特許 7413671 液体クロマトグラフを用いた分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-05

(45)【発行日】2024-01-16

(54)【発明の名称】液体クロマトグラフを用いた分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/26 20060101AFI20240109BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240109BHJP

【ＦＩ】

G01N30/26 H

G01N30/88 Q

G01N30/26 M

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019136384

(22)【出願日】2019-07-24

(65)【公開番号】P2021021570

(43)【公開日】2021-02-18

【審査請求日】2022-06-23

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】植松 原一

【審査官】中村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特開平０５－００５７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２２７７８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５８－１９０７５８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１－２０／２９２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

移動相を送液する送液ポンプと、
検体を注入する注入部と、
前記送液ポンプ及び前記注入部と流体連通されたカラムと、
前記カラムの下流にある検出器と、
前記カラムと前記検出器を収納する恒温槽と、
前記検出器の出口が排液部と流体連通した第１の流路と、前記検出器の出口が前記送液ポンプの吸引側と流体連通した第２の流路とに切り替え可能な切替部と、
を備えた液体クロマトグラフを用いた分析方法であって、
測定時は第１の流路に切り替え、非測定時は第２の流路に切り替え、
測定時及び非測定時のいずれの場合であっても、前記送液ポンプから移動相を送液し、
廃液は移動相のタンクへ直接戻す流路でないことを特徴とする前記記載の方法。

【請求項2】

前記カラムの実温度が３５℃～４５℃の範囲で保温されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記カラムがアフィニティゲルを充填したカラムであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

血液検体を対象に糖化ヘモグロビンを分析することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフを用いた分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病の判断基準の指標として、血液中の糖化ヘモグロビン（ｓＡ１ｃ）の割合を基に診断することが多い。ｓＡ１ｃ％の測定法として、測定原理の違いで幾つかの検査方法が知れられているが、その１つとして、液体クロマトグラフィによる検査方法がある。

【0003】

液体クロマトグラフィによる検査方法には、「アフィニティクロマトグラフィ」を原理とした方法もある。具体的には、血液を溶血、希釈後、アミノフェニルボロン酸基を配したゲルを充填したカラムに導入し、第一の溶離液で糖化ヘモグロビンをゲルに吸着させて非糖化ヘモグロビンのみを溶出させ、第二の溶離液に切り替えて、糖化ヘモグロビンを溶出させる。アフィニティクロマトグラフィによる糖化ヘモグロビンを測定する場合、カラム温度は４０～４５℃にする必要がある。当該方法には、分析カラムの温度と室温の差が大きい場合、送液の開始／停止により、熱的平衡が崩れ、再平衡化するまで時間を要するという問題があった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、溶離液の消費を抑え、分析カラムの温度と室温の差が大きい場合であっても熱的平衡を保つことが可能な分析方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明に係る液体クロマトグラフを用いた分析方法は、前記課題を解決するために、移動相を送液する送液ポンプと、検体を注入する注入部と、前記送液ポンプ及び前記注入部と流体連通されたカラムと、前記カラムの下流にある検出器と、前記検出器の出口が排液部と流体連通した第１の流路と、前記検出器の出口が前記送液ポンプの吸引側と流体連通した第２の流路とに切り替え可能な切替部と、を備えた液体クロマトグラフを用いて、測定時は第１の流路に切り替え、非測定時は第２の流路に切り替えることを特徴とする。

【0006】

以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。

【0007】

図１は本発明に用いられるクロマトグラフの１つの様態を示した流路構成図であり、糖化ヘモグロビンのアフィニティクロマトグラフィを想定しているが、本発明はこれに限定されない。なお、本明細書では移動相をバッファ、溶離液ということがある。

【0008】

糖化ヘモグロビン吸着用バッファ（以下、バッファＡということがある）を貯蔵したタンク１と糖化ヘモグロビン脱着用バッファ（以下、バッファＢということがある）を貯蔵したタンク２は並列して配置され、いずれも脱気ユニット３に繋がれている。バッファＡは流路開閉機構４により、バッファＢは流路開閉機構５により流路への連通が制御されている。送液ポンプ６の吐出側は注入部７と共に分析カラム８、検出器９へ連通している。分析カラム８の上流にはプレフィルタ１２、プレヒートコイル１３が備わっており、分析カラム８、検出器９と共に恒温槽１０に収まっている。

【0009】

検出器９から排出されるバッファの流路を切り替える目的で、２つの流路をとることができる切替部１１が配置される。切替部１１は、検出器９から排出されるバッファがドレインに流れる流路と、送液ポンプ６の吸引側に流れる流路をとることができるものであれば、特にその構造は限定されず、三方バルブなどであってもよい。図１に示すように４方２位置切り替えバルブで、ローター部の溝が２つ存在し、１つの溝が６０°、他方の溝が１２０°で彫られているものを使用することが好適である。
タンク１側にポートＡ、送液ポンプ６側にポートＢを接続、検出器９からの排出液をポートＣに接続、ポートＤにドレイン（排液部）に接続する。

【0010】

測定時は図１ａ、非測定時は図１ｂの状態とする。測定時は、検出器９からの廃液はそのままドレインに導かれる。非測定時は、検出器９からの廃液は、送液ポンプ６の吸引側に接続される。これにより、送液ポンプ６はタンク１に貯蔵されたバッファＡと検出器９からの廃液の両方を吸引可能な状態となるが、廃液量と送液量がほぼ同じため、ほぼ１００％がリサイクルされることとなる。

【0011】

検出器９からの廃液を送液ポンプ６の吸引側に接続させる点は、送液ポンプ６とタンク１との間であればどこでも良く、制限されるものではない。図１はバッファＡ、バッファＢの合流点（Ｐ１）より下流の地点と送液ポンプの間でリサイクルさせた例である。図２のように流路開閉機構４から合流点（Ｐ１）の途中の地点（図１のＰ２）と送液ポンプ６の間、図３のようにはタンク１から開閉機構４までの途中の地点（図１のＰ３）と送液ポンプ６の間でリサイクルさせても問題ない。

【0012】

アフィニティクロマトグラフィの一般的なシーケンスでは、測定開始ボタンを押すことで、送液が開始され、必要に応じてカラムの初期化等の動作をした後、１番目の検体がカラムに導入され、バッファＡとバッファＢのステップグラジエントにより、糖化ヘモグロビンの分離定量がなされる。それを指定の検体数繰り返し、全検体終了後、必要に応じてカラムの洗浄等の後処理がなされた後、送液が停止し、Ｓｔａｎｄ―ｂｙ状態となる。

【0013】

送液を続行した状態と、送液を停止した状態とで、分析カラムを含む温調される部分の熱容量が異なるため、実際の温調される部分の温度は送液の状態で異なる。
そのため、一般的なシーケンスで検体の測定を行うと、送液開始により、一度安定しておいた実温度Ｔ１からＴ２に下がり、熱的に平衡になるまで多くの時間を要する（図４参照）。この間に、検体の測定を行うと、信頼性の無い結果となってしまう。それを回避するには、送液開始から、実際の検体が注入されるまでの時間を長くし、熱的に再安定化するのを待つしかないが、バッファの消費量が増大してしまう。

【0014】

本発明では、測定時はそのままドレインに流し、非測定時は廃液をリサイクルさせるため、バッファをほとんど消費せず、送液の停止を行う必要がない。測定時及び非測定時のいずれの場合であっても、送液ポンプからの送液が続いていれば、カラムの温度（恒温槽の設定温度ではなく、カラムの実温度であり、例えば３５℃～４５℃の範囲）は常に安定しており、熱的に再安定化する時間を必要とせず、効率的にしかも信頼性の高い結果を得ることができる（図５参照）。

【発明の効果】

【0015】

本発明の分析方法は、溶離液の消費を抑え、分析カラムの温度と室温の差が大きい場合であっても熱的平衡を保つことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の、バッファＡをリサイクルする手法での、１つの様態を示した流路図である。図１ａはリサイクルＯＦＦ時、図１ｂはリサイクルＯＮ時である。

【図2】本発明の、バッファＡをリサイクルする手法での、別の様態を示した流路図である（図１の（Ｐ２）点でリサイクルさせる様態）。

【図3】本発明の、バッファＡをリサイクルする手法での、別の様態を示した流路図である（図１の（Ｐ３）点でリサイクルさせる様態）。

【図4】一般的な２つのバッファを用いた糖化ヘモグロビン測定のシーケンスでの、分析カラムの実温度を示した模式図である。

【図5】本発明による２つのバッファを用いた糖化ヘモグロビン測定のシーケンスでの、分析カラムの実温度を示した模式図である。

【図6】本発明の効果を検証すために使用した、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＶＩＩＩの基本流路である。なお、本検証では、破線部は未使用とした。

【図7】本発明の効果を検証すために使用した、東ソー（株）製グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＶＩＩＩの分析カラム部／検出部を詳細に示した図である。図７ａはカラムオーブンカバーを締めた図、図７ｂはカラムオーブンカバーを外した図である。

【図8】実施例１で、リサイクルを行わない場合と、リサイクルを行った場合での、分析カラム入口付近の実温の変化を示した図である。図８ａはリサイクルを行わない場合、図８ｂは行った場合である。

【図9】実施例２で、リサイクルを行わない場合と、リサイクルを行った場合での、分析カラム入口付近の実温の変化と、結果として得られるｓＡ１ｃ面積％を経過時間ととものプロットした図である。図９ａはリサイクルを行わない場合、図９ｂはリサイクルを行った場合である。

【実施例】

【0017】

本発明の効果を明らかにするため、図１のシステムを構築し、検証を行った。
東ソー（株）製「自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＶＩＩＩ」を使用したが、３種類のイオン交換用溶離液をアフィニティ分離用の２種類の溶離液（ｓＡ１ｃ吸着用溶離液（バッファＡ）、ｓＡ１ｃ脱着用溶離液）に変更、分析カラムもアフィニティクロマトグラフィ用に変更して、「アフィニティクロマトグラフィによるグリコヘモグロビン装置」として使用した（図６参照）。
また、バッファＡをリサイクルさせる場合、図１の如く、送液ポンプ６と流路開閉機構５の間にリサイクルバルブ（切替部１１）を挿入し、可視光検出部（検出器９）の出口を繋ぐ構成とした。なお、リサイクルバルブはジーエルサイエンス（株）製ＨＰＶ－ＲｃＡを使用した。
リサイクルバルブは２位置切り替えのローターバルブであり、リサイクルを行わない場合は、送液ポンプはバッファＡとつながり、また、検出器通過した液はドレインに導かれる。リサイクル時は、送液ポンプはバッファＡと検出器を通過した液の両方に繋がる流路をとることができる。

【0018】

図７は分析カラム、可視光検出部を詳細に示した図である。
分析カラム、可視光検出部は１つの温調ユニットとなっている。１つのアルミ板１４の上にカラム収納部２９と検出器ユニット１６が配置され、その下部にサーモモジュール３０が配されており、１つのブロックとして温度制御がなされる構造をとっている。温度制御の基となる温度センサ１８は、カラム収納部の下部のアルミ板内部に配されており、この点の温度が一定になるように制御されている。本実施例においては、分析カラム２１の入口付近の実際の温度を計測するために、分析カラムの入口表面に、別の温度センサ２２を配して、実際の温度を計測できるようにした。
分析カラムは、ｍ－アミノフェニルボロン酸をリガンドとしたＴＳＫｇｅｌ Ｂｏｒｏｎａｔｅ－５ＰＷ（東ソー（株）製、粒径１０μｍ）を内径２．５ｍｍ長さ１０ｍｍのカラム管に充填したものを使用した。

【0019】

ｓＡ１ｃ吸着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
塩化マグネシウム・６水和物 ５０ｍＭ
塩化ナトリウム ５００ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．１％
ｓＡ１ｃ脱着用溶離液（ｐＨ８．８）は、以下の組成で調整したものを使用した。
ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ
塩化ナトリウム ５００ｍＭ
Ｄ－ソルビトール ３０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．１％

【0020】

その他の測定条件は以下の通りである。
カラム温度 ４０℃～４５℃
流速 １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ４１５／５００ｎｍ

【0021】

検体として、凍結乾燥品０．５％［ＮＧＳＰ］）を精製水０．５ｍＬ溶解で１次溶解した後、室温下で３０分放置し、さらに１次溶解したもの３０μＬに対して精製水０．５ｍＬを添加したもののＡ１ｃコントロール（東ソー（株）製）のＬｅｖｅｌ＿２（ＨｂＡ１ｃ １０．０±）を用いた。

【0022】

糖化ヘモグロビン（ｓＡ１ｃ）の面積は、ピーク１の面積とピーク２の面積の差分に相当するので、ｓＡ１ｃの面積％は、
（ｓＡ１ｃピーク面積）＊１００／（ピーク総面積）
で計算した。

【0023】

（実施例１）
まず、バッファが送液されている状態と、停止した状態での、分析カラムの温度変化を測定した。カラム恒温槽は温度センサでの計測値が４５℃になるように、ＰＩＤ制御により制御されている。バッファが送液されている状態でも、停止した状態でも、一定の精度範囲で４５℃に保たれている。しかし、実際には温度センサが敷設されている点が常に４５℃に保たれている状態で、カラム恒温槽内全てが４５℃の保たれている訳ではない。一般的に、温度制御点から離れるほど、実際の温度は低くなる傾向がある。

【0024】

図８ａは、分析カラムの入口付近の温度を測定した結果を示した図であり、本装置の送液ポンプのＯＮ／ＯＦＦにより実際の温度変化を観測した結果である。送液を停止した状態では、分析カラム入口の実温度は３８．５℃であるが、送液を開始すると、実温度は急激に下がり約３２．５℃付近で一定となった。送液を停止すると、実温度は急激に上がり、元の３８．５℃で一定となった。
これは、送液を開始することで、室温付近（２５℃付近）におかれたバッファが、一定温度で熱的に平衡になったカラムに流れ込むことで、実温度が下がってしまうためである。このため、送液を開始してから、１５分以上経過しないと、カラムの実際の温度が一定にならず、この間は検体の測定を行っても、信頼性の高い測定値を得ることができない。

【0025】

図８ｂは、送液ポンプから常に送液を行い、リサイクルバルブを切り替えた場合の実温度を示した図である。計測開始前にリサイクルバルブをＯＮにして初期化を行い、計測開始から２０分で再度リサイクルバルブをＯＮ（リサイクル状態）、３０分でリサイクルバルブをＯＦＦ（通常の流路、検出器からの流出液はドレインへ）したものである。
計測開始前から送液が続行しているため、カラムの実温度は３２．５度付近で一定のままである。リサイクルバルブをＯＦＦ（通常の流路、検出器からの流出液はドレインへ）の状態で検体を測定し、検体を測定しない状態（Ｓｔａｎｄ―ｂｙ）では送液を停止せず、リサイクルバルブをＯＮ（リサイクル状態）にしておくことで、分析カラムの温度を一定に保つことができる。

【0026】

（実施例２）
Ｓｔａｎｄ－ｂｙ状態で送液を続行しリサイクルを行った場合と、従来のようにＳｔａｎｄ－ｂｙで送液を停止した場合での、ｓＡ１ｃの測定結果への影響を検証した。測定開始［Ｓｔａｒｔ］を押した後、続けて検体を２０回連続で測定し、ｓＡ１ｃ面積％を算出した。図９は測定開始からの経過時間を横軸にｓＡ１ｃ面積％と実際のカラム入口付近温度をプロットした図である。図９ａはリサイクルなし（従来の方法）で測定した結果であるが、測定開始により実際の温度が低下していき、その間、ｓＡ１ｃ面積％は徐々に下がっていく。実際のカラム温度が下がりきり、再平衡化が済んだ５検体目から以降からｓＡ１ｃ面積％の変動も少なくなる。

【0027】

図９ｂはリサイクルあり（本発明の方法）で測定した結果である。測定開始前にリサイクルバルブをＯＮにして初期化を行い、測定開始と同時にリサイクルバルブをＯＦＦとしている。送液は常に行われているため、温度平衡が乱れることはなく、１つ目の検体から安定的にｓＡ１ｃ面積％が算出されている。

【0028】

表１は、リサイクルを行った場合（本発明の方法）と、リサイクルを行わない場合（従来の方法）のｓＡ１ｃ面積％の変動を示した表である。ｎ＝１～１０とｎ＝１１～２０でＣｖ％を算出したものである。ここから分かるように、リサイクルなし（従来の方法）では、ｎ＝１～１０で３．２１７％、ｎ＝１１～２０で１．３５３％となり、測定開始後でデータのばらつきが大きいことが分かる。
リサイクルあり（本発明の方法）では、ｎ＝１～１０で０．３３７％、ｎ＝１１～２０で、０．６１０％となり、測定開始から安定的な測定結果が得られていることが分かる。

【0029】

【表1】

【0030】

次に、本発明によりバッファ消費量への影響を、以下のように仮定して算出する。
（仮定）
・流量を１．００ｍＬ／ｍｉｎとし、検体注入から０．６分間バッファＡを、１．６分までバッファＢを、３．０分までバッファＡを流すステップグラジエントで、３．０分サイクルで連続して測定する。
・リサイクルなしの場合
［ＳＴＡＲＴ］キーを押して、測定開始を実行すると、これと同時にバッファＡの送液が開始され、カラムの実温度が低下していき、熱的に安定となるのは約１５分後である。その後、検体の注入を行う。
・リサイクルありの場合
［ＳＴＡＲＴ］キーを押して、測定開始を実行すると、これと同時にリサイクルがＯＦＦとなる。［ＳＴＡＲＴ］キーを押す前からバッファＡの送液は行われていることから、１分程度の平衡化時間をとれば、検体の注入を行える。
・１００検体測定

【0031】

リサイクルなしでは、１００検体を２バッチに分けて測定を行った場合、バッファＡは安定待ち（熱的に安定するまでの時間）で１５ｍＬ、５０回の測定で１００ｍＬ消費する。２バッチ測定すると、２倍で２３０ｍＬ消費する。リサイクルありでは、バッファＡは安定待ち（平衡化時間）で１ｍＬ、５０回の測定で１００ｍＬ消費する。２バッチ測定すると、２倍で２０２ｍＬ消費する。両者の差は２８ｍＬとなる。なお、バッファＢの消費量に関しては両者に差はない。
１００検体を５バッチに分けて測定を行った場合、リサイクルなしでは、バッファＡは２７５ｍＬ消費する。リサイクルありでは、２０５ｍＬ消費する。両者の差は７０ｍＬと拡大する。

【0032】

以上説明したように、本発明のリサイクルを併用した測定系では、２バッチ目以降について、測定開始の指示から、実際の検体が注入できる時間を大幅に短縮できる。また、使用するバッファの消費量を大幅に削減することが可能であり、ランニングコストを重要視する糖化ヘモグロビンの測定系で有用な手段となりうる。

【符号の説明】

【0033】

１．タンク（糖化ヘモグロビン吸着用バッファ）
２．タンク（糖化ヘモグロビン脱着用バッファ）
３．脱気ユニット
４．流路開閉機構
５．流路開閉機構
６．送液ポンプ
７．検体注入機構
８．分析カラム
９．検出器
１０．恒温槽
１１．切替部
１２．プレフィルタ
１３．プレヒートコイル
１４．アルミプレート
１５．カバー
１６．検出器ユニット
１７．放熱フィン
１８．制御用温度センサ
１９．プレヒートコイル
２０．プレヒートコイルカバー
２１．分析カラム
２２．実温計測用温度センサ
２３．バッファ１
２４．バッファ２
２５．バッファ３
２６．流路開閉機構
２７．流路開閉機構
２８．流路開閉機構
２９．カラム収納部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】