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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-12-28
(45)【発行日】2024-01-12
(54)【発明の名称】乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240104BHJP
A23L 33/135 20160101ALN20240104BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240104BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
C12N1/20 E
A23L33/135
C12N15/11 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2022546228
(86)(22)【出願日】2021-08-20
(86)【国際出願番号】 JP2021030571
(87)【国際公開番号】W WO2022050082
(87)【国際公開日】2022-03-10
【審査請求日】2022-11-09
(31)【優先権主張番号】P 2020146884
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】野地 智法
(72)【発明者】
【氏名】宇佐美 克紀
(72)【発明者】
【氏名】麻生 久
(72)【発明者】
【氏名】清野 宏
(72)【発明者】
【氏名】藤橋 浩太郎
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 慎太郎
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１０－２２７０４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１７７１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Database Genbank [オンライン］，2008年04月30日，Accession No.EU136694Internet, <URL:https:// www.ncbi.nlm.gov/nuccore/eu136694>,
【文献】Database Genbank [オンライン]，2012年11月09日，Accession No.AB547676, <URL:https:// www.ncbi.nlm.gov/nuccore/ab547676>
【文献】細野朗，バクテロイデスと免疫，腸内細菌額雑誌，第27巻，2013年，pp.203-209
【文献】YANAGIBASHI, Tsutomu et al.，Bacteroides Induce Higher IgA Production Than Lactobacillus by Increasing Activation-Induced Cytidine Deaminase Expression in B Cells in Murine Peyer's Patches.，Biosci. Biotechnol. Biochem.，2009年，Vol.73, No.2，pp.372-377
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ １／３８
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ａ２３Ｌ ３３／００－ ３３／２９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株；並びに配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株；
から選択される細菌株を、１又は２種以上含むことを特徴とする乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤。
【請求項2】
細菌株が、パイエル板における免疫機能を活性化し、ＩｇＡ抗体産生形質細胞数を増加させる作用を有することを特徴とする請求項１に記載の増加剤。
【請求項3】
腸内細菌叢に占める、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するバクテロイデス属細菌株、及び配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するプレボテラ属細菌株の割合が低下した哺乳動物母体に接種することを特徴とする請求項１又は２に記載の増加剤。
【請求項4】
経口接種することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の増加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳汁中のＩｇＡ抗体（以下、単に「ＩｇＡ」ということがある）含有量を増加する作用を有する腸内共生菌を有効成分として含有する、乳汁中のＩｇＡ含有量の増加剤に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物は、本来宿主生体にとっては異物であることから、免疫システムにより排除される対象となり得るが、腸内共生菌は腸管免疫システムによる積極的な排除を受けずに腸管内に共生する特徴を有する。ヒトをはじめとする哺乳動物は、無菌状態で誕生後、外界と接触することにより様々な細菌に感染し、腸内細菌叢が構成されていく。ヒト腸管内には、約１０００種類以上の腸内共生菌が、約百兆個以上存在し、腸管内環境に大きな影響を及ぼしていると考えられている。
【0003】
バクテロイデス属細菌は、従来、有用性の少ない日和見菌であると考えられてきた。また、嫌気性菌であるため、培養が困難であり、増殖メカニズムをはじめ、不明な点が多かった。近年のバクテロイデス属細菌に関する研究により、例えば、腸管リンパ組織であるパイエル板細胞を、バクテロイデス属細菌の加熱死滅細菌の存在下で培養すると、乳酸菌であるラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌の加熱死滅細菌の存在下で培養した場合と比べ、培養上清中に分泌されるＩｇＡ量が多いことが報告されている（非特許文献１、２）。また、Bacteroides acidifaciensが、糖・脂質代謝異常を原因とする代謝性疾患に対して治療効果を有することが報告されている（特許文献１）。しかしながら、腸内共生菌（すなわち、腸内細菌叢を構成する細菌）と、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量との関連性については、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０１７－５３８７０２号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】腸内細菌学雑誌 ２７：２０３－２０９，２０１３
【文献】Biosci Biotechnol Biochem. 2009 Feb;73(2):372-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、乳汁中のＩｇＡ含有量を増加する作用を有する腸内共生菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、まず、授乳期の哺乳動物母体において、パイエル板（Peyer’s patches、以下、「ＰＰ」ということがある）における免疫機能が活性化することにより、ＰＰより乳腺にＩｇＡ産生形質細胞が遊走した結果、乳汁中のＩｇＡ含有量が増加することを見いだした。また、授乳期の哺乳動物母体の腸内細菌叢全体に占めるバクテロイデス属細菌株（Bacteroides acidifaciens）及びプレボテラ属細菌株（Prevotella buccalis）の割合が低下すると、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞数及び乳汁中のＩｇＡ含有量が減少することを確認した。さらに、腸内細菌叢全体に占めるこれら細菌種の割合が低下した授乳期の哺乳動物母体が、株化されたこれらの細菌種を経口接種すると、乳腺に存在するＩｇＡ産生形質細胞数及び乳汁中のＩｇＡ含有量が増加することを見いだした。本発明は、これら知見に基づき、完成するに至ったものである。
【0008】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株；並びに
配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株；
から選択される細菌株を、１又は２種以上含むことを特徴とする乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤。
〔２〕細菌株が、パイエル板における免疫機能を活性化し、ＩｇＡ抗体産生形質細胞数を増加させる作用を有することを特徴とする上記〔１〕に記載の増加剤。
〔３〕腸内細菌叢に占める、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するバクテロイデス属細菌株、及び配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するプレボテラ属細菌株の割合が低下した哺乳動物母体に接種することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の増加剤。
〔４〕経口接種することを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の増強剤。
〔１〕配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株；並びに
配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株；
から選択される細菌株を、１又は２種以上含むことを特徴とする乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤。
〔２〕細菌株が、パイエル板における免疫機能を活性化し、ＩｇＡ抗体産生形質細胞数を増加させる作用を有することを特徴とする上記〔１〕に記載の増加剤。
〔３〕腸内細菌叢に占める、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するバクテロイデス属細菌株、及び配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するプレボテラ属細菌株の割合が低下した哺乳動物母体に接種することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の増加剤。
〔４〕経口接種することを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の増強剤。
【0009】
また本発明の実施の他の形態として、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株（以下、「本件バクテロイデス属細菌株」ということがある）；並びに、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株（以下、「本件プレボテラ属細菌株」ということがある）；から選択される細菌株（以下、これらを総称して「本件細菌株」ということがある）の１又は２種以上を、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加を必要とする哺乳動物母体に接種するステップを含む、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する方法；や、
乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加における使用のための、１又は２種以上の本件細菌株；や、
乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤を製造するための、１又は２種以上の本件細菌株の使用；
を挙げることができる。
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株（以下、「本件バクテロイデス属細菌株」ということがある）；並びに、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株（以下、「本件プレボテラ属細菌株」ということがある）；から選択される細菌株（以下、これらを総称して「本件細菌株」ということがある）の１又は２種以上を、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加を必要とする哺乳動物母体に接種するステップを含む、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する方法；や、
乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加における使用のための、１又は２種以上の本件細菌株；や、
乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤を製造するための、１又は２種以上の本件細菌株の使用；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【0010】
本件細菌株は、乳汁中のＩｇＡ含有量を増加する作用を有する。特に、ストレスや抗生物質の投与等の腸内細菌叢を乱す要因により、腸内細菌叢全体に占める本件細菌株の割合が低下した結果、乳汁中のＩｇＡ含有量が低下した授乳期の哺乳動物母体に、本件細菌株を接種すると、本件細菌株による効果により、乳汁中のＩｇＡ含有量が増加するため、かかる乳汁を摂取した乳児期（具体的には、自力でＩｇＡを産生する能力がない又は低い時期）の仔の病原性細菌感染やウイルス感染を効果的に予防することができ、畜産業の生産性向上に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１Ａ及び１Ｂは、乳腺における細胞について、ＩｇＡ抗体産生レベル及び形質細胞マーカーの一つであるＣＤ９３の発現レベルを解析した結果を示す図である。図１Ａ中の数値は、細胞全体に対する、四角で囲った領域に含まれる細胞の割合（％）を示す。図１Ｂの「ＩｇＡ ｈｉｇｈ」は、図１Ａ中の四角で囲った領域のうち、「ｈｉｇｈ」の領域に含まれる細胞（すなわち、ＩｇＡ抗体を高レベルで産生する形質細胞）を示す。また、図１Ｂの「ＩｇＡ ｌоｗ」は、図１Ａ中の四角で囲った領域のうち、「ｌоｗ」の領域に含まれる細胞（すなわち、ＩｇＡ抗体を低レベルで産生する細胞）を示す。図１Ｃは、乳腺における細胞について、ＩｇＡ抗体産生レベル及び４種類の細胞表面マーカー（Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、Ｉ－Ａｄ、及びＣＤ１１ｂ）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図１Ｃ中の四角で囲った領域は、ＩｇＡ抗体を高レベルで産生する形質細胞を示す。また、図１Ｃ中の数値は、細胞全体に対するＩｇＡ抗体を高レベルで産生する形質細胞の割合（％）を示す。
【図2】図２Ａは、３種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス［図中の「非欠損」］、鼠径リンパ節（以下、「ＩＬＮ」ということがある）欠損マウス［図中の「ＩＬＮ欠損」］、及びＰＰ欠損マウス［図中の「ＰＰ欠損」］）の乳腺における形質細胞の存在割合について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図２Ｂは、図２Ａの結果を基に、乳腺に存在するＩｇＡ産生形質細胞（図２Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図２Ｃは、上記３種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊＊」は、それぞれ統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０００１）を示す（以下、同じ）。また、図中の白丸（○）は、各サンプルを示す（以下、同じ）。
【図3】図３Ａは、３種類の免疫不全（C.B-17/Icr-scid/scidJcl）母マウス（野生型C.B-17/Icr-+/+Jclマウス［以下、「野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウス」ということがある］のＩＬＮ由来単核細胞を移入した免疫不全マウス［図中の「ＩＬＮ由来単核細胞移入」］；野生型マウスのＰＰ由来単核細胞を移入した免疫不全マウス［図中の「ＰＰ由来単核細胞移入」］；及びこれら細胞未移入の免疫不全マウス［図中の「未移入」］）の乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図３Ｂは、図３Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図３Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図３Ｃは、上記３種類の免疫不全（C.B-17/Icr-scid/scidJcl）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．００１）を示す（以下、同じ）。なお、本実施例において、統計処理は、Prism 7ソフトウェアを用いた多重比較検定を用いて行った。
【図4】図４Ａは、２種類の近交系（Ｃ５７ＢＬ／６）母マウス（Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス［図中の「Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ」］；及び、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを基に作製した、腸管上皮特異的にＳｐｉＢ遺伝子が欠損したマウス［以下、「ＳｐｉＢ ｃＫＯマウス」ということがある］［図中の「ＳｐｉＢ ｃＫＯ」］）の乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図４Ｂは、図４Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図４Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図４Ｃは、上記２種類の近交系（Ｃ５７ＢＬ／６）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図5】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、３種類の抗生物質（アンピシリン［図中の「Ａｍｐ」、ネオマイシン［図中の「Ｎｅо」］、及びバンコマイシン［図中の「Ｖａｎ」］］）又はこれらの混合物（図中の「Ｍｉｘ」）を含む水、あるいは抗生物質不含の水（図中の「ＤＷ」）を自由飲水させた後、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図５Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図５Ｂ及び５Ｃ）を解析した結果を示す図である。図５Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図５Ｂ及び５Ｃにおける数値（１～７）は、各個体マウスを示す。
【図6】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、３種類の抗生物質（アンピシリン［図中の「Ａｍｐ」、ネオマイシン［図中の「Ｎｅо」］、及びバンコマイシン［図中の「Ｖａｎ」］］）又はこれらの混合物（図中の「Ｍｉｘ」）を含む水、あるいは抗生物質不含の水（図中の「ＤＷ」）を自由飲水させた後、腸内細菌叢に占める割合が特に大きく変化した４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図６Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図６Ｂ］、Prevotella buccalis［図６Ｃ］、及びEscherichia albertii［図６Ｄ］）の割合を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＊」は、統計学的に有意差があること（ｐ＜０．０５）を示す（以下、同じ）。
【図7】図７Ａは、近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、５種類の水（アンピシリン［図中の「Ａｍｐ」］を含む水；ネオマイシン［図中の「Ｎｅо」］を含む水；バンコマイシン［図中の「Ｖａｎ」］を含む水；これら３種類の抗生物質の混合物［図中の「Ｍｉｘ」］を含む水；又は抗生物質不含の水［図中の「ＤＷ」］）を自由飲水させた後、乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図７Ｂは、図７Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図７Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図７Ｃは、各種水を自由飲水した上記近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図8】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、３種類の抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、及びバンコマイシン）の混合物（以下、単に「抗生物質混合物」ということがある）を含む水を自由飲水させた後、授乳期の健常近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの糞便を用いた便微生物移植（ＦＭＴ；fecal microbiota transplantation）を行うか（図中の「ＦＭＴ ＋」）、あるいはＦＭＴを行わずに（図中の「ＦＭＴ －」）、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図８Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図８Ｂ及び８Ｃ）を解析した結果を示す図である。図８Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図８Ｂ及び８Ｃにおける数値各（１～７）は、各個体マウスを示す。
【図9】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、３種類の抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、及びバンコマイシン）の混合物（以下、単に「抗生物質混合物」ということがある）を含む水を自由飲水させた後、授乳期の健常近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの糞便を用いたＦＭＴを行うか（図中の「ＦＭＴ ＋」）、あるいはＦＭＴを行わなずに（図中の「ＦＭＴ －」）、腸内細菌叢に占める４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図９Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図９Ｂ］、Prevotella buccalis［図９Ｃ］、及びEscherichia albertii［図９Ｄ］）の割合を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図10】図１０Ａは、近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、上記３種類の抗生物質の混合物を含む水を自由飲水させた後、授乳期の健常近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの糞便を用いたＦＭＴを行うか（図中の「ＦＭＴ ＋」）、あるいはＦＭＴを行わなずに（図中の「ＦＭＴ －」）、乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図１０Ｂは、図１０Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図１０Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図１０Ｃは、ＦＭＴを行った（図中の「ＦＭＴ ＋」）又はＦＭＴを行わなかった（図中の「ＦＭＴ －」）上記近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図11】図１１Ａは、３種類の母マウス（ＳＰＦマウス［図中の「ＳＰＦ」］、ＧＦマウス［図中の「ＧＦ」］、及び免疫不全マウス［図中の「ＳＣＩＤ」］）の乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図１１Ｂは、ＳＰＦマウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体について、３種類の母マウス（ＳＰＦマウス［図中の「ＳＰＦ」］、ＧＦマウス［図中の「ＧＦ」］、及び免疫不全マウス［図中の「ＳＣＩＤ」］）の糞便中に含まれる微生物に対する反応性を解析した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図12】図１２Ａは、３種類の母マウス（野生型マウス［図中の「野生型」］；野生型マウスの骨髄由来単核球を移植［ＢＭＴ；bone marrow transplantation］した免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ＋」］；及びＢＭＴを行わなかった免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ－」］）の小腸組織を、ヘマトキシリン・エオシン染色により解析した結果を示す図である。中段及び下段における各図（１～５）は、上段の図中の四角で囲った領域（１～５）の拡大図である。図中のスケールバーは、５００μｍを示す。図１２Ｂは、上記３種類の母マウスの小腸組織を、Ｔ細胞を検出する抗ＣＤ３抗体とＢ細胞を検出する抗Ｂ２２０抗体を用いた免疫組織染色法により解析した結果を示す図である。図中の矢印が示す白線で囲った領域は、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）が存在することを示し、矢頭が示す白線で囲った領域は、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）が存在することを示す。
【図13】３種類の母マウス（野生型マウス［図中の「野生型」］；野生型マウスの骨髄由来単核球をＢＭＴした免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ＋」］；及びＢＭＴを行わなかった免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ－」］）について、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図１３Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図１３Ｂ及び１３Ｃ）を解析した結果を示す図である。図１３Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図１３Ｂ及び１３Ｃにおける数値各（１～６）は、各個体マウスを示す。
【図14】２種類の母マウス（野生型マウス［図１４Ａ］及び免疫不全マウス［図１４Ｂ］）の乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体について、３種類の母マウス（野生型マウス［図中の「野生型」］；野生型マウス由来の骨髄単核球をＢＭＴした免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ＋」］；及びＢＭＴを行わなかった免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ－」］）の糞便中に含まれる微生物に対する反応性を解析した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＃」及び「＃＃」は、t-testにより統計学的に有意差があること（それぞれ、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）を示す。
【図15】３種類の母マウス（野生型マウス［図中の「野生型」］；野生型マウス由来の骨髄単核球をＢＭＴした免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ＋」］；及びＢＭＴを行わなかった免疫不全マウス［図中の「免疫不全 ＢＭＴ－」］）について、腸内細菌叢に占める４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図１５Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図１５Ｂ］、Prevotella buccalis［図１５Ｃ］、及びEscherichia albertii［図１５Ｄ］）の割合を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図16】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、３種類の抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、及びバンコマイシン）の混合物を含む水を自由飲水させた後、２種類のマウス（野生型C.B-17/Icr-+/+Jclマウス、及び免疫不全［C.B-17/Icr-scid/scidJcl］マウス）由来の糞便を用いたＦＭＴを行い（図中の「野生型 ＦＭＴ」及び「免疫不全 ＦＭＴ」）、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図１６Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図１６Ｂ及び１６Ｃ）を解析した結果を示す図である。図１６Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図１６Ｂ及び１６Ｃにおける数値各（１～５）は、各個体マウスを示す。
【図17】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、上記３種類の抗生物質の混合物を含む水を自由飲水させた後、２種類のマウス（野生型マウス及び免疫不全マウス）由来の糞便を用いたＦＭＴを行い（図中の「野生型 ＦＭＴ」及び「免疫不全 ＦＭＴ」）、腸内細菌叢に占める４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図１７Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図１７Ｂ］、Prevotella buccalis［図１７Ｃ］、及びEscherichia albertii［図１７Ｄ］）の割合を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図18】図１８Ａは、近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、上記３種類の抗生物質の混合物を含む水を自由飲水させた後、２種類のマウス（野生型マウス及び免疫不全マウス）由来の糞便を用いたＦＭＴを行い（図中の「野生型 ＦＭＴ」及び「免疫不全 ＦＭＴ」）、乳腺における形質細胞のＩｇＡ抗体産生レベル及びＢ２２０発現レベルを解析した結果を示す図である。図１８Ｂは、図１８Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図１８Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図１８Ｃは、ＦＭＴを行った上記２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図19】２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens［図１９Ａ］及びPrevotella buccalis［図１９Ｂ］）について、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体に結合するもの（図中の「ＩｇＡ＋」）と、結合しないもの（図中の「ＩｇＡ－」）の割合を、かかる細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として解析した結果を示す図である。縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。
【図20】近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図２０Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図２０Ｂ及び２０Ｃ）を解析した結果を示す図である。図２０Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図２０Ｂ及び２０Ｃにおける数値各（１～８）は、各個体マウスを示す。
【図21】図２１Ａは、近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスに、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図２１Ｂは、図２１Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図２１Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図２１Ｃは、上記３種類の細菌株を接種した又は未接種の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。
【図22】ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、Parabacteroides goldsteiniiに対するＩｇＡ抗体の力価（図２２Ａ）、Bacteroides acidifaciensに対するＩｇＡ抗体の力価（図２２Ｂ）、及びPrevotella buccalisに対するＩｇＡ抗体の力価（図２２Ｃ）を測定した結果を示す図である。
【図23】２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス［図中の「非欠損」］及びＰＰ欠損マウス［図中の「ＰＰ欠損」］）に、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、細菌由来ｔｕｆ遺伝子を指標として腸内細菌の総数（図２３Ａ）と、腸内細菌叢を構成する各種細菌の割合（図２３Ｂ及び２３Ｃ）を解析した結果を示す図である。図２３Ａにおいて、縦軸は、糞便１ｍｇ当たりの各種細菌由来ｔｕｆ遺伝子のコピー数を示す。図２３Ｂ及び２３Ｃにおける数値各（１～８）は、各個体マウスを示す。
【図24】２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス［図中の「非欠損」］及びＰＰ欠損マウス［図中の「ＰＰ欠損」］）に、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、腸内細菌叢に占める４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図２４Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図２４Ｂ］、Prevotella buccalis［図２４Ｃ］、及びEscherichia albertii［図２４Ｄ］）の割合を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＊」、「＊＊＊」、及び「＊＊＊＊」は、統計学的に有意差があること（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１、及びｐ＜０．０００１）を示す。
【図25】図２５Ａは、２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス［図中の「非欠損」］及びＰＰ欠損マウス［図中の「ＰＰ欠損」］）に、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、乳腺における形質細胞について、ＩｇＡとＢ２２０をマーカーとして解析した結果を示す図である。図２５Ｂは、図２５Ａの結果を基に、ＩｇＡ産生形質細胞（図２５Ａにおける各図の右下の領域に含まれる細胞）数を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図２５Ｃは、上記３種類の細菌株を接種した又は未接種の上記２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した結果（平均値＋標準偏差）を示す図である。図中の「＊＊」、「＊＊＊」、及び「＊＊＊＊」は、統計学的に有意差があること（それぞれ、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１、及びｐ＜０．０００１）を示す。
【図26】２種類の近交系（ＢＡＬＢ／ｃ）母マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス［図中の「非欠損」］及びＰＰ欠損マウス［図中の「ＰＰ欠損」］）に、抗生物質混合物を含む水を自由飲水させ、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を接種するか（図中の「P. Goldsteinii接種」、「B. Acidifaciens接種」、及び「P. Buccalis接種」）、あるいは、これら細菌株未接種後（図中の「未接種」）、Parabacteroides goldsteiniiに対するＩｇＡ抗体の力価（図２６Ａ）、Bacteroides acidifaciensに対するＩｇＡ抗体の力価（図２６Ｂ）、及びPrevotella buccalisに対するＩｇＡ抗体の力価（図２６Ｃ）を測定した結果を示す図である。図中の「＊＊＊」及び「＊＊＊＊」は、統計学的に有意差があること（それぞれ、ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０００１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加剤は、「乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加するため」という用途に特定された、本件細菌株（すなわち、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株；並びに、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株；から選択される細菌株）を１又は２種以上含有する剤（以下、「本件増加剤」ということがある）である。ここで、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、通常、本件細菌株のゲノムＤＮＡ中に含まれる。
【0013】
本件増加剤は、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプロバイオティクスである本件細菌株を、単独で家畜用飼料や、飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（家畜用飼料組成物や、飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。上記飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。本件増加剤としては、家畜用飼料や飲食品が好ましい。
【0014】
本件バクテロイデス属細菌株は、配列番号１のヌクレオチド配列全体と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株であれば、生きた状態の細菌株であっても死滅した状態の細菌株であってもよい。本件バクテロイデス属細菌株は、後述する本実施例でその効果が実証されているBacteroides acidifaciensとは種が異なるものの、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するバクテロイデス属細菌株も包含する。本件バクテロイデス属細菌株としては、例えば、Bacteroides acidifaciens（例えば、ＪＣＭ１０５５６株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＵ１３６６９４］、ＮＭ７０＿Ｅ１０株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＫ９２９０７９］、Ａ４０株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２８６０７］、ＪＪＭ０２０７－２株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＲ３６４７４０］）、Bacteroides caecimuris（例えば、Ｉ４８株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１５４０１］、ＮＭ６３＿１－２５株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＫ９２９０７６］）、Bacteroides thetaiotaomicron（例えば、ＢＣＲＣ１０６２４株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＵ１３６６７９］、７３３０株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１２９３７］）、Bacteroides ovatus（例えば、ＡＴＣＣ ８４８３株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１２９３８］、Ｖ９７５株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＴ６２２２４６］）等を挙げることができる。
【0015】
本件プレボテラ属細菌株は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列全体と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株であれば、生きた状態の細菌株であっても死滅した状態の細菌株であってもよい。本件プレボテラ属細菌株は、後述する本実施例でその効果が実証されているPrevotella buccalisとは種が異なるものの、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量を増加する作用を有するプレボテラ属細菌株も包含する。本件プレボテラ属細菌株としては、例えば、Prevotella buccalis（例えば、ＪＣＭ１２２４６株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿１１３０９８］、ＤＣＷ＿ＳＬ＿３２Ａ株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＫ４２４０３３］、ＡＴＣＣ ３５３１０株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０４４６３０］、ＳＥＱ１８６株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＮ８６７２６１］）、ＢＶ３Ｃ７株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＮ８０９７７４）、ＢＶ３Ｐ１株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＮ８０９７６４）等を挙げることができる。
【0016】
本件バクテロイデス属細菌株及び本件プレボテラ属細菌株は、より具体的には、腸管リンパ組織であるパイエル板における免疫機能を活性化し、ＩｇＡ抗体産生形質細胞数を増加させる作用を有するものである。
【0017】
本件細菌株としては、天然に存在する本件バクテロイデス属細菌株及び本件プレボテラ属細菌株であってもよいし、遺伝子組み換え技術等を用いて、天然に存在する本件バクテロイデス属細菌株及び本件プレボテラ属細菌株を改変したものであってもよい。かかる改変株としては、例えば、幼若期の仔が引き起こす感染症（例えば、下痢症）の原因となる細菌やウイルスの抗原に対する特異的ＩｇＡ抗体を乳汁中に産生させるために、かかる抗原を発現する改変株や、哺乳動物母体の乳腺において、乳腺で引き起こされる感染症（例えば、乳腺炎／乳房炎）の原因となる抗原に対するＩｇＡ抗体の産生を誘導するために、かかる抗原を発現する改変株を挙げることができる。これら改変株を含む本件増加剤は、母体接種型母子移行ワクチンや母体の乳腺（乳房）を標的としたワクチンとしても有用である。
【0018】
本明細書において、「乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加」とは、授乳期の哺乳動物母体における乳汁中のＩｇＡ抗体含有量が、比較対照である授乳期の哺乳動物母体（以下、「比較対照母体」ということがある）における乳汁中のＩｇＡ抗体含有量と比べ、増加することを意味する。比較対照母体としては特に制限されず、ストレスや抗生物質の投与等の腸内細菌叢が乱れる要因のない授乳期の哺乳動物母体であってもよいが、後述する本実施例でその効果が実証されているため、ストレスや抗生物質の投与等の腸内細菌叢が乱れる要因のない授乳期の哺乳動物母体（換言すると、正常な腸内細菌叢を有する哺乳動物母体）と比べ、腸内細菌叢全体に占める本件バクテロイデス属細菌株及び／又は本件プレボテラ属細菌株の割合が低下した授乳期の哺乳動物母体を好適に例示することができる。乳汁中のＩｇＡ抗体含有量が増加したかどうかは、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、比較対照母体における、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の平均値；平均値＋標準偏差（ＳＤ）；平均値＋２ＳＤ；平均値＋３ＳＤ；中央値；四分位範囲等を挙げることができる。また、閾値は、感度（本件細菌株を接種した、授乳期の哺乳動物母体を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（本件細菌株を接種しなかった、授乳期の哺乳動物母体を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、本件細菌株を接種した、授乳期の哺乳動物母体における乳汁中のＩｇＡ抗体含有量のデータと、本件細菌株を接種しなかった、授乳期の哺乳動物母体における乳汁中のＩｇＡ抗体含有量のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
【0019】
本明細書において、哺乳動物としては、ヒトや、非ヒト哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜［例えば、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ］）等を挙げることができ、ヒトや家畜を好適に例示することができる。
【0020】
本件増加剤を接種する（本件増加剤の態様によっては、「投与する」又は「適用する」ともいう）対象としては、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量の増加を必要とする哺乳動物母体（好ましくは、授乳期の哺乳動物母体）であればよく、後述する本実施例でその効果が実証されているため、腸内細菌叢全体に占める本件バクテロイデス属細菌株及び本件プレボテラ属細菌株の割合が低下した哺乳動物母体を好適に例示することができる。
【0021】
本発明において、「配列番号１（又は２）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性」とは、配列番号１（又は２）のヌクレオチド配列における１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位され、配列番号１（又は２）のヌクレオチド配列全体の９０％以上の配列が同一であることを意味する。ここで、「１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列」とは、例えば１～１４９個の範囲内、好ましくは１～１００個の範囲内、より好ましくは１～７５個の範囲内、さらに好ましくは１～５０個の範囲内、より好ましくは１～４０個の範囲内、さらに好ましくは１～３０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内の数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列を意味する。
【0022】
本発明において、「少なくとも９０％の同一性」としては、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９６％以上、特にさらに好ましくは９７％以上、特にさらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上（例えば、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、１００％）の同一性である。ヌクレオチド配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）に基づくＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score＝100、word length＝12とする。
【0023】
本件増加剤は、液体タイプと非液体タイプとに大別される。液体タイプの本件増加剤は、本件細菌株の培養液から本件細菌株を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩水若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。一方、非液体タイプの本件増加剤は、液体タイプの本件増加剤に、適当な凍結保護剤（例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、トレハロース、デキストラン）を添加してアンプルやバイアル瓶などに充填した後、凍結するか、あるいは、凍結乾燥することにより製造することができる。
【0024】
本件増加剤を接種する方法としては、経口接種する方法であっても、非経口接種する方法（例えば、静脈内投与、局所投与）であってもよいが、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、経口接種する方法を好適に例示することができる。
【0025】
本明細書において、添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【0026】
本件増加剤に含まれる本件細菌株の接種量としては、接種する対象（哺乳動物母体）の生物種、年齢、体重、体調等により異なるため、一概に特定できないが、例えば、１日あたり、体重１ｋｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕ（Colony Forming Unit）、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。なお、かかる量を１回で接種してもよく、数回に分けて接種してもよい。また、本件増加剤が家畜用飼料組成物の場合、家畜用飼料組成物に含まれる本件細菌株の量は、例えば、家畜用飼料組成物１ｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。
【0027】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【0028】
１．材料及び方法
［細菌株］
理研バイオリソース研究センターの微生物材料開発室から、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［ＪＣＭ１３４４６］、Bacteroides acidifaciens［ＪＣＭ１０５５６］、及びPrevotella buccalis［ＪＣＭ１２２４６］）を入手した。これらの細菌を細菌培養ガス濃度調節剤（アネロパック［登録商標］）（スギヤマゲン社製）を用いた嫌気性条件下で、ＧＡＭ液体培地中に一晩培養した後、細菌数をカウントした。
［細菌株］
理研バイオリソース研究センターの微生物材料開発室から、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［ＪＣＭ１３４４６］、Bacteroides acidifaciens［ＪＣＭ１０５５６］、及びPrevotella buccalis［ＪＣＭ１２２４６］）を入手した。これらの細菌を細菌培養ガス濃度調節剤（アネロパック［登録商標］）（スギヤマゲン社製）を用いた嫌気性条件下で、ＧＡＭ液体培地中に一晩培養した後、細菌数をカウントした。
【0029】
［モデル動物］
６種類のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ［ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃ］マウス；Ｃ５７ＢＬ／６［Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ］マウス；ＩＣＲ［C.B-17/Icr-+/+Jcl］マウス；重症複合免疫不全症［C.B-17/Icr-scid/scidJcl］を有するＩＣＲマウス（すなわち、免疫不全マウス）；及びＢ６Ｎ．Ｃｇ－Ｔｇ［Ｖｉｌ－ｃｒｅ］９９７Ｇｕｍ／Ｊマウス）は、日本エスエルシー社、日本クレア社、The Jackson Laboratory、又は三協ラボサービス社から購入し、東北大学大学院農学研究科又は東京大学医科学研究所の動物施設で飼育した。また、Ｂ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＦＬＰｅ）３６マウスは、理研バイオリソース研究から分与された。図２及び図２３～２６の実験に用いたＰＰ欠損マウスは、胎生１４日目のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１ｍｇの抗ＩＬ－７Ｒα抗体（A7R34）を子宮内投与することにより作製した（文献「Yoshida et al., International Immunology, 11, 643-655. 1999」参照）。また、図２の実験に用いたＩＬＮ欠損マウスは、鼠径リンパ節を外科的に除去することにより作製した。また、図３の実験に用いたマウスは、免疫不全マウスの交配開始時に、以下の［細胞の単離］の項目に記載の方法に従って得られたＰＰ由来単核細胞及びＩＬＮ由来単核細胞を、野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウスへ尾静脈内投与することにより調製した。また、図５～７の実験に用いたマウスは、交配前から出産１４日後までの間、抗生物質（１ｇ／Ｌのアンピシリン、１ｇ／Ｌのネオマイシン、５００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、又はこれらの混合物）を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させることにより調製した。また、図８～１０及び１６～１８の実験に用いたマウスは、交配前から出産７日後までの間、抗生物質混合物を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させた後、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便（図８～１０及び１６～１８）や、免疫不全マウスから採取した糞便（図１６～１８）を、出産８～１４日の間、１日１回、計７回ＦＭＴを行うことにより調製した。また、図１２～１５の実験に用いたマウスにおいて、骨髄移植（ＢＭＴ）は、免疫不全マウスにおける交配開始時に、野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウスから得た１０６の骨髄単核球を用いて行った。また、図２０～２２の実験に用いたマウスは、交配前から出産７日後までの間、抗生物質混合物を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させた後、約１０１０ｃｆｕの３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を含むＰＢＳ５００μＬを経口投与することにより調製した。すべての動物実験は、東北大学及び東京大学の両方の所内動物実験委員会により承認されたプロトコルにしたがって設計された。
６種類のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ［ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃ］マウス；Ｃ５７ＢＬ／６［Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ］マウス；ＩＣＲ［C.B-17/Icr-+/+Jcl］マウス；重症複合免疫不全症［C.B-17/Icr-scid/scidJcl］を有するＩＣＲマウス（すなわち、免疫不全マウス）；及びＢ６Ｎ．Ｃｇ－Ｔｇ［Ｖｉｌ－ｃｒｅ］９９７Ｇｕｍ／Ｊマウス）は、日本エスエルシー社、日本クレア社、The Jackson Laboratory、又は三協ラボサービス社から購入し、東北大学大学院農学研究科又は東京大学医科学研究所の動物施設で飼育した。また、Ｂ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＦＬＰｅ）３６マウスは、理研バイオリソース研究から分与された。図２及び図２３～２６の実験に用いたＰＰ欠損マウスは、胎生１４日目のＢＡＬＢ／ｃマウスに、１ｍｇの抗ＩＬ－７Ｒα抗体（A7R34）を子宮内投与することにより作製した（文献「Yoshida et al., International Immunology, 11, 643-655. 1999」参照）。また、図２の実験に用いたＩＬＮ欠損マウスは、鼠径リンパ節を外科的に除去することにより作製した。また、図３の実験に用いたマウスは、免疫不全マウスの交配開始時に、以下の［細胞の単離］の項目に記載の方法に従って得られたＰＰ由来単核細胞及びＩＬＮ由来単核細胞を、野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウスへ尾静脈内投与することにより調製した。また、図５～７の実験に用いたマウスは、交配前から出産１４日後までの間、抗生物質（１ｇ／Ｌのアンピシリン、１ｇ／Ｌのネオマイシン、５００ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、又はこれらの混合物）を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させることにより調製した。また、図８～１０及び１６～１８の実験に用いたマウスは、交配前から出産７日後までの間、抗生物質混合物を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させた後、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便（図８～１０及び１６～１８）や、免疫不全マウスから採取した糞便（図１６～１８）を、出産８～１４日の間、１日１回、計７回ＦＭＴを行うことにより調製した。また、図１２～１５の実験に用いたマウスにおいて、骨髄移植（ＢＭＴ）は、免疫不全マウスにおける交配開始時に、野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウスから得た１０６の骨髄単核球を用いて行った。また、図２０～２２の実験に用いたマウスは、交配前から出産７日後までの間、抗生物質混合物を含む水を、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスに自由飲水させた後、約１０１０ｃｆｕの３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）を含むＰＢＳ５００μＬを経口投与することにより調製した。すべての動物実験は、東北大学及び東京大学の両方の所内動物実験委員会により承認されたプロトコルにしたがって設計された。
【0030】
［ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスの作製］
Ｓｐｉｂ遺伝子のエクソン２～５をｌｏｘＰ部位で両側をはさみ、エクソン５及び６の間のイントロンにＦｒｔ－ｆｌａｎｋｅｄ ｎｅｏ耐性カセットを挿入するようにターゲティングベクターを設計した。ターゲティングベクター３０μｇを線状化した後、ＪＭ８Ａ１．Ｎ３胚性幹細胞（KOMP Repositoryより入手）へ形質転換した。ネオマイシン耐性及びガンシクロビル耐性胚性幹細胞のコロニーを選択した後、以下の表１に示すプライマーセットを用いたＰＣＲ法や、以下の表１に示すプローブを用いたサザンブロット解析により、Ｓｐｉｂ遺伝子ターゲティングされた相同組換え体をスクリーニングした。スクリーニングした相同組換え体をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。Ｎｅｏ耐性カセットを欠失させてｆｌｏｘｅｄ Ｓｐｉｂマウスを得るため、ヘテロ型のＦ１マウスをＢ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＦＬＰｅ）３６マウスと交配した。次に、得られたｆｌｏｘｅｄ ＳｐｉｂマウスをＢ６Ｎ．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｖｉｌ－ｃｒｅ）９９７Ｇｕｍ／Ｊマウスと交配し、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを作製した。作製したＳｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスと、腸管上皮細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（Ｖｉｌｌｉｎ－Ｃｒｅトランスジェニックマウス）とを交配することにより、ＳｐｉＢコンディショナルノックアウトマウス（すなわち、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウス）を作製した。
Ｓｐｉｂ遺伝子のエクソン２～５をｌｏｘＰ部位で両側をはさみ、エクソン５及び６の間のイントロンにＦｒｔ－ｆｌａｎｋｅｄ ｎｅｏ耐性カセットを挿入するようにターゲティングベクターを設計した。ターゲティングベクター３０μｇを線状化した後、ＪＭ８Ａ１．Ｎ３胚性幹細胞（KOMP Repositoryより入手）へ形質転換した。ネオマイシン耐性及びガンシクロビル耐性胚性幹細胞のコロニーを選択した後、以下の表１に示すプライマーセットを用いたＰＣＲ法や、以下の表１に示すプローブを用いたサザンブロット解析により、Ｓｐｉｂ遺伝子ターゲティングされた相同組換え体をスクリーニングした。スクリーニングした相同組換え体をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。Ｎｅｏ耐性カセットを欠失させてｆｌｏｘｅｄ Ｓｐｉｂマウスを得るため、ヘテロ型のＦ１マウスをＢ６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＦＬＰｅ）３６マウスと交配した。次に、得られたｆｌｏｘｅｄ ＳｐｉｂマウスをＢ６Ｎ．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｖｉｌ－ｃｒｅ）９９７Ｇｕｍ／Ｊマウスと交配し、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを作製した。作製したＳｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスと、腸管上皮細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（Ｖｉｌｌｉｎ－Ｃｒｅトランスジェニックマウス）とを交配することにより、ＳｐｉＢコンディショナルノックアウトマウス（すなわち、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウス）を作製した。
【0031】
【表1】
【0032】
［細胞の単離］
各種マウスの乳腺、ＰＰ、及びＩＬＮから単核細胞を単離した。具体的には、乳腺及びＰＰを、０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼで６０分間、３７℃で消化し、乳腺由来単核細胞及びＰＰ由来単核細胞を単離した。また、ＩＬＮ由来単核細胞については、ＩＬＮを物理的に処理することにより調製した。得られた単核細胞の一部を、チュルク液（Turk's solution）で染色し、細胞数カウントした後、フローサイトメトリーや尾静脈内投与に用いた。
各種マウスの乳腺、ＰＰ、及びＩＬＮから単核細胞を単離した。具体的には、乳腺及びＰＰを、０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼで６０分間、３７℃で消化し、乳腺由来単核細胞及びＰＰ由来単核細胞を単離した。また、ＩＬＮ由来単核細胞については、ＩＬＮを物理的に処理することにより調製した。得られた単核細胞の一部を、チュルク液（Turk's solution）で染色し、細胞数カウントした後、フローサイトメトリーや尾静脈内投与に用いた。
【0033】
［フローサイトメトリー］
各々の組織から単離した単核細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ１６／３２(2.4G2)により１５分間４℃でブロックし、蛍光物質で標識した５種類の細胞表面マーカー（Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ９３、Ｉ－Ａｄ、及びＣＤ１１ｂ）に対する５種類の抗体（２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５Ｒ［Ｂ２２０］抗体［RA3-6B2、BD Bioscience社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗Ｌｙ６Ｃ抗体［HK1.4、Biolegend社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ９３抗体［AA4.1、Biolegend社製］、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識抗Ｉ－Ａｄ抗体［39-10-8、Biolegend社製］、及び２μｇ／ｍＬのＢＶ５１０標識抗ＣＤ１１ｂ抗体［M1/70、BD Bioscience社製］）の存在下で、３０分間４℃で抗原抗体反応処理を行った。なお、アイソタイプ・コントロール抗体として、４種類の抗体（５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識マウスＩｇＧ３抗体［MG3-35、Biolegend社製］、２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１標識ラットＩｇＧ２ａ［R35-95、BD Bioscience社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｃｙ７標識ラットＩｇＧ２ｂ［RTK4530、Biolegend社製］、及び２μｇ／ｍＬのＰＥ標識ラットＩｇＧ２ｃ［RTK4174、Biolegend社製］）を用いた。また、フローサイトメトリー解析における死細胞を除去するために、１０μｇ／テストの細胞生存溶液（Cell Viability Solution）（BD Bioscience社製）を添加した。また、細胞内におけるＩｇＡ抗体を検出するために、各々の組織から単離した単核細胞を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液中に２０分間室温で固定化処理し、界面活性剤（０．１％［ｗ／ｖ］サポニン）により１５分間室温で処理した後、５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識抗ＩｇＡ抗体（C10-3、BD Bioscience社製）の存在下で、３０分間室温で抗原・抗体反応処理を行った。なお、アイソタイプ・コントロール抗体として、２種類の抗体（５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣラットＩｇＧ１［R3-34、BD Bioscience社製］、及び２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１ラットＩｇＧ１［R3-34、BD Bioscience社製］）を用いた。Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer（Thermo Fisher Science社製）又はAccuri C6 flow cytometer（BD Bioscience社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。
各々の組織から単離した単核細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ１６／３２(2.4G2)により１５分間４℃でブロックし、蛍光物質で標識した５種類の細胞表面マーカー（Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ９３、Ｉ－Ａｄ、及びＣＤ１１ｂ）に対する５種類の抗体（２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５Ｒ［Ｂ２２０］抗体［RA3-6B2、BD Bioscience社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗Ｌｙ６Ｃ抗体［HK1.4、Biolegend社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｃｙ７標識抗ＣＤ９３抗体［AA4.1、Biolegend社製］、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識抗Ｉ－Ａｄ抗体［39-10-8、Biolegend社製］、及び２μｇ／ｍＬのＢＶ５１０標識抗ＣＤ１１ｂ抗体［M1/70、BD Bioscience社製］）の存在下で、３０分間４℃で抗原抗体反応処理を行った。なお、アイソタイプ・コントロール抗体として、４種類の抗体（５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識マウスＩｇＧ３抗体［MG3-35、Biolegend社製］、２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１標識ラットＩｇＧ２ａ［R35-95、BD Bioscience社製］、２μｇ／ｍＬのＰＥ－Ｃｙ７標識ラットＩｇＧ２ｂ［RTK4530、Biolegend社製］、及び２μｇ／ｍＬのＰＥ標識ラットＩｇＧ２ｃ［RTK4174、Biolegend社製］）を用いた。また、フローサイトメトリー解析における死細胞を除去するために、１０μｇ／テストの細胞生存溶液（Cell Viability Solution）（BD Bioscience社製）を添加した。また、細胞内におけるＩｇＡ抗体を検出するために、各々の組織から単離した単核細胞を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液中に２０分間室温で固定化処理し、界面活性剤（０．１％［ｗ／ｖ］サポニン）により１５分間室温で処理した後、５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識抗ＩｇＡ抗体（C10-3、BD Bioscience社製）の存在下で、３０分間室温で抗原・抗体反応処理を行った。なお、アイソタイプ・コントロール抗体として、２種類の抗体（５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣラットＩｇＧ１［R3-34、BD Bioscience社製］、及び２μｇ／ｍＬのＢＶ４２１ラットＩｇＧ１［R3-34、BD Bioscience社製］）を用いた。Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer（Thermo Fisher Science社製）又はAccuri C6 flow cytometer（BD Bioscience社製）を用いてフローサイトメトリーを行った。
【0034】
［ＥＬＩＳＡ法］
母マウスにおける乳汁中のＩｇＡ抗体の濃度を測定するために、乳汁を摂取した仔マウスから採取した胃内容物におけるＩｇＡ抗体（以下、「乳汁由来ＩｇＡ抗体」ということがある）の濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物を、１ｍｇ当たり１０μＬのＰＢＳに懸濁し、遠心分離により上清（以下、「乳汁由来試料」という）を回収した。次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μｇ／ｍＬの抗ＩｇＡ抗体（Bethyl Laboratries社製）を添加し、４℃で一晩インキュベートすることにより固相化処理を行った。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの存在下で、１時間室温でブロッキング処理を行った後、２階段希釈した乳汁由来試料を各ウェルに添加し、２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、各ウェルに、１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ＩｇＡ抗体（上記固相化した抗ＩｇＡ抗体とはエピトープが異なる抗ＩｇＡ抗体）（Bethyl Laboratries社製）を添加し、１時間室温でインキュベートし、ＴＭＢ（Tetramethylbenzidine）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（SeraCare Life Sciences社製）を用いて、ＨＲＰ由来のシグナルを生成させた。ＩｇＡ抗体の検量線を、既知の濃度のＩｇＡ抗体を含むマウス血清を用いて作成し、かかる検量線を基に、乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した。
母マウスにおける乳汁中のＩｇＡ抗体の濃度を測定するために、乳汁を摂取した仔マウスから採取した胃内容物におけるＩｇＡ抗体（以下、「乳汁由来ＩｇＡ抗体」ということがある）の濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物を、１ｍｇ当たり１０μＬのＰＢＳに懸濁し、遠心分離により上清（以下、「乳汁由来試料」という）を回収した。次に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、１００μｇ／ｍＬの抗ＩｇＡ抗体（Bethyl Laboratries社製）を添加し、４℃で一晩インキュベートすることにより固相化処理を行った。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの存在下で、１時間室温でブロッキング処理を行った後、２階段希釈した乳汁由来試料を各ウェルに添加し、２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、各ウェルに、１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ＩｇＡ抗体（上記固相化した抗ＩｇＡ抗体とはエピトープが異なる抗ＩｇＡ抗体）（Bethyl Laboratries社製）を添加し、１時間室温でインキュベートし、ＴＭＢ（Tetramethylbenzidine）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（SeraCare Life Sciences社製）を用いて、ＨＲＰ由来のシグナルを生成させた。ＩｇＡ抗体の検量線を、既知の濃度のＩｇＡ抗体を含むマウス血清を用いて作成し、かかる検量線を基に、乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物中のＩｇＡ抗体濃度を測定した。
【0035】
乳汁由来ＩｇＡ抗体について、（腸内微生物を含む）糞便や、３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）に対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した。具体的には、１００μｇ／ｍＬの糞便を含むＰＢＳと、１０μｇ／ｍＬの上記３種類の細菌株を含むＰＢＳを、それぞれ、１００μｍ孔のセルストレーナー（Cell Strainer）で濾過し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートすることにより固相化処理を行った。糞便を固相化したプレートについては、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１μｇ／ｍＬの抗ＩｇＡ抗体の存在下で、１時間室温でブロッキング処理を行い、上記３種類の細菌株を固相化したプレートについては、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの存在下で、１時間室温でブロッキング処理を行った。その後、１：６４に希釈した乳汁由来試料、及び希釈していない乳汁由来試料を、各ウェルに添加し、２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ＩｇＡ抗体（Bethyl Laboratries社製）を添加し、１時間室温でインキュベートし、ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（SeraCare Life Sciences社製）を用いて、ＨＲＰ由来のシグナルを生成させた。（腸内微生物を含む）糞便や上記３種類の細菌株に対する乳ＩｇＡの力価を、ＯＤ４５０値として算出した。
【0036】
［ＩｇＡ－Ｓｅｑ］
乳汁中のＩｇＡ抗体が結合する腸内細菌種を同定するために、文献「Palmet al., Cell 158, 1000-1010. 2014」に記載のＩｇＡ－Ｓｅｑを一部修正した方法を行った。具体的には、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便を含むＰＢＳ（１００μｇ／μＬ）を、４０μｍ孔のセルストレーナーを用いてデブリを除去することにより、腸内微生物を含む糞便懸濁液を調製した。５００μｇ／ｍＬの抗ＩｇＡ抗体、２０％（ｖ／ｖ）の正常ラット血清、及び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの存在下で、３０分間、４℃でブロッキング処理を行った後、乳汁由来試料と１：１の比率で混合し、３０分間、４℃でインキュベートした。洗浄後、懸濁液を２μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗ＩｇＡ抗体（mA-6E1、Invitrogen社製）及び５００ｎＭの細胞核染色試薬（ＳＹＴＯ ９）の存在下で３０分間、４℃でインキュベートした後、３０μＬ／テストのAnti-PE MicroBeads UltraPure（Miltenyi Biotec社製）の存在下で３０分間、４℃でインキュベートした。ＩｇＡ抗体が結合した細菌を、磁気細胞ソーターAutoMACS（Miltenyi Biotec社製）を用いて回収し、糞便ＤＮＡ単離キット（Stool DNA Isolation Kit）（チヨダサイエンス社製）を用いて、細菌由来のゲノムＤＮＡを抽出した。かかるゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下の［メタゲノム解析］の項目に記載の方法に従って、乳汁中のＩｇＡ抗体が結合する腸内細菌種を同定した。
乳汁中のＩｇＡ抗体が結合する腸内細菌種を同定するために、文献「Palmet al., Cell 158, 1000-1010. 2014」に記載のＩｇＡ－Ｓｅｑを一部修正した方法を行った。具体的には、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便を含むＰＢＳ（１００μｇ／μＬ）を、４０μｍ孔のセルストレーナーを用いてデブリを除去することにより、腸内微生物を含む糞便懸濁液を調製した。５００μｇ／ｍＬの抗ＩｇＡ抗体、２０％（ｖ／ｖ）の正常ラット血清、及び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの存在下で、３０分間、４℃でブロッキング処理を行った後、乳汁由来試料と１：１の比率で混合し、３０分間、４℃でインキュベートした。洗浄後、懸濁液を２μｇ／ｍＬのＰＥ標識抗ＩｇＡ抗体（mA-6E1、Invitrogen社製）及び５００ｎＭの細胞核染色試薬（ＳＹＴＯ ９）の存在下で３０分間、４℃でインキュベートした後、３０μＬ／テストのAnti-PE MicroBeads UltraPure（Miltenyi Biotec社製）の存在下で３０分間、４℃でインキュベートした。ＩｇＡ抗体が結合した細菌を、磁気細胞ソーターAutoMACS（Miltenyi Biotec社製）を用いて回収し、糞便ＤＮＡ単離キット（Stool DNA Isolation Kit）（チヨダサイエンス社製）を用いて、細菌由来のゲノムＤＮＡを抽出した。かかるゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下の［メタゲノム解析］の項目に記載の方法に従って、乳汁中のＩｇＡ抗体が結合する腸内細菌種を同定した。
【0037】
［メタゲノム解析］
各種マウスの糞便から、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen社製）を用いて細菌由来のゲノムＤＮＡを抽出し、メタゲノム解析を行った。具体的には、抽出した細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）及び以下の表２に示すプライマーを用いたＰＣＲ法を行い、各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅した。
各種マウスの糞便から、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen社製）を用いて細菌由来のゲノムＤＮＡを抽出し、メタゲノム解析を行った。具体的には、抽出した細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）及び以下の表２に示すプライマーを用いたＰＣＲ法を行い、各種細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３及びＶ４領域を増幅した。
【0038】
【表2】
【0039】
１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ増副産物について、文献「Palmet al., Cell 158, 1000-1010. 2014」に記載のとおり、各々の試料を識別するために、「xxxxxx」で示される６塩基インデックスを含む２回目ＰＣＲ用フォワードプライマー（5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-3’）及び２回目ＰＣＲ用リバースプライマー(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-3’)を用いた２回目のＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅産物を、MiSeqプラットフォーム及びMiSeq試薬キットv. 2（Illumina社製）を用いてシークエンシングを行った。得られたデータを、BaseSpace（Illumina社製）を用いて解析し、細菌種を同定した。
【0040】
［定量ＰＣＲ］
上記［ＩｇＡ－Ｓｅｑ］や［メタゲノム解析］の項目に記載の方法に従って抽出した細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、TB Green Premix Ex Taq II（タカラバイオ社製）を用いた定量ＰＣＲを行い、細菌特異的ｔｕｆ遺伝子のコピー数を定量した。プライマーはすべて、Perfect Real-timeサポートシステム（タカラバイオ社製）により設計した。
上記［ＩｇＡ－Ｓｅｑ］や［メタゲノム解析］の項目に記載の方法に従って抽出した細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、TB Green Premix Ex Taq II（タカラバイオ社製）を用いた定量ＰＣＲを行い、細菌特異的ｔｕｆ遺伝子のコピー数を定量した。プライマーはすべて、Perfect Real-timeサポートシステム（タカラバイオ社製）により設計した。
【0041】
［組織染色］
ＢＭＴを行ったマウスから定法に従って小腸組織を単離し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド液中に固定した後、パラフィンに包埋した。組織切片（５μｍ）をＴＮＢ溶液中で、室温で３０分間ブロッキング処理した後、ＰＥ標識抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体（RA3-6B2）と、マウスＣＤ３と交差反応する抗ヒトＣＤ３（ＳＰ２）抗体の存在下で、一晩４℃で抗原抗体反応処理を行った。洗浄後、組織切片を、ＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体の存在下で、１時間室温でインキュベートし、１０分間室温でTSA Plus fluorescein System（PerkinElmer社製）を用いて、ＣＤ３由来のシグナルを増幅した。また、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。また、組織病理学的分析のため、組織切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色し、BZ-9000（Keyence社製)又はBX63（Olympus社製）のいずれかで画像を取得した。
ＢＭＴを行ったマウスから定法に従って小腸組織を単離し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド液中に固定した後、パラフィンに包埋した。組織切片（５μｍ）をＴＮＢ溶液中で、室温で３０分間ブロッキング処理した後、ＰＥ標識抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体（RA3-6B2）と、マウスＣＤ３と交差反応する抗ヒトＣＤ３（ＳＰ２）抗体の存在下で、一晩４℃で抗原抗体反応処理を行った。洗浄後、組織切片を、ＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体の存在下で、１時間室温でインキュベートし、１０分間室温でTSA Plus fluorescein System（PerkinElmer社製）を用いて、ＣＤ３由来のシグナルを増幅した。また、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した。また、組織病理学的分析のため、組織切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色し、BZ-9000（Keyence社製)又はBX63（Olympus社製）のいずれかで画像を取得した。
【0042】
２．結果
［ＩｇＡ抗体産生形質細胞における細胞表面マーカーの発現解析］
乳腺においてＩｇＡが産生されるためには、ＩｇＡ抗体産生形質細胞が、乳腺へ遊走することが不可欠であることが報告されている（文献「Halsey et al., Ann N Y Acad Sci 409, 452-460. 1983」及び「Niimi et al., Mucosal Immunol 11, 643-653. 2018」参照）。そこで、母マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞を同定するために、６種類の形質細胞関連マーカー（ＩｇＡ抗体、及び５種類の細胞表面マーカー［Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、Ｉ－Ａｄ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ９３］）を用いたフローサイトメトリーを行った。その結果、ＩｇＡ抗体を高レベルで産生する形質細胞は、３種類の細胞表面マーカー（Ｌｙ６Ｃ、Ｉ－Ａｄ、及びＣＤ９３）が陽性でかつ、２種類の細胞表面マーカー（Ｂ２２０及びＣＤ１１ｂ）が陰性であることが示された（図１参照）。このため、以降の実験においては、Ｂ２２０陰性でかつＩｇＡ陽性の形質細胞をＩｇＡ産生形質細胞の指標とした。
［ＩｇＡ抗体産生形質細胞における細胞表面マーカーの発現解析］
乳腺においてＩｇＡが産生されるためには、ＩｇＡ抗体産生形質細胞が、乳腺へ遊走することが不可欠であることが報告されている（文献「Halsey et al., Ann N Y Acad Sci 409, 452-460. 1983」及び「Niimi et al., Mucosal Immunol 11, 643-653. 2018」参照）。そこで、母マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞を同定するために、６種類の形質細胞関連マーカー（ＩｇＡ抗体、及び５種類の細胞表面マーカー［Ｂ２２０、Ｌｙ６Ｃ、Ｉ－Ａｄ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ９３］）を用いたフローサイトメトリーを行った。その結果、ＩｇＡ抗体を高レベルで産生する形質細胞は、３種類の細胞表面マーカー（Ｌｙ６Ｃ、Ｉ－Ａｄ、及びＣＤ９３）が陽性でかつ、２種類の細胞表面マーカー（Ｂ２２０及びＣＤ１１ｂ）が陰性であることが示された（図１参照）。このため、以降の実験においては、Ｂ２２０陰性でかつＩｇＡ陽性の形質細胞をＩｇＡ産生形質細胞の指標とした。
【0043】
［パイエル板は、乳腺における母体ＩｇＡ抗体産生に主要な役割を果たす］
鼠径リンパ節（ＩＬＮ）は、乳腺の所属リンパ節（draining lymph node）としての役割を果たしていることが知られている（文献「Leonhardt,Gene 94, 121-124. 1990」参照）また、パイエル板（ＰＰ）は、特にＩｇＡ抗体が最も豊富に産生される胃腸管で、粘膜免疫系において極めて重要な役割を果たしていることが知られている（文献「Lindner et al., Nat Immunol 16, 880-888. 2015」及び「Moro-Sibilot et al., Gastroenterology 151, 311-323. 2016」参照）。そこで、２種類のモデル母マウス（ＩＬＮ欠損マウス及びＰＰ欠損マウス）を用いて、乳腺中の母体ＩｇＡ抗体産生に与える影響を解析した。その結果、ＩＬＮ欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数は、非欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数と比べ、ほとんど変わらなかったのに対して、ＰＰ欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値は、非欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値と比べ、有意に低いことが示された（図２Ａ及びＢ参照）。また、ＩＬＮ欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、非欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度とほとんど変わらなかったのに対して、ＰＰ欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、非欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度と比べ、有意に低いことが示された（図２Ｃ参照）。
鼠径リンパ節（ＩＬＮ）は、乳腺の所属リンパ節（draining lymph node）としての役割を果たしていることが知られている（文献「Leonhardt,Gene 94, 121-124. 1990」参照）また、パイエル板（ＰＰ）は、特にＩｇＡ抗体が最も豊富に産生される胃腸管で、粘膜免疫系において極めて重要な役割を果たしていることが知られている（文献「Lindner et al., Nat Immunol 16, 880-888. 2015」及び「Moro-Sibilot et al., Gastroenterology 151, 311-323. 2016」参照）。そこで、２種類のモデル母マウス（ＩＬＮ欠損マウス及びＰＰ欠損マウス）を用いて、乳腺中の母体ＩｇＡ抗体産生に与える影響を解析した。その結果、ＩＬＮ欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数は、非欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数と比べ、ほとんど変わらなかったのに対して、ＰＰ欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値は、非欠損マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値と比べ、有意に低いことが示された（図２Ａ及びＢ参照）。また、ＩＬＮ欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、非欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度とほとんど変わらなかったのに対して、ＰＰ欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、非欠損マウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度と比べ、有意に低いことが示された（図２Ｃ参照）。
【0044】
さらに、Ｔ細胞やＢ細胞が欠損した免疫不全（C.B-17/Icr-scid/scidJcl）母マウスに、野生型（Ｉｃｒ＋／＋）マウスのＩＬＮ由来単核細胞を移入しても、未移入の免疫不全母マウスと比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度はほとんど変わらなかったのに対して、免疫不全母マウスに、野生型マウスのＰＰ由来単核細胞を移入すると、未移入の免疫不全母マウスと比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は有意に高いことが示された（図３参照）。
【0045】
これらの結果は、ＩｇＡ産生形質細胞が乳腺に遊走するためには、（ＩＬＮではなく）ＰＰが必須であることを示している。
【0046】
［乳腺における母体ＩｇＡ抗体産生には、ＰＰにおけるＭ細胞による抗原取込みが必要である］
Ｓｐｉｂは、濾胞関連上皮（follicle-associated epithelium：ＦＡＥ）を含む腸管上皮において、ＦＡＥ中に存在する抗原を取り込むＭ細胞から、ＩｇＡ抗体を産生する成熟Ｂ細胞への分化に関与する転写因子であることが知られている（文献「Kanayaet al., Nat Immunol 13, 729-736. 2012」及び「Satoet al., Mucosal Immunol 6, 838-846. 2013」参照）。一方、Ｓｐｉｂ遺伝子のコンディショナルノックアウトモデルマウス（すなわち、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウス）は、パイエル板（ＰＰ）におけるＭ細胞を欠損したマウスである。そこで、Ｓｐｉｂと、乳腺におけるＩｇＡ産生との関連性を、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスを用いて解析した。その結果、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値は、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（すなわち、ＳｐｉＢ遺伝子が欠損していないマウス）の乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値と比べ、有意に低いことが示された（図４Ａ及びＢ参照）。また、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度と比べ、有意に低いことが示された（図４Ｃ参照）。
Ｓｐｉｂは、濾胞関連上皮（follicle-associated epithelium：ＦＡＥ）を含む腸管上皮において、ＦＡＥ中に存在する抗原を取り込むＭ細胞から、ＩｇＡ抗体を産生する成熟Ｂ細胞への分化に関与する転写因子であることが知られている（文献「Kanayaet al., Nat Immunol 13, 729-736. 2012」及び「Satoet al., Mucosal Immunol 6, 838-846. 2013」参照）。一方、Ｓｐｉｂ遺伝子のコンディショナルノックアウトモデルマウス（すなわち、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウス）は、パイエル板（ＰＰ）におけるＭ細胞を欠損したマウスである。そこで、Ｓｐｉｂと、乳腺におけるＩｇＡ産生との関連性を、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスを用いて解析した。その結果、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値は、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（すなわち、ＳｐｉＢ遺伝子が欠損していないマウス）の乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値と比べ、有意に低いことが示された（図４Ａ及びＢ参照）。また、ＳｐｉＢ ｃＫＯマウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度は、Ｓｐｉｂｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスにおける乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度と比べ、有意に低いことが示された（図４Ｃ参照）。
【0047】
この結果は、Ｓｐｉｂが乳腺におけるＩｇＡ産生に関与していることを示している。また、図２及び３の結果も合わせて考慮すると、Ｍ細胞により取り込まれた腸管内の抗原が、ＰＰにおける免疫機能が活性化されることにより、ＩｇＡ産生形質細胞数が増加し、増加したＩｇＡ産生形質細胞が乳腺へ遊走した結果、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量が増加したことを示している。
【0048】
［腸内微生物は乳汁中のＩｇＡ抗体産生を促進する］
腸内細菌叢が、ＰＰを含む胃腸管における宿主の免疫細胞とともに、ホメオスタシスを確立していることを考慮し、様々な種類の抗生物質、具体的には、アンピシリン、ネオマイシン、若しくはバンコマイシン、又はこれらの混合物を、妊娠期間～授乳期間中のＢＡＬＢ／ｃ母マウスに投与することにより腸内細菌叢を乱し、母体ＩｇＡ抗体産生に与える影響を調べた。初めに、各種抗生物質処理が腸内細菌叢に与える影響を調べるために、メタゲノム解析を行った。その結果、腸内細菌の総数は、各種抗生物質処理と未処理の間でほとんど変化は認められなかったものの（図５Ａ参照）、腸内細菌叢の構成は、両者間で大幅に変動し（図５Ｂ及び５Ｃ参照）、特に、４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、Prevotella buccalis、及びEscherichia albertii）の腸内細菌叢に対する割合が、大きく変動した（図６参照）。具体的には、バンコマイシンや、３種類の抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、及びバンコマイシン）からなる混合物を母マウスに自由飲水により投与すると、抗生物質未投与の母マウスと比べ、腸内細菌叢に占める３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図６Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図６Ｂ］、及びPrevotella buccalis［図６Ｃ］）の割合は、大幅に低下したのに対して、１種類の細菌株（Escherichia albertii［図６Ｄ］）の割合は高かった。また、バンコマイシンや、上記３種類の抗生物質からなる混合物を母マウスに自由飲水により投与すると、抗生物質未投与の母マウスと比べ、母マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合や数値が有意に低くなるとともに（図７Ａ及びＢ参照）、乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度も有意に低いことが示された（図７Ｃ参照）。
腸内細菌叢が、ＰＰを含む胃腸管における宿主の免疫細胞とともに、ホメオスタシスを確立していることを考慮し、様々な種類の抗生物質、具体的には、アンピシリン、ネオマイシン、若しくはバンコマイシン、又はこれらの混合物を、妊娠期間～授乳期間中のＢＡＬＢ／ｃ母マウスに投与することにより腸内細菌叢を乱し、母体ＩｇＡ抗体産生に与える影響を調べた。初めに、各種抗生物質処理が腸内細菌叢に与える影響を調べるために、メタゲノム解析を行った。その結果、腸内細菌の総数は、各種抗生物質処理と未処理の間でほとんど変化は認められなかったものの（図５Ａ参照）、腸内細菌叢の構成は、両者間で大幅に変動し（図５Ｂ及び５Ｃ参照）、特に、４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、Prevotella buccalis、及びEscherichia albertii）の腸内細菌叢に対する割合が、大きく変動した（図６参照）。具体的には、バンコマイシンや、３種類の抗生物質（アンピシリン、ネオマイシン、及びバンコマイシン）からなる混合物を母マウスに自由飲水により投与すると、抗生物質未投与の母マウスと比べ、腸内細菌叢に占める３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii［図６Ａ］、Bacteroides acidifaciens［図６Ｂ］、及びPrevotella buccalis［図６Ｃ］）の割合は、大幅に低下したのに対して、１種類の細菌株（Escherichia albertii［図６Ｄ］）の割合は高かった。また、バンコマイシンや、上記３種類の抗生物質からなる混合物を母マウスに自由飲水により投与すると、抗生物質未投与の母マウスと比べ、母マウスの乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合や数値が有意に低くなるとともに（図７Ａ及びＢ参照）、乳汁由来ＩｇＡ抗体の濃度も有意に低いことが示された（図７Ｃ参照）。
【0049】
これらの結果は、哺乳動物母体の腸内細菌叢に含まれる３種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）のいずれかが、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生に関与していること示している。
【0050】
腸内細菌叢における上記３種類の細菌株と、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生との関連性をより詳細に検証するために、上記３種類の抗生物質からなる混合物を母マウスに投与し、腸内細菌叢を乱した後、（上記３種類の細菌株が共生する）健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便を用いたＦＭＴを行った。その結果、ＦＭＴを行った母マウスにおける腸内細菌の総数は、ＦＭＴを行わなかった母マウスと比べ、わずかな増加が認められたものの（図８Ａ参照）、腸内細菌叢を構成する細菌の割合は、両者間で大幅に変動し（図８Ｂ及び８Ｃ参照）、腸内細菌叢に占める４種類の細菌株（Parabacteroides goldsteinii、Bacteroides acidifaciens、Prevotella buccalis、及びEscherichia albertii）、特に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）の割合は、ＦＭＴを行わなかった母マウスと比べ、ＦＭＴを行った母マウスの方が有意に高いことが示された（図９参照）。また、ＦＭＴを行った母マウスにおいて、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合や数値は、ＦＭＴを行わなかった母マウスと比べ、有意に高くなるとともに（図１０Ａ及びＢ参照）、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度も有意に高いことが示された（図１０Ｃ参照）。
【0051】
乳汁中のＩｇＡ抗体産生と、腸内細菌叢との関連性を解析するため、腸内細菌叢が存在しないＧＦ（Germ free）マウスと、生理的な腸内細菌叢が存在するＳＰＦ（special pathogen-free）マウスについて、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度を解析した。
【0052】
ＳＰＦ施設又は無菌施設のいずれかにおいて維持されていた授乳中のマウスから乳試料を採取した。ＧＦマウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、ＳＰＦマウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度と比べ、有意に低く、むしろ、抗体のすべてのサブクラスを欠如する免疫不全マウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度に近いことが示された（図１１Ａ参照）。また、ＳＰＦマウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体は、ＳＰＦマウスの糞便中に含まれる微生物に対しては、反応性を示したものの、免疫不全マウスの糞便中に含まれる微生物に対しては、ほとんど反応性を示さなかった（図１１Ｂ参照）。なお、コントロールとして使用した微生物を含まないＧＦマウスの糞便に対するＳＰＦマウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体の反応は認められなかった。これら結果から、宿主の免疫細胞、特にリンパ球が、乳汁中のＩｇＡ抗体産生に関与する腸内微生物環境を作り出している可能性を考え、免疫不全マウスを用いて解析を行った。
【0053】
免疫不全マウスにおいて、パイエル板はほとんど観察されなかったのに対して、野生型マウスの骨髄由来単核球を、免疫不全マウスへ移植（ＢＭＴ）すると、十分なＢ細胞及びＴ細胞を含むＰＰ様リンパ構造が認められた（図１２参照）。
【0054】
この結果は、ＰＰの器官形成は、出生前に始まっていることが報告されているものの（文献「Honda et al., J Exp Med 193, 621-630. 2001」参照）、出生後に、野生型マウスの骨髄由来単核球を免疫不全マウスへ移植することにより、免疫系が再構築された結果、ＰＰ様の腸管リンパ組織が形成されたことを示している。
【0055】
また、免疫不全マウスにおける腸内細菌の総数は、野生型マウスの骨髄由来単核球を移植した場合と、移植しなかった場合とでほとんど変わらなかったものの（図１３Ａ参照）、腸内細菌叢の構成は、野生型マウスの骨髄由来単核球を移植することにより大幅に変動した（図１３Ｂ及び１３Ｃ参照）。また、野生型マウスの乳汁由来ＩｇＡ抗体は、野生型マウスの糞便中に含まれる微生物のみならず、野生型マウスの骨髄由来単核球を移植した免疫不全マウスの糞便中に含まれる微生物に対しても反応性を示した（図１４Ａ参照）。一方、ＩｇＡ抗体を含まない免疫不全マウスの乳汁が有する野生型マウスの糞便中に含まれる微生物に対する反応性や、野生型マウスの骨髄由来単核球を移植した免疫不全マウスの糞便中に含まれる微生物に対する反応性はバックグラウンドレベルであった（図１４Ｂ参照）。さらに、免疫不全マウスの腸内細菌叢に占める２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）の割合は、野生型マウスの骨髄由来単核球を移植することにより、有意に増加した（図１５参照）。
【0056】
これらの結果は、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）が、授乳期の母マウスの腸内に定着し、乳汁中のＩｇＡ抗体含有量が増加するためには、授乳期の母マウスの免疫システムが必要であることを示している。
【0057】
さらに、上記３種類の抗生物質からなる混合物を母マウスに投与し、上記３種類の細菌株が共生する健常マウスから採取した糞便や、共生しない免疫不全マウスから採取した糞便を用いたＦＭＴを行った。その結果、腸内細菌の総数は、健常マウスから採取した糞便を用いたＦＭＴを行った場合と、免疫不全マウスから採取した糞便を用いたＦＭＴを行った場合との間でほとんど変化は認められなかったものの（図１６Ａ参照）、腸内細菌叢の構成は、両者間で変動し（図１６Ｂ及び１６Ｃ参照）、特に、腸内細菌叢に占める２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens、及びPrevotella buccalis）の割合は、免疫不全マウスの糞便を用いてＦＭＴを行った場合と比べ、野生型マウスの糞便を用いてＦＭＴを行った場合の方が、有意に高いことが示された（図１７参照）。また、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数値や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、免疫不全マウスの糞便を用いてＦＭＴを行った場合と比べ、野生型マウスの糞便を用いてＦＭＴを行った場合の方が、有意に高かった（図１８参照）。
【0058】
これらの結果は、哺乳動物母体の免疫系が、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）による腸内環境を整え、乳腺におけるＩｇＡ抗体を産生させることを示している。
【0059】
Bacteroides acidifaciensは、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するバクテロイデス属細菌株である。また、Prevotella buccalisは、配列番号２のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するプレボテラ属細菌株である。
【0060】
［乳汁中のＩｇＡ抗体の特異性は腸内微生物環境に依存する］
次に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）に対する乳汁中のＩｇＡ抗体の特異性を解析するために、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便と、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物とを用いて、ＩｇＡ－Ｓｅｑを行った。その結果、上記２種類の細菌株は、乳汁中のＩｇＡ抗体に結合しないものの割合よりも、乳汁中のＩｇＡ抗体に結合するものの割合の方が多いことが示された（図１９参照）。
次に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）に対する乳汁中のＩｇＡ抗体の特異性を解析するために、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した糞便と、ＢＡＬＢ／ｃ母マウスの乳汁を摂取した仔マウスの胃内容物とを用いて、ＩｇＡ－Ｓｅｑを行った。その結果、上記２種類の細菌株は、乳汁中のＩｇＡ抗体に結合しないものの割合よりも、乳汁中のＩｇＡ抗体に結合するものの割合の方が多いことが示された（図１９参照）。
【0061】
この結果は、上記２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）は、乳腺における母体ＩｇＡ抗体全体の産生を促進するだけでなく、ＰＰにおける免疫細胞を刺激し、これら細菌株に対するＩｇＡ抗体の産生も促進する作用を有することを示している。
【0062】
［B. acidifaciens及びP. buccalisの経口接種により、乳汁中のＩｇＡ抗体産生が増加する］
抗生物質混合物を投与したＢＡＬＢ／ｃ母マウスに、上記２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種し、乳汁中のＩｇＡ抗体産生が増加するかどうか検証した。なお、コントロールとしてParabacteroides goldsteiniiを用いた。その結果、これら細菌株の接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、腸内細菌の総数はほとんど変わらず（図２０Ａ参照）、腸内細菌叢の構成に変動が認められたものの（図２０Ｂ及び２０Ｃ参照）、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）の接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、有意に増加した（図２１参照）。一方、コントロールのParabacteroides goldsteiniiの接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、ほとんど変わらなかった（図２１参照）。また、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）の接種を行った場合、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量が有意に増加することが示された（図２２参照）。
抗生物質混合物を投与したＢＡＬＢ／ｃ母マウスに、上記２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種し、乳汁中のＩｇＡ抗体産生が増加するかどうか検証した。なお、コントロールとしてParabacteroides goldsteiniiを用いた。その結果、これら細菌株の接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、腸内細菌の総数はほとんど変わらず（図２０Ａ参照）、腸内細菌叢の構成に変動が認められたものの（図２０Ｂ及び２０Ｃ参照）、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）の接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、有意に増加した（図２１参照）。一方、コントロールのParabacteroides goldsteiniiの接種を行った場合、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、ほとんど変わらなかった（図２１参照）。また、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）の接種を行った場合、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量が有意に増加することが示された（図２２参照）。
【0063】
これらの結果は、腸内細菌叢が乱され、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量が低下した状態の哺乳動物母体に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種すると、ＰＰにおける免疫機能が活性化され、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量が増加することを示している。
【0064】
［B. acidifaciens及びP. buccalisの経口接種による、乳汁中のＩｇＡ抗体産生の増加には、ＰＰが必須である］
腸内細菌叢が乱され、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量が低下した状態の哺乳動物母体に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種したときに認められた、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量の増加には、ＰＰが必須かどうかを、ＰＰ欠損マウスを用いて検証した。なお、コントロールとしてParabacteroides goldsteiniiを用いた。その結果、これら細菌株の接種により、ＰＰ非欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ母マウス）及びＰＰ欠損マウスのそれぞれに、上記２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種すると、両者ともに、腸内細菌の総数はほとんど変わらなかったものの（図２３Ａ参照）、B. acidifaciensを接種した場合、両マウスともに、腸内細菌叢に占めるB. acidifaciensの割合が有意に増加した（図２３Ｂ及びＣ、並びに図２４参照）。また、ＰＰ非欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種すると、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、有意に増加したのに対して、ＰＰ欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種しても、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数の増加や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度の増加は認められず、ＰＰ非欠損マウスに、コントロールのParabacteroides goldsteiniiを接種した場合と同レベルであった（図２５参照）。また、ＰＰ非欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種すると、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量が有意に増加したのに対して、ＰＰ欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種しても、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量の増加は認められなかった（図２６参照）。
腸内細菌叢が乱され、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量が低下した状態の哺乳動物母体に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種したときに認められた、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量の増加には、ＰＰが必須かどうかを、ＰＰ欠損マウスを用いて検証した。なお、コントロールとしてParabacteroides goldsteiniiを用いた。その結果、これら細菌株の接種により、ＰＰ非欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ母マウス）及びＰＰ欠損マウスのそれぞれに、上記２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種すると、両者ともに、腸内細菌の総数はほとんど変わらなかったものの（図２３Ａ参照）、B. acidifaciensを接種した場合、両マウスともに、腸内細菌叢に占めるB. acidifaciensの割合が有意に増加した（図２３Ｂ及びＣ、並びに図２４参照）。また、ＰＰ非欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種すると、細菌株未接種の場合と比べ、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度は、有意に増加したのに対して、ＰＰ欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種しても、乳腺におけるＩｇＡ産生形質細胞の割合及び数の増加や、乳汁由来ＩｇＡ抗体濃度の増加は認められず、ＰＰ非欠損マウスに、コントロールのParabacteroides goldsteiniiを接種した場合と同レベルであった（図２５参照）。また、ＰＰ非欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種すると、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量が有意に増加したのに対して、ＰＰ欠損マウスに、上記２種類の細菌株を接種しても、これら細菌株特異的な乳汁由来ＩｇＡ抗体量の増加は認められなかった（図２６参照）。
【0065】
これらの結果は、腸内細菌叢が乱され、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量が低下した状態の哺乳動物母体に、２種類の細菌株（Bacteroides acidifaciens及びPrevotella buccalis）を接種したときに認められた、乳腺におけるＩｇＡ抗体産生量の増加には、ＰＰ（具体的には、ＰＰにおける免疫機能の活性化）が必須であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【0066】
本発明は、畜産業の生産性向上や、乳児の病原性細菌感染やウイルス感染の予防に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】