ－βのレベルまたは活性の減少、（２）ＭＩＰ２および／またはＫＣ／ＧＲＯレベルの増加、（３）ＩＮＦ－γ－陽性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のようなＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化または腫瘍組織への浸潤、および（４）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のクラスタリングの増加。

【0043】

Ａ．非腫瘍学的な疾患状態
Ａｂ１および関連抗体によって処置される状態としては、限定はされないが、骨欠損（例えば骨形成不全症）、糸球体腎炎、神経または皮膚の傷、肺または肺線維症（例えば、突発性肺線維症）、放射線誘発線維症、肝線維症、骨髄線維症、強皮症、免疫介在性疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、ベルガー病、および移植拒絶）、ならびにデュピュイトラン拘縮が挙げられる。

【0044】

それらはまた、限定はされないが、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、糖尿病性（Ｉ型およびＩＩ型）腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、びまん性全身性硬化症、先天性腎疾患（例えば、多発性嚢胞腎疾患、海綿腎、馬蹄腎）、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰化症、全身性または糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞を含む、腎不全の発生のリスクを処置、予防および減少させるためにも有用である。特に、限定はされないが：レニン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニスト（「ＡｎｇＩＩ受容体遮断薬」としても公知）、およびアルドステロンアンタゴニストを含む、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系のアンタゴニストと組み合わせた場合に有用である。例えば、その開示がその全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２００４／０９８６３７号を参照。

【0045】

Ａｂ１および関連抗体は、全身性硬化症、術後癒着、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障手術、角膜損傷、白内障、ペイロニー病、成人呼吸促拍症候群、肝硬変、心筋梗塞後瘢痕、血管形成術後の再狭窄、くも膜下出血後の瘢痕、椎弓切除後の線維症、腱および他の修復後の線維症、胆汁性肝硬変（硬化性胆管炎を含む）、心膜炎、肋膜炎、気管切開術、穿通性ＣＮＳ損傷、好酸球性筋肉痛症候群、血管再狭窄、静脈閉塞症、膵炎および乾癬性関節症のような、ＥＣＭの沈着に関連する疾患および状態の処置に有用である。

【0046】

Ａｂ１および関連抗体は、再上皮化の促進が有益である状態においてさらに有用である。そのような状態としては、限定はされないが、静脈性潰瘍、虚血性潰瘍（褥瘡）、糖尿病性潰瘍、移植部位、移植ドナー部位、擦過傷および熱傷のような皮膚の疾患、喘息、ＡＲＤＳのような気管支上皮の疾患、細胞傷害性処置に関連する粘膜炎、食道潰瘍（反射性疾患）、胃食道逆流症、胃潰瘍、小腸および大腸病変（炎症性腸疾患）のような腸管上皮の疾患が挙げられる。

【0047】

Ａｂ１および関連抗体のさらなる使用は、内皮細胞増殖が望ましい状態においてであり、例えば、アテローム性動脈硬化症の安定化、血管吻合の治癒の促進、または動脈疾患、再狭窄および喘息のような平滑筋細胞増殖の阻害が望ましい状態においてである。

【0048】

Ａｂ１および関連抗体はまた、リーシュマニア菌種、クルーズトリパノソーマ、結核菌およびらい菌、ならびにトキソプラズマ原虫、ヒストプラズマ・カプスラーツム菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプロ－シス、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスによって引き起こされるもののような、マクロファージ媒介感染への免疫応答の増強にも有用である。それらは、例えば、腫瘍、ＡＩＤＳまたは肉芽腫症によって引き起こされる免疫抑制を減らすのにも有用である。

【0049】

Ａｂ１および関連抗体はまた、緑内障および線維性帯切除術後の瘢痕のような眼科的な状態の予防および／または処置にも有用である。

【0050】

Ｂ．腫瘍学的な疾患状態
ＴＧＦ－βは、細胞増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、マトリックスリモデリング、血管新生、および免疫機能を含む、いくつかの生物学的プロセスを調節する。これらのプロセスのそれぞれが腫瘍進行に貢献する。適応症にわたるがん患者におけるＴＧＦ－βの広範な有害な役割も、腫瘍微小環境内でのならびに全身的なその上昇によって示唆されている。例えば、Kadam et al., Mol. Biomark. Diagn. (2013) 4(3)参照。研究は、悪性の状態で、ＴＧＦ－βがＥＭＴを誘導することができ、生じる間葉系の表現型は細胞の遊走および侵入の増加をもたらすことを示した。

【0051】

Ａｂ１および関連抗体は、限定はされないが、皮膚がん（例えば、切除不能なまたは転
移性のメラノーマを含むメラノーマ、有棘細胞癌および角化棘細胞腫）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、原発性腹膜がん、膀胱がん、腎がんまたは腎臓がん（例えば腎細胞癌）、尿路上皮癌、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、精巣がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、脳がん、神経膠芽腫、神経膠腫、中皮腫、白血病およびリンパ腫を含むがんのような、過剰増殖疾患の処置に有用である。

【0052】

いくつかの実施形態では、Ａｂ１および関連抗体は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療剤に基づく先の治療が失敗した、または失敗すると予想される患者、すなわち、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療に非応答者であるまたは非応答者であると予想される患者におけるがんの処置に有用である。いくつかの実施形態では、Ａｂ１および関連抗体は、先の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療から再発した患者におけるがんの処置に有用である。本明細書で使用する場合、用語「予想される」は、医学分野の当業者が、彼／彼女の一般的な医学知識および患者の特定の状態に基づき、治療を施すことなく、患者が応答者であるか非応答者であるか、および治療が失敗するかまたは有効でないかについて、予期できることを意味する。

【0053】

いくつかの実施形態では、がんは、限定はされないが、間葉系結腸直腸がん、間葉系卵巣がん、間葉系肺がん、間葉系頭部がんおよび間葉系頸部がんを含む、固形腫瘍の間葉系サブタイプである。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、上皮細胞遺伝子を下方調節し、間葉系遺伝子発現を増強することによって細胞の遊走および侵入特性を促進する。ＥＭＴは、腫瘍進行および侵入のホールマークである。結腸直腸および卵巣がんの４分の１までが間葉系である。したがって、ＴＧＦ－βの阻害およびＥＭＴのその誘導により、Ａｂ１または関連抗体は、間葉系固形腫瘍を処置するために使用される。いくつかの遺伝子マーカーおよび病理試験によって固形腫瘍の間葉系サブタイプが同定される。マーカーはＡＣＡＴ２、ＶＩＭ、ＭＧＰ、ＺＥＢ２、およびＺＷＩＮＴを含み、これはｑＲＴ－ＰＣＲまたは免疫組織化学によって検出される。そのようなマーカーは、抗ＴＧＦ－β単独治療または本発明の組み合わせ治療のための患者を選択するために使用される。

【0054】

いくつかの実施形態では、Ａｂ１および関連抗体は、進行した固形腫瘍を有する患者の処置に有用である。

【0055】

Ａｂ１および関連抗体は、造血障害または多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病、ならびにカポジ肉腫のような様々な肉腫のような悪性腫瘍の処置でも使用される。

【0056】

Ａｂ１および関連抗体は、シクロスポリン媒介悪性腫瘍またはがん進行（例えば、転移）の阻害にも有用である。

【0057】

がん治療の文脈では、「処置」は、がん増殖の減速、がん進行もしくは再発の遅延、またはがん転移の減少、ならびに患者の平均余命を延長するためのがんの部分緩解をもたらす任意の医療行為を含むことが、当然理解される。

【0058】

Ｃ．腫瘍学における組み合わせ治療
がんにおける細胞傷害性Ｔ細胞浸潤のレベルは、良好な臨床結果と関連付けられることが観察された（Fridman et al., Nat Rev Cancer (2012) 12(4):298-306; and Galon et al., Immunity (2013) 39(1):11-26）。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ_Ｈ１）を補助するヘルパーＴ細胞およびそれらが産生するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）は、同様に患者のポジティブな結果と関連付けられることが多い。これに対して、Ｔｒｅｇ細胞の存在は、患者の予後不良と関連付けられることが示された（Fridman、上記）。

【0059】

ＴＧＦ－βは、抗腫瘍免疫応答のほぼ全ての態様を抑制する。サイトカインは、ｉＴｒｅｇ分化を促進し、細胞傷害性（ＣＤ８^＋）細胞増殖および浸潤を減少させる。Ａｂ１または関連抗体によるＴＧＦ－βの阻害は、上記のように免疫抑制腫瘍微小環境を緩和し、がん患者にポジティブな結果をもたらす。

【0060】

さらに、本発明者らは、免疫抑制腫瘍微小環境を緩和することによって、Ａｂ１および関連抗体は、抗ＰＤ－１抗体のような、チェックポイント修飾薬が免疫応答をより誘導することを可能にすることができることを発見した。結果として、より多くの患者が、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２処置のような免疫治療から恩恵を受ける。

【0061】

免疫チェックポイント分子を標的化する治療剤有りまたは無しで、Ａｂ１および関連抗体はまた、化学治療（例えば、プラチナまたはタキソイドベースの治療）、放射線治療、およびがん抗原または発がん性駆動体を標的化する治療のような他のがん治療と併せても使用される。

【0062】

Ａｂ１または関連抗体、および抗ＰＤ－１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤を含む組み合わせによって処置されるがんは、上記の小節に列挙されるがんを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、進行性または転移性のメラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞癌、頭頚部扁平上皮癌、およびホジキンリンパ腫のように、がんは、先の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療に難治性である。難治性患者は、応答のいかなる証拠もない、処置開始の１２週間以内に例えば放射線学的に確認される、疾患が進行する患者である。

【0064】

いくつかの実施形態では、Ａｂ１または関連抗体は、抗ＰＤ－１治療のような別のがん治療と併せて使用され、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、肝細胞癌、および有棘細胞癌のような間葉系のがんを処置する。上記の考察も参照。

【0065】

抗ＰＤ－１抗体の例は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＭＥＤＩ０６０８（以前はＡＭＰ－５１４；例えば、国際公開第２０１２／１４５４９３号および米国特許第９，２０５，１４８号参照）、ＰＤＲ００１（例えば、国際公開第２０１５／１１２９００号参照）、ＰＦ－０６８０１５９１（例えば、国際公開第２０１６／０９２４１９号参照）およびＢＧＢ－Ａ３１７（例えば、国際公開第２０１５／０３５６０６号参照）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、国際公開第２０１５／１１２８００号に開示されるものを含む（ＰＣＴ公開の表１のＨ１Ｍ７７８９Ｎ、Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ、Ｈ１Ｍ７８００Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８８Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９１Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９４Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９６Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ９０１９Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０３４Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３７Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１１９Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２０Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ８９９２Ｐ、Ｈ４ｘＨ８９９９ＰおよびＨ４ｘＨ９００８Ｐと呼ばれるもの、およびＰＣＴ公開の表３のＨ４Ｈ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２、Ｈ４Ｈ９００８ＰおよびＨ４Ｈ９０４８Ｐ２と呼ばれるものなど）。国際公開第２０１５／１１２８００号の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【0066】

例えば、ＰＣＴ公開に開示されるＣＤＲ、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列、または重および軽鎖配列、ならびにＰＣＴ公開に開示される抗体と同じＰＤ－１エピトープに結合する抗体およ
び抗原結合断片を有する抗体および抗原結合断片を含む国際公開第２０１５／１１２８００号に開示の抗体および関連抗体は、本発明のＡｂ１または関連抗体と併せて使用され、がんを処置する。関連する実施形態では、有用な抗ＰＤ－１抗体は、それぞれ配列番号５および６として以下に示した重および軽鎖アミノ酸配列；配列番号５および６のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（イタリック体で示す）；または配列番号５および６の１つまたはそれ以上の（例えば、６個全て）ＣＤＲ（四角で示す）を含み得る。

【0067】

【化2】

【0068】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体のような本発明の抗体は、重鎖にＣ末端リジンを持たない。Ｃ末端リジンは、製造中に、または組換え技術により取り除かれる（すなわち、重鎖のコード配列は、Ｃ末端リジンのコドンを含まない）。したがって、Ｃ末端リジンのない配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含む抗体も本発明内で考慮される。

【0069】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＧＦ－β抗体または断片も、ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４のような免疫調節抗原に対する抗体と併せて使用される。例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＬＹ３３０００５４およびＢＭＳ－９３６５５９である。例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。

【0070】

Ｄ．処置の効能のバイオマーカー
Ａｂ１および関連抗体の効能は、バイオマーカーまたは標的占有率によって決定される。例えば、腫瘍組織において、標的占有率は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して、生検における活性なＴＧＦ－βのレベルを評価することによってアッセイされる。血液中で、ターゲットエンゲージメントは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球のような末梢血単核細胞上の循環ＴＧＦ－βの減少の効果を評価することによってアッセイされる。例えば、循環ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖の増加は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ４５^＋ＲＯ^＋ＣＣＲ７^＋ＣＤ２８^＋Ｋｉ６７^＋を使用して評価される。循環ＮＫ細胞の活性化は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ３^－ＣＤ５６^{ｈｉｇｈ／ｄｉｍ}ＣＤ１６^＋またはＣＤ１３７^＋を使用して評価される。さらに、Ｋｉ－６７、ＰＤ－１、およびＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化に関連するＰＤマーカーとして使用される。

【0071】

Ａｂ１または関連抗体による処置時の免疫調節は、例えば、ＮｅｏＧｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用するマルチプレックス免疫組織化学染色（ＩＨＣ）アッセイによる浸潤する免疫細胞および免疫マーカーの変化を評価することによってアッセイされる。特に、免疫マーカーのパネルのＮｅｏＧｅｎｏｍｉｃ’ｓ ＭｕｌｔｉＯｍｙｘ ＴＩＬ Ｐａｎｅｌ染色により、様々な免疫細胞の密度および局在の定量的な決定が可能になる。
免疫マーカーは、ｉＴｒｅｇの分化；ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤および増殖；ならびにＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの生成を示すことができる。Ａｂ１は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの分化を阻害し（例えば、下記の実施例３参照）、およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖およびそれらのＩＦＮγの生成を増加させる（混合リンパ球反応アッセイに示すように；データは示さず）ことが示された。したがって、Ａｂ１または関連抗体による処置の効能は、ｉＴｒｅｇの阻害、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖および腫瘍もしくは他の疾患組織への浸潤の誘導、ＩＦＮγ産生の増加、ならびに／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比の増加によって示される。Ａｂ１または関連抗体による処置時の免疫調節もまた、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、および他の免疫細胞のメチル化ＰＣＲベース定量的免疫細胞カウントによって末梢血においてアッセイされる。処置の効能は、腫瘍進行のような疾患進行における遅延または回復として臨床的に証明することができる。

【0072】

ＩＩ．抗体作製方法
Ａｂ１および関連抗体、ならびにＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のような他の共標的を標的化する抗体が、当技術分野で十分に確立された方法によって作製される。抗体の重および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子が転写および翻訳制御配列のような必要な発現制御配列に操作可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスのような植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列は、別々のベクターに挿入され、同じまたは異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。一実施形態では、両方のコード配列は同じ発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）に、別々の同じ発現制御配列（例えば、プロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。抗体コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的な制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。

【0073】

抗体鎖遺伝子に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有していてよい。哺乳動物宿主細胞発現の調節配列の例は、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのような）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーのような）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターのような強力な哺乳動物プロモーター由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。

【0074】

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子のようなさらなる配列を有し得る。例えば、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅によるｄｈｆｒ宿主細胞における使用のための）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸合成遺伝子を含み得る。

【0075】

本発明の抗体をコードする発現ベクターは、発現のため、宿主細胞に導入される。宿主細胞は、抗体の発現に好適な条件下で培養され、次いで回収および単離される。宿主細胞は、哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞を含む。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当技術分野で周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらは、特に、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞系を含む。細胞系は、それらの発現レベルに基づいて選択される。使用される他の細胞系は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞系である。

【0076】

さらに、抗体の発現は、多くの公知の技術を使用して増強される。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現システム（ＧＳシステム）は、特定の条件下で発現を増強する一般的な手法である。

【0077】

宿主細胞の組織培養培地は、ウシ血清アルブミンのような動物由来成分（ＡＤＣ）を含むまたは含まない。いくつかの実施形態では、無ＡＤＣ培養培地が、ヒトの安全性のために好ましい。組織培養は、フェドバッチ法、連続的灌流法、または宿主細胞および所望の収率に適した任意の他の方法を使用して実施される。

【0078】

ＩＩＩ．医薬組成物
本発明の抗体は、好適な保存安定性のために製剤化される。例えば、抗体は、薬学的に許容される賦形剤を使用する使用のために、凍結乾燥または保存または復元される。組み合わせ治療のため、２つまたはそれ以上の抗体のような治療剤は同時に処方され、例えば混合および単一組成物で提供される。

【0079】

用語「賦形剤」または「担体」は、本発明の化合物以外の任意の成分を記載するために本明細書で使用される。賦形剤の選択は、特定の投与の様式、可溶性および安定性への賦形剤の効果、ならびに投与剤形の性質のような因子に大きく依存する。「薬学的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性の、あらゆる溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。いくつかの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムのようなポリアルコールは組成物に含まれる。薬学的に許容される物質のさらなる例は、抗体の貯蔵寿命または有効性を増強する、湿潤剤または少量の湿潤剤または乳化剤のような補助剤、保存剤または緩衝材である。

【0080】

本発明の医薬組成物は、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として調製され、パッケージされ、またはバルクで販売される。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、前もって決めた量の活性成分を含む医薬組成物の個々の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の投与量または例えば、そのような投与量の２分の１または３分の１のような、このような投与量の便利な画分と等しい。

【0081】

本発明の医薬組成物は、典型的には非経口投与に好適である。本明細書で使用する場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理漂白および組織の漂白を介する医薬組成物の投与によって特徴づけられる任意の投与の経路を含み、したがって、通常血流への、筋肉への、または内蔵への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与は、限定はされないが、組成物の注射による、外科的切開による組成物の適用による、組織浸透非外科的創傷による組成物の適用による等、医薬組成物の投与を含む。特に、非経口投与は、限定はされないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、くも膜下腔、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、および関節滑液嚢内注射または注入；ならびに腎臓透析点滴技術を含むと考えられる。局所灌流も考えられる。好ましい実施形態は、静脈内および皮下経路を含む。

【0082】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、滅菌水または滅菌等張生理食塩水のような薬学的に許容される担体と組み合わせて活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製され、パッケージされ、または販売される。注射可能製剤は、アンプルまたは保存剤を含む複数用量容器のような、単位投与剤形で調製され、パッケージされ、または販売される。非経口投与の製剤は、限定はされないが、懸濁液、液剤、乳状液、油性または水性ビヒクル、ペースト等を含む。そのような製剤は、限定はされないが、懸濁、安定、または分散剤を含む１つまたはそれ以上の追加の成分をさらに含み得る。非経口投与のための製剤の一実施形態では、活性成分は、復元した組成物の非経口投与の前に好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロゲンフリー水）によって復元するための乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供される。非経口製剤はまた、塩、炭水化物および緩衝剤（例えば、ｐＨ３から９）のような賦形剤を含有し得る水溶液も含むが、いくつかの適用では、それらは、滅菌、パイロゲンフリー水のような好適なビヒクルと併せて使用される滅菌非水溶液としてまたは乾燥形態としてより好適に製剤化される。例示的な非経口投与形態は、滅菌水溶液、例えば、プロピレングリコールまたはデキストロース水溶液中の液剤または懸濁液を含む。そのような剤形は、所望であれば好適に緩衝される。有用な他の経口投与可能な製剤は、微結晶形態、またはリポソーム製剤中の活性成分を含むものを含む。非経口投与の製剤は、即時および／または調節放出されるように製剤化される。調節放出製剤は、遅延－、維持－、パルス－、制御－、標的化－、およびプログラム放出を含む。

【0083】

ＩＶ．例示的な実施形態
本発明のさらに特定の実施形態は以下のように記載される：
１．配列番号１における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および配列番号２における軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、ヒトＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、２２８位（ＥＵナンバリング）にプロリンを有するヒトＩｇＧ_４定常領域を含む前記抗体。
２．配列番号１の１～１２０残基に相当する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列および配列番号２の１～１０８残基に相当する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の抗体。
３．配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端のリジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の抗体。
４．Ｆ（ａｂ’）_２である、実施形態３に記載の抗体の抗原結合断片。
５．フレソリムマブと比較すると、半減期の延長、または暴露の増加を示す、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体または断片。
６．以下の：
ａ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）への分化を阻害する
ｂ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｃ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のクラスタリングを増加させる；
ｄ）ＭＩＰ－２のレベルを増加させる；および
ｅ）ＫＣ／ＧＲＯのレベルを増加させる
特性の１つまたはそれ以上を有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の抗体または断片。
７．１％より少ないハーフ抗体を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片を含む組成物。
８．薬剤としての実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片。
９．それを必要としている患者においてＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する方法であって、治療量の実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片を患者に投与する工程を含む前記方法。
１０．患者はがんを有する、実施形態９に記載の方法。
１１．がんは、メラノーマ、肺がん、有棘細胞癌、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、
頭頚部がん、肝細胞癌、尿路上皮がん、および腎細胞癌からなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。
１２．がんは、ＡＣＴＡ２、ＶＩＭ、ＭＧＰおよびＺＷＩＮＴの１つまたはそれ以上の過剰発現によって特徴づけられる、実施形態１０または１１に記載の方法。
１３．がんは間葉系腫瘍である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．抗体または断片は免疫抑制腫瘍微小環境を緩和する、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．患者のがんを処置する方法であって、
（１）実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片、および
（２）免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤
を患者に投与する工程を含む前記方法。
１６．免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２である、実施形態１５に記載の方法。
１７．免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体である、実施形態１６に記載の方法。
１８．抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５における重鎖ＣＤＲ１～３および配列番号６における軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、実施形態１７に記載の方法。
１９．抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５の１～１１７残基に相当するＶ_Ｈアミノ酸配列および配列番号６の１～１０７残基に相当するＶ_Ｌアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の方法。
２０．抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号６に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載の方法。
２１．抗ＴＧＦ－β抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態１５～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．がんは抗ＰＤ－１抗体処置に難治性である、実施形態１５～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．がんは、進行性もしくは転移性のメラノーマ、または有棘細胞癌である、実施形態１５～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．がんは、固形腫瘍の間葉系サブタイプである、実施形態１５～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．がんは、ＡＣＴＡ２、ＶＩＭ、ＭＧＰ、およびＺＷＩＮＴの１つまたはそれ以上の過剰発現によって特徴づけられる、実施形態１５～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．がんは、メラノーマ、肺がん、有棘細胞癌、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、頭頚部がん、肝細胞癌、尿路上皮がん、および腎細胞癌からなる群から選択される、実施形態１５～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．抗体または断片は免疫抑制腫瘍微小環境を緩和する、実施形態１５～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．抗ＴＧＦ－β抗体および抗ＰＤ－１抗体は患者に同じ日に投与される、実施形態１５～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．抗ＴＧＦ－β抗体および抗ＰＤ－１抗体は患者に隔週で投与される、実施形態１５～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．抗ＴＧＦ－β抗体および抗ＰＤ－１抗体はそれぞれ０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、実施形態１５～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．それを必要としている患者において免疫応答を増加させる方法であって、実施形態１～６のいずれか１つに記載の免疫チェックポイント阻害剤および抗体または断片を患者に投与する工程を含む前記方法。
３２．チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体である、実施形態３１に記載の方法。
３３．抗ＰＤ－１抗体は：
ａ）配列番号５のＨＣＤＲ１～３および配列番号６のＬＣＤＲ１～３；
ｂ）それぞれ、配列番号５の１～１１７残基および配列番号６の１～１０７残基に相当するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ；または
ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．抗ＴＧＦ－β抗体は配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．患者はがんを有する、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．患者は、免疫チェックポイント阻害剤による前の処置に難治性である、および／または固体腫瘍の間葉系サブタイプを有する、実施形態３５に記載の方法。
３７．がんは、メラノーマ、肺がん、有棘細胞癌、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、頭頚部がん、肝細胞癌、尿路上皮がん、および腎細胞癌からなる群から選択される、実施形態３５または３６に記載の方法。
３８．がんは、ＡＣＴＡ２、ＶＩＭ、ＭＧＰおよびＺＷＩＮＴの１つまたはそれ以上の過剰発現によって特徴づけられる、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．抗体または断片は免疫抑制腫瘍微小環境を緩和する、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．上記の方法のいずれかで患者を処置する上での使用のための実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片。
４１．上記の方法のいずれかで患者を処置する薬剤の製造のための、実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または断片の使用。
４２．実施形態１～６のいずれか１つの抗体または断片の重鎖、軽鎖、または両方をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
４３．実施形態４２の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
４４．実施形態４３の発現ベクターを含む宿主細胞。
４５．抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第１および第２のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する工程と、
抗体または抗原結合断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を増殖する工程と、
抗体または抗原結合断片を回収する工程と
を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片を産生する方法。
４６．
医薬組成物を産生する方法であって、
実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片を提供する工程と、
抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される賦形剤と混合する工程と
を含む前記方法。
４７．実施形態１～６のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片および別の治療剤を含む製品またはキット。
４８．他の治療剤は本明細書に記載の免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態４７に記載の製品またはキット。

【0084】

本発明を、以下の実施例でさらに記載するが、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を制限しない。

【0085】

〔実施例〕
この発明がよりよく理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のためだけであり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

【実施例1】

【0086】

Ａｂ１のＴＧＦ－β結合特性
全てのヒトおよびマウスＴＧＦ－βアイソフォームへのＡｂ１の親和性は、カルボキシメチル化（ＣＭ５）デキストランでコーティングしたＳシリーズチップを使用するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴によって決定した。一連の濃度のＡｂ１（１．１１、３．３３、１０、および３０ｎＭ）を、固定化した組換えＴＧＦ－βに注射し、リアルタイムで結合相互作用を測定した。ＴＧＦ－βホモダイマーを低密度で固定化し、結合活性効果を減らした。注射は３回実施し、結合アッセイを３回反復した。運動実験からのデータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ２．０ソフトウェアを使用して処理した。得られたセンサーグラムは、１：１結合モデルを使用するカーブフィッティング分析のため、ゼロ化、アライン、ダブルリファレンス、およびクロップし、会合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）、および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。

【0087】

組換えタンパク質は、内部で製造されるか（ヒトＴＧＦ－β１、２および３）またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社から得られた（マウスＴＧＦ－β１および２）。以下の表１は、アカゲザル、マウス、またはラットおよびヒトの間の３つの活性なＴＧＦ－βアイソフォームのアミノ酸配列相同性を示した（相同性は、全アミノ酸のうち保存されたアミノ酸のパーセンテージとして報告される）。

【0088】

【表1】

【0089】

ヒトＴＧＦ－β３およびマウスＴＧＦ－β３はアミノ酸配列が同一であるため、これら２つのタンパク質に関して異なる親和性の測定は算出されなかった。同様に、マウスおよびラットＴＧＦ－β１および２はアミノ酸配列が同一であり、異なる親和性測定も算出されなかった。

【0090】

上記の方法によって決定された、Ａｂ１のｋ_ａ、ｋ_ｄ、およびＫ_Ｄ値を以下の表２に示した。ヒトＴＧＦ－β１、２、および３へのＡｂ１のＫ_Ｄ値は、それぞれ１．４８、３．００、および１．６５ｎＭと決定された。マウス／ラットＴＧＦ－β１および２へのＡｂ１のＫ_Ｄ値は、それぞれ２．８０および１．８８ｎＭであると決定された。これらの結合特性は、フレソリムマブのものと類似していた。

【0091】

【表2】

【0092】

上記のデータは、Ａｂ１が強力なおよび選択的な汎ＴＧＦ－β阻害剤であることを実証した。表面プラズモン共鳴を使用する測定は、Ａｂ１が全てのヒトおよびマウスＴＧＦ－βアイソフォームに関して１から５ｎＭの間の親和性を有することを実証した。高レベルの特異性が、正常ラット、カニクイザルおよびヒト組織を使用してＧＬＰ免疫組織化学（ＩＨＣ）組織交差反応性試験によって確認された。

【実施例2】

【0093】

Ａｂ１のＴＧＦ－β中和能力
ＴＧＦ－β活性の中和におけるＡｂ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの能力は、細胞ベースのアッセイで測定された。このアッセイは、非形質転換のミンク肺上皮細胞（Ｍｖ １Ｌｕ細胞）の増殖を阻害するＴＧＦ－βの能力を測定した。例えば、国際公開第２００６／０８６４６９号およびMazzieri, et al., Eds, “Methods in Molecular Biology,” Vol. 142, “Transforming Growth Factor-β Protocols”参照。Ａｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１（マウス抗ＴＧＦ－β抗体、その重および軽鎖配列は配列番号９および１０として本明細書に開示される）のヒトＴＧＦ－β１、２、３およびマウスＴＧＦ－β１および２を中和する能力を評価した。組換えＴＧＦ－βタンパク質は、内部で製造されるか（ヒトＴＧＦ－β１、２および３）またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社から得られた（マウスＴＧＦ－β１および２）。

【0094】

全てのヒトおよびマウスＴＧＦ－βアイソフォームは、０．０２ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの範囲で用量依存的な方法でミンク肺細胞の増殖を阻害した。Ａｂ１、フレソリムマブ、および１Ｄ１１の能力を定量するため、示したＴＧＦ－βおよび段階希釈した抗体１ｎｇ／ｍｌをミンク肺細胞とインキュベートした。インキュベーションの３日後、細胞の増殖をＤＮＡへの結合時に蛍光を発するＣｙＱＵＡＮＴ色素によって定量した（図１Ａ～Ｅ）。データは、Ａｂ１、フレソリムマブ、およびそれらのマウス代用１Ｄ１１が、全てのヒトおよびマウスＴＧＦ－βアイソフォームを同程度まで阻害したことを示した。

【実施例3】

【0095】

Ａｂ１による誘導性制御性Ｔ細胞分化の阻害
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は免疫抑制性であり、がん患者においてネガティブな結果と関連付けられている。以下に記載した研究において、本発明者らは、Ａｂ１が、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）へのＴＧＦ－β誘導性分化を阻害できたかどうか調べた。原発性ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞は、健常ドナーから単離した。ヒトＴＧＦ－β１はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。

【0096】

培養細胞によって内在性で生成されたＴＧＦ－βへのＡｂ１のアンタゴニスト活性を調べるため、外因性のＴＧＦ－βを添加しない全ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、５０μｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール（ヒトＩｇＧ４、カッパ抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）抗体、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社）、Ａｂ１またはフレソリムマブによって、刺激（抗ＣＤ－３、抗ＣＤ－２８、およびＩＬ－２）の存在下または非存在下で６日間処置後フローサイトメトリー分析を行った。ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋集団の平均パーセントおよび標準偏差を親集団（リンパ球／肝臓／単一細胞／ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^－）から３回算出した。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ－２による全ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の刺激は、培養中のＦＯＸＰ３^＋ＣＤ２５^＋（ｉＴｒｅｇ）のパーセンテージを０％から１５％に増加した。Ａｂ１ ５０μｇ／ｍｌまたはフレソリムマブ５０μｇ／ｍｌによる処置は、同程度までｉＴｒｅｇのパーセンテージを減少させた（それぞれ８％および７％；図２）。対照的に、ヒトＩｇＧ_４（ｈＩｇＧ_４）アイソタイプコントロールによる処置は、ｉＴｒｅｇ分化に最小の効果を示した（２０％ ｉＴｒｅｇ）（図２）。第２の健常ボランティアから単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、同様の結果を生じた。

【0097】

外因性ＴＧＦ－βへのＡｂ１のアンタゴニスト活性を調べるため、ヒトＴＧＦ－β１ ２ｎｇ／ｍｌとインキュベートした全ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、刺激（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ－２）の存在下または非存在下で様々な抗体濃度のアイソタイプコントロール、Ａｂ１、またはフレソリムマブによって６日間処置後、フローサイトメトリー分析した。ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋集団の平均パーセントおよび標準偏差を親集団（リンパ球／肝臓／単一細胞／ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^－）から、注意書きした場合以外３回算出した。外因性ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）の刺激した全ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞への添加は、培養中のｉＴｒｅｇのパーセンテージを１５％から５５％に増加した。漸増濃度のＡｂ１による処置は、追従様式でｉＴｒｅｇのパーセンテージを２００μｇ／ｍｌで５５％から１５％に、６．２５μｇ／ｍｌで４３％減少させた。フレソリムマブによる処置は、Ａｂ１と同程度までｉＴｒｅｇのパーセンテージを減少させた（２００μｇ／ｍｌで５５％から１６％および６．２５μｇ／ｍｌで３２％）。様々な濃度のアイソタイプコントロール抗体による処置は、２００μｇ／ｍｌおよび６．２５μｇ／ｍｌで６０％のｉＴｒｅｇのパーセンテージに効果を示さなかった。図３参照。第２の健常ボランティアから単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、同様の結果を生じた。

【0098】

この研究は、Ａｂ１がＴＧＦ－βによって誘導されるｉＴｒｅｇ分化を阻害し、したがって免疫抑制腫瘍微小環境を緩和することにより臨床的な利点をもたらし得ることを実証した。

【実施例4】

【0099】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｂ１および抗ＰＤ－１抗体組み合わせの効果
本研究では、本発明者らは、ＴＧＦ－βが抗ＰＤ－１処置後のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の最大刺激を防ぐかどうか、そうであれば、Ａｂ１はこの防止を打ち消すことができるかどうか調べた。ＮＦＡＴｃ（活性化Ｔ細胞核内因子、細胞質１）調節配列の転写制御下での発現構築物からのルシフェラーゼ発現を使用して、Ｔ細胞活性化のレベルを測定した。

【0100】

本発明者らは、本研究のためＰｒｏｍｅｇａ社から購入した細胞アッセイシステムを使用した。このシステムは２つの細胞型：１）ヒトＰＤ－１およびＮＦＡＴ応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ならびに２）ヒトＰＤ－Ｌ１および抗原非依存的な方法で同種のＴ細胞受容体を活性化するように設計した工学的に作製した細胞表面タンパク質を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む。共培養すると、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞と相互作用し、Ｔ細胞受容体刺激およびルシフェラーゼ発現を駆動する核へのＮＦＡＴｃの移行を生じた。しかしながら、
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１のエンゲージメントは、非受容体１１型タンパク質チロシンフォスファターゼ（ＳＨＰ２）をＴ細胞受容体複合体へ動員し、ＮＦＡＴｃ核移行およびその後のルシフェラーゼ発現を阻害した。ＰＤ－１シグナル伝達の遮断は、ＳＨＰ２依存的な抑制を軽減し、したがって最大のルシフェラーゼ発現を可能にした。したがって、システムは、Ｔ細胞シグナル伝達へのＴＧＦ－βの効果およびＴ細胞の抗ＰＤ－１処置へのＡｂ１の影響を決定する機能的な方法を提供した。

【0101】

ＴＧＦ－β依存的な効果に関連する遅い動力学のため、Ｔ細胞受容体刺激の前にＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＴＧＦ－βによって前処置した。ヒトＴＧＦ－β１はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。Ａｂ１のアイソタイプコントロール抗体（抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４）は、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｃａｔ＃Ｃ０００４－５）から購入した。マウス抗ｈＰＤ－１ ＩｇＧおよびそのアイソタイプコントロール抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（Ｃａｔ＃３２９９１２）から購入した。各サンプルにつき１４個の複製物を分析した。

【0102】

結果は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞と２４時間共培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への抗ｈＰＤ－１抗体を添加すると、アイソタイプコントロールの添加の場合（２３４９６３ＲＬＵ、倍数変化＝３．６８５、ｐ値＜０．０００１）または単に抗体を加えなかった場合（２０６０４３ＲＬＵ、倍数変化＝４．２０２、ｐ値＜０．０００１）よりも大きくルシフェラーゼ活性（８６５７９４相対発光単位［ＲＬＵ］）が誘導されたことを示した。ＴＧＦ－β１ １８ｎｇ／ｍｌによる１２日間のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の前処置は、ＴＧＦ－β１で処置しなかったＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と比較して（８６５７９４ＲＬＵ、倍数変化＝－１．３５５、ｐ値＜０．０００１）、抗ｈＰＤ－１抗体の存在下でのＣＨＯ－Ｋ１細胞共培養において低いルシフェラーゼ活性（６３８８６６ ＲＬＵ）を誘導した（図４）。

【0103】

Ａｂ１のアンタゴニスト能力を評価するため、１２日間Ａｂ１、アイソタイプコントロールＡｂの存在下で、またはＡｂ無しでＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＴＧＦ－β１ １８ｎｇ／ｍｌで前処置し、次いで２４時間抗ＰＤ－１の存在下でＣＨＯ－Ｋ１細胞と共培養した。Ａｂ１（９２４１８６ ＲＬＵ）の存在は、アイソタイプコントロールＡｂ（６３９４４０ＲＬＵ、倍数変化＝１．４４５、ｐ値＜０．０００１）およびＡｂコントロール無し（６３８８６６ＲＬＵ、倍数変化＝１．４４７、ｐ値＜０．０００１）と比較して、ルシフェラーゼ活性のＴＧＦ－β依存的な抑制を軽減した。ＴＧＦ－β１による前処置をせず、抗ＰＤ－１ Ａｂの存在下でＣＨＯ－Ｋ１細胞共培養と共培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞にＡｂ１（９７５６５４ＲＬＵ）またはアイソタイプコントロール（９５５７１７ ＲＬＵ）を添加したコントロール群は、Ａｂ無しコントロールと比較してルシフェラーゼ活性が統計的に増加したが、最小の倍数変化であった（８６５７９４ＲＬＵ、それぞれ倍数変化＝１．１２７および１．１０４、ｐ値＝０．００２３および０．００１２８４）（図４）。ＲＬＵ値も、下記の表３に示した。

【0104】

【表3】

【0105】

Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＴＧＦ－β１前処置が増殖または生存力の低下をもたらし、したがってＣＨＯ－Ｋ１細胞との２４時間共培養中にルシフェラーゼ活性の低下をもたらす可能性を除外するため、本発明者らは、Ａｂ１、抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４の存在下、または抗体無し（ビヒクル）で７日間、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＴＧＦ－β１ １８ｎｇ／ｍｌまたはＰＢＳとインキュベートした。２～３日毎に、等量の各群を使用して新しいフラスコに播種し、その時ＴＧＦ－β１および抗体の両方が新しくされた（全部で２つの再播種イベントが起こった）。最終培養のアセスメントにより、全ての処置群の生存力が変更されたことを実証した（９４％から９６％の範囲）。さらに、各処置群の最終培養のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の総数は、非常に類似していた（２５００万から２９００万の範囲）。

【0106】

上記の研究は、抗ＰＤ－１処置後のＴ細胞受容体の下流のシグナル伝達の増加がＴＧＦ－βによって抑制され、最適以下のＴ細胞刺激をもたらすことを実証した。本発明者らのデータは、ＴＧＦ－βの阻害が免疫抑制腫瘍微小環境を緩和し、抗ＰＤ－１剤のようなチェックポイント調節剤がよりよい免疫応答を誘導し、したがって、免疫腫瘍学的処置から恩恵を受ける患者の割合を増加させることが可能になることを示唆した。

【実施例5】

【0107】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｂ１および抗ＰＤ１抗体組み合わせの効果
本発明者らは、次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがんモデルにおける抗ＴＧＦ－βおよび抗ＰＤ－１を組み合わせた処置の効果を研究した。

【0108】

忍容性／予備的安全性
材料および方法
単一薬剤としておよび組み合わせでＡｂ１および抗マウスＰＤ－１（ｍＰＤ－１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の忍容性を、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスで評価した。Ａｂ１（１０、２０、および５０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプコントロールＡｂ（抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４はＣｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した；１０および２０ｍｇ／ｋｇで使用した）を単剤として３日毎にＩＶ投与（Ｑ３Ｄ）または抗ＰＤ１ Ｍａｂ ５ｍｇ／ｋｇと組み合わせて週２回ＩＶ投与した。この研究で使用した抗ＰＤ－１ Ａｂは、「抗ｍＰＤ１＿ｈｙｂ＿ＲＭＰ１１４＿ｍＩｇＧ１ＬＣｆｕｌｌｒａｔ」（またはｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ）と示される。それは、ラットＩｇＧ_２ａクローンＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ．＃ＢＥ０１４６）のラットＦｃ領域をマウスＩｇＧ_１Ｆｃ領域と置き換えることによって生成されたキメララット抗ｍＰＤ－１抗体であった。このキメラ抗体の重および軽鎖アミノ酸配列は配列番号７および８に示される。忍容性は、動物の体重の測定および臨床的な観察によって評価された。３週間の処置の最後に、最後の処置の４時間後、最終のサンプル採取を実施し、組織（心臓、腎臓、肝臓、肺、および脾臓）をホルムアルデヒドで固定し、病理組織学的分析に送った。

【0109】

投与量は、体重減少をもたらす腫瘍誘導性悪液質がコントロールビヒクル処置群で観察されない限り、個々のマウスにおいて３連続日で１５％体重減少、１日で２０％体重減少、または１０％もしくはそれ以上の薬物関連死がある場合、非常に毒性であると考えられた。動物体重は腫瘍重量を含んだ。

【0110】

毒性／安全性結果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける忍容性試験は、Ａｂ１およびｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂの単一薬剤および組み合わせの試験した全ての投与レベルが十分に忍容性であったことを示した。任意の処置群において試験した全ての用量で体重の大きな変化は観察されなかった。重篤なまたは大きな臨床的な観察は研究中観察されなかった。病理組織学的な分析は、どんな組み合わせでも、用量関係性なく、アイソタイプコントロール抗体処置群を含む全ての処置群の脾臓（白色髄）におけるリンパ球の数の増加を同定した。他の顕著な顕微鏡による所見は観察されなかった。アイソタイプコントロールＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ－１Ｍａｂ（５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ群の２匹のマウスは、試験の最終日の最終投与後に死亡が確認された。病理組織学的な分析は、死因と関連する任意の薬物を見出さなかった。

【0111】

効能試験
皮下のＭＣ３８同系大腸腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＴＧＦ－βおよび抗ＰＤ－１を組み合わせる処置の効果を評価した。マウスに、Ａｂ１ ２５ｍｇ／ｋｇ、ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ ５ｍｇ／ｋｇ、または両方を３週間Ｑ３Ｄで与えた。この研究は、Ａｂ１と抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂの組み合わせが、単一薬剤のみよりも著しく大きな抗腫瘍活性を持つことを実証した。材料および方法およびこの研究の日付は以下に詳細に記載する。

【0112】

材料および方法
動物
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。動物は、研究に加える前に少なくとも３日間順応させた。マウスは、研究の開始時に１１週齢であり、体重は１７．０と２０．９ｇの間であった。それらは食事（Ｈａｒｌａｎ２９１６げっ歯類食、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）および滅菌水に自由にアクセスできるようにし、１２時間の明／暗サイクルで飼育した。

【0113】

腫瘍細胞
ＭＣ３８は大腸腺癌細胞系である。細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手し、１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＨＩ ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１０４３８０２６）を補足したＬ－グルタミン入りＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ）－１６４０（Ｇｉｂｃｏ社、Ｃａｔ＃１１８７５）を含む、完全培地（ＣＭ）中、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。細胞を回収し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１４１９０）中に再懸濁し、マウスあたり１×１０^６個の細胞／２００μｌを、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に皮下（ＳＣ）移植した。

【0114】

化合物
Ａｂ１は、動物に水溶液で投与した。それは０．２２μｍのフィルターでＰＥＳを通し、滅菌水中２～１０℃で保存した。抗体は、腹腔内（ＩＰ）に１０ｍｌ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇで動物に与えた。

【0115】

抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、Ａｂ１のアイソタイプコントロールとして使用した。この抗体は、１０ｍｌ／ｋｇでＩＰによって、２５ｍｇ／ｋｇでＩＰによってコントロール動物に与えた。

【0116】

ｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ（上記）はＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、Ｃａｔ＃１４１９０－０９４）中で提供し、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇでＩＰによって動物に与えた。

【0117】

研究デザイン
０日目、６０匹の動物にＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。移植後８日目に、平均腫瘍サイズ５０～７５ｍｍ^３を有するマウスをプールし、無作為にコントロールおよび処置群に分けた（群あたり１０匹のマウス）。上記の用量でのビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）、抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４、Ａｂ１、および抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂによる処置は、９日目に開始し、１２、１５、１８、２１、および２７日目に反復した。ビヒクルおよび抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４処置した動物はコントロールとして使用した。マウスは毎日チェックし、臨床的に有害な反応を記録した。個々のマウスは、実験の終了まで週に３から４回計量した。

【0118】

マウスは、≧２０％疾病率または体重減少が観察された場合、安楽死させた。腫瘍は、最終的な屠殺まで週２回カリパーによって測定した。腫瘍サイズがおよそ２０００ｍｍ^３に達した、または動物の健康上の問題があった（腫瘍の領域の２０％が潰瘍化した）場合、動物は安楽死させ、死亡日を記録した。固体腫瘍体積は２方向腫瘍測定から見積もられ、以下の式：
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［長さ（ｍｍ）×幅^２（ｍｍ^２）］／２
に従って算出した。

【0119】

所与の日の群の退縮パーセントの中央値は、次いでこの日の群の各動物で算出した、個々の退縮パーセントの中央値を取ることによって得られた。算出の日は、退縮パーセントの中央値が群の活性の典型ではなかった場合を除いて、ΔＴ／ΔＣ（すなわち、処置群とコントロール群との間のベースラインからの腫瘍体積変化の中央値の比）が算出された日に決定された。この場合、退縮パーセントの中央値が最大であった場合、その日は最初の日によって決定された。腫瘍体積が処置の開始時の腫瘍体積の５０％まで減少した場合、部分的（ＰＲ）として定義された。完全な退縮（ＣＲ）は、腫瘍体積が１４ｍｍ^３よりも小さいまたは記録されない場合に達成されたと考えられた。

【0120】

効能
主要効能エンドポイントは、ΔＴ／ΔＣ、退縮パーセントの中央値、部分退縮、および完全退縮によって示されるように、ベースラインからの腫瘍体積変化であった。各処置（Ｔ）およびコントロール（Ｃ）群の腫瘍体積における変化は、特定の観察日の腫瘍体積から最初の処置の日（病期分類日）の腫瘍体積を引く事によって毎日各動物について算出した。中央値ΔＴは処置群について算出し、中央値ΔＣはコントロール群について算出した。ΔＴ／ΔＣ比は、算出されパーセンテージとして表された。
ΔＴ／ΔＣ＝（デルタＴ中央値／デルタＣ中央値）×１００

【0121】

ΔＴ／ΔＣ比≦４０％が治療的に活性であると考えられた。０％のΔＴ／ΔＣ比は腫瘍停滞として考えられた。ΔＴ／ΔＣ比＜０％は腫瘍退縮として考えられた

【0122】

腫瘍退縮パーセントは、研究の開始時（ｔ_０）の腫瘍体積と比較した特定の観察日に処置群で減少した腫瘍体積のパーセンテージとして定義した。特定の時点（ｔ）で、各動物に関して、退縮パーセントは以下の式：
退縮％（ｔ）＝［（容積_ｔ０－容積_ｔ）／容積_ｔ０］×１００
を使用して算出した。

【0123】

所与の日の群の退縮パーセントの中央値は、次いで、群の各動物に関して算出した個々の退縮％値の中央値を取ることによって算出した。算出の日は、退縮パーセントの中央値が群の活性の典型ではない場合を除いて、ΔＴ／ΔＣが算出された日によって決定された。この場合、退縮パーセントの中央値が最大であった場合、その日は最初の日によって決定された。

【0124】

統計分析
処置および日（反復）を因子とする二元配置分散分析を、ベースラインからの腫瘍体積変化に実施した。相互作用または処置効果が著しい処置^＊日の場合、多重性のボンフェローニ－ホルム相関による比較分析に続き、８～２７日の各日で全ての処置群をコントロール群と比較した。ベースラインからの腫瘍体積変化は、各動物および各日について、特定した観察日の腫瘍体積から最初の処置日（８日目）の腫瘍体積を引くことによって算出した。

【0125】

群間で分散の不均一性が観察された場合、群による対称化合物（ＣＳ）共分散構造＝オプションがＡＮＯＶＡ型モデルのために選択された（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．（２００８） ＳＡＳ／ＳＴＡＴ ９．２ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｂｙ Ｃａｒｙ ＮＣ）。図５および６では、各群の中央値および中央値絶対偏差（ＭＡＤ）を、処置の各日について示した。以下の表４～６では、各群の中央値およびノーマライズしたＭＡＤ（ｎＭＡＤ＝１．４８２６^＊ＭＡＤ）を各測定日について報告した。全ての統計分析は、ＳＡＳバージョンｖ９．２ソフトウェアを使用して実施した。５％より少ない（ｐ＜０．０５）可能性は、重要とみなした。

【0126】

効能結果
腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの、Ａｂ１、抗ＰＤ－１ Ｍａｂ、または２つの組み合わせによる処置もまた、十分に忍容性であり、動物の通常の健康および活性ならびに体重の著しい変化の欠如によって示されるように非毒性であった。単一薬剤として、Ａｂ１ ２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄおよび抗ＰＤ－１ Ｍａｂ ５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄは、それぞれ、最低３．４％（９日目）および２．１％（９日目）のみの体重減少値を引き起こした。Ａｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄ）と抗ＰＤ－１ Ｍａｂ（５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄ）の組み合わせも、十分に忍容性であり、最低１．３％（９日目）の体重減少値を示した（表４）。

【0127】

単一薬剤として、Ａｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄ）および抗ＰＤ－１ Ｍａｂ（５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄ）は、Ａｂ１アイソタイプコントロール（抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４）によって処置した動物と比較して、腫瘍増殖に撹乱を示さなかった。処置の２７日目のΔＴ／ΔＣ比は、それぞれ９３％および１０９％であった（表４）。抗ＰＤ－１ Ｍａｂと抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４の組み合わせは、処置の２７日目に３１％のΔＴ／ΔＣで最小の抗腫瘍活性を実証し（コントロール群と統計的に異ならない）、１０匹のマウスのうち２匹のみで完全な退縮が観察された。しかしながら、抗ＰＤ－１ ＭａｂおよびＡｂ１の組み合わせは、処置の２７日目に－１ ΔＴ／ΔＣで１５日から２７日までの優れた抗腫瘍活性を実証し（コントロール群と統計的に異なる）、１０匹のマウスのうち６匹で完全な退縮が観察された（表４）。

【0128】

【表4】

【0129】

表５および６ならびに図５～７は、マウスモデルの腫瘍体積への単独または組み合わせの抗体の活性を示すさらなるデータを示す。

【0130】

【表5】

【0131】

【表6】

【0132】

表および図のデータは、Ａｂ１ ２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ
５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとの組み合わせが、それらの用量でのいずれかの抗体よりも大きな抗腫瘍効果を有したことを示す。単一薬剤としてＡｂ１との組み合わせと比較した場合、この差は統計的に著しく、１９、２３、および２７日目のｐ値はそれぞれ０．０００７、＜０．０００１、および＜０．０００１であった。単一薬剤としてｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂとの組み合わせと比較した場合、この差も統計的に著しく、１９、２３、および２７日目のｐ値は０．０２７６、０．０００４、および０．００２４であった（表６）。抗ＨＥＬ ｈｌｇＧ_４ ２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ ５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとの組み合わせ群について、ベースラインからの腫瘍体積変化への処置効果は、測定の任意の日のいずれかの薬剤単独の効果とは著しく異ならなかった。

【0133】

要約すると、Ａｂ１ ２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとｘ－抗ｍＰＤ－１ Ｍａｂ ５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとの組み合わせは、１５日目から２７日目に単独で使用したいずれかの薬剤よりも著しく大きな抗腫瘍効果を有した。

【0134】

別の研究では、本発明者らは１、１０、または２５ｍｇ／ｋｇの用量のＡｂ１と５ｍｇ／ｋｇの用量のマウスＰＤ－１抗体との組み合わせの、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮下のＭＣ３８マウス大腸がんモデルに対する抗腫瘍活性を評価した。
指数関数的に増殖するＭＣ３８大腸腺癌細胞（ＮＣｌ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）は、５％ ＣＯ_２で加湿したインキュベータ―内で、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ－１６４０中で培養し、次いで雌のＣ５７／Ｂｌ６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）のわき腹に皮下移植した（１×１０^６個の細胞）。腫瘍が平均サイズ５０～７５ｍｍ^３に達すると、マウスはプールされ、無作為にコントロール群と処置群とに分けた（群あたり１０匹のマウス）。腫瘍担持マウスは、次いで、ＰＢＳ、ＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、またはＡｂ１（１、１０、および２５ｍｇ／ｋｇ）によって、各動物が全部で６～７回用量を受けるまで週に３回腹腔内に処置した。腫瘍は、デジタルキャリパーによって週に２回測定し、腫瘍体積を算出し（ｍｍ^３＝Ｌ×Ｗ×Ｈ）、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してグラフ化した。腫瘍が＞２０００ｍｍ^３に成長した場合、または腫瘍が腫瘍表面の＞２０％の潰瘍形成を示した場合、マウスは研究の終了時にＣＯ_２によって安楽死させた。

【0135】

単一薬剤として、Ａｂ１ ２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄの用量およびマウスα－ＰＤ－１抗体５ｍｇ／ｋｇの用量は、ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおいて、それぞれ２／８および４／８の完全退縮である部分活性を実証した。Ａｂ１ １、１０、または２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとマウスα－ＰＤ－１抗体 ５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄとの組み合わせは、治療的に活性であった。移植後２４日目に、ベースラインからの腫瘍体積変化を比較する場合、試験した全ての用量のＡｂ１とマウスα－ＰＤ－１抗体 ５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄの組み合わせの効果は、Ａｂ１ １、１０、および２５ｍｇ／ｋｇそれぞれで５／８、６／８、および７／８完全退縮であり、各単一薬剤の効果よりも大きかった。表６Ａは、結果の要約を提供する。

【0136】

【表7】

【0137】

要約すると、これらの前臨床データは、ＰＤ－１阻害のＴＧＦ－β阻害との組み合わせが、チェックポイント阻害剤遮断のみよりも高度に腫瘍増殖を阻害できることを実証した。

【実施例6】

【0138】

腫瘍内ＴＧＦ－β１レベル
腫瘍内ＴＧＦ－β１レベルは、ＬｏＶｏ結腸直腸がんの皮下への異種移植片移植ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて研究した。マウスに、Ａｂ１またはアイソタイプコントロールＭａｂ １０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇのいずれかを、腫瘍体積が１００ｍｍ^３より小さいときに開始して、全部で８回のＩＶ投与で、３日毎に静脈内に注射した。

【0139】

２．８ｍｍセラミックボール（ＭｏＢｉｏ １３１１４－５０）と２ｍｌプラスチックチューブ中、－８０℃で保存した腫瘍サンプルは、室温で溶かした。１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ ７８４４０）を補足した、１ミリリットル（ｍｌ）のコールドのＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（ＭＳＤ）Ｔｒｉｓ溶解緩衝液（Ｒ６０ＴＸ－２）を組織に添加し、次いでＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４ Ｄｕａｌホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、４℃で、それぞれ６５００ｒｐｍ、２０秒で２サイクル、ホモ
ジナイズした。ライセートは、４℃のエッペンドルフ５４１７Ｃ 遠心分離機で、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離によって精製した。上澄み液を、きれいな冷やしたエッペンドルフチューブに移し、上記のようにさらに２０分間遠心分離によってさらに精製した。その後、上澄み液をプラスチック９６ウェル保管ブロックに移し、液体窒素で急速冷凍し、－８０℃で保存した。

【0140】

次の日、サンプルは室温で溶かし、氷上に置いた。ライセートのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ ２３２２５）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。ライセートは、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＭＳＤ Ｔｒｉｓ溶解緩衝液（上記参照）を使用して、およそ８ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にノーマライズし、プラスチックマイクロチューブに分配した。

【0141】

ノーマライズした腫瘍ライセートのＴＧＦ－β１濃度は、電気化学発光アッセイを用いるヒトＴＧＦ－β１キット（ＭＳＤ、Ｋ１５１ＩＵＣ－２）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。ＭＳＤ溶解緩衝液中で段階希釈した組換えマウスＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ．＃７６６６－ＭＢ－００５）をキャリブレータ―として使用した。サンプルは、プレート上に２回ロードした。電気化学発光シグナルはＭＥＳＯ
ＳＥＣＴＯＲ Ｓ ６００プレートリーダー（ＭＳＤ）を使用して測定し、サンプル中のＴＧＦ－β１濃度はＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアｖ４．０を使用して標準曲線に基づいて定量した。

【0142】

サンプル２回の平均濃度はソフトウェアによって算出した。「適合曲線範囲以下」または「検出範囲以下」とソフトウェアによって決定された濃度値はゼロ値で置き換えた。全タンパク質のｍｇあたりのＴＧＦ－β１濃度を算出するために、アッセイで測定した濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、サンプルのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割った。

【0143】

結果は、アイソタイプコントロールを注射したマウスでは、腫瘍内ＴＧＦ－β１レベルは全タンパク質２１．４ｐｇ／ｍｇの中央値であったことを示し、Ａｂ１を注射したマウスでは相当するレベルは検出できなかった（図８）。

【0144】

上記の所見のヒトでの関連性を実証するため、上記の方法を使用して、上記のようにそれらの腫瘍内ＴＧＦ－β１レベルに関して、本発明者らは１０人のヒト結腸直腸腫瘍サンプルおよび１０人のヒトメラノーマ腫瘍サンプルを試験した。ヒトＣＲＣサンプルでは、ＴＧＦ－β１レベルは約７から２５ｐｇ／ｍｇの範囲であった。ヒトメラノーマサンプルでは、ＴＧＦ－β１レベルは約１ｐｇ／ｍｌから高くても４３ｐｇ／ｍｌの範囲であった。これらのデータは、単独でまたは抗ＰＤ－１抗体のような他の免疫チェックポイント阻害剤と併せて、処置する腫瘍におけるＡｂ１のような抗ＴＧＦ－β１治療剤の使用をさらに支持する。

【実施例7】

【0145】

Ａｂ１の薬物動態研究
この実施例は、Ａｂ１の薬物動態（ＰＫ）プロファイル特徴づけした、およびそれをフレソリムマブのものと比較した研究を記載する。一研究では、カニューレ処置したスプラーグドーリーラットの５つの群に、単一用量のＡｂ１またはフレソリムマブ５ｍｇ／ｋｇを静脈内に与えた。各群は５匹の雌と５匹の雄であった。ラットからの血液を、投与後の０．２５、６、２４、４８、７２、１４４、１９２、および２４０時間で回収した。Ａｂ１およびフレソリムマブ血清の濃度はＥＬＩＳＡによって決定した。比較可能性は、（参照に対する試験物質の）ＡＵＣ比の９０％信頼区間が８０％から１２５％の範囲内である場合に決定された。

【0146】

ラットの５つの群からの経時的な抗体血清濃度は図９Ａに示す。群２、４、および５（図９Ａの凡例参照）からのＰＫパラメーターは以下の表７に示す。この研究は、フレソリムマブよりもずっと長い半減期（７．１日対４．３日の平均Ｔ_１／２）およびより遅い排出速度（０．３０ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ対０．５１ｍｌ／ｈｒ／ｋｇのＣＬ）で、Ａｂ１が線形のＰＫ挙動を示すことを示した。データは、Ａｂ１がラットにおいてフレソリムマブよりも１．７倍高い暴露を有したことを示した。

【0147】

【表8】

【0148】

Ａｂ１（試験２）でのさらなるＰＫ研究を、カニクイザルの群で実施した。各群は５匹の雌と５匹の雄であり、Ａｂ１ １ｍｇ／ｋｇ（図９Ｂ）または１０ｍｇ／ｋｇ（図９Ｄ）の単回用量、または投与あたりＡｂ１ １ｍｇ／ｋｇ（図９Ｃ）または１０ｍｇ／ｋｇ（図９Ｅ）の５回の毎週用量を静脈内注入によって与えた。サルにおけるＡｂ１の経時的な血清濃度は、図９Ｂ～Ｅに示す。先の研究で、単回または反復Ｑ２Ｗ（隔週）用量でサルに与えたフレソリムマブの経時的な血清濃度も比較のため図に示した。これらのデータは、Ａｂ１もサルで線形のＰＫ挙動を示し、用量あたり１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ両方でのフレソリムマブよりも、単回または反復投与後に高い暴露を示すことを示した。１０ｍｇ／ｋｇの単回投与では、Ａｂ１は１３日の半減期を有し、一方フレソリムマブは４．５日の半減期を有した；Ａｂ１は約０．４０ｍｌ／ｈｒ／ｋｇのＣＬを有し、一方フレソリムマブは０．６６ｍｌ／ｈｒ／ｋｇのＣＬを有した。ラットの研究と同様に、サルの研究も、Ａｂ１はフレソリムマブよりも約１．７倍高い暴露を有することを示した。

【0149】

上記の研究は、Ａｂ１が、フレソリムマブよりも統計的に著しく長い半減期、より長いクリアランス時間、およびｉｎ ｖｉｖｏでのより高い生物学的暴露を示すことを実証した。

【0150】

さらに、Ａｂ１２腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける研究は、Ａｂ１が、静脈内または腹腔内のどちらで投与されても、類似のＰＫプロファイルを有したことを示した。

【0151】

２－コンパートメントモデルにおけるアロメトリックスケーリングを使用して、本発明者らは、サルのデータに基づいて７０ｋｇの男性で以下のＰＫパラメーターを予測した（表８）：

【0152】

【表9】

【0153】

Ａｂ１の予測したＰＫパラメーターはまた、ヒトでのフレソリムマブのものよりもより好ましかった。例えば、ヒトで１２．３ｍｌ／ｈｒ／ｋｇのＣＬであるフレソリムマブは、Ａｂ１よりも早いクリアランス速度を示した。

【実施例8】

【0154】

Ａｂ１の毒性研究
Ａｂ１の毒性研究をラットおよびカニクイザルで実施した。医薬品の安全性保証エンドポイントは、５週間毎週の反復用量のＧＬＰ（医薬品安全性試験判断基準）で評価した。サルでは最大１０ｍｇ／ｋｇ／用量（濃度２ｍｇ／ｍｌ）およびラットでは最大３０ｍｇ／ｋｇ／用量（濃度６ｍｇ／ｍｌ）の用量で、Ａｂ１関連の病理組織学的所見は注射部位で見られなかった。神経学的な調査で試験した任意の用量レベルでのこの試験において、体温、呼吸数、血圧、およびＥＣＧパラメーターへのＡｂ１関連の効果は記録されなかった。

【0155】

ラットのＮＯＡＥＬ（有害効果が観察されないレベル）は、５週間毎週の反復投与で３ｍｇ／ｋｇ／用量であると見出され、ＳＴＤ１０（動物の１０％に死または不可逆的な重篤な毒性を引き起こす重篤な毒性の用量）は、ラットで３から１０ｍｇ／ｋｇ／投与の間であると見出された。毒性は、多発性肥厚小瘤によって特徴づけられる心臓弁拡大；ならびに混合細胞肺胞浸出液、混合細胞血管周囲浸潤、筋性動脈の肥大、出血、および／または肺重量増加のような異常な肺の状態を含んだ。

【0156】

ＮＯＡＥＬおよびＨＮＳＴＤ（すなわち、それを超えると死亡、致死性の毒性または非可逆的な毒性が生じる最高非重篤毒性用量）用量は、サルでは５週間の毎週の反復投与は１０ｍｇ／ｋｇ／投与であると見出された（比較すると、フレソリムマブのサルでのＮＯＡＥＬは、隔週で７もしくは１３回投与、または４週間Ｑ３Ｄで投与した場合、１ｍｇ／ｋｇであると示された）。以下の表９に示したデータも参照。

【0157】

【表10】

【0158】

上記の毒性データに基づき、Ａｂ１は、毎週約０．０５ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇ、または例えば隔週などより少ない頻度の投与量レベルでヒト患者に安全に投与されることが予期される。

【実施例9】

【0159】

抗ＴＧＦ－β単独治療のｉｎ ｖｉｖｏでの効能
この研究では、本発明者らは、ヒトおよびマウスＴＧＦ－β１、２および３と交差反応する、１Ｄ１１、マウスＩｇＧ_１抗ウシＴＧＦ－β抗体の転移性同系腫瘍モデルへの効果を調べた。このモデルでは、Ｂ１６－Ｆ１０マウスメラノーマ細胞をＩＶによってＣ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に導入し、マウスの流入領域リンパ節に転移を形成した。コントロール抗体、１３Ｃ４による処置は効果を示さないが、腫瘍接種の１日後に開始する週３回の１Ｄ１１ ５０ｍｇ／ｋｇによる処置は完全に転移を抑制した。

【0160】

免疫応答の役割を調査するため、β２ミクログロブリン遺伝子欠損であり、したがって、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を欠くマウスは、足蹠にＢ１６－Ｆ１０を移植され、上記のように処置された。免疫能のあるマウスで見られた結果と対照的に、１Ｄ１１はこれらのマウスの流入領域リンパ節における転移の数に影響はなかった。これらの結果は、ＴＧＦ－β阻害作用の機構は適応細胞性免疫によることを示唆している。

【実施例10】

【0161】

がんでのＴＧＦ－β特徴
先の研究は、抗ＰＤ－１治療に応答しないメラノーマ患者は、転写特徴ＩＰＲＥＳ（Hugo et al., Cell (2016) 165:35-44）を有することを示した。抗ＰＤ－１単独治療への自然抵抗性の機構を調べるため、本発明者らは、非応答者対応答者の転写特徴を研究した。本発明者らは、１Ｍプロファイルを超えるデータベースにＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｓを使用するこれらのプロファイルの比較が、腫瘍において抗ＰＤ－１応答とＴＧＦ－βシグナル伝達の活性化との間の強い相関を明らかにしたことを見出した。これらのデータは、メラノーマのベースラインで、ＴＧＦ－βが抗ＰＤ－１単独治療への自然耐性に関連することを示唆した。

【0162】

さらに、本発明者らは、抗ＰＤ－１応答とＴＧＦ－βシグナル伝達の活性化との間に相関があるだけでなく、その相関が強いことも見出した（Ｒ＝０．５９、ｔ検定によるｐ値＜９Ｅ－４）。したがって、本発明者らは、以下の、本発明者らのゲートウェイインディ
ケーション１に到達した：メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ）におけるＴＧＦ－β媒介免疫抑制が自然耐性に寄与できる。さらに、本発明者らは、ＴＧＦ－β誘導性の遺伝子発現変化は、１Ｄ１１処置によってクエンチ可能であることを見出し、ＴＧＦ－β活性化の特徴の特異性を確認した。これらの結果は、抗ＴＧＦ－βと抗ＰＤ－１治療剤を組み合わせて使用し、抗ＰＤ－１単独治療に応答しないがん患者を処置する利点を支持した。

【0163】

メラノーマ以外にも、他の腫瘍型にわたるこの相関の分析は、間葉腫（例えば、ＣＲＣ、ＨＣＣ、頭頚部扁平上皮癌、および卵巣がん）も、ＴＧＦ－β活性化および予測される抗ＰＤ－１耐性の両方がエンリッチされていたことを明らかにした。この所見は、ＥＭＴにおけるＴＧＦ－βシグナル伝達の役割と一致した。したがって、本発明者らは、以下の、本発明者らのゲートウェイインディケーション２に到達した：間葉腫、特に免疫浸潤を伴うものは、抗ＴＧＦ－βおよび抗ＰＤ－１組み合わせ治療から恩恵を受ける。機械学習手法を使用して、３０を超えるＥＭＴマーカー遺伝子から間葉腫を選択するために使用される少数の遺伝子；例えば、ＡＣＴＡ２、ＶＩＭ、ＭＧＰ、ＺＥＢ２、およびＺＷＩＮＴを同定した。ＡＣＴＡ２およびＶＩＭは、例えば腫瘍型にわたってトランスポータブルであることが見出された。したがって、ＴＧＦ－β活性化の転写特徴および特徴内の遺伝子は、抗ＴＧＦ－βおよび抗ＰＤ－１抗体組み合わせ治療のベースラインでがん患者選択の有用なバイオマーカーとして寄与し得る。

【0164】

腫瘍微小環境におけるバイオマーカーを研究するため、患者腫瘍の免疫構造を、ＣＲＣおよびメラノーマにおいて、ＭｕｌｔｉＯｍｙｘ、マルチプレックスＩＨＣアッセイを使用して評価した。多重化は、各腫瘍サンプルからの１つのＦＦＰＥ切片において１２個のバイオマーカーによって実施した（２２個の免疫細胞型を合わせて説明する）。研究は、炎症の範囲を含み、分析がどの程度各腫瘍型を評価し、可能な処置効果に相関させるか評価した。統計的な方法が、細胞集団レベルでの違いを評価するために開発され、複製一致、分散の分析のための火山型序列、および相関行列を含む。ＭｕｌｔｉＯｍｙｘアッセイは、優れた技術的な再現性および正確さ、好適なダイナミックレンジ、選択免疫細胞および対象の領域における炎症状態の違いを実証し、細胞集団の間の陽性および陰性相関の両方を含んだ。

【実施例11】

【0165】

抗ＰＤ－１有りまたは無しでのＡｂ１による処置後のＭＣ３８腫瘍におけるＴＧＦ－β１、ＭＩＰ－２、およびＫＣ／ＧＲＯの変化
ＴＧＦ－βの中和を実証するため、Ａｂ１（抗ＰＤ－１有りまたは無し）の腫瘍におけるサイトカインの発現に影響を及ぼす能力を評価した。

【0166】

ＭＣ３８腫瘍担持マウスは、腫瘍の容積が６１から１１０ｍｍ^３であった場合、ＰＢＳまたは抗ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ）いずれかのみの単回用量、または抗ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた漸増用量のＡｂ１（１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって処置した。腫瘍は、処置後１時間、６時間、１０時間、２４時間、７２時間、および１６８時間で回収し、２．８ｍｍセラミックボール（Ｐｒｅｃｙｌｌｙｓ ＫＴ３９６１－１００７．２）を含む２ｍｌプラスチックチューブ内で急速冷凍し、－８０℃で保存した。ライセートを調製するため、腫瘍は室温で溶かした。１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ７８４４０）を補足したコールドのＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ （ＭＳＤ） Ｔｒｉｓ溶解緩衝液（Ｒ６０ＴＸ－２） １ｍＬを組織に添加し、次いでＰｒｅｃｅｌｌｙ（登録商標）２４Ｄｕａｌホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、４℃で、それぞれ６５００ｒｐｍ、２０秒で２サイクル、ホモジナイズした。ライセートは、４℃のエッペンドルフ５４１７Ｃ遠心分離機で、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離によって精製した。上澄み液を、きれいな冷やしたエッペンドルフチューブに移し
、上記のようにさらに３０分間遠心分離によってさらに精製した。上澄み液をプラスチック９６ウェル保存ブロックに移し、氷上に置いた。ライセートのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ ２３２２５）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。ライセートは、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＭＳＤ Ｔｒｉｓ溶解緩衝液（上記参照）を使用して、およそ５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にノーマライズし、プラスチックマイクロチューブに分配し、液体窒素で急速冷凍し、－８０℃で保存した。

【0167】

腫瘍ライセートの活性化ＴＧＦ－β１の濃度は、電気化学発光アッセイを用いるヒトＴＧＦ－β１キット（ＭＳＤ、Ｋ１５１ＩＵＣ－２）を使用して測定した。ＭＳＤ溶解緩衝液中で段階希釈した組換えマウスＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、７６６６－ＭＢ－００５）をキャリブレータ―として使用した。上記のように調製したノーマライズした腫瘍ライセートを溶かし、アッセイは製造業者の指示に従って実施した。潜在関連ペプチドと複合体を形成したＴＧＦβ－１を含む全ＴＧＦβ－１よりも腫瘍に存在するＴＧＦβ－１の活性型のみを定量するために、サンプルの酸処置は行わなかった。サンプルは、プレート上に２回ロードした。電気化学発光シグナルはＭＥＳＯ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ ６００プレートリーダー（ＭＳＤ）を使用して測定し、サンプル中のＴＧＦβ－１濃度はＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアｖ．４．０を使用して標準曲線に基づいて定量した。

【0168】

ＰＢＳまたは抗ＰＤ－１いずれかのみで処置した動物と比較して、抗ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ）と一緒に全ての投与レベル（１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ）でＡｂ１によって処置した動物は、腫瘍の活性化ＴＧＦ－βレベルの減少を示し、ｉｎ ｖｉｖｏでその標的とのＡｂ１のエンゲージメントを実証した（図１０Ａ）。活性ＴＧＦ－β１の低下レベルは１時間以内に観察され、少なくとも１６８時間持続した。

【0169】

ＭＩＰ－２（ＣＸＣＬ２）およびＫＣ／ＧＲＯ（ＣＸＣＬ１）は、好中球を含む顆粒球の走化性ケモカインである。ＭＩＰ－２およびＫＣ／ＧＲＯのレベルは、これらの同じサンプルでも評価した。抗ＰＤ－１と一緒にＡｂ１により処置した後、ＭＩＰ－２の腫瘍内レベルは、ＰＢＳまたは抗ＰＤ－１いずれかのみで処置した動物のものと比較して抗ＰＤ－１と一緒にＡｂ－１によって処置した動物において少なくとも４倍の増加を示し；ＭＩＰ－２レベルの増加は少なくも１６８時間続くことが示された（図１０Ｂ）。同様に、ＫＣ／ＧＲＯのレベルも増加することが示されたが、ＭＩＰ－２のものと比較して７２および１６８時間の遅い時点であった（図１０Ｃ）。したがって、Ａｂ１と抗ＰＤ－１ｍＡｂの組み合わせは、ＭＩＰ－２およびＫＣ／ＧＲＯのレベルの増加より早い活性ＴＧＦ－β１のレベルの減少を誘導した。これらの結果は、Ａｂ１が、腫瘍微小環境内でＴＧＦ－βのレベルを減少および阻害できることを実証した。さらに、ＭＩＰ－２およびＫＣ／ＧＲＯレベルの観察された増加は、それらがＴＧＦ－βの中和によって影響されるサイトカインであり、したがってＡｂ１によって処置した患者における利用可能性のあるバイオマーカーとして寄与できることを示した。

【実施例12】

【0170】

Ａｂ１処置によるＮＫ細胞クラスタリングの修復
ＴＧＦ－βは、異なる免疫細胞型の活性を阻害することによって免疫システムに影響することが公知である。ＴＧＦ－βは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性およびＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣを阻害することが報告されている（Trotta et al., Journal of immunology
(2008) 181:3784-3792）。ＮＫ細胞は、それらの活性を増強する機構として密なクラス
ターを形成し、これらの密に詰め込まれたクラスター内のＩＬ－２の局在を介して活性化することが近年報告されている（Kim et al., Scientific Reports (2017) 7:40623）。
ＩＬ－２の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏでクラスター化した精製ヒトＮＫ細胞は、これらの
密に詰め込まれたクラスターを形成することが示された。

【0171】

本研究では、本発明者らは、Ａｂ１の非存在下または存在下でのＮＫ細胞「クラスタリング」へのＴＧＦ－βの効果を評価した。ＮＫ細胞は、製造業者のプロトコールに従ってＮＫ細胞ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ試薬（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によるネガティブセレクションによって健康なドナーの血液から新しく単離した。ＮＫ細胞は、丸底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）で、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補足したＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）中１．２×１０^５個の細胞／ウェルで培養した。ＴＧＦ－β１は、示した通り、無関係のＩｇＧ４またはＡｂ１ １００μｇ／ｍＬのいずれかの存在下で、最終濃度０．１、１または１０ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞は７２時間培養し、ＮＫ細胞クラスタリングは、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡で画像を捕らえることによって可視化した。

【0172】

漸増用量のＴＧＦ－β１の添加は、ＮＫ細胞クラスタリングを阻害することを示した。ＩｇＧ４コントロール抗体ではなくＡｂ１を、ＮＫ細胞培養に添加した場合、ＮＫ細胞クラスターが発生することが示された。この結果は、ＴＧＦ－β中和がＮＫ細胞活性化に影響し、活性化の増加およびＮＫ細胞の増殖をもたらし、免疫システムの抗腫瘍応答を支持することを実証した。

【実施例13】

【0173】

Ａｂ１処置による増殖性ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生のＴＧＦ－β媒介抑制の復帰
自然免疫システムに加えて、ＴＧＦ－βはＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性を阻害することが報告されている（Flavell et al., Nature Reviews Immunology (2010) 10:554-567）。ＣＤ
８^＋Ｔ細胞活性へのＴＧＦ－βおよびＡｂ１の役割を探索するため、精製したヒトＣＤ３^＋細胞がＢＬＣＬ細胞と混合されたＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイシステムが確立された。ＣＤ８^＋細胞増殖およびＩＦＮ－γ産生をまず、ＴＧＦ－βの存在下で評価した。特に、ＣＤ３^＋細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配単離後に健常なドナーから分画したＰＢＭＣから、ＥａｓｙＳｅｐ Ｔ Ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して単離した。ＣＤ３^＋細胞は、次いで、製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）によって標識した。ＭＬＲアッセイは、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ中で、標識したＣＤ３^＋細胞（２×１０^５個の細胞）を照射したＢＬＣＬ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ
Ｂｉｏ）（２×１０^４個の細胞；２分）と混合することによって実施した。示したように、ＴＧＦ－β１、ＩｇＧ４コントロール抗体および／またはＡｂ１を培養物に添加し、培養物は４日間５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。細胞は、次いで、ＰＭＡ細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびタンパク質トランスポーター阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の存在下で４時間刺激した。生細胞を、氷上でＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ生存能色素（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって識別し、ＦＡＣｓ緩衝液で洗浄した。細胞はＴｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で固定し、洗浄し、ペレット化し、ＦＡＣｓ緩衝液中に再懸濁した。細胞は、ＢＶ６５０抗－ｈｕＣＤ４、ＰＥＲＣＰ／Ｃｙ５．５ 抗－ｈｕＣＤ８、ＦＩＴＣ抗－ｈｕＣＤ３、およびＰＥ抗－ｈｕＩＦＮγ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色することによってフローサイトメトリーのために調製した。フローサイトメトリーは、ＢＤ Ｃａｎｔｏで実行し、結果はＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析し、生細胞、単一、およびＣＤ３^＋細胞をゲートした。ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージは、減少したＣｅｌｌＴｒａｃｅ
Ｖｉｏｌｅｔ染色に基づくと増殖を経ており、ＩＮＦ－γ染色に陽性であるＣＤ８^＋細胞をゲートすることによって定量した。ＦＭＯは、全ての抗体染色のコントロールとして実行した。

【0174】

ＭＬＲアッセイへのＴＧＦ－βの包含は、およそ４倍までＩＦＮ－γに陽性なＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを減少させることが示された（図１１Ａ）。ＡｂまたはコントロールＡｂの包含は、ＴＧＦβの非存在下で、これらのＩＮＦγ^＋増殖ＣＤ８＋細胞の発生に効果を示さなかった（図１１Ｂ）。しかしながら、コントロール抗体ではなくＡｂ１の含有は、用量依存的な方法でＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋細胞の増殖を回復することができる。これらの結果は、ＴＧＦ－β中和が、ＩＮＦ－γを発現するエフェクターＣＤ８^＋細胞の増殖へのＴＧＦ－βの免疫抑制効果を遮断することによって、獲得免疫システムに影響することができることを実証した。これらのＩＮＦγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、抗腫瘍免疫に重要な役割を果たすことが示唆された（Ikeda et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002) 13:95-109）。

【実施例14】

【0175】

抗ＴＧＦ－β治療への同系マウスモデルの応答
この研究では、本発明者らは、どの同系マウスモデルが、抗ＴＧＦ－β抗体Ａｂ１および抗ＰＤ－１による処置への応答を予測するために使用できるかを調べた。マウスモデルを階級化するため、本発明者らは、マウスでの腫瘍へのＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤およびＴＧＦ－β経路活性化を評価した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤は、ＲＮＡＳｅｑから得たデータからＣＤ８^＋Ｔ細胞特徴に基づきアッセイした。いくつかの適応症（図１２Ａおよび１２ＢのＸ軸の下に示した）から生じる腫瘍細胞を有する１７の異なるマウス同系モデルは、全トランスクリプトームＲＮＡｓｅｑを使用して転写的にプロファイルした。この同系モデルの「一覧」は、モデルあたり使用した５から７の生物学的複製物により、共通のバックグラウンド株Ｃ５７／ＢＬ６で構築された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ２０００シーケンス後、１００万リードあたりの転写物（ＴＰＭ）で発現される遺伝子発現プロファイルをＳＴＡＲアライナーおよびＣｕｆｆｌｉｎｋｓ転写物推定量を使用して、生シーケンスリードの標準的な処理によって生成した。生じる複数サンプルデータマトリックスは、最終的にクオンタイル正規化した。

【0176】

図１２Ａは、一覧にわたるＣＤ８^＋Ｔ細胞の相対的存在量を示す（ｌｏｇ２変換）。相対的なＣＤ８^＋Ｔ細胞存在量は、ＣＤ８Ｔ細胞の存在の高度に特異的なインジケーターであることが示されている、特有のマーカー遺伝子ＣＤ８Ｂを使用して推定した（Becht et
al., Curr Opin Immunol (2016) 39:7-13; and Becht et al., Genome Biol (2016) 17:218）。各箱ひげ図は、生物学的複製物にわたる値の範囲を要約する。ＭＣ３８モデルは
、ＥＭＴ６モデルよりも約２倍多いＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤を示した（それぞれ左および右の箱）。Ａ２０およびＥＬ４リンパ腫モデルは、それぞれ全体で最高および最低レベルのＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤を示し、ＥＬ４でのＣＤ８^＋Ｔ細胞は無視できる。

【0177】

ＭＣ３８、ＭＣ３８.ｏｖａ、ＣＴ２６、およびＬ１２１０マウス細胞系は、最高レベ
ルのＣＤ８遺伝子特徴を示した。さらに、ＥＭＴ－６乳がん細胞系は、ベースラインに近いＴ細胞浸潤を示すことが示され、これは、ＥＭＴ６腫瘍が免疫排除表現型を有するという近年の報告と一致している（S. Mariathasan et al. 2017, ESMO Immuno-Oncology Congress, Geneva, Geneva Switzerland）。

【0178】

図１２Ｂは、一覧にわたるＴＧＦ－β経路活性化を示す。ＴＧＦβによるＭＣＦ７細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に由来し、いくつかの他のＴＧＦ－β特徴での比較によって確認された、ＴＧＦ－β経路活性化の１７０個の遺伝子の転写の特徴を使用して、一覧の各プロファイルに経路活性化スコアを割り当てた。スコアは、「制御遺伝子セットエンリッチメント分析」（rGSEA, Theilhaber et al. 2014）を使用して計算し、遺伝子バックグラ
ウンドに対する特徴遺伝子のエンリッチメントをｌｏｇ２として表した。ＭＣ３８モデルは平均の活性化を示したが、ＥＭＴ６モデルは非常に高いＴＧＦ－β経路活性化を示した（それぞれ、左および右の箱）。

【実施例15】

【0179】

マウス乳がんモデルへのＡｂ１および抗ＰＤ１抗体組み合わせの効果
この研究では、本発明者らは、抗ＰＤ－１有りまたは無しでのＡｂ１の治療効果を調べた。指数関数的に増殖するＥＭＴ－６乳房細胞（ＣＲＬ－２７５５、ＡＴＣＣ）を、５％ＣＯ_２で加湿したインキュベータ内で、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ－１６４０中で培養し、次いで雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）のわき腹に皮下移植した（０．５×１０^６個の細胞／マウス）。腫瘍が平均サイズ６８～１１６ｍｍ^３に達すると、マウスはプールされ、無作為にコントロールと処置群に分けた（群あたり１０匹のマウス）。腫瘍担持マウスは、次いで、ＰＢＳ、Ａｂ１（１０および２５ｍｇ／ｋｇ）によって、各動物に、全部で６回用量のため週に３回腹腔内に処置した。腫瘍は、デジタルキャリパーによって週に２回測定し、腫瘍体積を算出し（ｍｍ^３＝Ｌ×Ｗ×Ｈ）、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してグラフ化した。腫瘍が＞３０００ｍｍ^３に成長した場合、または腫瘍が腫瘍表面の＞２０％の潰瘍形成を示した場合、マウスは研究の終了時にＣＯ_２によって安楽死させた。

【0180】

単一薬剤として、１０または２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄの用量のＡｂ１および５ｍｇ／ｋｇの用量のマウスα－ＰＤ－１抗体は、ＥＭＴ－６腫瘍担持マウスにおいて、それぞれ１／１０、２／１０および２／１０の完全退縮である部分活性を実証した。１０または２５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄの用量のＡｂ１と５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄのマウスα－ＰＤ－１抗体の組み合わせは、治療的に活性であった。移植後３１日目に、ベースラインからの腫瘍体積変化を比較する場合、試験した全ての用量のＡｂ１と５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｄのマウスα－ＰＤ－１抗体の組み合わせの効果は、Ａｂ１ １０および２５ｍｇ／ｋｇそれぞれで７／１０および４／１０の完全退縮であり、各単一薬剤の効果よりも大きかった。表１０は、結果の要約である。

【0181】

【表11】

【0182】

本明細書で他に記載しない限り、本発明に関係して使用した科学および技術用語は当業者に共通に理解される意味を有する。例示的な方法および材料は以下に記載したが、本明
細書に記載のものと類似のまたは等しい方法および材料も本発明の実施または試験に使用される。本明細書に記載の全ての文献および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。抵触する場合には、定義を含む本明細書が制御する。多くの文章が本明細書に引用されるが、この引用は、これらの文章のいずれかが当技術分野の共通の一般的知識の一部を形成することを認めない。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形用語は単数も含む。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬品および薬学的化学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法およびその技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の指示に従って実施した。この明細書および実施形態を通して、単語「有する（have）」および「含む（comprise）」、または「has」、「having」、「comprises」または「comprising」のような変化形は、言及した整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないと理解される。

【0183】

本明細書に記載の配列を以下に列挙する。

【0184】

〔配列表〕
配列番号１（Ａｂ１重鎖）
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFS SNVISWVRQA PGQGLEWMGG VIPIVDIANY
AQRFKGRVTI TADESTSTTY MELSSLRSED TAVYYCASTL GLVLDAMDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
配列番号２（Ａｂ１軽鎖）
ETVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSLG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRAPGIP
DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYADSPITFG QGTRLEIKRT VAAPSVFIFP
PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL
TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
配列番号３（リーダー配列－１～１９残基を含む、フレソリムマブ重鎖）
MGWSCIILFL VATATGVHSQ VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGYTFSS NVISWVRQAP
GQGLEWMGGV IPIVDIANYA QRFKGRVTIT ADESTSTTYM ELSSLRSEDT AVYYCASTLG
LVLDAMDYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW
NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK
YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG
VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG
QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLGK
配列番号４（リーダー配列－１～１９残基を含む、フレソリムマブ軽鎖）
MGWSCIILFL VATATGVHSE TVLTQSPGTL SLSPGERATL SCRASQSLGS SYLAWYQQKP
GQAPRLLIYG ASSRAPGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP EDFAVYYCQQ YADSPITFGQ
GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号５（抗ＰＤ－１Ｍａｂ重鎖）
EVQLLESGGV LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NFGMTWVRQA PGKGLEWVSG ISGGGRDTYF
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLKGED TAVYYCVKWG NIYFDYWGQG TLVTVSSAST
KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK
配列番号６（抗ＰＤ－１Ｍａｂ軽鎖）
DIQMTQSPSS LSASVGDSIT ITCRASLSIN TFLNWYQQKP GKAPNLLIYA ASSLHGGVPS
RFSGSGSGTD FTLTIRTLQP EDFATYYCQQ SSNTPFTFGP GTVVDFRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号７（ｘ－抗ｍＰＤ－１Ｍａｂ重鎖）
EVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCSVTGYSIT SSYRWNWIRK FPGNRLEWMG YINSAGISNY
NPSLKRRISI TRDTSKNQFF LQVNSVTTED AATYYCARSD NMGTTPFTYW GQGTLVTVSS
AKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD
LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT VPEVSSVFIF
PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV
SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV
SLTCMITDFF PEDITVEWQW NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFVYSKLNVQ KSNWEAGNTF
TCSVLHEGLH NHHTEKSLSH SPG
配列番号８（ｘ－抗ｍＰＤ－１Ｍａｂ軽鎖）
DIVMTQGTLP NPVPSGESVS ITCRSSKSLL YSDGKTYLNW YLQRPGQSPQ LLIYWMSTRA
SGVSDRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDVGI YYCQQGLEFP TFGGGTKLEL KRADAAPTVS
IFPPSTEQLA TGGASVVCLM NNFYPRDISV KWKIDGTERR DGVLDSVTDQ DSKDSTYSMS
STLSLTKADY ESHNLYTCEV VHKTSSSPVV KSFNRNEC
配列番号９（１Ｄ１１重鎖）
HVQLQQSGPE LVRPGASVKL SCKASGYIFI TYWMNWVKQR PGQGLEWIGQ IFPASGSTNY
NEMFEGKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARGD GNYALDAMDY WGQGTSVTVS
SAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS
DLYTLSSSVT VPSSTWPSQT VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI
FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTKPR EEQFNSTFRS
VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK
VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG SYFVYSKLNV QKSNWEAGNT
FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK
配列番号１０（１Ｄ１１軽鎖）
NIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYGNSFMHWY QQKSGQPPKL LIYLASNLES
GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPL TFGAGTKLEL KRADAAPTVS
IFPPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS
STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【配列表】

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