特許 7420950 多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション画像を獲得し、処理するためのシステム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-15

(45)【発行日】2024-01-23

(54)【発明の名称】多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション画像を獲得し、処理するためのシステム及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20240116BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 E

G01N21/64 F

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022537620

(86)(22)【出願日】2020-12-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-24

(86)【国際出願番号】 US2020065371

(87)【国際公開番号】W WO2021127019

(87)【国際公開日】2021-06-24

【審査請求日】2022-08-12

(31)【優先権主張番号】62/949,391

(32)【優先日】2019-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】390040660

【氏名又は名称】アプライド マテリアルズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】３０５０ Ｂｏｗｅｒｓ Ａｖｅｎｕｅ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ ９５０５４ Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ユン－チン

(72)【発明者】

【氏名】シエ， タン

(72)【発明者】

【氏名】キム， クロイ

【審査官】吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６－５１１７９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－２２０９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－２４５０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－０８８３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－０６９７７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５００５７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１７７９５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許第０５８２７６６０（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／６２ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングシステムであって、
試薬中の蛍光プローブに曝露されるべきサンプルを包含するためのフローセルと、
複数の試薬源のうちの１つから前記フローセルへの流れを制御するためのバルブと、
前記フローセルを通るように流体を流すためのポンプと、
可変周波数励起光源及び前記サンプルから蛍光放出された光を受信するよう位置付けられたカメラを含む、蛍光顕微鏡と、
前記フローセルと前記蛍光顕微鏡とを垂直方向に相対運動させるためのアクチュエータと、
前記フローセルと前記蛍光顕微鏡とを横方向に相対運動させるためのモータと、
制御システムと、を備え、前記制御システムが、ネストされたループとして、
前記サンプルを複数の異なる試薬に曝露するために、前記バルブに、前記フローセルを複数の異なる試薬源に順次連結させることと、
前記複数の異なる試薬の各試薬につき、前記モータに、サンプルに対して、複数の異なる視野に前記蛍光顕微鏡を順次位置付けさせることと、
前記複数の異なる視野の各視野につき、前記可変周波数励起光源に、複数の異なる波長を順次放出させることと、
前記複数の異なる波長の各波長につき、前記アクチュエータに、サンプルに対して、複数の異なる垂直高さに前記蛍光顕微鏡を順次位置付けさせることと、
前記複数の異なる垂直高さの各垂直高さにつき、それぞれの波長によって励起されたそれぞれの試薬のそれぞれの蛍光プローブを有するサンプルのそれぞれの視野をカバーするそれぞれの垂直高さで、画像を取得することと、を行うよう構成される、
蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングシステム。

【請求項2】

前記可変周波数励起光源が複数のレーザモジュールを含み、前記制御システムは、前記複数の異なる波長を順次放出するために前記レーザモジュールを順次作動させるよう構成される、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記制御システムが、前記バルブ及び前記モータを制御するためのコンピュータと、前記レーザモジュール及び前記アクチュエータを制御するためのマイクロコントローラとを含む、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記サンプルと前記カメラとの間の光路内に位置付けられたフィルタホイールを更に備え、前記フィルタホイールは複数の発光バンドパスフィルタを含み、前記制御システムは、前記画像が取得される時に、選択されたフィルタが、前記複数の異なる波長のうちの前記波長によって励起された時の前記蛍光プローブによる発光に関連付けられた発光バンドパスを有するように、前記可変周波数励起光源と前記フィルタホイールとを協調させるよう構成される、請求項２に記載のシステム。

【請求項5】

前記フローセル内の前記サンプルを支持するためのステージを備え、前記モータが、前記ステージを直行する軸の対に沿って駆動するよう構成されたリニアアクチュエータの対を備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項6】

前記複数の異なる視野のうちの少なくとも２つの視野の各視野、及び前記視野の複数の画像において共有される少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、前記視野での前記複数の画像における前記ピクセルについてのデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、前記ピクセルを復号するよう構成された、データ処理システムを更に備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

各画像につき画質値を決定し、前記画質値が画質閾値を満たさなければ画像を選別排除するよう構成されるデータ処理システムをさらに備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

品質メトリックは、鮮鋭度品質値であり、品質メトリック閾値は、鮮鋭度品質閾値である、請求項７に記載のシステム。

【請求項9】

サンプルを包含するためのフローセルと、前記サンプルを照射するための可変周波数励起光源と、蛍光顕微鏡とを含む蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングシステムの制御のためのコンピュータプログラム製品であって、命令を有するコンピュータ可読媒体を備え、前記命令が、一又は複数のプロセッサに、
ネストされたループとして、
前記サンプルを複数の異なる試薬に曝露するために、バルブに、前記フローセルを複数の異なる試薬源に順次連結させることと、
前記複数の異なる試薬の各試薬につき、モータに、サンプルに対して、複数の異なる視野に前記蛍光顕微鏡を順次位置付けさせることと、
前記複数の異なる視野の各視野につき、前記可変周波数励起光源に、複数の異なる波長を順次放出させることと、
前記複数の異なる波長の各波長につき、アクチュエータに、サンプルに対して、複数の異なる垂直高さに前記蛍光顕微鏡を順次位置付けさせることと、
前記複数の異なる垂直高さの各垂直高さにつき、それぞれの波長によって励起されたそれぞれの試薬のそれぞれの蛍光プローブを有するサンプルのそれぞれの視野をカバーするそれぞれの垂直高さで、画像を取得することと、を実行させる
コンピュータプログラム製品。

【請求項10】

前記複数の異なる視野のうちの少なくとも２つの視野の各視野、及び前記視野の複数の画像において共有される少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、前記視野での前記複数の画像における前記ピクセルについてのデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、前記ピクセルを復号する命令を更に備える、請求項９に記載のコンピュータプログラム製品。

【請求項11】

各画像につき画質値を決定し、前記画質値が画質閾値を満たさなければ画像を選別排除する命令を更に備える、請求項９に記載のコンピュータプログラム製品。

【請求項12】

品質メトリックは、鮮鋭度品質値であり、品質メトリック閾値は、鮮鋭度品質閾値である、請求項１１に記載のコンピュータプログラム製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この明細書は、多重蛍光インシトゥ（その場）ハイブリダイゼーションイメージングに関する。

【背景技術】

【0002】

生体サンプル（例えば組織切除、生検、培養細胞）における複数の生体分析物（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質）を可視化し、定量化するための方法を開発することに、バイオテクノロジー界及び製薬業界は多大な興味を抱いている。科学者は、疾患の診断／モニタリング、バイオマーカーの検証、及び治療法の検討を行うために、かかる方法を使用する。現在までのところ、例示的な方法は、生体サンプルに対して機能的ドメインで標識された抗体又はオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）の多重イメージングを含むものである。

【0003】

多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ｍＦＩＳＨ）イメージングは、空間トランスクリプトミクスにおける遺伝子発現を判定するための強力な技法である。要約すると、サンプルは、対象のＲＮＡを標的とする複数のオリゴヌクレオチドプローブに曝露される。かかるプローブは異なる標識スキームを有し、その標識スキームにより、相補的な蛍光標識されたプローブがサンプルに導入される時に、種々のＲＮＡ種を識別することが可能になる。その後、種々の波長の励起光への曝露により、蛍光画像の連続ラウンドが獲得される。所与のピクセルの各々につき、励起光の種々の波長に対する種々の画像からの蛍光強度が、信号配列を形成する。この配列は次いで、コードブック（これにより、各コードが遺伝子に関連付けられる）からの参照コードのライブラリと比較される。画像中のそのピクセルで発現する関連遺伝子を特定するために、最良一致の参照コードが使用される。

【発明の概要】

【0004】

一態様では、蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングシステムは、試薬中の蛍光プローブに曝露されるべきサンプルを包含するためのフローセルと、複数の試薬源のうちの１つからフローセルへの流れを制御するためのバルブと、フローセルを通るように流体を流すためのポンプと、可変周波数励起光源及びサンプルから蛍光放出された光を受信するよう位置付けられたカメラを含む、蛍光顕微鏡と、フローセルと蛍光顕微鏡とを垂直方向に相対運動させるためのアクチュエータと、フローセルと蛍光顕微鏡とを横方向に相対運動させるためのモータと、制御システムと、を含む。この制御システムは、ネストされたループとして、バルブに、サンプルが複数の異なる試薬に曝露されるようにフローセルを複数の異なる試薬源に順次連結させ、複数の異なる試薬の各試薬につき、モータに、サンプルに対して、複数の異なる視野に蛍光顕微鏡を順次位置付けさせ、複数の異なる視野の各視野につき、可変周波数励起光源に、複数の異なる波長を順次放出させ、複数の異なる波長の各波長につき、アクチュエータに、サンプルに対して、複数の異なる垂直高さに蛍光顕微鏡を順次位置付けさせ、複数の異なる垂直高さの各垂直高さにつき、それぞれの波長によって励起されたそれぞれの試薬のそれぞれの蛍光プローブを有するサンプルのそれぞれの視野をカバーするそれぞれの垂直高さで、画像を取得するよう、構成される。

【0005】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。アクチュエータはピエゾアクチュエータでありうる。データ処理システムは、各画像の画質値を決定し、画質値が画質閾値を満たさなければ画像を選別排除するよう構成されうる。画質値は鮮鋭度品質値又は輝度品質値でありうる。カメラはＣＭＯＳカメラでありうる。

【0006】

別の態様では、蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージング・解析システムは、試薬中の蛍光プローブに曝露されるべきサンプルを包含するためのフローセルと、イメージングパラメータの複数の異なる組み合わせで、サンプルの複数の画像を順次収集するための蛍光顕微鏡と、データ処理システムと、を含む。このデータ処理システムは、画像が収集される際に蛍光顕微鏡から画像を順次受信するよう、かつ、画像の実験的アーチファクトを除去し、ＲＮＡ画像スポット鮮鋭化を提供するために、オンザフライ（ｏｎ－ｔｈｅ－ｆｌｙ）画像前処理を実施するよう構成された、オンライン前処理システムと、複数の画像が収集された後に、同じ視野を有する複数の画像の位置決め（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を実施するよう、かつ、複数の画像内の強度値を復号して、発現した遺伝子を特定するよう構成された、オフライン処理システムと、を含む。

【0007】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。データ処理システムは、鮮鋭度品質値又は輝度品質値を決定するよう構成されうる。鮮鋭度品質値は、画像全体の画像輝度の勾配の絶対値を積分することによって決定されうる。画質値は、鮮鋭度品質値が最小鮮鋭度値を上回った場合に閾値を満たすよう決定されうる。輝度品質値は、画像全体の画像輝度を積分することによって決定されうる。画質値は、輝度品質値が最小輝度値を上回った場合に閾値を満たすよう決定されうる。

【0008】

別の態様では、蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングシステムは、試薬中の蛍光プローブに曝露されるべきサンプルを包含するためのフローセルと、蛍光顕微鏡と、制御システムとを含む。この蛍光顕微鏡は、サンプルを照射するための可変周波数励起光源と、フィルタホイール上の複数の発光バンドパスフィルタと、フィルタホイールを回転させるためのアクチュエータと、フィルタホイール上のフィルタを通過した、サンプルから蛍光放出された光を、受信するよう位置付けられたカメラと、を含む。制御システムは、可変周波数励起光源に、選択された波長を有する光ビームを放出させ、アクチュエータに、選択されたフィルタがサンプルとカメラとの間の光路内に位置付けられるよう、フィルタホイールを回転させ、カメラから画像を取得し、かつ、選択されたフィルタが、画像が取得される時に、選択された波長によって励起された時の蛍光プローブによる発光に関連付けられた発光バンドパスを有するように、可変周波数励起光源とフィルタホイールとを協調させるよう、構成される。

【0009】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、命令であって、一又は複数のプロセッサに、複数の画像の各画像に対して、一又は複数のフィルタを適用し、逆畳み込み（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を実施して、複数のフィルタリング済みの画像を生成することと、複数のフィルタリング済みの画像の位置決めを実施して、複数の位置決め済みでフィルタリング済みの画像を生成することと、複数の位置決め済みでフィルタリング済みの画像の少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、そのピクセルについて、複数の位置決め済みでフィルタリング済みの画像内のデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルを復号することと、少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードワードに関連付けられた遺伝子を決定して、この遺伝子がそのピクセルで発現しているという指示を記憶することと、を実行させるための、命令を有する。

【0010】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。画像の輝度値のヒストグラムを決定すること、及びこのヒストグラム中の分位限界における輝度値を決定することによって、閾値を決定するための命令が存在しうる。分位限界は９９．５％以上（例えば９９．９％以上）でありうる。一又は複数のフィルタを適用するための命令は、ローパスフィルタを適用するための命令を含みうる。逆畳み込みを実施するための命令は、２Ｄ点広がり関数を用いて逆畳み込みを行うための命令を含みうる。

【0011】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、サンプルの複数の初期画像であって、共通の視野を共有する複数の初期画像を受信するための命令を有する。複数の初期画像の各初期画像につき、初期画像は、均等なサイズの複数のサブ画像に分割され、かかる複数のサブ画像から、サブ画像のサイズに等しいサイズの合成画像が計算されることにより、複数の縮小サイズ画像が生成され、複数の画像の各画像は、対応する縮小サイズ画像を有し、複数の縮小サイズ画像のうちの少なくとも１つの縮小サイズ画像につき、複数の縮小サイズ画像を位置決めするための変換が決定され、少なくとも１つの縮小サイズ画像の各々につき、その縮小サイズ画像について決定された変換が対応する初期画像に適用されて、初期画像に等しいサイズの変換された画像が生成されることにより、複数の変換された画像が生成され、複数の変換された画像の少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、そのピクセルについて、複数の変換された画像におけるデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルが復号される。少なくとも２つのピクセルの各ピクセルにつき、コードワードに関連付けられた遺伝子が決定され、この遺伝子がそのピクセルで発現しているという指示が記憶される。

【0012】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。初期画像を複数のサブ画像に分割するための命令は、初期画像を、複数の列及び複数の行を有する矩形格子に分割するための命令を含みうる。この矩形格子は均等な数の列と行とを有しうる。初期画像は、正確にＮ個の画像に分割されうる（ここで、Ｎ＝Ｚ^２であり、Ｚは偶数の整数である）。Ｎは２でありうる。サブ画像は、１０２４×１０２４ピクセル以下のサイズを有しうる。

【0013】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は命令であって、サンプルのある共通の視野を表わす複数の画像を受信し、複数の画像の位置決めを実施して、複数の位置決め済みの画像を生成し、位置決め済みの画像の複数のピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、そのピクセルについて、複数の位置決め済みの画像内のデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルを復号し、一又は複数のピクセル及び一又は複数のピクセルの各ピクセルの最良一致として特定された各コードワードにつき、そのピクセルについての画像ワードのビット比がコードワードの閾値を満たすかどうかを判定する、ための命令を有する。画像ワードは、そのピクセルについての、複数の位置決め済みの画像におけるデータ値から形成される。閾値を満たしていると決定された少なくとも１つのピクセルにつき、コードワードに関連付けられた遺伝子が決定され、この遺伝子がそのピクセルで発現しているという指示が記憶される。ビット比が閾値を満たしていないピクセルは選別排除される。

【0014】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。閾値を決定することは、サンプルの複数の画像からのビット値のヒストグラム中の、第１分位限界における値を決定することを含みうる。分位限界はデフォルト値を有しうる。閾値を決定した後、サンプルの複数の画像からのビット値のヒストグラム中の、異なる第２分位限界における値を決定することによって、更新された閾値が決定されうる。

【0015】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、命令であって、サンプルのある共通の視野を表わす複数の画像を受信し、複数の画像の位置決めを実施して、複数の位置決め済みの画像を生成し、位置決め済みの画像の複数のピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、そのピクセルについて、複数の位置決め済みの画像内のデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルを復号し、一又は複数のピクセル及び一又は複数のピクセルの各ピクセルについて最良一致として特定された各コードワードにつき、そのピクセルについての画像ワードのビット輝度がコードワードの閾値を満たしているかどうかが判定されるための、命令を有する。画像ワードは、そのピクセルについての、複数の位置決め済みの画像におけるデータ値から形成される。閾値を満たしていると決定された各ピクセルにつき、コードワードに関連付けられた遺伝子が決定され、この遺伝子がそのピクセルで発現しているという指示が記憶される。ビット比が閾値を満たしていないピクセルは選別排除される。

【0016】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。閾値を決定することは、サンプルの複数の画像からのビット値のヒストグラム中の、第１分位限界における値を決定することを含みうる。閾値を決定した後、サンプルの複数の画像からのビット値のヒストグラム中の、異なる第２分位限界における値を決定することによって、更新された閾値が決定されうる。

【0017】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、サンプルの複数の初期画像を受信するための命令を有する。複数の初期画像は、複数の異なる視野の各視野での多数の（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ）画像を含む。命令は、画像処理アルゴリズムであって、その視野での多数の画像の画像フィルタリング又はその視野での多数の画像の位置決めのうちの一又は複数が実施される、画像処理アルゴリズムを実施するために記憶される。各視野につき、一又は複数の初期パラメータ値が決定され、別々の視野は別々の初期パラメータ値を有する。画像処理アルゴリズムは、別々の視野に別々の初期復号パラメータ値を使用して、各視野につき実施される。一又は複数の後続復号パラメータ値が決定され、画像処理アルゴリズム及び復号化アルゴリズムが、異なる視野に同じ後続パラメータ値を使用して各視野で実施されて、空間トランスクリプトミクスデータ（ｓｐａｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｄａｔａ）のセットが生成される。

【0018】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。画像処理アルゴリズム及び復号化アルゴリズムは、ある視野での複数のピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、複数の画像内のそのピクセルについて、データ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルを復号し、複数の最良一致コードワードを生成する。各視野につき、各ピクセルワードとそのピクセルワードについての最良一致コードワードとの間の適合度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ ｏｆ ｆｉｔ）が決定されることにより、各視野につき複数の適合度が提供されうる。適合度を決定することは、ピクセルワードと最良一致コードワードとの間の距離を決定することを含みうる。各視野につき、その視野についての複数の適合度から平均適合度が決定されることにより、複数の平均適合度が提供されうる。

【0019】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、サンプルの複数の初期画像であって、複数の異なる視野の各視野での多数の画像を含む、複数の初期画像を受信するための命令を有する。各視野につき、その視野での多数の画像に基づいて、空間トランスクリプトミクスデータのセットが生成される。空間トランスクリプトミクスデータの各セットは一又は複数のデータペアを含み、一又は複数のデータペアの各データペアは、位置とその位置で発現した遺伝子とを含む。隣接した視野からの多数の画像のオーバーラップ領域が決定される。各視野についての空間トランスクリプトミクスデータのセットから、複数の異なる視野をカバーする合成画像のための、空間トランスクリプトミクスデータの合成セットが生成される。空間トランスクリプトミクスデータの合成セットの生成において、異なる視野からの少なくとも１つの二重計数されたデータペア（これは、サンプル内の同じ箇所に同じ遺伝子が発現していることを表わす）は選別排除される。

【0020】

実行形態は、以下の特徴のうちの一又は複数を含みうる。オーバーラップ領域を決定することは、各行につき、第１ＦＯＶからの第１画像と隣接した第２ＦＯＶからの第２画像との間で水平シフト推定を実施することを含みうる。オーバーラップ領域を決定することは、各行につき、第１ＦＯＶからの第１画像と隣接した第２ＦＯＶからの第２画像との間で垂直シフト推定を実施することを含みうる。水平シフト推定及び垂直シフト推定は各々、第１画像と第２画像との相互相関を含みうる。

【0021】

別の態様では、コンピュータプログラム製品は、サンプルの複数の画像であって、複数の異なる視野の各視野での多数の画像を含む、複数の画像を受信するための命令を有する。複数の画像の各画像に対して、その画像の画質チェックが実施される。画質チェックを実施した後に、複数の画像の各画像からアーチファクトが除去される。アーチファクトを除去した後に、複数の画像の各画像において画像スポットが鮮鋭化される。画像スポットを鮮鋭化した後に、多数の画像の各々につき、多数の画像の位置決めが実施され、複数の位置決め済みの画像が生成される。位置決めを実施した後に、多数の画像の各々、及び多数の画像の各セットのうちの位置決め済みの画像の複数のピクセルの各ピクセルにつき、コードブック内の複数のコードワードから、そのピクセルについて、対応する多数の位置決め済みの画像内のデータ値との最良一致を提供するコードワードを特定することによって、ピクセルが復号される。

【0022】

実行形態の利点は、以下に示すもののうちの一又は複数を含みうるが、それらに限定されるわけではない。

【0023】

遺伝子発現を判定するための多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ｍＦＩＳＨ）画像の獲得及びその後の処理は、産業分野での採用に適した様態で自動化されうる。複数の視野（ＦＯＶ）を必要とする大きなサンプルサイズが、均一な画質で処理されうる。マルチサンプル又はマルチモーダルの研究におけるランツーラン（Ｒｕｎ－ｔｏ－ｒｕｎ）の整合性が改善されうる。別々の時間に捕捉された同じＦＯＶの蛍光画像が、別個の基準（ｆｉｄｕｃｉａｌｓ）を使用せずに（例えば、基準ビーズを必要とせずに）、かつ従来的技法の一部よりも少ない計算資源を使用して、かかる従来的技法よりも正確に、位置決めされうる。

【0024】

一又は複数の実施形態の詳細事項について、添付図面及び以下の説明において記述する。その他の特徴、態様、及び利点についても、かかる説明、図面、及び特許請求の範囲から自明となろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーションイメージングのための装置の概略図である。

【図2】データ処理の方法のフロー図である。

【図3】相互情報アルゴリズムを使用する画像位置決めプロセスを概略的に示している。

【図4】画像内の強度の対数ヒストグラムである。

【図5A】収集された画像である。

【図5B】図５Ａの画像から生成されたマスクを示している。

【図6A】フィルタリング済みで逆畳み込み済みの画像からの強度の対数ヒストグラムである。

【図6B】正規化後の強度の対数ヒストグラムである。

【図7】復号の方法を示している。

【図8A】あるサンプルコードワードについて特定された複数のピクセルのビット比の対数ヒストグラムである。

【図8B】あるサンプルコードワードについて特定された複数のピクセルの輝度の対数ヒストグラムである。

【図9】ステッチング（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）の方法のフロー図である。

【図10】オンザフライで画像処理が実施されるデータ処理の方法の別の実行形態のフロー図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

様々な図面における類似の参照番号及び記号表示は、同様の要素を示している。

【0027】

多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ｍＦＩＳＨ）イメージングは強力な技法であるが、これまでは、主に学術分野において使用されてきた。この技法を産業分野における空間トランスクリプトミクスのために使用すること、例えば、研究を実施しているバイオテクノロジー企業が、製品化を意図する医薬品を開発するために空間トランスクリプトミクスにｍＦＩＳＨを使用することは、数多くの問題を提起する。例えば、以下のようなことである。

【0028】

・このシステムは完全に又はほぼ完全に自動化されるものであり、これにより、ユーザ（例えば、生物学に精通しているが、画像処理又はソフトウェアプログラミングの技法には通じていない研究科学者）に必要になるのは、調査対象の生物学的態様に関連するパラメータを入力することだけであり、画像処理に関連する決定を行う必要も、プログラミングの専門知識を有する必要もなくなる。かかる自動化は、実際には、簡単なことではなく、数多くの落とし穴を包含している。

【0029】

・既存の最新技術では、一般的な光学顕微鏡から、小さなサンプルに適した小さな画像サイズを有するサンプル画像が取得される。産業分野で利用されるサンプルは、もっと大型であることがあり、完全にイメージングするためには複数の視野が必要になりうる。かかる複数のＦＯＶは、手作業でステッチングされうるが、半自動アプローチには、不十分な画像位置決め、発現した遺伝子の過剰計数、又はステッチングされた画像の異なる領域の処理における不整合による信頼性の欠如といった、問題が発生する可能性がある。

【0030】

・このプロセスには、産業上実現可能になるのに十分なほど高いスループットが必要になる。しかし、既存の最新技術では、イメージングに多大な時間がかかり、データ解析に多数の手作業のステップが必要になる。大規模なライフサイエンス・臨床研究には、より高いイメージングスループット及び品質制御が必要である。更に、データ処理のスケーラビリティは計算時間によって限定される。

【0031】

・各ＦＯＶは個別に処理されるので、関心領域全体にわたる有意な変動が見いだされうる。加えて、種々の機器からの画像は、ソフトウェアパイプラインに送信される前に、十分に較正され、変換される必要がある。従来的には、画像処理パラメータは、システム又はサンプルのばらつきに適応するよう手作業で調整される必要がある。

【0032】

・既存のソリューションは、完全画像（ｐｅｒｆｅｃｔ ｉｍａｇｅｓ）の強固な仮定を有しており、これにより、実験条件と較正方法の間にギャップが生じる。

【0033】

上記の問題のうちの一又は複数に対処することが可能な、全体アーキテクチャならびに数多くの個々の構成要素及びステップについて、以下で説明する。

【0034】

一般に、かかる全体アーキテクチャならびに個々の構成要素及びステップが、最小限の手作業のステップを伴う、エンドツーエンドのｍＦＩＳＨイメージング・復号プロセスを可能にする。システムは、完全自動ハードウェアアーキテクチャとオンザフライ画像処理とを統合する。方法は、フィードバック制御、画像較正、及び大域的最適化を含む。エンドツーエンドのプロセス時間を削減すること、及び１サンプルあたりのスループットを向上させることが可能になる。装置は、産業分野において研究科学者が容易に使用しうる。制御メトリックにより下流解析前のデータ品質が確保されうる。早期検出が、サンプルの無駄を削減する。アルゴリズムにより、均一で整合性のある空間的遺伝子発現を伴う、大きなイメージングエリアへのスケーラビリティが可能になりうる。大規模研究のためのデータの精度及び再現性が向上しうる。その結果は、容易に解釈されること、及びソフトウェアパッケージにおいて更に解析されることが可能である。

【0035】

図１を参照するに、多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ｍＦＩＳＨ）イメージング・画像処理装置１００は、サンプル１０を保持するためのフローセル１１０と、サンプル１０の画像を取得するための蛍光顕微鏡１２０と、ｍＦＩＳＨイメージング・画像処理装置１００の様々な構成要素の動作を制御するための制御システム１４０と、を含む。制御システム１４０は、例えば制御ソフトウェアを実行する、メモリやプロセッサなどを有するコンピュータ１４２を含みうる。

【0036】

蛍光顕微鏡１２０は、複数の異なる波長の励起光１３０を生成しうる励起光源１２２を含む。詳細には、励起光源１２２は、別々の時間に別々の波長を有する狭帯域幅の光ビームを生成しうる。例えば、励起光源１２２は、マルチ波長連続波レーザシステム（例えば、別々の波長のレーザビームを生成するために個別に作動しうる複数のレーザモジュール１２２ａ）によって提供されうる。レーザモジュール１２２ａからの出力は、共通の光ビーム経路に多重送信されうる。

【0037】

蛍光顕微鏡１２０は、光源１２２からの励起光をフローセル１１０に導くための様々な光学部品を含む、顕微鏡本体１２４を含む。例えば、光源１２２からの励起光は、マルチモードファイバ内に連結され、レンズのセットによって再集束され、拡張されてから、コアイメージング構成要素（高開口数（ＮＡ）対物レンズ１３６など）によって、サンプル内へと導かれうる。励起チャネルを切り替える必要がある場合、複数のレーザモジュール１２２ａのうちの１つを作動停止させて、別のレーザモジュール１２２ａを作動させることが可能であり、デバイス間の同期は、一又は複数のマイクロコントローラ１４４、１４６によって実現される。

【0038】

対物レンズ１３６又は顕微鏡本体１２４全体は、Ｚ駆動アクチュエータに連結された垂直可動マウントに設置されうる。例えばＺ駆動アクチュエータを制御するマイクロコントローラ１４６による、Ｚ位置の調整によって、焦点位置の微細チューニングが可能になりうる。代替的又は追加的には、フローセル１１０（又はフローセル１１０内のサンプルを支持するステージ１１８）は、Ｚ駆動アクチュエータ１１８ｂによって垂直可動である可能性もある（例えば軸方向ピエゾステージ）。かかるピエゾステージは、精密かつ迅速な多面画像の獲得を可能にしうる。

【0039】

イメージングされるべきサンプル１０が、フローセル１１０内に位置付けられる。フローセル１１０は、面積が約２ｃｍ×２ｃｍの（顕微鏡の物体面又は画像面に平行な）断面積を有するチャンバでありうる。サンプル１０は、フローセル内のステージ１１８上に支持されてよく、ステージ（又はフローセル全体）は、例えばＸＹ運動を可能にするためのリニアアクチュエータの対１１８ａによって、横方向に可動でありうる。これにより、横方向にオフセットした別々の視野（ＦＯＶ）におけるサンプル１０の画像の獲得が可能になる。あるいは、顕微鏡本体１２４が、横方向に可動なステージ上に保持されることもある。

【0040】

フローセル１１０への入口は、ハイブリダイゼーション試薬源１１２のセットに接続される。マルチバルブポジショナ１１４は、供給源を切り替えて、どの試薬１１２ａがフローセル１１０に供給されるかを選択するよう、コントローラ１４０によって制御されうる。各試薬は、一又は複数のオリゴヌクレオチドプローブの異なるセットを含む。各プローブは、異なる対象のＲＮＡ配列を標的とし、波長の異なる組み合わせによって励起される一又は複数の蛍光物質（例えば蛍光体）の異なるセットを有する。試薬１１２ａに加えて、パージ流体１１２ｂ（例えばＤＩ水）の供給源も存在しうる。

【0041】

フローセル１１０の出口はポンプ１１６（例えば蠕動ポンプ）に接続され、ポンプ１１６は、フローセル１１０を通る液体（例えば試薬又はパージ流体）の流れを制御するよう、同じくコントローラ１４０によって制御される。フローセル１１０からの使用済み溶液は、ポンプ１１６によって化学廃棄物管理サブシステム１１９に送られうる。

【0042】

稼働中、制御装置１４０は、光源１２２に励起光１３０を放出させ、これにより、サンプル１０中の蛍光物質の蛍光（例えば、サンプル中のＲＮＡに結合されるプローブであって、励起光の波長によって励起されるプローブの蛍光）が生じる。放出された蛍光１３２とともに、後方伝播励起光（例えば、サンプルやステージなどから散乱した励起光）も、顕微鏡本体１２４の対物レンズ１３６によって収集される。

【0043】

収集された光は、放出された蛍光を後方伝播照明光から分離するために、顕微鏡本体１２４内のマルチバンドダイクロイックミラー１３８によってフィルタリングされてよく、放出された蛍光はカメラ１３４に送られる。マルチバンドダイクロイックミラー１３８は、数多くの励起波長のもとでプローブから予期される各発光波長の、通過帯域を含みうる。単一のマルチバンドダイクロイックミラーを使用することで、（複数のダイクロイックミラー又は可動ダイクロイックミラーと比較して）システム安定性の向上がもたらされうる。

【0044】

カメラ１３４は、高解像度の（例えば２０４８ｘ２０４８ピクセルの）ＣＭＯＳカメラ（例えば科学用ＣＭＯＳカメラ）であってよく、対物レンズの直近（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）画像平面に設置されうる。他のカメラの種類（例えばＣＣＤ）も使用可能でありうる。カメラからの画像データは、（例えばマイクロコントローラからの）信号によってトリガされると捕捉されうる（例えば、画像処理システム１５０に送信されうる）。ゆえに、カメラ１３４は、サンプルから画像のシーケンスを収集しうる。

【0045】

残留励起光を更に除去し、励起チャネル間のクロストークを最小化するために、レーザ発光波長の各々は、対応するバンドパス発光フィルタ１２８ａと対にされうる。各フィルタ１２８ａは、１０～５０ｎｍ（例えば１４～３２ｎｍ）の波長を有しうる。一部の実行形態では、例えばプローブの蛍光物質が、立ち下がりが長い（ｌｏｎｇ ｔｒａｉｌｉｎｇ）スペクトルプロファイルを有する場合、フィルタは、励起から生じるプローブの蛍光物質の帯域幅よりも狭くなる。

【0046】

フィルタは、アクチュエータ１２７ｂによって回転可能な高速フィルタホイール１２８上に設置される。フィルタホイール１２８は、イメージング経路内の光学収差を最小化するために、無限遠空間に設置されうる。フィルタホイール１２８の発光フィルタを通過した後の浄化された蛍光信号は、管レンズによって再集束され、カメラ１３４によって捕捉されうる。ダイクロイックミラー１３８は、対物レンズ１３８とフィルタホイール１２８との間の光路内に位置付けられうる。

【0047】

制御システム１４０は、システムの高速同期動作を容易にするために、協調した様態で蛍光顕微鏡１２０の構成要素にトリガ信号（例えばＴＴＬ信号）を送信するために用いられる、２つのマイクロコントローラ１４４、１４６を含みうる。第１マイクロコントローラ１４４は、コンピュータ１４２によって直接実行され、フィルタホイール１２８のアクチュエータ１２８ｂをトリガして、別々の色チャネルにおける発光フィルタ１２８ａを切り替える。第１マイクロコントローラ１４４は更に、第２マイクロコントローラ１４６をトリガし、第２マイクロコントローラ１４６は、どの波長の光がサンプル１０に送られるかを制御するために、光源１２２にデジタル信号を送信する。例えば、第２マイクロコントローラ１４６は、どのレーザモジュールを作動させるかを制御し、ひいては、どの波長の光が励起光に使用されるかを制御するために、光源１２２の個々のレーザモジュールにオン／オフ信号を送信しうる。新たな励起チャネルへの切り替えが完了した後、第２マイクロコントローラ１４６は、ピエゾステージ１１６のモータを制御して、イメージング高さを選択する。最後に、第２マイクロコントローラ１４６は、画像を獲得するために、カメラ１３４にトリガ信号を送信する。

【0048】

コンピュータ１４２と装置１００のデバイス構成要素との間の通信は、制御ソフトウェアによって調整される。この制御ソフトウェアは、全てのデバイス構成要素のドライバを単一のフレームワークに統合し、ひいては、ユーザが（多くのデバイスを別個に制御しなければならないのではなく）イメージングシステムを単一の機器として操作することを可能にしうる。

【0049】

制御ソフトウェアは、顕微鏡の相互作用動作及びイメージング結果の即時可視化をサポートする。加えて、制御ソフトウェアはプログラミングインタフェースを提供してよく、このプログラミングインタフェースにより、ユーザがそのイメージングワークフローを設計し、自動化することが可能になる。デフォルトワークフロースクリプトのセットはスクリプト言語で指定されうる。

【0050】

一部の実行形態では、制御システム１４０は、ループ内の蛍光画像（単に「収集画像」又は単に「画像」とも称される）を、（最内ループから最外ループへと）ｚ軸、色チャネル、横方向位置、そして試薬という順序で、（すなわち制御ソフトウェア及び／又はワークフロースクリプトによって）獲得するよう構成される。

【0051】

これらのループは、以下の擬似コードで表わされうる。

for h = 1:N_hybridization
% multiple hybridizations
for f = 1:N_FOVs
% multiple lateral field-of-views
for c = 1:N_channels
% multiple color channels
for z = 1:N_planes
% multiple z planes
Acquire image(h, f, c, z);
end % end for z
end % end for c
end % end for f
end % end for h

【0052】

ｚ軸ループにつき、制御システム１４０は、ステージ１１８に、複数の垂直位置をステップスルー（ｓｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ）させる。ステージ１１８の垂直位置はピエゾアクチュエータによって制御されるので、位置の調整に必要な時間は短く、このループにおける各ステップは極めて高速である。

【0053】

第１に、サンプルは、サンプルを通る複数の画像平面が望ましいものになりうるのに十分な厚さ（例えば数ミクロン）でありうる。例えば、細胞の複数の層が存在することがあり、一細胞内でさえも、遺伝子発現の垂直変異が存在しうる。更に、薄いサンプルでは、焦点面の垂直位置は、例えば熱ドリフトのせいで、事前には未知でありうる。加えて、サンプル１０はフローセル１１０内で垂直にドリフトすることがある。複数のＺ軸位置でイメージングすることで、厚いサンプル内の細胞の大部分がカバーされることを確実にすること、及び、薄いサンプル内の最良焦点位置の特定を支援することが可能になる。

【0054】

色チャネルループにつき、制御システム１４０は、光源１２２に、種々の波長の励起光をステップスルーさせる。例えば、レーザモジュールのうちの１つを作動させ、その他のレーザモジュールを作動停止させる。更に、サンプル１０とカメラ１３４との間の光の光路内に好適なフィルタを移動させるよう、発光フィルタホイール１２８を回転させる。

【0055】

横方向位置につき、制御システム１４０は、サンプルの別々の視野（ＦＯＶ）を獲得するために、光源１２２に、種々の横方向位置をステップスルーさせる。例えば、ループの各ステップにおいて、ステージを横方向にシフトさせるために、ステージ１１８を支持しているリニアアクチュエータが駆動されうる。一部の実行形態では、ステップの数及び横方向運動は、蓄積されたＦＯＶがサンプル１０全体をカバーするように選択される。一部の実行形態では、横方向運動は、ＦＯＶが部分的にオーバーラップするように選択される。

【0056】

試薬につき、制御システム１４０は、装置１００に、複数の異なる利用可能な試薬をステップスルーさせる。例えば、ループの各ステップにおいて、制御システム１４０は、フローセル１１０をパージ流体１１２ｂに接続するよう、バルブ１１４を制御することと、現在の試薬をパージするための第１期間にわたって、ポンプ１１６に、セルを通るようにパージ流体を引き込ませることと、次いで、フローセル１１０を異なる新たな試薬に接続するよう、バルブ１１４を制御することと、次いで、新たな試薬中のプローブが好適なＲＮＡ配列に結合するのに十分な第２期間にわたって、セルを通るように新たな試薬を引き込むことと、を行いうる。フローセルをパージするため、及び新たな試薬中のプローブが結合するためにはいくらかの時間が必要になるので、試薬を調節するのに必要な時間は、横方向位置、色チャネル、又はｚ軸を調節することと比較して、最も長くなる。

【0057】

その結果として、ｚ軸、色チャネル（励起波長）、横方向ＦＯＶ、及び試薬についての可能な値の組み合わせごとに、蛍光画像が獲得される。最内ループが最速の調整時間を有し、それを順次囲むループの調整時間は順次遅くなっていくので、この構成は、上記のパラメータの値の組み合わせにつき、画像を獲得する上で最も時間効率の良い技法を提供する。

【0058】

データ処理システム１５０は、画像を処理し、遺伝子発現を判定して、空間トランスクリプトミクスデータを生成するために使用される。少なくとも、データ処理システム１５０は、データ処理デバイス１５２（例えば、コンピュータ可読媒体に記憶されたソフトウェアによって制御される一又は複数のプロセッサ）と、カメラ１３４によって獲得された画像を受信するローカル記憶デバイス１５４（例えば不揮発性コンピュータ可読媒体）とを含む。例えば、データ処理デバイス１５２は、ＧＰＵプロセッサを有するか又はＦＰＧＡボードがインストールされた、ワークステーションでありうる。データ処理システム１５０は、ネットワークを通じてリモートストレージ１５６に（例えば、インターネットを通じてクラウドストレージに）接続されることもある。

【0059】

一部の実行形態では、データ処理システム１５０は、画像が受信される際にオンザフライ画像処理を実施する。詳細には、データ獲得の進行中に、データ処理デバイス１５２は画像前処理ステップ（フィルタリングや逆畳み込みなど）を実施してよく、かかる画像前処理ステップは記憶デバイス１５４内の画像データに対して実施可能であるが、データセット全体が必要とされるわけではない。フィルタリング及び逆畳み込みは、データ処理パイプラインにおける主要なボトルネックであるので、画像獲得が行われる際の前処理を行うことにより、オフライン処理時間を大幅に短縮すること、ひいては、スループットを向上させることが可能になる。

【0060】

図２は、全ての画像が獲得された後に処理が実施される、データ処理の方法のフロー図を示している。このプロセスは、システムが、生画像ファイル及び支援ファイルを受信すること（ステップ２０２）で始まる。詳細には、データ処理システムは、カメラから生画像のフルセット（例えば、ｚ軸、色チャネル（励起波長）、横方向ＦＯＶ、及び試薬の可能な値の組み合わせの各々についての画像）を受信しうる。

【0061】

加えて、データ処理システムは、参照発現ファイル（例えば、ＦＰＫＭ：ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）ファイル、データスキーマ、及び、ＤＡＰＩ画像といった一又は複数の染色画像）を受信しうる。参照発現ファイルは、従来の配列結果とｍＦＩＳＨの結果とを照合確認するために使用されうる。

【0062】

カメラから受信された画像ファイルは、オプションで、メタデータ、すなわち、画像が取得されたハードウェアパラメータ値（例えばステージ位置、ピクセルサイズ、励起チャネルなど）を含みうる。データスキーマは、イメージが一又は複数のイメージスタック内に好適な順序で配置されるように、かかるハードウェアパラメータに基づいてイメージを順序付けるための規則を提供する。メタデータが含まれない場合、データスキーマは、画像の順序と、その画像を生成するために使用されたｚ軸、色チャネル、横方向ＦＯＶ、及び試薬の値とを関連付けるうる。

【0063】

染色画像は、トランスクリプトミクス情報が重なった状態でユーザに提示されることになる。

【0064】

品質が不十分な画像を選別排除するために、収集された画像は、より集中的な処理の前に一又は複数の品質メトリックと照合されることがある（ステップ２０３）。品質メトリック（複数可）を満たす画像のみが、更なる処理に送られる。これにより、データ処理システムにかかる処理負荷が大幅に削減されうる。

【0065】

合焦不良を検出するために、収集された画像ごとに鮮鋭度品質値が決定されうる。例としては、鮮鋭度品質は、画像全体にわたる強度の勾配を合算することによって計算されうる。

【0066】

鮮鋭度品質値が閾値を下回る場合、その画像は焦点が合っていないと特定されうる。閾値は、予め設定された、経験的に決定された値でありうるか、又は、同じＦＯＶを有する複数の画像の鮮鋭度値に基づいて計算されうる。例えば、鮮鋭度品質値の標準偏差が計算され、この標準偏差に基づいて閾値が設定されうる。

【0067】

上述したように、焦点面のｚ軸位置は、正確には分からないことがある。焦点が合っていない画像は選別排除されうる。一部の実行形態では、ｚ軸ループの各々において、単一の画像（例えば最良鮮鋭度品質を有する画像）のみが保持される。一部の実行形態では、ｚ軸ループのそれぞれ１つからの複数の画像が鮮鋭度品質を満たしていることがあり、かかる複数の画像が合成されて（例えば混合されて）、単一の画像を形成する。

【0068】

関心領域を検出するために、収集された各画像について、輝度品質値が決定されうる。輝度品質は、画像内に細胞が存在するかどうかを判定するために使用されうる。例えば、画像内の全てのピクセルの強度値が合算され、閾値と比較されうる。合計が閾値を下回る場合、このことは、画像内には実質的に何も存在しないこと（すなわち、画像内に細胞が存在しないこと）、関心情報が存在しないこと、及びこの画像が処理される必要はないことを示しうる。別の例としては、画像内の強度値の標準偏差が計算され、閾値と比較されうる。この標準偏差が閾値を下回る場合、このことは、画像が相当程度均一であること、及び励起されたプローブを示す輝点が欠けている可能性があることを示す。この場合も、かかる収集された画像は、関心情報を有しておらず、この画像が処理される必要はない。

【0069】

上述した２つの品質チェックは例示的なものであり、その他の品質メトリックも使用されうる。例えば、スポット品質を測定する品質メトリックが使用されることもある。

【0070】

別の品質チェックは、ハイブリダイゼーション間シフトを検出しうる。イメージングのラウンドとラウンドとの間に著しいサンプルドリフトが生じた場合には、後続の位置決めが不確実になることがある。サンプルドリフトは、数多くの画像処理アルゴリズム（例えば位相相関）によって検出されうる。詳細には、収集された画像は、同じＦＯＶについての（ただし先の試薬についての）画像と比較されうる。画像が十分に相関していない場合（例えば、閾値相関を満たしていない場合）、収集された画像は関心情報を有しておらず、この画像が処理される必要はない。

【0071】

次に、各画像は、実験的アーチファクトを除去するよう処理される（ステップ２０４）。各ＲＮＡ分子は、種々の励起チャネルのプローブで複数回ハイブリダイズされることになるので、マルチチャネルでマルチラウンドの画像スタック全体における厳密な位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、ＦＯＶ全体にわたるＲＮＡ同定を明らかにする上で有益である。実験的アーチファクトを除去することは、視野平坦化（ｆｉｅｌｄ ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）及び／又は色収差補正を含みうる。一部の実行形態では、視野平坦化は色収差補正の前に実施される。

【0072】

励起光における照明プロファイルの不完全性（例えばガウス分布、又はその他の、ＦＯＶ全体における均一な分布ではない不均一な分布）が、ＦＯＶ全体における不均一な蛍光信号レベルにつながることがあり、この空間的不均一性は、励起チャネル間で変動することが多い。かかる不均一性は、照明場からＦＯＶ全体における蛍光信号レベルへと転送され、結果的に、空間トランスクリプトミクス解析結果を偏らせる。このアーチファクトを排除するために、照明プロファイル（例えば試験画像）が、各色チャネルにつき、ＦＯＶ内の蛍光体密度が均一な蛍光ターゲットを使用して測定される。測定された照明プロファイルは次いで、イメージングデータにおける、チャネル固有の正規化係数として使用される。例えば、各色チャネルの照明プロファイル（すなわち、測定されるべき発光波長の各々）は、正規化画像として記憶されてよく、ある色チャネルについて収集された画像内の各ピクセルの強度値が、関連付けられた色チャネルの正規化画像内の対応するピクセルの強度値で除算される。

【0073】

色収差補正は、種々の発光チャネルにわたって変動する光学的歪みに対処するものである。つまり、プローブは種々の波長につき測定を行うので、イメージング経路内の色収差は、もし存在すれば、その下流の解析結果を著しく劣化させうる。この潜在的なハードウェア欠陥に抗して解析結果のロバスト性を維持するために、色収差補正のためのソフトウェアベースのソリューションが、データ処理パイプラインにおいて提供されうる。詳細には、既知のパターン（例えば矩形パターン）の蛍光スポットを有するターゲットを使用して、各色チャネルにつき、テスト画像が生成される。各色チャネルにつき、このテスト画像内の測定されたスポットの位置を既知のパターンに合わせるように戻す、変換が計算される。かかる変換は記憶され、サンプルの画像が収集されている時の通常動作においては、収集された画像の色チャネルに基づいて、好適な変換が選択され、収集された画像の各々に適用される。

【0074】

各画像は処理されて、ＲＮＡ画像スポット鮮鋭化が提供される（ステップ２０６）。ＲＮＡ画像スポット鮮鋭化は、セルラーバックグラウンドを除去するためにフィルタを適用すること、及び／又は、ＲＮＡスポットを鮮鋭化するために点広がり関数を用いて逆畳み込みを行うことを含みうる。

【0075】

比較的輝度の高いバックグラウンドからＲＮＡスポットを識別するために、ＲＮＡスポットの周囲のセルラーバックグラウンドを除去するよう、画像（例えば視野平坦化され、色補正された画像）にローパスフィルタが適用される。フィルタリング済みの画像には更に、ＲＮＡスポットを鮮鋭化するための、２－Ｄ点広がり関数（ＰＳＦ）による逆畳み込み、及び、スポットを若干平滑化するための、半ピクセル幅を有する２－Ｄガウスカーネルによる畳み込みが行われる。

【0076】

同じＦＯＶを有する画像は、その中の特徴（例えば細胞又は細胞小器官）を位置合わせするよう、位置決めされる（ステップ２０８）。画像シーケンス内のＲＮＡ種を正確に特定するために、画像の種々のラウンドにおける特徴が（例えばサブピクセル精度まで）位置合わせされる。しかし、ｍＦＩＳＨサンプルは水相でイメージングされ、モータ動力のステージによってあちこちに動かされるので、数時間にわたるイメージングプロセスの間に、サンプルドリフト及びステージドリフトが画像特徴シフトに変換されることがあり、このことは、対処されないままであれば、トランスクリプトミクス解析を損なうことになりうる。換言すると、蛍光顕微鏡とフローセル又は支持体との位置合わせが正確かつ反復可能であると仮定したとしても、サンプルが、後の画像では同じ箇所になくなっていることがあり、これにより、復号にエラーが導入されうるか、又は、単に復号が不可能になりうる。

【0077】

画像を位置決めするための従来型の一技法は、スライド上のキャリア物質内に基準マーカー（例えば蛍光ビーズ）を配置することである。一般に、サンプルと基準マーカービーズとはほぼ一緒に動く。かかるビーズは、それらのサイズ及び形状に基づいて、画像内で特定されうる。ビーズの位置を比較することで、２つの画像の位置決めが可能になる（例えばアフィン変換の計算）。

【0078】

しかし、蛍光ビーズ又は類似の基準マーカーを使用せずに、単に画像内のデータを使用して、画像を位置決めすることも可能でありうる。詳細には、高強度領域は、一般に、同じＦＯＶの複数の画像にわたって、同じ位置に配置されるものである。画像同士の位置決めに使用されうる技法は、位相相関アルゴリズム及び相互情報（ＭＩ）アルゴリズムを含む。ＭＩアルゴリズムは、一般に、位相相関アルゴリズムよりも精密かつロバストである。したがって、相互情報（ＭＩ）ベースのドリフト補正法が位置合わせに使用されうる。しかし、この精度を得るには多大な計算時間が必要になりうる。

【0079】

図３は、同じＦＯＶを有する収集された画像を位置合わせするために相互情報アルゴリズムを使用するプロセスであって、ＭＩ位置決めアルゴリズムの高精度を保持しつつ計算負荷を低減する、プロセスを示している。同じＦＯＶを有する収集された画像のセットは、オリジナルの画像スタックと見なされてよい。このスタック内の画像の順序は、上述したデータスキーマによって設定される。画像スタック内の収集された画像３０２の各々は、例えば２０４８×２０４８ピクセルでありうる。一般に、このサイズの画像に対して相互情報アルゴリズムを実施するには、過大な計算能力が必要とされうる。収集された画像３０２は、４つの画像パッチ３０４ａ、３０４ｂ、３０４ｃ、３０４ｄに均等にスライスされる。収集された画像３０２の各々が２０４８×２０４８ピクセルであると仮定すれば、画像パッチは１０２４×１０２４ピクセルとなる。画像パッチ３０４ａ、３０４ｂ、３０４ｃ、３０４ｄの各々は位相係数φで乗算される。位相シフトされた画像パッチはオーバーラップされ、合算されて、複素画像が生成され、複素画像の実部と虚部とが積算されて、積算画像３０６が作成される。この積算画像３０６は、オリジナル画像３０２の１／４のサイズ（例えば１０２４×１０２４ピクセル）を有する。

【0080】

このプロセスは、縮小されたサイズの画像３０６のスタック３０８を生成するために、オリジナルの画像スタック内のオリジナル画像３０２の各々について反復される。次いで、スタック３０８を使用して相互情報アルゴリズムが実施されて、スタック３０８内の縮小画像３０６の各々につき、変換が生成される。この変換は、並進変換及び／又はスケーリング変換を含みうる。オリジナルのスタック内の画像を位置合わせするために、縮小画像の各々につき決定された変換が、オリジナルのスタック内の対応する収集された画像に適用される。これにより、オリジナルのサイズ（例えば２０４８ｘ２０４８ピクセル）の収集された画像３１０のスタック３１２が得られることとなり、このスタック内では、同じＦＯＶでの複数の画像３１０は位置合わせされている。

【0081】

このスライスアンドオーバーラップストラテジにより、画像内の特徴の大部分が保持され、したがって、高い精度が保たれるはずであるが、シフト計算用の一時的画像サイズは減少し、ひいては計算負荷も減少している。図３及び上記の説明は、オリジナル画像の右上、右下、左上、及び左下の象限に対応する４つのパッチに分割することを対象としているが、別の数のパッチが使用されることもある。例えば、画像は、パッチ同士が同じ寸法を有する限り、他の形状（正方形ではない長方形など）に分割されてもよい。例えば、オリジナルの画像は、２５６×２０４８ピクセルの８つの画像パッチに分割されることも可能である。一般に、画像は、複数の列及び複数の行（例えば均等な数の列と行）を有する矩形格子に分割されうる。画像はＮ個の画像に分割されてよく、ここでＮ＝Ｚ^２であり、Ｚは偶数の整数である（図３の例ではＮ＝２）。

【0082】

図２を再度参照するに、ステップ２０６のフィルタリングプロセス及び逆畳み込みプロセスは、個々のフレーム（すなわちビット）に対して個別に実施されるので、ステップ２０８の位置決めに先だって行われうる。更に、位置決めに使用される画像スタックは、ＲＮＡスポットの空間的特徴を明らかにするために背景補正され、鮮鋭化されるので、位置決め精度が向上しうる。後者の利点を検証するために、低集密度の細胞サンプル、高集密度の細胞サンプル、及び脳組織サンプルからの３つのデータセットの位置決め精度を、位置決め先行アプローチの場合とフィルタリング先行アプローチの場合とで比較した。位置決め品質は、全てのレイヤにわたる位置決め済みの画像スタックを積算してから、積算画像の最大値と最小値とを計算することによって評価された。フィルタリング先行アプローチの方が、一般に、平坦化された画像の最大値は大きくなり、最小値は小さくなる（これは位置決め品質の向上を示す）。

【0083】

位置決め後に、位置決め品質チェックが実施されうる。位置決めが適切であれば、各画像内の輝点がオーバーラップすることにより、総輝度が増大することになる。位置決めされていない画像のスタックが合算されうることには言及したが、同様に、位置決め済みの画像３１０のスタック３１２（図３参照）も、例えば以下のように合算されうる。

【0084】

Ｉ_Ｕ（ｘ，ｙ）の最大値が、Ｉ_Ｒ（ｘ，ｙ）の最大値と比較されうる。ｍａｘ（Ｉ_Ｒ（ｘ，ｙ））＞ｍａｘ（Ｉ_Ｕ（ｘ，ｙ））であれば、位置決めは成功したと見なされうる。これに対して、ｍａｘ（Ｉ_Ｒ（ｘ，ｙ））≦ｍａｘ（Ｉ_Ｕ（ｘ，ｙ））であれば、データ処理システムは、位置決めが失敗したことを示し、エラーコードを発出しうる。このＦＯＶは後続の解析から除外される可能性があり、かつ／又は、新たな画像が取得されることが必要になりうる。

【0085】

オプションで、位置決め後に、収集された画像の各々につき、マスクが計算されうる。つまり、各ピクセルの強度値が閾値と比較される。マスク内の対応するピクセルは、その強度値が閾値を上回る場合には１に設定され、強度値が閾値を下回る場合には０に設定される。閾値は、経験的に決定された所定の値であっても、画像内の強度値から計算されてもよい。一般に、マスクは、サンプル内の細胞の場所に対応しうる。細胞間の空間は、蛍光を発することはなく、低い強度を有するはずである。

【0086】

マスクを作成するために、各視野につき、そのＦＯＶの画像シーケンスから圧縮フレームＰ（ｘ，ｙ）が作成される。圧縮フレームＰ（ｘ，ｙ）は、そのＦＯＶの画像に対して積算演算を実施することによって生成されうる。
例えば、

であり、ここで、ｉは、位置決め済みの画像３１０のスタック３１２（図３参照）におけるレイヤ番号を表わす。閾値は、ログのヒストグラムＰ（ｘ，ｙ）に基づいて生成されうる。

【0087】

例えば、図４は、収集された画像における圧縮フレーム値（Ｐ（ｘ，ｙ））の対数ヒストグラム４００を示している。一般に、対数ヒストグラムは、強度の初期大幅増加部（第１の局所的最大値の前縁部でありうる）、及び強度の最終大幅減少部（第２の局所的最大値の後縁部でありうる）を含むことになる。ヒストグラムの下端に最も近い第１ピーク４０２（又は、明確なピークがなければ、強度の大幅増加の縁部）と、ヒストグラムの上端に最も近い第２ピーク４０４（又は、明確なピークがなければ、強度の大幅減少の縁部）とを特定するために、ヒストグラムに、ピーク及び／又は縁部を検出するアルゴリズムが使用されうる。閾値４１０は、特定された２つの点４０２、４０４の強度値に基づいて設定されうる。例えば、閾値４１０は強度値の平均でありうる。閾値４１０を決定するために、ヒストグラムには、ピーク検出法の代わりにＯｔｓｕ閾値法が使用されることもある。この技法は有用でありうる。ヒストグラムは常に２つの明確なピークを示すわけではないからである。

【0088】

ごま塩効果（Ｓａｌｔ ａｎｄ ｐｅｐｐｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）はマスクから除去されうる。「オン」ピクセルの連続領域の外部にある単一の「オン」ピクセル、又は、「オン」ピクセルの連続領域の内部にある単一の「オフ」ピクセルは、周囲のエリアと一致するよう、「オフ」又は「オン」に転換されうる。一般に、閾値サイズ（例えば５０ピクセル）を下回る、マスク内の隣接したピクセルのクラスタは、エラーとして示され、周囲のエリアと一致するよう変更されうる。マスクを使用することによって、メモリスペースの節約が可能になり、計算作業負荷が削減されうる。

【0089】

収集された１つの画像を図５Ａに示しており、図５Ｂは、図５Ａの画像から得られたマスクを示している。

【0090】

図２を再度参照するに、あるＦＯＶ内の画像を位置決めした後に、空間トランスクリプトミクス解析が実施されうる（ステップ２１０）。

【0091】

ヒストグラムの整合性を高めるために、空間トランスクリプトミクス解析の前にＦＯＶ正規化が実施されうる。一部の実行形態では、ＦＯＶ正規化は位置決め後に行われる。あるいは、ＦＯＶ正規化は、位置決めの前に行われることもある。ＦＯＶ正規化は、フィルタリングの一部と見なされることも可能である。収集された画像における問題は、上述したフィルタリング及び逆畳み込みの後であっても、最も輝度の高いピクセルにおける輝度に著しい（例えば数桁にわたる）変動がありうるということである。例えば、図６Ａを参照するに、収集された画像における強度値のヒストグラム６０２は、非常に長いテール部６０４を有する。これにより、復号プロセスに不確実性が導入されうる。ＦＯＶ正規化はこのエラー源を相殺しうる。

【0092】

まず、画像内の全ての強度値が、画像内の最大強度値に対して正規化される。例えば、最大強度値が決定され、全ての強度値がこの最大値で除算されることにより、強度値は０とＩ_ＭＡＸ（例えば１）との間で変動することになる。

【0093】

次に、画像中の強度値が解析されて、最高強度値を含む上位分位数（例えば、９９％以上の分位数（すなわち上位１％）、９９．５％以上の分位数、又は９９．９％以上の分位数、又は９９．９５％以上の分位数（すなわち上位０．０５％））が決定される。この分位数のカットオフを、図６Ａの破線６１０で示している。この分位数限界における強度値（例えば、図６Ａの例の９９．９５％分位数におけるｌｏｇ（－２）という強度値）が決定され、記憶されうる。上位分位数内の強度値を有する全てのピクセルは、最大強度値（例えば１）を有するよう再設定される。次いで、残りのピクセルの強度値が、同じ最大値に達するようスケーリングされる。これを実現するためには、上位分位数内になかったピクセルの強度値が、記憶された分位数限界の強度値で除算される。図６Ｂは、ＦＯＶ正規化から得られる強度値のヒストグラム６２０を示している。

【0094】

復号について、図７を参照して説明する。しかし、図３を少しだけ再度参照するに、特定のＦＯＶの位置合わせされた複数の画像は、複数の画像レイヤ３１０を含むスタック３１２と見なされてよく、この場合、各画像レイヤは、Ｘ×Ｙピクセル（例えば２０４８×２０４８ピクセル）である。画像レイヤの数（Ｂ）は、色チャネルの数（例えば励起波長の数）とハイブリダイゼーションの数（例えば反応体の数）との組み合わせに依拠する（例えば、Ｂ＝Ｎ＿ハイブリダイゼーション×Ｎ＿チャネル）。

【0095】

ここで図７を参照するに、正規化の後、この画像スタックは、ピクセルワードの２‐Ｄマトリクス７０２として評価されうる。マトリクス７０２は、数Ｐの行７０４（ここでＰ＝Ｘ×Ｙ）及び数Ｂの列７０６を有してよく、ここでＢは所与のＦＯＶのスタック内の画像の数（例えばＮ＿ハイブリダイゼーション×Ｎ＿チャネル）である。各行７０４は、ピクセルのうちの１つ（スタック内の複数の画像にわたる同じピクセル）に対応し、行７０４からの値がピクセルワード７１０を提供する。各列７０６は、ワード７１０内の値のうちの１つ（すなわち、そのピクセルの画像レイヤからの強度値）を提供する。上述したように、値は正規化されうる（例えば、０とＩ_ＭＡＸとの間で変動する）。図７では、種々の強度値が、それぞれのセルの異なる濃淡の度合いとして表わされている。

【0096】

全てのピクセルが復号ステップに送られれば、全てのＰワードは、後述するように処理されることになる。しかし、セル境界の外部のピクセルは、２‐Ｄマスク（上記図４Ｂ参照）によって選別排除され、処理されないことがある。結果として、後述する解析において、計算負荷が大幅に削減されうる。

【0097】

データ処理システム１５０は、画像データを復号して特定のピクセルにおいて発現した遺伝子を特定するために使用される、コードブック７２２を記憶している。コードブック７２２は複数の参照コードワード（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｄｅ ｗｏｒｄ）を含み、各参照コードワードは、特定の遺伝子に関連付けられている。図７に示しているように、コードブック７２２は、数Ｇの行７２４及び数Ｂの列７２６を有する２Ｄマトリクスとして表わされてよく、ここで、Ｇはコードワードの数（例えば遺伝子の数）である（ただし、同じ遺伝子が複数のコードワードによって表わされる可能性がある）。各行７２４は参照コードワード７３０のうちの１つに対応し、各列７０６は、既知の遺伝子の事前の較正及び試験によって確立されている、参照コードワード７３０内の値のうちの１つを提供する。各列につき、参照コード７３０内の値はバイナリ（すなわち「オン」又は「オフ」）でありうる。例えば、値の各々は０かＩ_ＭＡＸ（例えば１）のいずれかでありうる。図７では、かかるオン及びオフの値は、それぞれのセルの明るさと暗さの濃淡によって表わされている。

【0098】

復号されるべき各ピクセルにつき、ピクセルワード７１０と各参照コードワード７３０との間の距離ｄ（ｐ，ｉ）が計算される。例えば、ピクセルワード７１０と参照コードワード７３０との間の距離は、ユークリッド距離（例えば、ピクセルワード内の値の各々と参照コードワード内の対応する値との平方差の和）として計算されうる。この計算は、次のように表わされうる。

ここで、Ｉ_ｐ，ｘはピクセルワードのマトリクス７０２からの値であり、Ｃ_ｉ，ｘは参照コードワードのマトリクス７２２からの値である。ユークリッド距離の代わりに、その他のメトリック（例えば差の絶対値の和、余弦角、相関など）が使用されることもある。

【0099】

所与のピクセルについて各コードワードの距離値が計算されると、最小距離値が決定され、この最小距離値を提供するコードワードが、最良一致コードワードとして選択される。換言すると、データ処理装置は、ｍｉｎ（ｄ（ｐ，１），ｄ（ｐ，２）、…、ｄ（ｐ，Ｂ））を決定し、最小値を提供するｉの値（１とＢとの間）として値ｂを決定する。この最良一致コードワードに対応する遺伝子が、例えばコードワードを遺伝子に関連付けるルックアップテーブルから決定され、そのピクセルは、遺伝子を発現させるものとしてタグ付けされる。

【0100】

図２を再度参照するに、データ処理装置は偽のコールアウトを除外しうる。偽のコールアウトを除外する一技法は、遺伝子の発現を示す距離値ｄ（ｐ，ｂ）が閾値を上回る場合（例えばｄ（ｐ，ｂ）＞Ｄ１_ＭＡＸの場合）に、タグを破棄することである。

【0101】

偽のコールアウトをフィルタリングするための別の技法は、計算されたビット比が閾値を下回る場合にコードワードを却下することである。このビット比は、オンであると（コードワードから決定されたと）想定されるレイヤの画像ワードからの強度値の平均値を、オフであると（これもコードワードから決定されたと）想定されるレイヤの画像ワードからの強度値の平均値で除算したものとして、計算される。例えば、図７に示しているコードワード７３０の場合、列３～６及び１２～１４に対応するビットはオンであり、列１～２及び７～１１に対応するビットはオフである。ゆえに、このコードワードがピクセルｐの最良一致として選択されると仮定すれば、ビット比ＢＲは、次のように計算されうる。

【0102】

ビット比ＢＲは、閾値ＴＨ_ＢＲと比較される。一部の実行形態では、閾値ＴＨ_ＢＲは、事前測定値から経験的に決定される。しかし、一部の実行形態では、閾値ＴＨ_ＢＲは、サンプルから取得された測定値に基づいて、特定のコードワードについて自動的に計算されうる。図８Ａは、特定のコードワードにタグ付けされた全てのピクセルのビット比強度値の対数ヒストグラム８０２を示している。閾値８０４は、このヒストグラム８０２に基づいて計算される。例えば、初期閾値８０２を計算するために、デフォルトの分位数（例えば５０％）が使用されうる。しかし、この分位数は、後述する最適化において調整されうる。

【0103】

偽のコールアウトをフィルタリングするための更に別の技法は、計算されたビット輝度が閾値を下回る場合に、コードワードを却下することである。ビット輝度は、オンであると（コードワードから決定されたと）想定されるレイヤの画像ワードからの強度値の平均値として計算される。例えば、図７に示しているコードワード７３０では、列３～６及び１２～１４に対応するビットがオンになっている。ゆえに、このコードワードがピクセルｐの最良一致として選択されると仮定すれば、ビット輝度ＢＢは、次のように計算されうる。

BB=[I(p,3)+I(p,4)+I(p,5)+I(p,6)+I(p,12)+I(p,13)+I(p,14)]/7

【0104】

ビット輝度ＢＢは、閾値ＴＨ_ＢＢと比較される。一部の実行形態では、閾値ＴＨ_ＢＢは、事前測定値から経験的に決定される。しかし、一部の実行形態では、閾値ＴＨ_ＢＢは、サンプルから取得された測定値に基づいて、特定のコードワードについて自動的に計算されうる。図８Ｂは、特定のコードワードにタグ付けされた全てのピクセルのビット輝度値の対数ヒストグラム８１２を示している。閾値８１４は、このヒストグラム８１２に基づいて計算される。例えば、初期閾値８１４を計算するために、デフォルトの分位数（例えば８０％又は９０％）が使用されうる。しかし、この分位数は、後述する最適化において調整されうる。

【0105】

図２を再度参照するに、データ処理装置はここで、最適化及び再復号を実施しうる（ステップ２１２）。最適化は機械学習ベースの復号パラメータの最適化を含んでよく、その後、空間トランスクリプトミクス解析を更新するために、復号パラメータが更新された状態でステップ２１０に戻る。このサイクルは、復号パラメータが安定化するまで反復されうる。

【0106】

復号パラメータの最適化には、メリット関数（例えばＦＰＫＭ／ＴＰＭ相関、空間相関、又は信頼比（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｉｏ））が使用される。メリット関数における変数として含まれうるパラメータは、セルラーバックグラウンドを除去するために使用されるフィルタの形状（例えば、周波数範囲の始まりと終わりなど）、ＲＮＡスポットを鮮鋭化するために使用される点広がり関数の開口数値、ＦＯＶの正規化で使用される分位境界Ｑ、ビット比閾値ＴＨ_ＢＲ、ビット輝度ＴＨ_ＢＢ（又は、ビット比閾値ＴＨ_ＢＲ若しくはビット輝度ＴＨ_ＢＢを決定するために使用される分位数）、及び／又は、ピクセルワードがコードワードと一致すると見なされうる最大距離Ｄ１_ｍａｘ、を含む。

【0107】

このメリット関数は、事実上不連続な関数でありうるので、従来型の勾配追従アルゴリズムは、最適なパラメータ値を特定するのに不十分でありうる。パラメータ値に収束させるためには、機械学習モデルが使用されうる

【0108】

次に、データ処理装置は、全てのＦＯＶにわたるパラメータ値の統合（ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を実施しうる。各ＦＯＶは個別に処理されるので、各視野には、異なる正規化、二値化（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）、及びフィルタリングの設定が行われうる。その結果として、高コントラスト画像は、クワイエットエリア（ｑｕｉｅｔ ａｒｅａ）において偽のポジティブなコールアウトを引き起こす変動を有する、ヒストグラムを生じさせうる。統合の結果は、全てのＦＯＶが同じパラメータ値を使用するということである。これにより、クワイエットエリアの背景ノイズからコールアウトを大幅に除去すること、及び大サンプルエリアにおける明瞭かつ不偏な空間パターンが提供されることが可能になる。

【0109】

全てのＦＯＶにわたって使用されることになるパラメータ値を選択するには、数多くのアプローチが実行可能である。１つの選択肢は、単に、所定のＦＯＶ（例えば、最初に測定されたＦＯＶ、又はサンプルの中心付近のＦＯＶ）を選び、この所定のＦＯＶのパラメータ値を使用することである。別の選択肢は、複数のＦＯＶにわたるパラメータの値を平均化してから、この平均値を使用することである。別の選択肢は、どのＦＯＶが、そのピクセルワードとタグ付けられたコードワードとの間の最良適合をもたらしたかを、決定することである。例えば、タグ付けされたコードワードこのコードワードのためのピクセルワードとの間に最小平均距離ｄ（ｐ，ｂ１）を有するＦＯＶが決定されてから、このＦＯＶが選択されうる。

【0110】

あるいは、統合は、空間トランスクリプトミクス解析の前に（例えば、ステップ２０８と２１０との間に）実施されうる。この場合、統合は、ステップ２１０の前に選択されたパラメータ（例えば、ステップ２０４又は２０６で使用されたパラメータ）について実施されるが、ステップ２１０及び２１２におけるパラメータについては実施されない。

【0111】

ここで、データ処理装置は、ステッチング及びセグメンテーションを実施しうる（ステップ２１４）。ステッチングにより、複数のＦＯＶが合成されて単一の画像になる。ステッチングは、数多くの技法を使用して実施されうる。図９を参照するに、１つのアプローチは、ＦＯＶの各行であって、まとまってサンプルの合成画像を形成することになるＦＯＶの各行、及び行内の各ＦＯＶにつき、各ＦＯＶの水平シフトを決定することである。水平シフトが計算されると、ＦＯＶの各行につき、垂直シフトが計算される。水平シフト及び垂直シフトは、相互相関（例えば位相相関）に基づいて計算されうる。各ＦＯＶの水平シフト及び垂直シフトにより、単一の合成画像が生成されてよく、遺伝子座標は、水平シフト及び垂直シフトに基づいて、この合成画像に転送されうる。

【0112】

遺伝子が合成蛍光画像内の（ＦＯＶ中の座標及びこのＦＯＶの水平シフトと垂直シフトから決定された）特定の座標で発現しているという指示が、例えばメタデータとして、追加されうる。この指示は「コールアウト（ｃａｌｌｏｕｔ）」と称されうる。

【0113】

染色画像（例えばＤＡＰＩ画像）は、合成された染色画像を生成するよう、図９に関連して上述した技法を使用してひとまとめにステッチングされうる。一部の実行形態では、収集された複数の蛍光画像から１つの合成蛍光画像を作成する必要はない。各ＦＯＶの水平シフト及び垂直シフトが決定されれば、合成染色画像内の遺伝子座標が計算されうる。染色画像は、収集された蛍光画像（複数可）に対して位置決めされうる。遺伝子が（ＦＯＶにおける座標及びこのＦＯＶの水平シフトと垂直シフトから決定された）合成染色画像内の特定の座標で発現しているという指示は、例えばメタデータとして追加され、コールアウトが提供されうる。

【0114】

ステッチングされた画像には潜在的な問題が残る。詳細には、一部の遺伝子は、オーバーラップエリアにおいて二重計数されることがある。二重計数を除去するために、遺伝子を発現するものとしてタグ付けされた各ピクセルと、同じ遺伝子を発現するものとしてタグ付けされた他の近傍のピクセルとの間の距離（例えばユークリッド距離）が計算されうる。この距離が閾値を下回る場合、コールアウトのうちの１つが除去されうる。ピクセルのクラスタが遺伝子を発現するものとしてタグ付けされていれば、より複雑な技法が使用されることもある。

【0115】

合成画像（例えば染色された細胞の画像）を細胞に対応する複数の領域へとセグメンテーションすることは、様々な既知の技法を使用して実施されうる。セグメンテーションは、典型的には、画像のステッチングの後に実施されるが、合成画像にコールアウトが追加される前又は追加された後に行われることもある。

【0116】

遺伝子発現の位置を示すコールアウトを有するセグメンテーションされた画像はここで、記憶され、解析のために、例えば視覚的ディスプレイ上でユーザに提示されうる。

【0117】

上記の記述は、各ＦＯＶにつき単一のｚ軸画像が使用されると仮定しているが、これが必須というわけではない。別々のｚ軸位置からの画像は別個に処理されうる。事実上、異なるｚ軸位置はＦＯＶの新たなセットを提供する。

【0118】

上述したように、データ処理（画像処理の複数のステップを含む）は、要求される計算が多く、多大な時間量を要しうることが、問題の１つである。従来的な技法では、画像処理が始まる前に全ての画像が獲得されることが問題である。しかし、画像が受信される際にオンザフライ画像処理を実施することが可能である。

【0119】

図１０は、画像処理がオンザフライで実施される、修正後のデータ処理方法を示している。具体的に記述してはいないステップが、図２の方法と同様な様態で実施されることもある。最初に、データ処理システムはサポートファイルを受信しうる（ステップ２０２ａ）。ただし、このステップは、画像が獲得された後まで延期されることも可能である。一部のファイル（例えばデータスキーマ）が、画像処理の実施のために、データ処理システムにローディングされることが必要な場合もある。

【0120】

装置は、新たな画像を獲得するプロセス（ステップ２０２ｂ）を開始して（例えば、ｚ軸、色チャネル、横方向位置、及び試薬を調整するためにループをステップスルーして）、これらのパラメータの実現可能な値の組み合わせの各々で、画像を獲得する。

【0121】

各画像が獲得される際に、画像が前処理されるのに十分な品質のものであるかどうかを判定するために、品質管理（ＱＣ）テストが実施される（ステップ２０３）。品質が十分であれば、獲得された画像のオンザフライ前処理が実施される（ステップ２５２）。この文脈において、「オンザフライ（ｏｎ－ｔｈｅ－ｆｌｙ）」とは、１つの画像の処理が後続の画像の獲得と並行して実施されうることを示す。このオンザフライ前処理は、実験的アーチファクトの除去（ステップ２０４）、及びＲＮＡ画像スポット鮮鋭化（ステップ２０６）を含みうる。かかる画像前処理ステップは、各画像につき個別に実施されるものであり、同じＦＯＶ内の他の画像又は他のＦＯＶでの画像に依拠しないので、このようなシフト処理は処理の品質に悪影響を与えることはないと言える。一般に、多大な計算負荷が、試薬が交換されている間の時間にシフトされうる。その結果として、フローセルへのサンプルのローディングから、コールアウトを有するセグメンテーションされた画像の受信までの時間全体が大幅に短縮されることにより、著しくスループットが改善され、研究が加速されうる。

【0122】

一部の実行形態では、画像は「リアルタイム（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）」で前処理される。すなわち、１つの画像の処理は、装置による後続の画像の収集と並行して実施され、後続の画像がデータ処理システムで受信される前に完了する。

【0123】

この明細書では、システム及びコンピュータプログラム構成要素に関連して、「構成された（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）」という語が使用されている。一又は複数のコンピュータのシステムが、特定の工程又は動作を実施するよう構成されるということは、システムに、稼働中にシステムに工程又は動作を実施させるソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はこれらの組み合わせがインストールされていることを意味する。一又は複数のコンピュータプログラムが特定の工程又は動作を実施するよう構成されるということは、この一又は複数のプログラムが命令を含み、かかる命令は、データ処理装置によって実行されると、装置に工程又は動作を実施させることを意味する。

【0124】

この明細書に記載している主題及び機能的動作の実施形態は、デジタル電子回路、有形に具現化されたコンピュータソフトウェア若しくはファームウェア、コンピュータハードウェア（この明細書で開示している構造物及びそれらの構造的等価物を含む）、又はこれらのうちの一又は複数の組合せにおいて、実装されうる。この明細書に記載している主題の実施形態は、一又は複数のコンピュータプログラム（すなわち、データ処理装置による実行又はデータ処理装置の動作の制御のために、有形の非一時的記憶媒体上の符号化されたコンピュータプログラム命令の一又は複数のモジュール）として実装されうる。このコンピュータ記憶媒体は、機械可読記憶デバイス、機械可読記憶基板、ランダムアクセスメモリデバイス若しくはシリアルアクセスメモリデバイス、又はこれらのうちの一又は複数の組み合わせ、でありうる。代替的に又は追加的に、プログラム命令は、人工的に生成された伝播信号（例えば、機械生成された電気信号、光信号、又は電磁信号）であって、データ処理装置による実行に適したレシーバ装置に送信される情報を符号化するために生成される、伝播信号上で符号化されうる。

【0125】

「データ処理装置（ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ）」という語は、データ処理ハードウェアのことを指し、データを処理するためのあらゆる種類の装置、デバイス、及び機械（例としてはプログラマブルプロセッサ、コンピュータ、又は複数のプロセッサ若しくはコンピュータを含む）を包含する。装置は、特殊用途ロジック回路（例えばＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路））であってもよいか、又はかかる回路を更に含みうる。この装置は、オプションで、ハードウェアに加えて、コンピュータプログラム向けの実行環境を創出するコード（例えば、プロセッサファームウェアを構成するコード、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、又はこれらのうちの一又は複数の組み合わせ）も含みうる。

【0126】

コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリ、モジュール、ソフトウェアモジュール、スクリプト、若しくははコードとも称されうるか、又はそのように説明されうる）は、コンパイル型言語若しくはインタプリタ型言語、又は宣言型言語若しくは手続型言語を含む任意の形態のプログラミング言語で書かれてよい。更に、コンピュータプログラムは、スタンドアローンプログラムとして、又はモジュール、コンポーネント、サブルーチン、若しくはコンピューティング環境での使用に適したその他のユニットとしてのものを含む、任意の形態でデプロイされうる。プログラムはファイルシステム内のファイルに対応しうるが、それが必要なわけではない。プログラムは、例えば、一又は複数のスクリプトがマークアップ言語文書に、対象のプログラム専用の単一のファイルに、又は複数の連携ファイル（例えば一又は複数のモジュール、サブプログラム、若しくはコードの一又は複数の部分を記憶している複数のファイル）に記憶されるように、他のプログラム又はデータを保持するファイルの一部分に記憶されうる。コンピュータプログラムは、一箇所に位置しているか、又は複数箇所にわたって分置されてデータ通信ネットワークによって相互接続されている、一又は複数のコンピュータで実行されるよう、デプロイされうる。

【0127】

この明細書に記載しているプロセス及びロジックフローは、一又は複数のプログラマブルコンピュータであって、入力データに作用すること及び出力を生成することによって機能を果たすために一又は複数のコンピュータプログラムを実行する、一又は複数のプログラマブルコンピュータによって実施されうる。かかるプロセス及びロジックフローは、特殊用途ロジック回路（例えばＦＰＧＡ又はＡＳＩＣ）によって、又は特殊用途ロジック回路と一又は複数のプログラミングされたコンピュータとの組み合わせによって、実施されることもある。

【0128】

コンピュータプログラムの実行に適したコンピュータは、汎用マイクロプロセッサ若しくは特殊用途マイクロプロセッサ、又はこの両方、あるいは他の任意の種類の中央処理装置に基づきうる。一般に、中央処理装置は、読取専用メモリ若しくはランダムアクセスメモリ、又はこの両方から、命令及びデータを受信することになる。コンピュータの必須要素は、命令を実施又は実行するための中央処理ユニット、及び命令及びデータを記憶するための一又は複数のメモリデバイスである。かかる中央処理ユニット及びメモリは、特殊用途ロジック回路によって補完されうるか、又は特殊用途ロジック回路に組み込まれうる。一般に、コンピュータは更に、データを記憶するための一又は複数の大容量記憶デバイス（例えば磁気ディスク、光磁気ディスク、若しくは光ディスク）を含むか、あるいは、かかる大容量記憶デバイスからデータを受信するか、若しくは大容量記憶デバイスにデータを送信するか、又はその両方を行うよう、大容量記憶デバイスに動作可能に連結される。しかし、コンピュータが上述したデバイスを有することが必要なわけではない。

【0129】

コンピュータプログラム命令及びデータを記憶するのに適したコンピュータ可読媒体は、あらゆる形態の不揮発性メモリ、媒体、及びメモリデバイス（例としては、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリデバイスといった半導体メモリデバイス、内蔵ハードディスク若しくは取り外し可能ディスクといった磁気ディスク、光磁気ディスク、ならびにＣＤ－ＲＯＭ及びＤＶＤ－ＲＯＭディスクを含む）を含む。

【0130】

ユーザとの相互作用のために、この明細書に記載している主題の実施形態は、ＣＲＴ（陰極線管）又はＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニタといった、ユーザに情報を表示するためのディスプレイデバイスと、キーボードと、マウス又はトラックボールといったポインティングデバイス（これにより、ユーザはコンピュータに入力を行いうる）とを有するコンピュータで、実装されうる。ユーザとの相互作用のために、他の種類のデバイスも使用されうる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック（例えば視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバック）であってよく、ユーザからの入力は、音響入力、音声入力、又は触覚入力を含む任意の形態で受信されうる。加えて、コンピュータは、ユーザによって使用されるデバイスとの間で文書を送受信することによって（例えば、ウェブブラウザから受信した要求に応答して、ユーザのデバイス上のこのウェブブラウザにウェブページを送信することによって）、ユーザと相互作用しうる。また、コンピュータは、テキストメッセージ又は他の形式のメッセージをパーソナルデバイス（例えば、メッセージアプリケーションを実行しているスマートフォン）に送信し、それに応じてユーザから応答メッセージを受信することによって、ユーザと相互作用しうる。

【0131】

機械学習モデルが実装されるデータ処理装置は更に、例えば、機械学習のトレーニング又はプロダクション（すなわち推論）の作業負荷のうち共通の計算集約的部分を処理するための、特定用途ハードウェアアクセラレータユニットを含みうる。

【0132】

機械学習モデルは、機械学習フレームワーク（例えばＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗフレームワーク、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｔｏｏｌｋｉｔフレームワーク、Ａｐａｃｈｅ Ｓｉｎｇａフレームワーク、又はＡｐａｃｈｅ ＭＸＮｅｔフレームワーク）を使用して実装され、デプロイされうる。

【0133】

この明細書に記載している主題の実施形態はコンピューティングシステムにおいて実装されてよく、このコンピューティングシステムは、（例えばデータサーバとしての）バックエンド構成要素を含むか、又はミドルウェア構成要素（例えばアプリケーションサーバ）を含むか、又はフロントエンド構成要素（例えば、グラフィカルユーザインターフェース、ウェブブラウザ、若しくはアプリであって、それを通じてユーザがこの明細書に記載している主題の実行形態と相互作用しうるグラフィカルユーザインターフェース、ウェブブラウザ、若しくはアプリを有するクライアントコンピュータ）を含むか、あるいは、一又は複数のかかるバックエンド構成要素、ミドルウェア構成要素、又はフロントエンド構成要素の任意の組み合わせを含む。このシステムの構成要素同士は、任意の形態のデジタルデータ通信（例えば通信ネットワーク）又はかかるデジタルデータ通信の任意の媒体によって、相互接続されうる。通信ネットワークの例は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及びワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）（例えばインターネット）を含む。

【0134】

この明細書は、多数の具体的な実行形態の詳細事項を包含しているが、これらは、いかなる発明の範囲又は特許請求されうる範囲に対する限定として解釈すべきではなく、むしろ、特定の発明の特定の実施形態に特有でありうる特徴の説明として解釈すべきである。別個の実施形態を踏まえてこの明細書で説明しているある種の特徴は、単一の実施形態において組み合わされて実装されることもある。反対に、単一の実施形態を踏まえて説明している様々な特徴が、複数の実施形態において別個に、又は任意の好適なサブコンビネーションで、実装されることもある更に、特徴は、特定の組み合わせで作用するものとして上述されていることがあり、そのようなものとして最初に特許請求されることすらあるが、特許請求される組み合わせの一又は複数の特徴は、場合によっては、その組み合わせから削除されてよく、この特許請求される組み合わせは、サブコンビネーション又はサブコンビネーションの変形例を対象とすることもある。

【0135】

同様に、工程は、特定の順序で図面に示され、特許請求の範囲に列挙されているが、これは、望ましい結果を実現するために、かかる工程が示されている特定の順序で又は順次実施されること、又は示されている全ての工程が実施されることが必須であると、理解すべきではない。ある種の状況においては、マルチタスク動作及び並行処理を行うことが有利になりうる。更に、上述した、実施形態における様々なシステムモジュール及び構成要素の分離は、全ての実施形態においてかかる分離が必須であると理解すべきではなく、記載しているプログラム構成要素及びシステムは、一般に、単一のソフトウェア製品内で互いに一体化されること、又は複数のソフトウェア製品内にパッケージ化されることも可能であると、理解すべきである。

【0136】

本発明の主題の特定の実施形態について説明してきた。その他の実施形態も、以下の特許請求の範囲に含まれる。例えば、特許請求の範囲に列挙される動作は、異なる順序で実施されてよく、それでも望ましい結果を実現しうる。一例としては、添付の図に示しているプロセスは、望ましい結果を実現するために、必ずしも示している特定の順序で又は順次行われることを必要としない。場合によっては、マルチタスク及び並行処理を行うことが有利になりうる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】