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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-04
(45)【発行日】2024-01-15
(54)【発明の名称】α－リノレン酸産生能が向上した微生物またはその培養物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/15 20060101AFI20240105BHJP
C12P 7/6427 20220101ALI20240105BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240105BHJP
A23L 33/12 20160101ALI20240105BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20240105BHJP
A23K 10/37 20160101ALI20240105BHJP
A23K 10/28 20160101ALI20240105BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N1/15 ZNA
C12P7/6427
A23L33/10
A23L33/12
A23K10/16
A23K10/37
A23K10/28
C12N15/53
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020034277
(22)【出願日】2020-02-28
(65)【公開番号】P2021006020
(43)【公開日】2021-01-21
【審査請求日】2022-11-16
(31)【優先権主張番号】P 2019120570
(32)【優先日】2019-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】真野 潤一
(72)【発明者】
【氏名】小竹 英一
(72)【発明者】
【氏名】都築 和香子
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 聡
(72)【発明者】
【氏名】楠本 憲一
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５１５９５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２４６５３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０００－１６６５４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／１０１１２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－１５８２８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Damude, H. G. et al.，"Identification of bifunctional delta12/omega3 fatty acid desaturases for improving the ratio of omega3 to omega6 fatty acids in microbes and plants"，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2006年，Vol. 103，pp. 9446-9451
【文献】Database: GenPept, [online]，XP_001818769，unnamed protein product [Aspergillus oryzae RIB40]，2018年04月04日，Internet, [retrieved on 2023.09.11], <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_001818769>
【文献】Database: GenPept, [online]，GAA91372.1，oleate delta-12 desaturase [Aspergillus luchuensis IFO 4308]，2015年10月02日，Internet, [retrieved on 2023.09.11], <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/GAA91372>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
糸状菌に属し、糖質代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む微生物において、宿主と同属同種の微生物由来の核酸が細胞外から少なくとも１つ導入されており、導入された核酸の少なくとも１つにより脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現し、微生物が、アスペルギルス属微生物であり、
高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２又は９のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
α－リノレン酸産生能が向上した微生物。
【請求項2】
微生物が、食品安全性または飼料安全性を有するアスペルギルス属微生物である、請求項１記載の微生物。
【請求項3】
アスペルギルス属微生物が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・リュウキュウエンシス、アスペルギルス・リュウキュウエンシス・カワチ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソヤ、アスペルギルス・タマリ、又はアスペルギルス・アワモリである、請求項１または２記載の微生物。
【請求項4】
宿主と同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現が、宿主と同属同種の微生物由来のプロモーターで制御されている、請求項１～３のいずれか一項記載の微生物。
【請求項5】
プロモーターが、ＴＥＦ１プロモーターである、請求項４記載の微生物。
【請求項6】
糸状菌に属し、糖質代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む微生物において、宿主と同属同種の微生物由来の核酸が細胞外から少なくとも１つ導入されており、導入された核酸の少なくとも１つにより脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現し、
微生物が、アスペルギルス属微生物であり、
高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２又は９のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
α－リノレン酸産生能が向上した微生物またはその培養物の生産方法。
【請求項7】
アスペルギルス属微生物が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・リュウキュウエンシス、アスペルギルス・リュウキュウエンシス・カワチ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソヤ、アスペルギルス・タマリ、又はアスペルギルス・アワモリである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項記載の微生物を含む、食品または飼料。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項記載の微生物、またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。
【請求項10】
以下を含む、α－リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：（ｉ）食用性物質と、請求項１～５のいずれか一項記載の微生物、またはその培養物あるいは請求項９記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
【請求項11】
食用性物質が、食品またはその廃棄物である、請求項１０記載の方法。
【請求項12】
食用性物質が、糖質を含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項13】
食用性物質が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、請求項１０～１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
食用性物質が、米飯を含む、請求項１０～１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項15】
食用性物質が、ホエイを含む、請求項１０～１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項16】
以下を含む、α－リノレン酸の製造方法：（ｉ）糖質供給源と、請求項１～５のいずれか一項記載の微生物、またはその培養物あるいは請求項９記載の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）糖質供給源を発酵させる工程。
【請求項17】
糖質供給源が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項８記載の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα－リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、α－リノレン酸産生能が向上した微生物またはその培養物に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え技術を利用してヤロウィア属の微生物を改良し、α－リノレン酸を生産する技術が報告されている（特許文献１）。また、アスペルギルス属微生物を用いて食品廃棄物を処理して飼料を生産する方法が報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許第４９１６８８６号公報
【文献】特許第４６７１４３６号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｄｊｏｕｓｓｅ Ｌ ｅｔ ａｌ， Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． ４５， ３６８－３７３， ２００５．
【文献】矢澤一良 食品科学工学会誌、４３、１、１２３１－１２３７、１９９６年
【文献】Ｋｉｒｕｂａｋａｒａｎ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｐｏｕｌｔ． Ｓｃｉ． ９０， １， １４７－１５６， ２０１１．
【文献】Ｃｏｒｉｎｏ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｍｅａｔ Ｓｃｉ． ９８， ４， ６７９－６８８， ２０１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
近年、国際的に環境問題への関心が高まっており、資源循環型社会の実現に期待が寄せられている。日本国内では、食品廃棄物が年間２８００万トン発生しているとされ、その有効利用技術の開発が求められている。特に、米飯などのデンプンを含む食品廃棄物の有効活用が必要である。また、オメガ３脂肪酸の健康機能性が注目されており、その一つであるα－リノレン酸を多く含む食品の生産が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、食品または飼料として安全に使用することができるアスペルギルス属の微生物が元来もつα－リノレン酸生産能力をセルフクローニングで大幅に高められることを明らかにした。セルフクローニングとは、宿主と同属同種の微生物のＤＮＡをそのまま、もしくは、複数を組み合わせて、宿主の細胞に導入することである。セルフクローニングで改良した微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要はないことから、費用をかけることなく速やかに産業利用することが可能である。このアスペルギルス属微生物のセルフクローニング株を食品廃棄物を用いて培養することで、食品廃棄物を有効活用し、かつ、α－リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を生産することができる。α－リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を飼料として用いることで、α－リノレン酸を多く含む健康機能性の高い畜産物または水産物を生産することができる。また、α－リノレン酸を多く含む微生物菌体またはその培養物を直接、健康機能性の高い食品として利用することもできる。
【0007】
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕糸状菌に属し、糖質代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む微生物において、宿主と同属同種の微生物由来の核酸が細胞外から少なくとも１つ導入されており、導入された核酸の少なくとも１つにより脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現する、α－リノレン酸産生能が向上した微生物またはその培養物。
〔２〕微生物が、食品安全性または飼料安全性を有する微生物である、〔１〕の微生物またはその培養物。
〔３〕微生物が、アスペルギルス属微生物である、〔１〕または〔２〕の微生物またはその培養物。
〔４〕 高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔５〕 高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔６〕宿主と同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現が、宿主と同属同種の微生物由来のプロモーターで制御されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔７〕プロモーターが、ＴＥＦ１プロモーターである、〔６〕の微生物またはその培養物。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物を含む、食品または飼料。
〔９〕〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。
〔１０〕以下を含む、α－リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：
（ｉ）食用性物質と、〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物あるいは〔９〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
〔１１〕食用性物質が、食品またはその廃棄物である、〔１０〕の方法。
〔１２〕食用性物質が、糖質を含む、〔１０〕または〔１１〕の方法。
〔１３〕食用性物質が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕食用性物質が、米飯を含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１５〕食用性物質が、ホエイを含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１６〕以下を含む、α－リノレン酸の製造方法：
（ｉ）糖質供給源と、〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物あるいは〔９〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）糖質供給源を発酵させる工程。
〔１７〕糖質供給源が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、〔１６〕の方法。
〔１８〕〔８〕の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα－リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。
〔１〕糸状菌に属し、糖質代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む微生物において、宿主と同属同種の微生物由来の核酸が細胞外から少なくとも１つ導入されており、導入された核酸の少なくとも１つにより脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を高発現する、α－リノレン酸産生能が向上した微生物またはその培養物。
〔２〕微生物が、食品安全性または飼料安全性を有する微生物である、〔１〕の微生物またはその培養物。
〔３〕微生物が、アスペルギルス属微生物である、〔１〕または〔２〕の微生物またはその培養物。
〔４〕 高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔５〕 高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、配列番号９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔６〕宿主と同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現が、宿主と同属同種の微生物由来のプロモーターで制御されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの微生物またはその培養物。
〔７〕プロモーターが、ＴＥＦ１プロモーターである、〔６〕の微生物またはその培養物。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物を含む、食品または飼料。
〔９〕〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物。
〔１０〕以下を含む、α－リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法：
（ｉ）食用性物質と、〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物あるいは〔９〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
〔１１〕食用性物質が、食品またはその廃棄物である、〔１０〕の方法。
〔１２〕食用性物質が、糖質を含む、〔１０〕または〔１１〕の方法。
〔１３〕食用性物質が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕食用性物質が、米飯を含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１５〕食用性物質が、ホエイを含む、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１６〕以下を含む、α－リノレン酸の製造方法：
（ｉ）糖質供給源と、〔１〕～〔７〕のいずれかの微生物またはその培養物あるいは〔９〕の組成物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）糖質供給源を発酵させる工程。
〔１７〕糖質供給源が、デンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む、〔１６〕の方法。
〔１８〕〔８〕の飼料を動物（但し、ヒトを除く）に給与して飼育しα－リノレン酸を高含有させることを含む、畜産物または水産物の生産方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、食品または飼料として安全に使用できるα－リノレン酸高含有微生物菌体またはその培養物を製造することができる。デンプンもしくはそれを含む食品廃棄物からα－リノレン酸高含有微生物菌体を生産し、食品や飼料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列と相同性が認められた塩基配列のリストで、上から相同性が高い順にリストアップされている。相同性は、「Ｑｕｅｒｙ Ｃｏｖｅｒ」欄および「Ｐｅｒ． Ｉｄｅｎｔ」欄に示される。
【図2】図２は、配列番号２の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のアミノ酸配列と相同性が認められたアミノ酸配列のリストで、上から相同性が高い順にリストアップされている。相同性は、「Ｑｕｅｒｙ Ｃｏｖｅｒ」欄および「Ｐｅｒ． Ｉｄｅｎｔ」欄に示される。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0011】
本発明は、α－リノレン酸産生能が向上した、糸状菌に属する微生物またはその培養物に関する。このような微生物を培養すると、α－リノレン酸の含有量が多い微生物菌体を製造することができる。より具体的には、本発明の微生物またはその培養物は、糸状菌に属し、糖質代謝経路および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を含む微生物において、細胞外から少なくとも１つの核酸が導入されており、導入された核酸の少なくとも１つにより脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現量が導入前（野生株）と比較して高められている微生物またはその培養物である。導入される核酸は、特に限定されないが、例えば、宿主と同属同種の微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（例、その微生物のゲノム中に存在する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）、プロモーター、転写因子、微生物のα－リノレン酸の産生、蓄積、分泌に関わるその他の宿主と同属同種の微生物由来の核酸が挙げられる。微生物に導入される、同属同種の微生物由来の核酸は、微生物から直接抽出した核酸でもよいし、他の微生物（例、大腸菌）に、同属同種の微生物由来の核酸を生産させて得られる核酸等の、遺伝子工学の分野で既知の手法により人工的に合成された核酸でもよい。
【0012】
本発明において、α－リノレン酸を生産するために用いる微生物は、糸状菌に属する微生物である。本発明において、α－リノレン酸を生産するために用いる微生物は、食品安全性または飼料安全性を有する微生物であることが好ましい。食品安全性または飼料安全性を有する微生物としては、例えば、食品製造や飼料として使用された経験がある微生物が挙げられる。このような微生物のうち、アスペルギルス属の微生物として、より具体的には例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）が挙げられる。これらのうち、アスペルギルス・オリゼ（例、アスペルギルス・オリゼ ＲＩＢ４０株）およびアスペルギルス・カワチ（例、アスペルギルス・カワチ ＮＢＲＣ４３０８株）が好ましい。
【0013】
糸状菌に属する微生物、特に、アスペルギルス属微生物は、一般的にα－リノレン酸生産能力が高い種類の微生物ではないので、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が存在していても、その発現量は一般的に低い。そこで、導入される核酸の組み合わせとして、好ましくは、宿主と同属同種の微生物に由来する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子と共に、斯かる遺伝子の発現が高まるプロモーターが挙げられる。これにより、微生物が元来もつα－リノレン酸生産能力が大幅に高められる。プロモーターとしては、宿主と同属同種の微生物由来のプロモーターを用いることが好ましい。このことにより、改変微生物は、遺伝子組換えに関する安全性審査を受ける必要がなく、食品または飼料の用途に用いることができる。同属同種の微生物由来のゲノム領域（例、プロモーター、コード領域、３’非翻訳領域）での微生物の改変を「セルフクローニング」と呼ぶことがある。
【0014】
本発明におけるセルフクローニングとは、宿主（組換えＤＮＡ技術において、ＤＮＡが移入される生細胞をいう。以下同じ。）と分類学上同一の種に属する微生物のＤＮＡのみを用いて宿主の性質を変化させることである。遺伝子組換え生物の食品や飼料としての利用や環境放出に関する安全性審査のためには、入念かつ大量に実験データを用意する必要があるとともに、審査に長期間を要することから、莫大なコストが必要である。しかし、法令等〔（１）組換えＤＮＡ技術応用食品及び添加物の安全性審査の手続（抄）（平成１２年厚生省告示第２３３号）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｉｌｅ／０６－Ｓｅｉｓａｋｕｊｏｕｈｏｕ－１１１３０５００－Ｓｈｏｋｕｈｉｎａｎｚｅｎｂｕ／１＿１１．ｐｄｆ、（２）飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｍｉｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｆｉｓ／ｆｅｅｄ／ｈｏｕｒｅｉ／ｓｕｂ１＿ｓｅｉｂｕｎｋｉｋａｋｕ．ｈｔｍｌ、（３）遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律施行規則（平成１５年財務省、文部科学省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第１号）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｖ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｆｉｌｅｓ／ｊｐ／１０８４５８．ｐｄｆ〕に示されているように、セルフクローニングで改良された微生物は、遺伝子組換え生物の安全性審査を受けることなく、産業利用することが可能であり、安全性審査のためのコストを必要としない。また、遺伝子組換え微生物を産業利用する場合には、培養後に入念に滅菌処理を行う必要があり、そのために多大なコストを要する。一方、セルフクローニングで改良された微生物は、非遺伝子組換えの微生物として扱うことができるため、滅菌処理のコストを必要としない。
【0015】
セルフクローニングとしては、例えば、微生物ゲノム上の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のプロモーター領域の、宿主と同属同種の微生物に由来するプロモーターでの置換または挿入、微生物ゲノム上のプロモーター下流領域への、宿主と同属同種の微生物に由来する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の置換または挿入、宿主と同属同種の微生物に由来するプロモーターと宿主と同属同種の微生物に由来する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み合わせた遺伝子発現カセット（選抜マーカー遺伝子が結合されていてもよい）の微生物への導入が挙げられる。セルフクローニングの手段としては、例えば、相同組換え、ゲノム編集（例、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）、ベクター導入が挙げられる。
【0016】
高発現する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、ＦＡＤ３、Ｄ１５Ｄ等のω－３デサチュラーゼ等をコードする遺伝子が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。また、配列番号９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、または、配列番号９のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ脂肪酸不飽和化活性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。このような同一性は、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上が挙げられる。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、用いる微生物の種に対応する脂肪酸不飽和化酵素（例、ＦＡＤ３タンパク質）をコードする遺伝子であってもよい。脂肪酸不飽和化活性としては、例えば、ω－３デサチュラーゼ活性が挙げられ、具体的には例えば、リノール酸（Ｃ１８：２）をα－リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換する活性が挙げられる。
【0017】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入においては、既知の遺伝子工学的手法を用いてα－リノレン酸のより効率的な生産のための改変を行ってもよい。例えば、ヤロウィア属酵母にエイコサペンタエン酸を生産させる際の複数コピーの導入によって高い生産量を得ている（Ｘｕｅ Ｚ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１、８、７３４－７４０、２０１３）。
【0018】
プロモーターは、目的に応じて選択すればよく、例えば、高発現プロモーター、すなわち発現量の多いプロモーターを選択できる。高発現プロモーターを用いることにより、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現量を向上させることができる。プロモーターの他の例としては、特定の条件下で特異的に発現するプロモーターも挙げられる。これにより、α－リノレン酸を生産するタイミングや条件を厳密に制御することができる。プロモーターとしては、具体的には例えば、以下を挙げることができるが、これらに限定されない：ＴＥＦ１プロモーター；α－アミラーゼ遺伝子やグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター（秦洋二ら、醸協、９３、１２、９２２－９３１、１９９８年、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００年）；スーパーオキシドデスムターゼ遺伝子、チトクロームＰ－４５０遺伝子、カタラーゼ遺伝子、ＡＴＰａｓｅ遺伝子、又はヒストン遺伝子のプロモーター（特許第３７９２４６７号公報）；麹菌が本来有しているｒｅｇｉｏｎＩＩＩと呼ばれる塩基配列を重複させた人工プロモーター（峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１－８３８、２０００年）。
【0019】
本発明におけるセルフクローニングによる改良は、例えば、宿主と同属同種の微生物に由来するプロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とを組み合わせた遺伝子発現カセットを細胞内に存在させることで達成することができる。例えば、発現プロモーターは、アスペルギルス属の場合、ＴＥＦ１プロモーターを使用してもよい。発現カセットが細胞内に導入された株を選抜するために、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主と同属同種の生物に由来するマーカー遺伝子を接続して、宿主に導入してもよい。例えば、マーカー遺伝子には、ピリチアミン耐性遺伝子やオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子）を用いてもよい。また、アスペルギルス属以外に由来するマーカー遺伝子を用いる場合には、高発現プロモーターと脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現カセットとともに宿主に導入したのちに、相同組換えやＣｒｅリコンビナーゼによって導入したマーカー遺伝子をゲノムから除去してもよい。
【0020】
本発明においては、例えば以下のように脂肪族不飽和化酵素遺伝子以外の核酸を導入する等の既知の遺伝子工学的手法により微生物のα－リノレン酸産生能をより向上させてもよい。
糖質から脂肪酸に至る生合成経路上の遺伝子の発現量を高めることで、脂質の生産量が増加することが知られている。ヤロウィア属酵母の場合、アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子とジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を高めることで脂質生産量が高まることが報告されている（Ｔａｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１５、１－９、２０１３）。アスペルギルス属菌の場合でも、アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子、パルミトイルＡＣＰチオエステラーゼ、アセチルＣｏＡクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素遺伝子の発現量を高めることで、脂質の生合成が高まることが報告されている（Ｔａｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９７、２６９－２８１、２０１３）。こうした遺伝子の発現強化を組み合わせることで、α－リノレン酸の生産量をより高めることができる。
糖質から脂肪酸に至る生合成経路上の遺伝子の発現量を高めることで、脂質の生産量が増加することが知られている。ヤロウィア属酵母の場合、アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子とジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を高めることで脂質生産量が高まることが報告されている（Ｔａｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１５、１－９、２０１３）。アスペルギルス属菌の場合でも、アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子、パルミトイルＡＣＰチオエステラーゼ、アセチルＣｏＡクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素遺伝子の発現量を高めることで、脂質の生合成が高まることが報告されている（Ｔａｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９７、２６９－２８１、２０１３）。こうした遺伝子の発現強化を組み合わせることで、α－リノレン酸の生産量をより高めることができる。
【0021】
脂肪酸の生合成には、大量のＮＡＤＰＨが必要である。このため、ＮＡＤＰＨを供給するペントースリン酸回路の遺伝子の発現量を高めることで、脂質の生産量が高まることが報告されている（Ｔａｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８０、９、１８２９－１８３５、２０１６）。
【0022】
脂肪酸は、一般的に、パルミチン酸が脂肪酸合成酵素によって合成された後、それが鎖長延長酵素によってステアリン酸に変換される。ステアリン酸はΔ９不飽和化酵素による反応を受け、オレイン酸によって変換される。オレイン酸は、Δ１２不飽和化酵素による反応を受け、リノール酸に変換される。リノール酸は、Δ１５（もしくはオメガ３）不飽和化酵素による反応を受け、α－リノレン酸に変換される。例えば、Ｘｕｅ Ｚ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１、８、７３４－７４１、２０１３では、エイコサペンタエン酸を合成する経路にある鎖長延長酵素と不飽和化酵素の発現量を高めることで、エイコサペンタエン酸を大量に合成できることが報告されている。このように、α－リノレン酸の生合成に必要な鎖長延長酵素、Δ９不飽和化酵素、Δ１２不飽和化酵素の遺伝子の発現量を高めることによっても、α－リノレン酸の生産量をより高めることができる。
【0023】
生合成された脂肪酸は、一般的にトリアシルグリセロールとして菌体内に蓄積されるが、特定の遺伝子の破壊によって菌体外に分泌生産させることができる。アスペルギルス属菌の場合、アシルＣｏＡ合成酵素遺伝子の破壊によって菌体外に脂肪酸が分泌されることが報告されている（Ｔａｍａｎｏ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８０、９、１８２９－１８３５、２０１６）。こうした遺伝子破壊を組み合わせることで、α－リノレン酸を菌体外に分泌生産させ、生産量をより高めることができる。
【0024】
生体内に蓄積された脂肪酸は、β－酸化と呼ばれる代謝経路によってアセチルＣｏＡまで分解されることが知られている。ヤロウィア属酵母の場合、脂肪酸の分解に関与するアシルＣｏＡ酸化酵素の遺伝子やβ－酸化の場となるペルオキシソームの制御に関与するＰＥＸ１０遺伝子などの破壊によって、脂肪酸の分解が抑制され、より多くの脂質を生産可能になることが報告されている（Ｌｅｄｅｓｍａ－Ａｍａｒｏ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６１、４０－５０、２０１６）。このため、脂肪酸の分解に関与する遺伝子の破壊、もしくは、発現量の低減によって、α－リノレン酸の生産量をより高めることができる。
【0025】
アスペルギルス属菌が食用性物質を栄養源として生育する場合、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、プロテアーゼなどをはじめとする様々な分解酵素を菌体外に分泌して、食用性物質を分解する。このため、こうした分解酵素の遺伝子の発現量を高めることで、栄養源の分解が早く進み、所定の時間で生産されるα－リノレン酸の生産量をより高めることができる。
【0026】
本発明におけるα－リノレン酸とは、９，１２，１５－オクタデカトリエン酸のことであり、細胞内に含まれる形態は、トリアシルグリセロールやリン脂質に含まれるエステル体、もしくは、遊離脂肪酸であってもよい。
【0027】
本発明の微生物は、糖質代謝経路および脂肪酸合成経路を含むので、デンプン、ラクトース等の糖質を含む物質の存在下で培養することにより、デンプン、ラクトース等の糖質を代謝して、α－リノレン酸の前駆物質であるＣ１８脂肪酸（例、リノール酸（Ｃ１８：２））を産生する。そして、セルフクローニングにより強化された脂肪酸不飽和化酵素の作用により、リノール酸（Ｃ１８：２）がα－リノレン酸（Ｃ１８：３）に変換され、α‐リノレン酸が微生物またはその培養物中に高含有量で蓄積される。
本明細書において糖質とは、微生物が資化できる糖であればよく、その分子量は特に限定されない。三糖以上の場合直鎖でも分岐鎖でもよい。例えば、単糖（例、キシロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース）、二糖（例、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セロビオース）、オリゴ糖（例、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖）、多糖（例、デンプン、セルロース、アガロース、カラギーナン、ペクチン、グルコマンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン）、糖アルコール（例、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール）、プロテオグリカン（例、グリコサミノグルカン、ガラクトサミノグリカン）、糖タンパク質、糖脂質が挙げられる。これらのうち、デンプン、ラクトースが好ましい。
本明細書において糖質とは、微生物が資化できる糖であればよく、その分子量は特に限定されない。三糖以上の場合直鎖でも分岐鎖でもよい。例えば、単糖（例、キシロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース）、二糖（例、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、セロビオース）、オリゴ糖（例、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖）、多糖（例、デンプン、セルロース、アガロース、カラギーナン、ペクチン、グルコマンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン）、糖アルコール（例、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール）、プロテオグリカン（例、グリコサミノグルカン、ガラクトサミノグリカン）、糖タンパク質、糖脂質が挙げられる。これらのうち、デンプン、ラクトースが好ましい。
【0028】
本発明の微生物を培養することで、α－リノレン酸の含量が高い微生物菌体を調製することができる。特に、食品廃棄物、より好ましくは、デンプン、ラクトース等の糖質を含む食品廃棄物からα－リノレン酸の含量が多い微生物菌体を調製することができる。
【0029】
本発明においてセルフクローニングで改良されたアスペルギルス属微生物は、好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα－リノレン酸が１０％以上を占めることができる。より好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα－リノレン酸が１５％以上を占めることができる。さらに好ましくは、菌体に含まれる総脂肪酸のうちα－リノレン酸が２０％以上を占めることができる。
【0030】
本発明の微生物が、アスペルギルス属微生物である場合、アスペルギルス属微生物の菌株は、アスペルギルス属微生物の公知の培養条件に従って培養することができる。また、栄養源として、糖質を含む廃棄物を用いることができる。例えば、米飯（残飯）などのデンプンを含む食品廃棄物を栄養源として培養することができる。また、ラクトースを含むホエイなどの、ラクトースを含む食品廃棄物も栄養源として培養することができる。培養にあたり、培地は液体であっても固体であってもよい。
【0031】
α－リノレン酸を生産する目的でアスペルギルス属微生物を培養するために用いる培地は、炭素源を含む。炭素源としては、以下に限定されないが、上段で定義した糖質（例、デンプン、グルコース、スクロース、ラクトース、セロビオース、アラビノース、マルトース、グリセロール、トリアシルグリセロール）、遊離脂肪酸が挙げられる。また、デンプン、ラクトース等の糖質もしくはそれを含む食品廃棄物を、直接、もしくは、ほかの物質と混合することで培地として利用することができる。
【0032】
上記培地は、炭素源に加えて、通常は窒素源及び無機塩類を含み、さらに必要に応じてビタミン類、アミノ酸、微量元素等を含んでもよい。無機塩類としては、例えば、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を使用することができる。好ましい一実施形態では、上記培地は、可溶性デンプン、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム７水和物を少なくとも含む。但し培地組成は、微生物の培養に適切なものであれば特に限定されない。
【0033】
培養は、本発明の微生物で通常用いられる培養条件で行うことができる。例えば、アスペルギルス属微生物は、４℃～４０℃、好ましくは２０℃～３７℃で培養することができる。アスペルギルス属微生物を培養する培地のｐＨは３～１０が好ましい。
【0034】
α－リノレン酸の生産のためには、本発明の微生物の培養は、糖質（例、デンプン、ラクトース）を含む培地で通気攪拌しながら培養することが好ましく、典型的には数時間～１０日、好ましくは２４時間以上である。
【0035】
上記のようにして本発明の微生物を培養することにより、上記α－リノレン酸が生成され菌体中に蓄積される。また、本発明の微生物を培養することにより、微生物が分泌したα－リノレン酸を含む培養物を得ることもできる。
【0036】
本発明はまた、上述した微生物またはその培養物を含む、食品または飼料を提供する。本発明の食品または飼料の種類は、特に限定されず、α－リノレン酸の高含有化による付加価値を付与したい食品または飼料を広く対象とすることができる。
【0037】
本発明はまた、上述した微生物またはその培養物を含む、食用性物質発酵用組成物を提供する。本発明の食用性物質発酵用組成物を食用性物質に適用させて発酵することにより、α－リノレン酸を多く含む食品または飼料を製造することができる。
食用性物質発酵用組成物は、いわゆる麹であり、上述した微生物またはその培養物を含めばよく、任意成分（例えば、保存剤、発酵促進剤等）をさらに含んでもよい。食用性物質発酵用組成物の製造方法は、特に限定されないが、従来の麹の製造方法によればよい。
食用性物質は、微生物の発酵原料となり得るものであればよく、例えば、食品または飼料、それらの原料（いわゆる食材）、廃棄物であり、特に限定されない。食用性物質は、糖質を含むことが好ましい。中でも、デンプン系食品（例えば、米飯類、パン類、麺類、豆類、その他のデンプンを含む食材の加工品）、デンプン系飼料、それらの原料、廃棄物（例、残飯、製造時の副産物）がより好ましい。ラクトース系食品（例えば、牛乳、スキムミルク、ホエイ、チーズ、ヨーグルト、バター、その他の乳製品等、ラクトースを含む加工食品）、ラクトース系飼料、それらの原料、廃棄物（例、残飯、製造時の副産物）もより好ましい。飼料を製造する場合、食用性物質は食品又はその原料の廃棄物でもよく、澱粉系食品の廃棄物、ラクトース系食品の廃棄物が好ましい。
食用性物質発酵用組成物は、いわゆる麹であり、上述した微生物またはその培養物を含めばよく、任意成分（例えば、保存剤、発酵促進剤等）をさらに含んでもよい。食用性物質発酵用組成物の製造方法は、特に限定されないが、従来の麹の製造方法によればよい。
食用性物質は、微生物の発酵原料となり得るものであればよく、例えば、食品または飼料、それらの原料（いわゆる食材）、廃棄物であり、特に限定されない。食用性物質は、糖質を含むことが好ましい。中でも、デンプン系食品（例えば、米飯類、パン類、麺類、豆類、その他のデンプンを含む食材の加工品）、デンプン系飼料、それらの原料、廃棄物（例、残飯、製造時の副産物）がより好ましい。ラクトース系食品（例えば、牛乳、スキムミルク、ホエイ、チーズ、ヨーグルト、バター、その他の乳製品等、ラクトースを含む加工食品）、ラクトース系飼料、それらの原料、廃棄物（例、残飯、製造時の副産物）もより好ましい。飼料を製造する場合、食用性物質は食品又はその原料の廃棄物でもよく、澱粉系食品の廃棄物、ラクトース系食品の廃棄物が好ましい。
【0038】
本発明はまた、α－リノレン酸を高含有量で含む食品または飼料の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）食用性物質と、上述した微生物またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
（ｉ）食用性物質と、上述した微生物またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）食用性物質を発酵させる工程。
【0039】
工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）で行う発酵を行うための環境を準備する工程である。食用性物質と、上述した微生物またはその培養物とを接触させる方法としては、例えば、食用性物質と微生物またはその培養物とを容器に同時に又は順次添加し、必要に応じて撹拌、混合する方法が挙げられるが、特に限定されない。食用性物質については上述のとおりである。食用性物質と微生物またはその培養物のそれぞれの使用量は、発酵が可能な量であればよく、特に限定されない。食用性物質は、１種類の食用性物質でもよいし、２種以上の食用性物質の組み合わせでもよい。
【0040】
工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で準備した発酵環境の下、発酵を行う工程である。発酵条件は、特に限定されないが、使用する微生物が発酵を行いα－リノレン酸を生産できる条件が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα－リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望のα－リノレン酸を含む食品または飼料を得ることができる。
【0041】
本発明はまた、α－リノレン酸の製造方法を提供する。このような方法は、以下を含む：
（ｉ）糖質供給源（例、デンプン供給源もしくはラクトース供給源）と、上述した微生物またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）糖質供給源（例、デンプン供給源もしくはラクトース供給源）を発酵させる工程。
（ｉ）糖質供給源（例、デンプン供給源もしくはラクトース供給源）と、上述した微生物またはその培養物とを接触させる工程；および
（ｉｉ）糖質供給源（例、デンプン供給源もしくはラクトース供給源）を発酵させる工程。
【0042】
（ｉ）、（ｉｉ）とも、食用性物質の代わりに糖質供給源（例、デンプン供給源もしくはラクトース供給源）を用いること、生産物がα－リノレン酸であることのほかは、上述の食品または飼料の製造方法と同様である。糖質供給源とは、糖質を含む物質であればよく、好ましくはデンプンおよびラクトースの少なくともいずれかを含む。糖質供給源としては、上述した食用性物質が好ましい。工程（ｉｉ）における発酵後、発酵産物にはα－リノレン酸が含まれているので、必要に応じて精製、その他最終製品として必要な加工を施し、所望の純度のα－リノレン酸を得ることができる。
【0043】
本発明の方法では、好ましくは、このようにして生成されたアスペルギルスの菌体を遠心分離やろ過によって回収し、それを食品や飼料として利用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼは、日本酒やみそ、しょうゆの製造に利用されており、食品として利用できる安全な微生物である。上記のセルフクローニングで改良されたアスペルギルス属微生物もこのように食品の一部として利用することができる。また、アスペルギルス・リュウキュウエンシスは泡盛の製造に利用されており、食品廃棄物を分解して飼料を生産するためにも利用されている（特許文献２）。さらに、アスペルギルス・カワチは、焼酎の製造に利用されており、食品として利用できる安全な微生物である。上記のセルフクローニングで改良されたアスペルギルス属微生物も、このように飼料として利用することができる。
【0044】
アスペルギルス属菌体内のα－リノレン酸は菌体から抽出して使用してもよい。また、培養物（例、培養液）から菌体を分離することなく、培養物全体を食品や飼料として利用することもできる。
【0045】
α－リノレン酸を含む食品を摂取することで、高血圧の抑制効果が期待できる（非特許文献１）。また、α－リノレン酸を人が食品として摂取した場合、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸の前駆体として働くことから、これらの脂肪酸の健康効果として知られている血中の中性脂肪の低減効果なども期待できる（非特許文献２）。また、α－リノレン酸を多く含む飼料を動物に与えることで、畜産物にα－リノレン酸が蓄積されることが明らかとなっている（非特許文献３、４）。すでに、α－リノレン酸を飼料として用いて動物を生育させることで、α－リノレン酸高含有畜産物が実際に生産され販売されている。これと同様に、上記のセルフクローニングで改良されたアスペルギルス属微生物を飼料として利用することで、α－リノレン酸が動物の組織内に移行し、健康機能性が高い畜産物、水産物（畜産・水産利用品（加工肉、乳製品）を含む）を生産することができる。
【実施例】
【0046】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0047】
［実施例１］α－リノレン酸の生産に関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の選定
アスペルギルス属微生物としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株（ＮＢＲＣ１００９５９株）を使用した。ＲＩＢ４０株のゲノムはＧｅｎｂａｎｋに多数登録されている。この情報の中には、複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が登録されていたが、α－リノレン酸の生合成に直接関与することを意味する「ｄｅｌｔａ－１５ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」等として登録されているものは存在しなかった。そこで、ＲＩＢ４０株のゲノム内に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のうち、「ＳＣ０１０」のＬｏｃｕｓ ｔａｇ ＡＯ０９００１００００７１４として登録されている遺伝子（配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）をα－リノレン酸の生産に関与するものであると仮定し研究を行うこととした。
アスペルギルス属微生物としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株（ＮＢＲＣ１００９５９株）を使用した。ＲＩＢ４０株のゲノムはＧｅｎｂａｎｋに多数登録されている。この情報の中には、複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が登録されていたが、α－リノレン酸の生合成に直接関与することを意味する「ｄｅｌｔａ－１５ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」等として登録されているものは存在しなかった。そこで、ＲＩＢ４０株のゲノム内に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のうち、「ＳＣ０１０」のＬｏｃｕｓ ｔａｇ ＡＯ０９００１００００７１４として登録されている遺伝子（配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）をα－リノレン酸の生産に関与するものであると仮定し研究を行うこととした。
【0048】
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて、配列番号１をＧｅｎｂａｎｋのｎｒデータベースに登録されているアミノ酸配列と相同性検索を行ったところ、配列番号１と高い相同性を示した登録配列は図１のリストに示したとおりとなった。Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒおよびＰｅｒ． Ｉｄｅｎｔがともに１００％で配列番号１と完全に一致する配列はＲＩＢ４０株の配列そのもののみであった。また、ＲＩＢ４０株の配列そのもの以外で配列番号１と最も高い相同性を示した塩基配列は、α－リノレン酸の生産に関与しない「ｄｅｌｔａ－１２ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」として登録されているものであったことから、配列番号１の遺伝子がα－リノレン酸の生産に関与することを容易に推定することはできなかった。
【0049】
配列番号１の遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号２である。配列番号２をＧｅｎｅｂａｎｋのｎｒデータベースとＢＬＡＳＴ検索を行ったが、図２に示すとおり、Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒおよびＰｅｒ． Ｉｄｅｎｔがともに１００％で完全に一致する配列はＲＩＢ４０株の配列そのもののみであった。また、α－リノレン酸の生産に寄与しない「ｄｅｌｔａ－１２ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」として登録されている配列と９０％以上のアミノ酸配列の一致（Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒ １００％かつＰｅｒ．Ｉｄｅｎｔ ９０％以上）が確認され、α－リノレン酸の生産に関与する「ｄｅｌｔａ－１５ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」として登録されている配列との相同性は見られなかった。このことから、配列番号２のタンパク質がα－リノレン酸の生産に関与することを容易に推定することはできなかった。
【0050】
［実施例２］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ断片の調製
（アスペルギルス属微生物培養用培地の組成）
酵母エキス（粉末；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２％、Ｄ－グルコース（和光純薬工業）２％を純水に溶かしたものをＹＰＤ培地（ＹＰＤ液体培地）とし、以降の実施例で用いた。
（アスペルギルス属微生物培養用培地の組成）
酵母エキス（粉末；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２％、Ｄ－グルコース（和光純薬工業）２％を純水に溶かしたものをＹＰＤ培地（ＹＰＤ液体培地）とし、以降の実施例で用いた。
【0051】
（アスペルギルス属微生物由来プロモーターおよび脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の調製）
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、ＲＩＢ４０株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４および５のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼの高発現プロモーターとして報告されているＴＥＦ１プロモーター領域を増幅してＰＣＲ断片を得た（Ｋｉｔａｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５０， ８５－９２ （１９９８））。
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、ＲＩＢ４０株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号４および５のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼの高発現プロモーターとして報告されているＴＥＦ１プロモーター領域を増幅してＰＣＲ断片を得た（Ｋｉｔａｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５０， ８５－９２ （１９９８））。
【0052】
同様に、ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号６および７のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、配列番号１の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅してＰＣＲ断片を得た。
【0053】
これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これらの精製ＤＮＡ断片を、それぞれ「ＴＥＦ１プロモーター精製断片」および「脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片」とした。
【0054】
（ベクター断片の調製）
また、アスペルギルス属用形質転換ベクターにはｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ｐＰＴＲＩを制限酵素ＮｄｅＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＰＴＲＩベクター精製断片とした。
また、アスペルギルス属用形質転換ベクターにはｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ｐＰＴＲＩを制限酵素ＮｄｅＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＰＴＲＩベクター精製断片とした。
【0055】
（発現カセット作成用培地の組成）
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％含む培地をＬＢ液体培地とし、これに寒天を培地１リットルあたり１５ｇとアンピシリンナトリウムを加え、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬで含むアンピシリン入りＬＢ寒天培地を調製し、それぞれ、以降の実施例で用いた。
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％含む培地をＬＢ液体培地とし、これに寒天を培地１リットルあたり１５ｇとアンピシリンナトリウムを加え、アンピシリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬで含むアンピシリン入りＬＢ寒天培地を調製し、それぞれ、以降の実施例で用いた。
【0056】
（発現カセットを含むＤＮＡ断片の作成）
ＴＥＦ１プロモーター精製断片、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片、ｐＰＴＲＩベクター精製断片の３つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。
ＴＥＦ１プロモーター精製断片、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片、ｐＰＴＲＩベクター精製断片の３つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。
【0057】
形質転換処理された大腸菌を、アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットがｐＰＴＲＩベクターの中に挿入されていることを確認した。このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入したＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットの配列が所望の配列になっていることを塩基配列解析及びＰＣＲにより確認した。さらに、制限酵素ＭｆｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いて、ＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットとベクター上にもともと存在するピリチアミン耐性マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片を切断した。この試料をアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製し、発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片を得た。発現カセットを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号３である。
【0058】
配列番号３に含まれるＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域をそれぞれ、ＢＬＡＳＴを用いてアスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡと相同性検索を行った。その結果、各構成要素はすべてアスペルギルス・オリゼ由来の登録塩基配列と完全に一致し、いずれもアスペルギルス・オリゼ由来であることが確認された。なお、配列番号３に含まれるピリチアミン耐性遺伝子は、アスペルギルス・オリゼのピリチアミン耐性突然変異株から取得されたものであり（特開２０００－３０８４９１）、アスペルギルス・オリゼ由来の塩基配列であることが確認された。
【0059】
［実施例３］アスペルギルス属微生物ゲノムへの発現カセットの導入
（アスペルギルス属微生物用培地の組成）
純水１リットルあたり、硝酸ナトリウム６．０ｇ、塩化カリウム０．５２ｇ、リン酸二水素カリウム１．５２ｇ、グルコース１０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４９ｇ、硫酸鉄七水和物０．００１ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．００８８ｇ、硫酸銅五水和物０．０００４ｇ、四ほう酸ナトリウム十水和物０．０００１ｇ、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００００５ｇを含むｐＨ６．５の培地をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ（ＣＤ）培地とし、ＣＤ培地１リットルあたりに寒天２０ｇを加えて調製したものをＣＤ寒天培地とし、それぞれ以降の実施例で用いた。
（アスペルギルス属微生物用培地の組成）
純水１リットルあたり、硝酸ナトリウム６．０ｇ、塩化カリウム０．５２ｇ、リン酸二水素カリウム１．５２ｇ、グルコース１０ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４９ｇ、硫酸鉄七水和物０．００１ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．００８８ｇ、硫酸銅五水和物０．０００４ｇ、四ほう酸ナトリウム十水和物０．０００１ｇ、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００００５ｇを含むｐＨ６．５の培地をＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ（ＣＤ）培地とし、ＣＤ培地１リットルあたりに寒天２０ｇを加えて調製したものをＣＤ寒天培地とし、それぞれ以降の実施例で用いた。
【0060】
（アスペルギルス属微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の作成）
ｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）のマニュアルに従い、宿主となるＲＩＢ４０株のプロトプラストを調製し、実施例２に記載した発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片をＲＩＢ４０株に導入した。ＤＮＡ断片導入処理されたＲＩＢ４０株を、ピリチアミンを０．１μｇ／ｍｌの終濃度で含有するＣＤ寒天培地で培養した。このピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で生育が見られたコロニーをＹＰＤ培地で培養した。続いて、培養菌体を遠心分離で回収し、ＩＳＯＰＬＡＮＴでゲノムＤＮＡを抽出して、ピリチアミン耐性遺伝子とＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域を含む発現カセットがゲノム内に導入されていることをＰＣＲで確認した。導入したＤＮＡを構成する塩基配列は、すべて宿主と同じアスペルギルス・オリゼ由来のものであることから、この遺伝的改変はセルフクローニングとみなすことができる。得られたＲＩＢ４０株を、「脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株」（以下「セルフクローニング株」）と呼ぶ。
ｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）のマニュアルに従い、宿主となるＲＩＢ４０株のプロトプラストを調製し、実施例２に記載した発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片をＲＩＢ４０株に導入した。ＤＮＡ断片導入処理されたＲＩＢ４０株を、ピリチアミンを０．１μｇ／ｍｌの終濃度で含有するＣＤ寒天培地で培養した。このピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で生育が見られたコロニーをＹＰＤ培地で培養した。続いて、培養菌体を遠心分離で回収し、ＩＳＯＰＬＡＮＴでゲノムＤＮＡを抽出して、ピリチアミン耐性遺伝子とＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域を含む発現カセットがゲノム内に導入されていることをＰＣＲで確認した。導入したＤＮＡを構成する塩基配列は、すべて宿主と同じアスペルギルス・オリゼ由来のものであることから、この遺伝的改変はセルフクローニングとみなすことができる。得られたＲＩＢ４０株を、「脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株」（以下「セルフクローニング株」）と呼ぶ。
【0061】
［実施例４］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のデンプンからの培養
上記ＣＤ培地のグルコース１０ｇの代わりに可溶性デンプン３０ｇを加えた培地を、デンプンＣＤ培地とし、以降の実施例で用いた。ＣＤ寒天培地でＲＩＢ４０株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地でセルフクローニング株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。デンプンＣＤ培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにデンプンＣＤ培地に接種した。３０℃、１２０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
上記ＣＤ培地のグルコース１０ｇの代わりに可溶性デンプン３０ｇを加えた培地を、デンプンＣＤ培地とし、以降の実施例で用いた。ＣＤ寒天培地でＲＩＢ４０株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地でセルフクローニング株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。デンプンＣＤ培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにデンプンＣＤ培地に接種した。３０℃、１２０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
【0062】
［実施例５］デンプンで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂質含量の測定
実施例４に記載の菌体から脂質を抽出した。菌体を水で洗浄後、乳鉢と乳棒で摩砕した。摩砕物を凍結乾燥して、乾燥重量を測定した。この乾燥物に、水２ｍｌ、クロロホルム２．５ｍＬ、メタノール５ｍＬを添加して、２時間振とうした。さらに、クロロホルムを２．５ｍＬ、水を１ｍＬ添加して、遠心してクロロホルム・メタノール層を回収した。このクロロホルム・メタノール層から溶媒を留去し、残った脂質の重量を測定した。その結果、脂質含量は、表１に示すとおり、ＲＩＢ４０株とセルフクローニング株でほぼ同等であった。
実施例４に記載の菌体から脂質を抽出した。菌体を水で洗浄後、乳鉢と乳棒で摩砕した。摩砕物を凍結乾燥して、乾燥重量を測定した。この乾燥物に、水２ｍｌ、クロロホルム２．５ｍＬ、メタノール５ｍＬを添加して、２時間振とうした。さらに、クロロホルムを２．５ｍＬ、水を１ｍＬ添加して、遠心してクロロホルム・メタノール層を回収した。このクロロホルム・メタノール層から溶媒を留去し、残った脂質の重量を測定した。その結果、脂質含量は、表１に示すとおり、ＲＩＢ４０株とセルフクローニング株でほぼ同等であった。
【0063】
【表1】
【0064】
［実施例６］デンプンで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例４で残った菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
実施例４で残った菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
【0065】
ＲＩＢ４０株菌体とセルフクローニング株のガスクロマトグラフは図４に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＲＩＢ４０株菌体と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子高発現株のα‐リノレン酸の含有比率が表２に示されるとおりであることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα‐リノレン酸の比率が、ＲＩＢ４０株に比べて約１１倍増加していることが分かった。また、セルフクローニング株の乾燥菌体重量のうち、α－リノレン酸が占める割合はＲＩＢ４０株の約１０倍に増加していることが明らかとなった（表３）。
【0066】
【表2】
【0067】
【表3】
【0068】
［実施例７］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株のラクトースからの培養
上記ＣＤ培地のグルコース１０ｇの代わりにラクトース３０ｇを加えた培地を、ラクトースＣＤ培地とし、以降の実施例で用いた。ＣＤ寒天培地でＲＩＢ４０株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地でセルフクローニング株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。ラクトースＣＤ培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにラクトースＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
上記ＣＤ培地のグルコース１０ｇの代わりにラクトース３０ｇを加えた培地を、ラクトースＣＤ培地とし、以降の実施例で用いた。ＣＤ寒天培地でＲＩＢ４０株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地でセルフクローニング株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。ラクトースＣＤ培地５０ｍＬを３００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにラクトースＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
【0069】
［実施例８］ラクトースで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子セルフクローニング株の脂肪酸組成
実施例７で得た菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
実施例７で得た菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
【0070】
ガスクロマトグラフの結果から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、ＲＩＢ４０株菌体と脂肪酸不飽和化酵素遺伝子高発現株のα－リノレン酸の含有比率が表４に示されるとおりであることが確認された。この結果から、セルフクローニング株は、総脂肪酸に対するα－リノレン酸の比率が、ＲＩＢ４０株に比べて約５８倍に増加していることが分かった。
【0071】
【表4】
【0072】
［実施例９］アスペルギルス・カワチ株においてα－リノレン酸の生産に関与する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の選定
アスペルギルス属微生物としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＮＢＲＣ４３０８株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｍｕｔ． ｋａｗａｃｈｉｉと呼ばれることもある。以下カワチ株とする）を使用した。カワチ株のゲノムはＧｅｎｂａｎｋに多数登録されている。この情報の中には、複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が登録されていたが、α－リノレン酸の生合成に直接関与することを意味する「ｄｅｌｔａ－１５ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」等として登録されているものは存在しなかった。そこで、カワチ株のゲノム内に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のうちＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＤＦ１２６４８０ 「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ ４３０８ ＤＮＡ， ｃｏｎｔｉｇ： ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３４， ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のＬｏｃｕｓ Ｔａｇ ＡＫＡＷ＿０９４８６として登録されている遺伝子（配列番号８の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）をα－リノレン酸の生産に関与するものであると仮定し研究を行うこととした。
アスペルギルス属微生物としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＮＢＲＣ４３０８株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ ｍｕｔ． ｋａｗａｃｈｉｉと呼ばれることもある。以下カワチ株とする）を使用した。カワチ株のゲノムはＧｅｎｂａｎｋに多数登録されている。この情報の中には、複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が登録されていたが、α－リノレン酸の生合成に直接関与することを意味する「ｄｅｌｔａ－１５ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」等として登録されているものは存在しなかった。そこで、カワチ株のゲノム内に存在する複数の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のうちＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＤＦ１２６４８０ 「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ ４３０８ ＤＮＡ， ｃｏｎｔｉｇ： ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３４， ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のＬｏｃｕｓ Ｔａｇ ＡＫＡＷ＿０９４８６として登録されている遺伝子（配列番号８の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子）をα－リノレン酸の生産に関与するものであると仮定し研究を行うこととした。
【0073】
配列番号８の遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号９）はＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＧＡＡ９１３７２「ｏｌｅａｔｅ ｄｅｌｔａ－１２ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」としてデータベースに登録されていた。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて、配列番号９をＧｅｎｂａｎｋのｎｒデータベースに登録されているアミノ酸配列と相同性検索を行ったところ、配列番号９と高い相同性を示した登録配列は図４のリストに示したとおりとなった。機能が推定されているアミノ酸配列はいずれもα－リノレン酸の生産に直接関与しない「ｄｅｌｔａ－１２ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ」として登録されているものであった。このことから、配列番号８の遺伝子、配列番号９のアミノ酸配列がα‐リノレン酸の生産に直接関与することを容易に推定することはできなかった。
【0074】
［実施例１０］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子発現カセットを含むＤＮＡ断片の調製
（アスペルギルス属微生物由来プロモーターおよび脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の調製）
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、カワチ株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１０および１１のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・カワチの高発現プロモーターとして配列番号１２のＴＥＦ１プロモーター領域を増幅してＰＣＲ断片を得た。
（アスペルギルス属微生物由来プロモーターおよび脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ゲノムＤＮＡ断片の調製）
ＹＰＤ液体培地をプラスチックチューブに添加し、カワチ株を培養し、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（株式会社ニッポンジーン）を使用した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１０および１１のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、アスペルギルス・カワチの高発現プロモーターとして配列番号１２のＴＥＦ１プロモーター領域を増幅してＰＣＲ断片を得た。
【0075】
同様に、ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１３および１４のヌクレオチド配列からなるプライマーでＰＣＲを行い、配列番号８の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅してＰＣＲ断片を得た。
【0076】
これらのＰＣＲ断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてＤＮＡ断片を精製した。これらの精製ＤＮＡ断片を、それぞれ「ＴＥＦ１プロモーター精製断片」および「脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片」とした。
【0077】
（ベクター断片の調製）
また、アスペルギルス属用形質転換ベクターにはｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ｐＰＴＲＩを制限酵素ＮｄｅＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＰＴＲＩベクター精製断片とした。
また、アスペルギルス属用形質転換ベクターにはｐＰＴＲＩ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ｐＰＴＲＩを制限酵素ＮｄｅＩ（株式会社ニッポンジーン）で切断した。この切断断片をアガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。これを、ｐＰＴＲＩベクター精製断片とした。
【0078】
（発現カセットを含むＤＮＡ断片の作成）
ＴＥＦ１プロモーター精製断片、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片、ｐＰＴＲＩベクター精製断片の３つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。
ＴＥＦ１プロモーター精製断片、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子／３’非翻訳領域精製断片、ｐＰＴＲＩベクター精製断片の３つをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、５０℃で３０分間反応させた。この反応液を形質転換用大腸菌（ＮＥＢ ５－ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）；ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）と混合し、マニュアルに従い、形質転換処理を行った。
【0079】
形質転換処理された大腸菌を、アンピシリン入りＬＢ寒天培地で約１８時間培養して、生育したコロニーを得た。このコロニーから抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、ＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットがｐＰＴＲＩベクターの中に挿入されていることを確認した。このコロニーをＬＢ液体培地で培養し、得られた大腸菌菌体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてベクターＤＮＡを精製した。このベクターＤＮＡに導入したＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットの配列が所望の配列になっていることを塩基配列解析及びＰＣＲにより確認した。さらに、制限酵素ＭｆｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）を用いて、ＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域からなる発現カセットとベクター上にもともと存在するピリチアミン耐性マーカー遺伝子とを含むＤＮＡ断片を切断した。この試料をアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製し、発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片を得た。発現カセットを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号１５である。
【0080】
［実施例１１］アスペルギルス・カワチ株のゲノムへの発現カセットの導入
（アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入株の作成）
宿主となるカワチ株のプロトプラストを調製し、実施例１０に記載した発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片をカワチ株に導入した。ＤＮＡ断片導入処理されたカワチ株を、ピリチアミンを０．２μｇ／ｍｌの終濃度で含有するＣＤ寒天培地で培養した。このピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で生育が見られたコロニーをＹＰＤ培地で培養した。続いて、培養菌体を遠心分離で回収し、ＩＳＯＰＬＡＮＴでゲノムＤＮＡを抽出して、ピリチアミン耐性遺伝子とＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域を含む発現カセットがゲノム内に導入されていることをＰＣＲで確認した。得られたカワチ株を、「遺伝子導入カワチ株」と呼ぶ。
（アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入株の作成）
宿主となるカワチ株のプロトプラストを調製し、実施例１０に記載した発現カセットを含む精製ＤＮＡ断片をカワチ株に導入した。ＤＮＡ断片導入処理されたカワチ株を、ピリチアミンを０．２μｇ／ｍｌの終濃度で含有するＣＤ寒天培地で培養した。このピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で生育が見られたコロニーをＹＰＤ培地で培養した。続いて、培養菌体を遠心分離で回収し、ＩＳＯＰＬＡＮＴでゲノムＤＮＡを抽出して、ピリチアミン耐性遺伝子とＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、３’非翻訳領域を含む発現カセットがゲノム内に導入されていることをＰＣＲで確認した。得られたカワチ株を、「遺伝子導入カワチ株」と呼ぶ。
【0081】
［実施例１２］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入カワチ株のデンプンからの培養
ＣＤ寒天培地で通常のカワチ株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で遺伝子導入カワチ株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。デンプンＣＤ培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにデンプンＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
ＣＤ寒天培地で通常のカワチ株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で遺伝子導入カワチ株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。デンプンＣＤ培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにデンプンＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
【0082】
［実施例１３］デンプンで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入株の脂肪酸組成
実施例１２で残った菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
実施例１２で残った菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
【0083】
カワチ株菌体と遺伝子導入カワチ株のガスクロマトグラフは図５に示したとおりとなった。標品との比較から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α‐リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、カワチ株菌体と遺伝子導入株のα－リノレン酸の含有比率が表５に示されるとおりであることが確認された。この結果から、遺伝子導入カワチ株は、総脂肪酸に対するα－リノレン酸の比率が、カワチ株に比べて約５倍増加していることが分かった。また、遺伝子導入カワチ株の乾燥菌体重量のうち、α－リノレン酸が占める割合はカワチ株の約５倍に増加していることが明らかとなった（表５）。
【0084】
【表5】
【0085】
［実施例１４］脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入カワチ株のラクトースからの培養
ＣＤ寒天培地でカワチ株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で遺伝子導入株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。ラクトースＣＤ培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにラクトースＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
ＣＤ寒天培地でカワチ株を培養し、滅菌綿棒で胞子を回収して、胞子懸濁液を調製した。また、ピリチアミン含有ＣＤ寒天培地で遺伝子導入株を培養し、同様に滅菌綿棒で胞子を回収し、胞子懸濁液を回収した。ラクトースＣＤ培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の羽根つきフラスコに調製した。上記の胞子懸濁液のＯＤ６００を測定し、吸光度が０．０５になるようにラクトースＣＤ培地に接種した。３０℃、９０ｒ．ｐ．ｍで４日間振とう培養し、十分量の菌体を回収した。
【0086】
［実施例１５］ラクトースで培養した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子導入カワチ株の脂肪酸組成
実施例１４で得た菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
実施例１４で得た菌体をビーズとともにプラスチックチューブに入れ、ビーズ破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で処理を行い、破砕した。遠心エバポレーターを用いて６０℃で１時間処理し、水分を除去し、脂肪酸組成分析試料とした。これに、ヘプタデカン酸メチルエステルのヘキサン溶液（２ｇ／Ｌ）を内部標準として５０μＬ添加し、その後、直ちに、０．５Ｎの水酸化ナトリウムメタノール溶液を５００μＬ添加して、均一に混合後、１２００ｒ．ｐ．ｍで１時間攪拌した。さらに、硫酸を４０μＬ添加してｐＨを調整した後、ヘキサンを５００μＬ添加して、３０分間攪拌した。ヘキサン層を回収し、ガスクロマトグラフ分析装置で分析を行った。ガスクロマトグラフ分析装置には、水素炎イオン化検出器を備えた株式会社島津製作所製ＧＣ－２０１０ ｐｌｕｓを用いた。サンプルは、スプリットレスモードで１μＬを注入した。気化室は６０℃で分析を開始し、１００℃／分で温度を上げ、２４０℃で保持した。カラムにはＤＢ－２２５（３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ、アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、カラムオーブンは５０℃で開始し、３０℃／分で上昇させ、２００℃で保持した。ヘリウムをキャリアガスとして線速度３３ｃｍ／分で流し、２０分間で分析を完了した。検出器は、２４０℃、２５Ｈｚで使用した。水素は４０ｍｌ／分、空気は４００ｍＬ／分で流し、メイクアップガスはヘリウムを３０ｍＬ／分で使用した。
【0087】
カワチ株と遺伝子導入カワチ株のガスクロマトグラフの結果から、いずれも主要な脂肪酸はパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、α－リノレン酸（Ｃ１８：３）であることが確認された。各脂肪酸のピーク面積を、ＡＯＣＳ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅ １ｊ－０７に記載の補正係数であるｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓを用いて補正し、カワチ株菌体と遺伝子導入カワチ株のα－リノレン酸の含有比率が表６に示されるとおりであることが確認された。この結果から、遺伝子導入カワチ株は、総脂肪酸に対するα－リノレン酸の比率が、通常のカワチ株に比べて約２３倍に増加していることが分かった。
【0088】
【表6】
【0089】
［実施例１６］アミノ酸配列の同一性の評価
実施例１～８において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株の配列番号２の酵素がα－リノレン酸の生産に寄与する酵素であることが確認された。この配列番号２の酵素と同株のもつ類似酵素のアミノ酸配列を比較した。評価には、アライメント作成プログラムのＣｒｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを用いた。比較する２つの配列のアライメントを作成し、完全に一致するアミノ酸残基の数を算出し、それをアライメント全体の長さで除して求められる百分率をアミノ酸の同一性とした。まず、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているＲＩＢ４０株の情報からＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号２の酵素とアミノ酸配列の相同性が高いＲＩＢ４０株の５つのタンパク質を見出した。続いて、これらのタンパク質と配列番号２の酵素とのアミノ酸の同一性を算出した（表７）。
実施例１～８において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株の配列番号２の酵素がα－リノレン酸の生産に寄与する酵素であることが確認された。この配列番号２の酵素と同株のもつ類似酵素のアミノ酸配列を比較した。評価には、アライメント作成プログラムのＣｒｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを用いた。比較する２つの配列のアライメントを作成し、完全に一致するアミノ酸残基の数を算出し、それをアライメント全体の長さで除して求められる百分率をアミノ酸の同一性とした。まず、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているＲＩＢ４０株の情報からＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号２の酵素とアミノ酸配列の相同性が高いＲＩＢ４０株の５つのタンパク質を見出した。続いて、これらのタンパク質と配列番号２の酵素とのアミノ酸の同一性を算出した（表７）。
【0090】
【表7】
【0091】
また、実施例９～１５において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ株の配列番号９の酵素α－リノレン酸の生産に寄与する酵素であることが確認された。この配列番号９の酵素と同株のもつ類似酵素のアミノ酸配列を比較した。まず、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているカワチ株の情報からＢＬＡＳＴ検索を行い、配列番号９の酵素と相同性の高いカワチ株の４つのタンパク質を見出した。次に、これらのタンパク質とのアミノ酸の同一性を評価した（表８）。
【0092】
【表8】
【0093】
今回α－リノレン酸の生産に寄与することが確認されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株の酵素（配列番号２）とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ株の酵素（配列番号９）は、各菌株内の他の酵素とアミノ酸の同一性は４０％未満であった。他方で、配列番号２と配列番号９のアミノ酸配列は、同一性が７８％であった。このことから、配列番号２もしくは配列番号９とアミノ酸配列の同一性が例えば７０％を超えるアスペルギルス属のタンパク質は、α－リノレン酸の生産に寄与する酵素であると推定することができる。Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータベースを用いて配列番号２もしくは配列番号９とアミノ酸配列の相同性が高い酵素の遺伝子を検索し、高発現させることで、アスペルギルス属の様々な菌株においてα－リノレン酸の生産量を高めることができる。
【産業上の利用可能性】
【0094】
本発明は、食品や飼料として安全に利用できるα－リノレン酸高含有微生物菌体の生産に用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【0095】
配列番号１：アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号２：アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号３：ピリチアミン耐性遺伝子及びＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、および３’非翻訳領域を含む遺伝子発現カセット。
配列番号４および５：アスペルギルス・オリゼＴＥＦ１プロモーター領域を増幅するためのプライマー。
配列番号６および７：アスペルギルス・オリゼ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅するためのプライマー。
配列番号８：アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号９：アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号１０および１１：アスペルギルス・カワチ株ＴＥＦ１プロモーター領域を増幅するためのプライマー。
配列番号１２：アスペルギルス・カワチ株ＴＥＦ１プロモーター領域。
配列番号１３および１４：アスペルギルス・カワチ株脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅するためのプライマー。
配列番号１５：アスペルギルス・カワチ株に導入したピリチアミン耐性遺伝子及びＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、および３’非翻訳領域を含む遺伝子発現カセット。
配列番号２：アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号３：ピリチアミン耐性遺伝子及びＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、および３’非翻訳領域を含む遺伝子発現カセット。
配列番号４および５：アスペルギルス・オリゼＴＥＦ１プロモーター領域を増幅するためのプライマー。
配列番号６および７：アスペルギルス・オリゼ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅するためのプライマー。
配列番号８：アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子のヌクレオチド配列。
配列番号９：アスペルギルス・カワチ株の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号１０および１１：アスペルギルス・カワチ株ＴＥＦ１プロモーター領域を増幅するためのプライマー。
配列番号１２：アスペルギルス・カワチ株ＴＥＦ１プロモーター領域。
配列番号１３および１４：アスペルギルス・カワチ株脂肪酸不飽和化酵素遺伝子とその３’非翻訳領域を増幅するためのプライマー。
配列番号１５：アスペルギルス・カワチ株に導入したピリチアミン耐性遺伝子及びＴＥＦ１プロモーター、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、および３’非翻訳領域を含む遺伝子発現カセット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】