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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-24
(45)【発行日】2024-02-01
(54)【発明の名称】ゲノム編集された細胞を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240125BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240125BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/10 ZNA
C12N9/16 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020556604
(86)(22)【出願日】2019-08-07
(86)【国際出願番号】 JP2019031117
(87)【国際公開番号】W WO2020100361
(87)【国際公開日】2020-05-22
【審査請求日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】P 2018215588
(32)【優先日】2018-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度国立研究開発法人日本医療研究開発機構 難治性疾患実用化研究事業「稀少免疫疾患に対する新規高精度ゲノム編集手法を用いた治療技術開発に関する研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中田 慎一郎
(72)【発明者】
【氏名】富田 亜希子
【審査官】菅原 洋平
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－０１１５２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cell Stem Cell，2013年，Vol. 13，pp. 659-662, Supplemental Information
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集された細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）を製造する方法であって、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する少なくとも１箇所で一本鎖切断する方法。
【請求項2】
置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
請求項１から３のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞（ただし、ヒト体内に存在する状態の細胞、ヒト生殖細胞、およびヒト胚細胞を除く）において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する少なくとも１箇所で一本鎖切断するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム編集された細胞を製造する方法に関し、主として、相同染色体間の相同組換えにより、ヘテロ変異が正常配列に置換された細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＡＬＥＮｓやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系などのプログラム可能なヌクレアーゼの登場により、現在、ゲノム編集技術は、急速な広まりを見せている。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、この複合体が、ガイドＲＮＡと相補的な配列を持つゲノム上の標的部位に結合して、ＤＮＡ二本鎖の両方を切断する。一世代前のゲノム編集技術であるＴＡＬＥＮｓは、ＤＮＡを標的化するＴＡＬＥタンパク質とＤＮＡを切断するヌクレアーゼ（主として、ＦｏｋＩ）との融合タンパク質であるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と同様に、ゲノム上の標的部位でＤＮＡの二本鎖切断を生じさせる。
【0003】
このＤＮＡの二本鎖切断は、非相同末端結合により修復された場合、ヌクレオチドの挿入や欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ： ｉｎｄｅｌ）が生じ、フレームシフトなどにより遺伝子ノックアウトを行うことができる。一方、細胞外から、修復鋳型となるドナーＤＮＡを導入した場合には、ゲノムとドナーＤＮＡとの間の相同組換えにより、遺伝子ノックインを行うことができる。この遺伝子ノックインにおいては、ＤＮＡの挿入のみならず、１～数ヌクレオチドの置換や欠失を生じさせることも可能である。
【0004】
しかしながら、ゲノム恒常性の観点では、プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集には大きな問題がある。その一つは、ＤＮＡの二本鎖切断による目的外の遺伝子変異の発生である。体細胞では、相同組換えによる修復よりも非相同末端結合による修復が優位であるため、ゲノム編集系により二本鎖切断された標的部位では、修復鋳型によるノックインよりも、目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）が生じやすい。そのため、ゲノム編集を実施した細胞集団において、目的通りのノックインを達成できた細胞や遺伝子配列の変化が全く起こらなかった細胞に加え、非相同末端結合に起因する目的外の変異が生じた細胞が少なからず含まれてしまう。また、１細胞レベルで見れば、常染色体の対立遺伝子のうち１つが計画通りにノックインされても、もう一方には目的外の変異が入る可能性がある。また、プログラム可能なヌクレアーゼは、標的配列と類似性の高いＤＮＡ配列（オフターゲット）においてもＤＮＡ二本鎖切断を発生させ、ゲノム変異を生じさせることが報告されている。
【0005】
そこで、本発明者らは、Ｃａｓ９の２つのヌクレアーゼ部位のうち一方を失活させたニッカーゼ型Ｃａｓ９を用い、ＤＮＡの一本鎖切断によって相同組換えを誘導することにより、従来のＤＮＡの二本鎖切断による手法と比較して、非相同末端結合による目的外の変異（ｉｎｄｅｌ）の発生を抑制しうる手法を開発した。その一つは、ニッカーゼを用い、標的とするゲノムに２箇所、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れることによる、タンデムニック法を利用したゲノム編集法である（非特許文献１、特許文献１）。また、本発明者らは、この方法をさらに発展させ、標的とするゲノムに１箇所のニックを入れ、修復鋳型を含むドナープラスミドに１箇所のニックを入れるＳＮＧＤ法（ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｉｃｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ）も開発した（特許文献１）。
【0006】
その一方で、ゲノム編集においては、修復鋳型として用いるドナーＤＮＡのゲノムへのランダムな組み込みという問題もある。すなわち、細胞にＤＮＡを多量に導入すると、ＤＮＡの一部がゲノムの任意の部位に組み込まれてしまう現象（ランダムインテグレーション）が高頻度に発生する。しかしながら、ランダムインテグレーションが生じた部位を同定することは困難であり、医療応用などを行う場合には、安全性の面で問題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１８－１１５２５号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２８， ２２３－２３０， ２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、このような上記従来技術の有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、外来のドナーＤＮＡを用いずに、特異的かつ高効率に、相同組換えによるゲノム編集を行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、まず、細胞外からドナーＤＮＡを導入するのではなく、細胞に元々存在する相同染色体を修復鋳型としてゲノム編集を行うことにより、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題を回避することを構想した。
【0011】
細胞内の染色体にヘテロ接合体変異あるいは複合ヘテロ接合体変異が存在する場合、一方のアリル（これを「アリルＡ」と称する）に存在する遺伝子変異は、もう一方のアリル（これを「アリルＢ」と称する）には存在しない。ここで、仮に、アリルＡとアリルＢとの間で相同組換えを誘導することができれば、アリルＢを修復鋳型としてアリルＡの変異を正常配列に修復したり、逆に、アリルＡを鋳型としてアリルＢの正常配列に変異を導入することが可能である。この場合、既存法において鋳型として用いていた外来のドナーＤＮＡ（人工合成ＤＮＡ鎖やプラスミドなど）は不要となる。しかしながら、体細胞において相同組換え修復が起こるのは姉妹染色分体間であり、相同染色体間での相同組換えは非常に起こりにくい。
【0012】
そこで、本発明者らは、相同染色体の標的部位周辺にＤＮＡ切断を導入することによる、相同染色体間の相同組換えの誘導を試みた。様々な切断様式を検討した結果、レシピエントとなる染色体上の修正対象とするヌクレオチドの近傍ＤＮＡ領域の複数箇所にニックを生じさせ、かつ、ドナーとなる染色体上では、レシピエントの染色体においてニックを生させる箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所にニックを生じさせることにより、非相同末端結合を顕著に抑制し、標的部位における相同染色体間での組換えを特異的に誘導することに成功した（ニックの導入の例を図１Ａ～Ｈに示す）。そして、これにより、目的外の変異を生じさせずに、高効率で標的の変異を修復することに成功した。さらに、本発明者らは、この方法の原理によれば、広く、相同染色体間で異なる塩基を標的として、いずれかの塩基に統一することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
本発明は、相同染色体間の相同組換えを利用したゲノム編集に関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
【0014】
（１）ゲノム編集された細胞を製造する方法であって、
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する方法。
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換することを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する方法。
【0015】
（２）置換されるレシピエントの塩基が変異塩基であり、ドナーの塩基が正常塩基である、（１）に記載の方法。
【0016】
（３）部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、（１）又は（２）に記載の方法。
【0017】
（４）（１）から（３）のいずれかに記載の方法に用いるためのキットであって、
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断するキット。
相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞において、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含み、
当該部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、当該レシピエントの染色体においては、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、当該ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断するキット。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、非相同末端結合による目的外の変異の発生を顕著に抑制しながら、相同染色体間の相同組換えによって、特異的かつ高効率にゲノム編集を行うことができる。また、相同組換えに外来のドナーＤＮＡを利用ぜず、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションという問題も生じないことから、遺伝子治療などの医療応用を行った場合でも、高い安全性でゲノム編集を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図2A】図２Ａは、相同組換えのドナーとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５′側領域に相当）の標的部位を示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である（以下、図２Ｂ～Ｈについても同様）。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
【図2B】図２Ｂは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
【図2C】図２Ｃは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ２（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図2D】図２Ｄは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ３（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ４（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図2E】図２Ｅは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ５（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ６（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図2F】図２Ｆは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ７（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ８（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図2G】図２Ｇは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ９（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１０（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図2H】図２Ｈは、相同組換えのレシピエントとした染色体のサイミジンキナーゼ１遺伝子における、本実施例で設計したｃｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの５’側領域に相当）の標的部位を示す。アンダーラインは、それぞれ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１１（上図）及びＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－Ｓ１２（下図）のｃｒＲＮＡの標的部位を示す。
【図4A】図４Ａは、図３に示した本実施例のサンプルにおいて、サイミジンキナーゼ活性の回復を指標にゲノム編集が生じた細胞を検出した結果を示す。図下は、図上のサンプル＃１～６のグラフを拡大したものである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明におけるゲノム編集された細胞を製造する方法は、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することを原理とする。
【0021】
具体的には、相同染色体の特定の部位に相同染色体間で異なる塩基を有する細胞に、当該特定の部位の近傍ＤＮＡ領域で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを導入し、当該相同染色体の一方をレシピエントとし、他方をドナーとした相同組換えを誘導して、当該特定の部位におけるレシピエントの塩基をドナーの塩基に置換する。
【0022】
本発明におけるゲノム編集の対象となる「細胞」としては、相同染色体を有する限り、特に制限はなく、様々な真核細胞を対象とすることができる。「真核細胞」としては、例えば、動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞が挙げられる。また動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞が挙げられる。
【0023】
「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。具体的には、例えば、各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、造血幹細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。ゲノム編集動物の作成には、受精後の卵母細胞、すなわち受精卵を用いることができる。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。受精前の卵母細胞には、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
【0024】
本発明において「哺乳動物」とは、ヒト及び非ヒト哺乳動物を包含する概念である。非ヒト哺乳動物の例としては、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの齧歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などが挙げられる。上記の非ヒト哺乳動物は、家畜又はコンパニオンアニマル（愛玩動物）であってもよく、野生動物であってもよい。
【0025】
「植物細胞」としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類の細胞が挙げられる。「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞などが含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、塊根、種子、カルスなどが挙げられる。植物の例としては、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションなどが挙げられる。
【0026】
相同染色体の特定の部位における「相同染色体間で異なる塩基」は、一つの塩基であっても、複数の塩基（塩基配列）であってもよい。また、変異であっても、多型であってもよい。変異としては、例えば、置換、欠失、挿入、又はこれらの組み合わせが挙げられ、多型には、例えば、一塩基多型やマイクロサテライト多型が挙げられる。
【0027】
本発明においては、相同染色体のうち、特定部位に変異や多型を持つ染色体を、相同組換えにおけるレシピエントとすることも、ドナーとすることもできる。すなわち、本発明におけるゲノム編集により、相同染色体を構成する２つの染色体の特定部位の塩基を、双方とも正常配列にすることもでき、また、双方とも特定の変異配列や多型配列にすることもできる。例えば、ＨＬＡにおいては、ヘテロ接合体のＨＬＡをホモ接合体ＨＬＡにすることもできる。
【0028】
医療上の有用性の観点からの典型的な本発明の利用態様は、ヘテロ接合体変異に起因するヒトの疾患を治療又は予防するために、ヒト細胞における当該変異を正常配列へと修復することである。ここで「ヘテロ接合体変異に起因する疾患」としては、当該ヘテロ変異により直接的に生じる疾患（優性遺伝疾患）の他、２種の異なる変異の組み合わせ（複合ヘテロ接合体）により生じる疾患（劣性遺伝疾患）も含む意である。対象疾患としては、例えば、先天性免疫不全症におけるＯＡＳ１異常症などの常染色体優性遺伝形式をとる常染色体ヘテロ接合体変異により発症する疾患、ＡＤＡ欠損症などの常染色体劣性遺伝形式をとる遺伝性疾患、及び女性の第ＶＩＩＩ因子・第ＩＸ因子欠損の血友病などの女性でＸ連鎖性伴性遺伝形式で発症する疾患が挙げられるが、これらに制限されない。
【0029】
本発明に用いる「部位特異的ニッカーゼ」としては、ゲノム上の部位特異的にＤＮＡを一本鎖切断できるものであれば制限はないが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が好ましい。Ｃａｓタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含むが、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質は、典型的には、これら２つのドメインのいずれかのドメインの変異により、その切断活性が喪失している。このような変異としては、ｓｐＣａｓ９タンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質）の場合には、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が挙げられる。その他、種々の由来のＣａｓ９タンパク質が公知であり（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３）、それらのニッカーゼ型を利用することができる。なお、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。
【0030】
また、本発明においては、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１２ｂ、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１４などを利用することもできる。ニッカーゼ型Ｃｐｆ１タンパク質における変異としては、例えば、ＡｓＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）では、Ｎ末端から１２２６番目のアミノ酸（アルギニン）のアラニンへの変異（Ｒ１２２６Ａ：Ｎｕｃドメイン内の変異）が挙げられる。Ｃｐｆ１のアミノ酸配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されている（例えば、アクセッション番号：ＷＰ＿０２１７３６７２２、ＷＰ＿０３５６３５８４１など）。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を構成するタンパク質としては、核移行シグナルを付加したものを用いてもよい。
【0032】
ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質を構成要素とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡと結合して複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列に標的化されてＤＮＡを一本鎖切断する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系においては、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系においては、ｔｒａｃｒＲＮＡは不要である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系におけるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む一分子ガイドＲＮＡでも、ｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片とからなる二分子ガイドＲＮＡであってもよい。
【0033】
ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を含む。標的ＤＮＡ配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列であり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域より選択されることが好ましい。典型的には、ＤＮＡの部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間の塩基対形成の相補性と、それに隣接して存在するＰＡＭの両方によって決定される位置で生じる。
【0034】
多くのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系においては、ｃｒＲＮＡは、さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含む。一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（一分子又は二分子）が二重鎖ＲＮＡを形成し、形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。
【0035】
ＰＡＭは、Ｃａｓタンパク質の種類や由来により異なる。典型的なＰＡＭ配列は、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ１型）では、「５′－ＣＣＮ」であり、Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ａ２型）では、「５′－ＴＣＮ」であり、Ｈ．ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｂ型）では、「５′－ＴＴＣ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｅ型）では、「５′－ＡＷＧ」であり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ－Ｆ型）では、「５′－ＣＣ」であり、Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ－Ａ型）では、「５′－ＮＧＧ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＧＲＲＴ」又は「５′－ＮＧＲＲＮ」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質では、「５′－ＮＡＡＡＡＣ」である。Ｃｐｆ１では、典型的には、「５’－ＴＴＮ」又は「５’－ＴＴＴＮ」である。なお、タンパク質を改変すること（例えば、変異の導入）により、ＰＡＭ認識を改変することも可能である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１， ８８６－８９４（２０１６））。
【0036】
本発明においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系以外の部位特異的ニッカーゼを利用することもできる。このような部位特異的ニッカーゼとしては、例えば、ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼが挙げられる。人工ヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬＥ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＺＦ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）、ＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ）を利用することができる。これら人工ヌクレアーゼとの融合により、ニッカーゼ活性を発揮し得る酵素としては、例えば、ＴｅｖＩが挙げられる（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１３；４：１７６２． ｄｏｉ： １０．１０３８／ ｎｃｏｍｍｓ２７８２）。これら人工ヌクレアーゼは、特定の塩基（あるいは特定の塩基配列）を認識するモジュール（ペプチド）を連結することにより構築されたＤＮＡ結合ドメインにより、標的ＤＮＡ配列に標的化され、当該ＤＮＡ結合ドメインに融合されたニッカーゼにより、ＤＮＡを一本鎖切断する。人工ヌクレアーゼにおけるＤＮＡ結合ドメインとニッカーゼの間には、適当なスペーサーペプチドが導入されていてもよい。
【0037】
本発明においては、レシピエントの染色体においては、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）の近傍ＤＮＡ領域の複数箇所で一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する部位特異的ニッカーゼの組み合わせを利用する。
【0038】
ここで「近傍ＤＮＡ領域」とは、特定の部位から、通常、１０００００塩基以内、１００００塩基以内、５０００塩基以内、２０００塩基以内、好ましくは１０００塩基以内（例えば、５００塩基以内、４００塩基以内、３００塩基以内、２００塩基以内、１００塩基以内、５０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）の領域である。また、「近傍ＤＮＡ領域の複数箇所」は、同一のＤＮＡ鎖状であっても、異なるＤＮＡ鎖上であってもよい。
【0039】
具体的な態様の例としては、上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域と３′側近傍ＤＮＡ領域に１箇所ずつ（図１Ａのパターン１とパターン２、図１Ｃのパターン１′と２（ａ）′、図１Ｄのパターン２（ｂ）′）、上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域に２箇所（図１Ｂのパターン３（ａ）、パターン４（ａ）、図１Ｄのパターン３（ａ）′、図１Ｅのパターン４（ａ）′）、上記特定の部位の３′側近傍ＤＮＡ領域に２箇所（図１Ｂのパターン３（ｂ）、パターン４（ｂ）、図１Ｅのパターン３（ｂ）′、図１Ｆのパターン４（ｂ）′）、及び上記特定の部位の５′側近傍ＤＮＡ領域と３′側近傍ＤＮＡ領域に少なくとも１箇所ずつで計３箇所（図１Ｇのパターン５とパターン６）が挙げられる。切断される箇所は、４箇所以上であってもよい。また、１つの特定の部位の近傍ＤＮＡ領域には、他の特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）が存在していてもよい（図１Ｈのパターン７）。
【0040】
ドナーの染色体とレシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所の全てが対応している態様（図１Ａのパターン１、図１Ｂのパターン３、図１Ｃのパターン１′、図１Ｄのパターン３（ａ）′、図１Ｅのパターン３（ｂ）′、図１Ｇのパターン６、図１Ｈのパターン７（ｄ））においては、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼが、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列にも結合するように設計すればよい。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、典型的には、同一のＤＮＡ配列である。
【0041】
一方、ドナーの染色体とレシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所の一部が対応していない態様（図１Ａのパターン２、図１Ｂのパターン４、図１Ｃのパターン２（ａ）′、図１Ｄのパターン２（ｂ）′、図１Ｅのパターン４（ａ）′、図１Ｆのパターン４（ｂ）′、図１Ｇのパターン５、図１Ｈのパターン７（ａ）～（ｃ））においては、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列に結合する部位特異的ニッカーゼの組み合わせの一部を、ドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列には結合しないように設計することができる。この場合、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列である。例えば、ゲノム編集により置換を行う塩基（相同染色体間で異なる塩基）を含むように、部位特異的ニッカーゼの標的ＤＮＡ配列を設定すれば、レシピエントの染色体の標的ＤＮＡ配列とドナーの染色体の対応ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ配列となる。部位特異的ニッカーゼがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である場合には、レシピエントの標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにガイドＲＮＡを設計すればよい。また、部位特異的ニッカーゼがニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼの場合には、レシピエントの標的ＤＮＡ配列に結合特異性を持つようにＤＮＡ結合ドメインを設計すればよい。この態様においては、部位特異的ニッカーゼの設計上、一本鎖切断される部位は、上記特定の部位（相同染色体間で異なる塩基）から、通常、約１００塩基位内、より好ましくは５０塩基以内（例えば、４０塩基以内、３０塩基以内、２０塩基以内、１０塩基以内）である。
【0042】
本発明において、異なるＤＮＡ鎖上で一本鎖切断を行う場合には、一本鎖切断の距離が近すぎると二本鎖切断が生じうる。従って、異なるＤＮＡ鎖上にある一本鎖切断箇所の距離は、通常、１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上であり、かつ、通常、２０００塩基以内、好ましくは１０００塩基以内、さらに好ましくは５００塩基以内である。
【0043】
本発明においては、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを細胞に導入する。細胞に導入される「部位特異的ニッカーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合には、例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質の組み合わせの形態であっても、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡとの組み合わせの形態であっても、それらを発現するベクターの組み合わせであってもよい。ガイドＲＮＡは、分解を抑制するための修飾（化学修飾など）が行われていてもよい。ニッカーゼ活性を持つ酵素と融合された人工ヌクレアーゼである場合には、例えば、タンパク質の形態であっても、当該タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡであっても、当該タンパク質を発現するベクターの形態であってもよい。
【0044】
発現ベクターの形態を採用する場合には、発現させるべきＤＮＡに作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含む。ここで、「作動可能に結合している」とは、調節エレメントに上記ＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）が挙げられる。調節エレメントとしては、目的に応じて、例えば、多様な宿主細胞中でのＤＮＡの構成的発現を指向するものであっても、特定の細胞、組織、あるいは器官でのみＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。また、特定の時期にのみＤＮＡの発現を指向するものであっても、人為的に誘導可能なＤＮＡの発現を指向するものであってもよい。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１プロモーター）、ｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター）、ｐｏｌＩプロモーター、又はそれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、導入する細胞の種類などに応じて、適切な発現ベクターを選択することができる。
【0045】
部位特異的ニッカーゼの細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リポフェクション法、ナノ粒子媒介性トランスフェクション法、ウイルス媒介性核酸送達法などの公知の方法で行うことができる。
【0046】
細胞への導入後、部位特異的ニッカーゼの組み合わせが、レシピエントの染色体においては、標的塩基の近傍ＤＮＡ領域で複数箇所一本鎖切断し、ドナーの染色体においては、レシピエントの染色体において一本鎖切断される箇所に対応する箇所の少なくとも１箇所で一本鎖切断する。これにより非相同末端結合による目的外の変異の発生を顕著に抑制しながら、相同染色体間での相同組換えが誘導され、特異的かつ高効率に、標的塩基がドナーにおける対応する塩基に置換される。本発明によれば、非相同末端結合による目的外の変異の発生を９０％以上、好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％）抑制することができる。
【0047】
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットであって、上記部位特異的ニッカーゼの組み合わせを含むキットを提供する。当該のキットは、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含む場合があり、追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、対照のガイドＲＮＡ）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
【実施例】
【0048】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0049】
[実施例１］複数ニック法の有効性
Ａ．材料
（１）ＴＳＣＥＲ２細胞
Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ １遺伝子（ＴＫ１）のヘテロ接合体変異をもつｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔＴＫ６細胞（ｅｘｏｎ ４に１ヌクレオチド挿入。フレームシフト）由来細胞である。健常アリルのｉｎｔｏｒｏｎ ４に３１塩基対の挿入（これ自体はＴＫ１遺伝子機能の喪失とは関係ない）とｅｘｏｎ ５に変異を入れ、複合ヘテロ接合体変異に改変し、ＴＫ１遺伝子の機能を喪失させている。サイミジンキナーゼに依存したＤＮＡ合成ｓａｌｖａｇｅ経路が機能しないため、ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎによりＤＮＡ ｄｅ ｎｏｖｏ合成経路を遮断すると、２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、及びｔｈｙｍｉｄｉｎｅを供給しても細胞増殖することができない。ゲノム編集によりサイミジンキナーゼ活性が回復した場合、ＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］， １００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］）中でも細胞増殖可能となる。
Ａ．材料
（１）ＴＳＣＥＲ２細胞
Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ １遺伝子（ＴＫ１）のヘテロ接合体変異をもつｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔＴＫ６細胞（ｅｘｏｎ ４に１ヌクレオチド挿入。フレームシフト）由来細胞である。健常アリルのｉｎｔｏｒｏｎ ４に３１塩基対の挿入（これ自体はＴＫ１遺伝子機能の喪失とは関係ない）とｅｘｏｎ ５に変異を入れ、複合ヘテロ接合体変異に改変し、ＴＫ１遺伝子の機能を喪失させている。サイミジンキナーゼに依存したＤＮＡ合成ｓａｌｖａｇｅ経路が機能しないため、ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎによりＤＮＡ ｄｅ ｎｏｖｏ合成経路を遮断すると、２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、及びｔｈｙｍｉｄｉｎｅを供給しても細胞増殖することができない。ゲノム編集によりサイミジンキナーゼ活性が回復した場合、ＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］， １００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］）中でも細胞増殖可能となる。
【0050】
（２）ニッカーゼ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系と標的領域の構造
ドナーとなる野生型の標的領域（ＴＫ１ Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｅｘｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ４の配列）を図２Ａ（配列番号：１）に示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
ドナーとなる野生型の標的領域（ＴＫ１ Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｅｘｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ４の配列）を図２Ａ（配列番号：１）に示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
【0051】
また、レシピエントとなる変異型の標的領域を図２Ｂ（配列番号：２）に示す。大文字がエクソンを、小文字がイントロンを示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。アンダーラインは、上から順に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓの標的部位、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓの標的部位を示す。
【0052】
また、Ｓ１～Ｓ１２の標的領域を図２Ｃ～２Ｈ（配列番号：３～１４）に示す。大文字はエクソン、小文字はその他の配列を示す。四角で囲んだ塩基配列はＰＡＭ配列である。標的配列部位をアンダーラインで示した。
【0053】
ｓｇＲＮＡのうちｃｒＲＮＡに相当する配列は、以下の通りである。なお、下線はＰＡＭに対する配列である。
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号：１５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
ＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧ（配列番号：１６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号：１７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓ
ＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号：１８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１
ＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号：１９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２
ＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号：２０）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３
ＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号：２１）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４
ＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧ（配列番号：２２）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５
ＧＡＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２３）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６
ＣＡＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧ（配列番号：２４）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７
ＧＡＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧ（配列番号：２５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８
ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号：２６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９
ＣＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＡＧＧ（配列番号：２７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０
ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＧ（配列番号：２８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１
ＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２
ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号：３０）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＣＧＣ］と［ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＧＣＣ］と［ＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓを用いた場合は、［ｃｃｃａｇｃ］と［ｔａｃｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇａｇｇ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓを用いた場合は、［ＣＣＴＧＣＴ］と［ＣＣＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１を用いた場合は、［ＣＣＴＣＡＧ］と［ＡＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２を用いた場合は、［ＣＣＡＧＴＧ］と［ＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３を用いた場合は、［ＣＣＴＧＧＧ］と［ＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４を用いた場合は、［ＣＣＴＧＴＣ］と［ＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＧＴＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＴＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６を用いた場合は、［ＣＣＴＧＡＴ］と［ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７を用いた場合は、［ＣＣＣＴＣＧ］と［ＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８を用いた場合は、［ＣＣＡＧＧＡ］と［ＧＧＴＡＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９を用いた場合は、［ＣＣＴＡＣＧ］と［ＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＴＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０を用いた場合は、［ＣＣＣＡＴＴ］と［ＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２を用いた場合は、［ＣＣＣＴＧＧ］と［ＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣ］との間に、それぞれＤＮＡ二本鎖切断あるいはニックが生じると予想されている（図２Ａ～Ｈ及び配列番号：１～１４を参照のこと）。
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号：１５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
ＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＧ（配列番号：１６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧ（配列番号：１７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓ
ＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号：１８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１
ＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号：１９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２
ＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号：２０）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３
ＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧ（配列番号：２１）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４
ＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧ（配列番号：２２）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５
ＧＡＡＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２３）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６
ＣＡＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧ（配列番号：２４）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７
ＧＡＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧ（配列番号：２５）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８
ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧ（配列番号：２６）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９
ＣＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＧＴＡＧＧ（配列番号：２７）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０
ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＧ（配列番号：２８）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１
ＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＧ（配列番号：２９）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２
ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧ（配列番号：３０）
ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＣＧＣ］と［ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓを用いた場合は、［ＣＣＣＧＣＣ］と［ＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓを用いた場合は、［ｃｃｃａｇｃ］と［ｔａｃｔｃｔｔｇｔｇｇｃｔｇａｇｇ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２９ｓを用いた場合は、［ＣＣＴＧＣＴ］と［ＣＣＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１を用いた場合は、［ＣＣＴＣＡＧ］と［ＡＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ２を用いた場合は、［ＣＣＡＧＴＧ］と［ＡＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ３を用いた場合は、［ＣＣＴＧＧＧ］と［ＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ４を用いた場合は、［ＣＣＴＧＴＣ］と［ＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ５を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＧＴＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＣＴＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ６を用いた場合は、［ＣＣＴＧＡＴ］と［ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ７を用いた場合は、［ＣＣＣＴＣＧ］と［ＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ８を用いた場合は、［ＣＣＡＧＧＡ］と［ＧＧＴＡＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ９を用いた場合は、［ＣＣＴＡＣＧ］と［ＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＴＴＧ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１０を用いた場合は、［ＣＣＣＡＴＴ］と［ＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１１を用いた場合は、［ＣＣＡＧＣＴ］と［ＡＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡ］との間に、ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１＿Ｓ１２を用いた場合は、［ＣＣＣＴＧＧ］と［ＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣ］との間に、それぞれＤＮＡ二本鎖切断あるいはニックが生じると予想されている（図２Ａ～Ｈ及び配列番号：１～１４を参照のこと）。
【0054】
変異アリル上の［ＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］配列（アンダーラインは、１ヌクレオチド挿入変異）が、健常アリルの野生型配列を鋳型として相同染色体間組換えにより修正され、［ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］と修正された場合に、サイミジンキナーゼ活性が回復する。また、［ＣＣＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］、［ＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧ］といった、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断部位周辺での１ヌクレオチド欠失（ヌクレオチド欠失型）でもサイミジンキナーゼ活性は回復する（非特許文献１）。
【0055】
Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡの両者を発現するベクターを用いて、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡを発現させた。利用したベクターを以下に示す。
Ｖ１： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ２： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
Ｖ３： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ４： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
Ｖ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ６： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ７： ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ８： ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ９： ＰＸ４５９（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
サンプル＃１： Ｖ１＋Ｖ５
サンプル＃２： Ｖ１＋Ｖ４
サンプル＃３： Ｖ２＋Ｖ５
サンプル＃４： Ｖ２＋Ｖ４
サンプル＃５： Ｖ３＋Ｖ４
サンプル＃６： Ｖ３＋Ｖ５
サンプル＃７： Ｖ７＋Ｖ９
サンプル＃８： Ｖ８＋Ｖ９
各サンプルにおいてニックあるいはＤＮＡ二本鎖切断が入る位置を図３に示した。
Ｖ１： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ２： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２１ｓ
Ｖ３： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ４： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
Ｖ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ６： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ７： ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
Ｖ８： ＰＸ４５８（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
Ｖ９： ＰＸ４５９（Ｃａｓ９－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
サンプル＃１： Ｖ１＋Ｖ５
サンプル＃２： Ｖ１＋Ｖ４
サンプル＃３： Ｖ２＋Ｖ５
サンプル＃４： Ｖ２＋Ｖ４
サンプル＃５： Ｖ３＋Ｖ４
サンプル＃６： Ｖ３＋Ｖ５
サンプル＃７： Ｖ７＋Ｖ９
サンプル＃８： Ｖ８＋Ｖ９
各サンプルにおいてニックあるいはＤＮＡ二本鎖切断が入る位置を図３に示した。
【0056】
Ｂ．方法と結果
２種類のプラスミドをそれぞれ８μｇ、６００ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を１２０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１００μＬを１３５０Ｖ １０ｍｓ ３回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件１）。別の方法として、細胞濃度及びプラスミド濃度は維持したまま、１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１もしくはＰＸ４５８ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１０、２０、１００、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり０．５、又は１細胞となるように分注し、培養した。２週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
２種類のプラスミドをそれぞれ８μｇ、６００ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を１２０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１００μＬを１３５０Ｖ １０ｍｓ ３回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件１）。別の方法として、細胞濃度及びプラスミド濃度は維持したまま、１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１もしくはＰＸ４５８ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１０、２０、１００、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり０．５、又は１細胞となるように分注し、培養した。２週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
【0057】
ＣＨＡＴ培地中で、１ ｗｅｌｌあたりＡ個の細胞をまいた場合に、コロニーができたｗｅｌｌの割合（％）をＢとし、通常培地中で１ ｗｅｌｌあたりＣ個の細胞をまいた場合に、コロニーができたｗｅｌｌの割合（％）をＤとしたとき、編集成功率を下記のように算出した。
（Ｂ／Ａ）／（Ｄ／Ｃ）ｘ１００ （％）
結果を図４Ａ（エレクトロポレーション条件１）及び図４Ｂ（エレクトロポレーション条件２）に示す。標的遺伝子をＣａｓ９もしくはＣａｓ９ニッカーゼにより認識させない場合、ゲノム編集は起こらなかった（図３，４Ａ，４Ｂ、サンプル＃６，＃８）。修正対象とするヌクレオチド付近にＤＮＡ二本鎖切断を発生させた場合、サイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合は、５．４３±０．７７％に達するが、このうち相同染色体間組換えによるものは３．６６％にとどまり、９６．３％はヌクレオチド欠失が原因となっていた（図３，４Ａ、サンプル＃７及び表１）。
（Ｂ／Ａ）／（Ｄ／Ｃ）ｘ１００ （％）
結果を図４Ａ（エレクトロポレーション条件１）及び図４Ｂ（エレクトロポレーション条件２）に示す。標的遺伝子をＣａｓ９もしくはＣａｓ９ニッカーゼにより認識させない場合、ゲノム編集は起こらなかった（図３，４Ａ，４Ｂ、サンプル＃６，＃８）。修正対象とするヌクレオチド付近にＤＮＡ二本鎖切断を発生させた場合、サイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合は、５．４３±０．７７％に達するが、このうち相同染色体間組換えによるものは３．６６％にとどまり、９６．３％はヌクレオチド欠失が原因となっていた（図３，４Ａ、サンプル＃７及び表１）。
【0058】
【表1】
【0059】
一方、変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）と離れた部位（部位Ｂ）の２箇所及び健常アリルの部位Ｂの１箇所にニックを発生させると０．４６０±０．０５０％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復した（図３，４Ａ、サンプル＃２）。エレクトロポレーションの条件を変えると、この割合は１．０４±０．１０５％に向上した（図４Ｂ）。これらは、変異アリルの部位Ａに１箇所ニックを入れた場合（０．０５０２±０．０１１３％、図３，４Ａ、サンプル＃１）よりも修正効率が高かった。変異アリル、健常アリルともに、部位Ａ及び部位Ｂの２箇所にニックを発生させた場合にも０．５２２±０．０３５％の割合で遺伝子修正が行われた（図３，４Ａ、サンプル＃４）。
【0060】
次に、Ｓａｍｐｌｅ＃２及び＃７において、コロニーを形成した細胞におけるＴＫ１遺伝子のＩｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＤＮＡ断片をｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲにより増幅させた。Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲにはＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いた。プライマーとして［ＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧ（配列番号：３１）］［ＡＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＴＣ（配列番号：３２）］を用いた。ＰＣＲ断片は［ＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴ（配列番号：３３）］をプライマーとしてサンガーシーケンス法によるＤＮＡ配列解析を行った。編集前のＤＮＡシーケンス結果を図５Ａ、相同染色体間組換えによる修正が行われた細胞でのＤＮＡシーケンス結果を図５Ｂ、ヌクレオチド欠失となったＤＮＡシーケンスの例を図５Ｃ，Ｄに示した。変異アリルが野生型に修正された細胞の割合は、サンプル＃２では１００％（１１１クローン／１１１クローン）であった（表１）。
【0061】
［実施例２］ニック間の距離がゲノム編集効率に与える影響の検証
Ａ．材料
本実施例で利用したベクターを以下に示す。
ＶＮ１： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ３： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＶＮ４： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＮ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＳ１： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１
ＶＳ２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ２
ＶＳ３： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ３
ＶＳ４： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ４
ＶＳ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ５
ＶＳ６： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ６
ＶＳ７： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ７
ＶＳ８： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ８
ＶＳ９： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ９
ＶＳ１０： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１０
ＶＳ１１： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１１
ＶＳ１２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１２
上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
－３２２ｓ／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ３（３．０μｇ）
Ｓ１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１（３．０μｇ）
Ｓ２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ２（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）
Ｓ４／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ４（３．０μｇ）
Ｓ５／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）
Ｓ７／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ７（３．０μｇ）
Ｓ８／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ９／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ９（３．０μｇ）
Ｓ１０／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１０（３．０μｇ）
Ｓ１１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ１２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１２（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（４．５μｇ）
なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図６に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図７に示した。各サンプルにおいて、予想されるニック間の距離（図７における部位Ａと部位Ｂとの間の距離）及び切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
－３２２ｓ／２０ｓ：３４１ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ１／２０ｓ：８１７３ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ２／２０ｓ：５６７８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ３／２０ｓ：３９６４ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ４／２０ｓ：２３６９ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ５／２０ｓ：１３６７ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ６／２０ｓ：６０８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ７／２０ｓ：１３６ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ８／２０ｓ：１００４ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ９／２０ｓ：２３５３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１０／２０ｓ：４０４１ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１１／２０ｓ：６３３３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１２／２０ｓ：８６１２ｎｔ、パターン４（ｂ）、パターン７（ａ）
２０ｓ／ｅｍｐ．：ニックは一箇所のみ
ｅｍｐ．／ｅｍｐ．：ニックは発生しない
Ｂ．方法と結果
上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり４０、又は１００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
Ａ．材料
本実施例で利用したベクターを以下に示す。
ＶＮ１： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）２０ｓ
ＶＮ３： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１（ｅｘ４）－３２２ｓ
ＶＮ４： ＰＸ４６１（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＮ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ｅｍｐｔｙ
ＶＳ１： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１
ＶＳ２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ２
ＶＳ３： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ３
ＶＳ４： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ４
ＶＳ５： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ５
ＶＳ６： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ６
ＶＳ７： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ７
ＶＳ８： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ８
ＶＳ９： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ９
ＶＳ１０： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１０
ＶＳ１１： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１１
ＶＳ１２： ＰＸ４６２（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ－Ｐ２Ａ－ＰｕｒｏＲ）－ＴＳＣＥＲ２＿ＴＫ１－Ｓ１２
上記のベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
－３２２ｓ／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ３（３．０μｇ）
Ｓ１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１（３．０μｇ）
Ｓ２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ２（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）
Ｓ４／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ４（３．０μｇ）
Ｓ５／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）
Ｓ７／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ７（３．０μｇ）
Ｓ８／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ９／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ９（３．０μｇ）
Ｓ１０／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１０（３．０μｇ）
Ｓ１１／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ１２／２０ｓ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１２（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（４．５μｇ）
なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図６に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図７に示した。各サンプルにおいて、予想されるニック間の距離（図７における部位Ａと部位Ｂとの間の距離）及び切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
－３２２ｓ／２０ｓ：３４１ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ１／２０ｓ：８１７３ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ２／２０ｓ：５６７８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ３／２０ｓ：３９６４ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ４／２０ｓ：２３６９ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ５／２０ｓ：１３６７ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ６／２０ｓ：６０８ｎｔ、パターン２（ａ）
Ｓ７／２０ｓ：１３６ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ８／２０ｓ：１００４ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ９／２０ｓ：２３５３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１０／２０ｓ：４０４１ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１１／２０ｓ：６３３３ｎｔ、パターン４（ｂ）
Ｓ１２／２０ｓ：８６１２ｎｔ、パターン４（ｂ）、パターン７（ａ）
２０ｓ／ｅｍｐ．：ニックは一箇所のみ
ｅｍｐ．／ｅｍｐ．：ニックは発生しない
Ｂ．方法と結果
上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり４０、又は１００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
【0062】
結果を図６に示す。標的遺伝子をＣａｓ９ニッカーゼにより認識させない場合、ゲノム編集は起こらなかった（図６及び７のサンプル ｅｍｐ/ｅｍｐ）。変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）と離れた部位（部位Ｂ）の２箇所及び健常アリルの部位Ｂの１箇所にニックを発生させると０．２９４±０．０９８％～２．８２±０．０１０％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復し（図６及び７のサンプル －３２２ｓ／２０ｓ、Ｓ１／２０ｓ、Ｓ２／２０ｓ、Ｓ３／２０ｓ、Ｓ４／２０ｓ、Ｓ５／２０ｓ、Ｓ６／２０ｓ、Ｓ７／２０ｓ、Ｓ８／２０ｓ、Ｓ９／２０ｓ、Ｓ１０／２０ｓ、Ｓ１１／２０ｓ、Ｓ１２／２０ｓ）、すべてのサンプルにおいて、変異アリルの修正対象とするヌクレオチド付近（部位Ａ）にのみニックを発生させた場合（図６及び７のサンプル ２０ｓ/ｅｍｐ：０．０９１６±０．０４９８％の割合で細胞のサイミジンキナーゼ活性が回復）よりも修正効率が高かった。
【0063】
次に、Ｓａｍｐｌｅ Ｓ３／２０ｓ及びＳ１２／２０ｓにおいて、コロニーを形成した細胞におけるＴＫ１遺伝子のＩｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＤＮＡ断片及びＩｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域のＤＮＡ断片をｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲもしくは抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにより増幅させた。ゲノムＤＮＡ抽出には、カネカ簡易ＤＮＡ抽出キット Ｖｅｒｓｉｏｎ ２（Ｋａｎｅｋａ）を用いた。Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲにはＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いた。ゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲには、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域用のプライマーとして［ＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＡＧ（配列番号：３１）］［ＡＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＴＣ（配列番号：３２）］を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域用のプライマーとして［ＡＧＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＧＴＣＴ（配列番号：３４）］［ＡＴＧＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴ（配列番号：３５）］を用いた。Ｉｎｔｒｏｎ３～Ｉｎｔｒｏｎ４領域のＰＣＲ断片は［ＴＧＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴ（配列番号：３３）］を、Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域のＰＣＲ断片は［ＴＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号：３６）］をプライマーとして、サンガーシーケンス法によるＤＮＡ配列解析を行った。Ｉｎｔｒｏｎ４～Ｉｎｔｒｏｎ５領域の編集前のＤＮＡシーケンス結果を図８（ａ）、相同染色体間組換えにより、両アリルが野生型となった細胞でのＤＮＡシーケンス結果を図８（ｂ）に示した。
【0064】
サンプルＳ３／２０ｓ、Ｓ１２／２０ｓともに、Ｅｘｏｎ４及びＥｘｏｎ５にゲノム編集に伴う新たな変異の発生は認められなかった。サンプルＳ３／２０ｓでは、Ｅｘｏｎ４は９８．９％、Ｅｘｏｎ５は１．０６％が修正された。Ｅｘｏｎ４、Ｅｘｏｎ５がともに修正された細胞はなかった。サンプルＳ１２／２０ｓではＥｘｏｎ４は８３．２％、Ｅｘｏｎ５は３０．５％が修正された。Ｅｘｏｎ４、Ｅｘｏｎ５がともに修正された細胞は１３．７％であった（表２）。Ｅｘｏｎ５が修正されたすべての細胞において、Ｉｎｔｒｏｎ４に存在する３１ヌクレオチドの挿入変異も修正されていた。
【0065】
【表2】
【0066】
Ｓ１２／２０ｓのようなパターン（パターン７（ａ））により、Ｅｘｏｎ４の１ヌクレオチド挿入、Ｉｎｔｒｏｎ４の３１ヌクレオチド挿入、Ｅｘｏｎ５の１塩基置換と３箇所の変異を同時に修正することが可能であった。
【0067】
［実施例３］追加の一本鎖切断の導入によるゲノム編集効率への影響の検証
Ａ．材料
本実施例で利用したベクターを以下に示す。本実施例では、ベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（６．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（７．５μｇ）
なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図９に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１０に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：パターン５
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：パターン５
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ）
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ）
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：パターン４（ｂ）
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：パターン４（ｂ）
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが一箇所のみ
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが発生しない
Ｂ．方法と結果
上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり２０、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
Ａ．材料
本実施例で利用したベクターを以下に示す。本実施例では、ベクターを、以下の通り、組み合わせ、ＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ３（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ６（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ８（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＳ１１（３．０μｇ）＋ＶＮ５（３．０μｇ）
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ１（１．５μｇ）＋ＶＮ２（１．５μｇ）＋ＶＮ５（６．０μｇ）
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ＶＮ４（１．５μｇ）＋ＶＮ５（７．５μｇ）
なお、各ベクター由来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が標的とするゲノム上の位置を図９に示した。また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１０に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：パターン５
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ８：パターン５
Ｓ６／２０ｓ／Ｓ１１：パターン５
Ｓ３／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ）
Ｓ６／２０ｓ／ｅｍｐ：パターン２（ａ）
２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ：パターン４（ｂ）
２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐ：パターン４（ｂ）
２０ｓ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが一箇所のみ
ｅｍｐ／ｅｍｐ／ｅｍｐ：ニックが発生しない
Ｂ．方法と結果
上記リスト中に示した量の各プラスミドと、１５０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞を３０μＬのＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中で混合し、このうちの１０μＬを１３００Ｖ ２０ｍｓ ２回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件２）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、ＥＧＦＰ陽性細胞（ＰＸ４６１ベクターのトランスフェクションに成功した細胞）をＦＡＣＳＡｒｉａＩＩもしくはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩを用いてソートした。ソート後の細胞は１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で１日、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で５日間培養した。エレクトロポレーションから１－２週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり２０、又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
【0068】
結果を図９に示した。レシピエントアリルに２箇所、ドナーアリルに１箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／ｅｍｐ（２．６８±０．３７％）、サンプル２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐ（２．５９±０．１７％）と比較し、レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ８では、サイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合が５．０７±１．４７％と高効率であった。サンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ１１においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ３／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐよりも高く、サンプルＳ６／２０ｓ／Ｓ８においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ６／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ８／ｅｍｐよりも高く、また、サンプルＳ６／２０ｓ／Ｓ１１においてサイミジンキナーゼ活性を回復する細胞の割合もサンプルＳ６／２０ｓ／ｅｍｐ及びサンプル２０ｓ／Ｓ１１／ｅｍｐよりも高いことが示された。
【0069】
［実施例４］外来性ＤＮＡを利用しない複数ニック法によるゲノム編集効率の検証
Ａ．材料
図１１に示した領域（Ｓ３、２０ｓ、２９ｓ、Ｓ８）を標的とするｓｇＲＮＡもしくはヒトゲノム中には標的配列が存在しないｓｇＲＮＡ（ｎｏ）を、以下の通り組み合わせ、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ ｍＲＮＡとともにＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２０ｓ：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３：１００μＭを０．９μＬ
２０ｓ：１００μＭを０．９μＬ
２９ｓ：１００μＭを０．９μＬ
Ｓ８：１００μＭを０．９μＬ
ｎｏ：１００μＭを０．９μＬ
また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１２に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８： パターン５
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８： パターン６
Ｓ３／２０ｓ： パターン２（ａ）
２０ｓ／Ｓ８： パターン４（ｂ）
Ｓ３／Ｓ８： パターン１
Ｓ３：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
２０ｓ： ニックは一か所のみ
２９ｓ： ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
Ｓ８：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
ｎｏ： ニックは発生しない
Ｂ．方法と結果
ｓｇＲＮＡをそれぞれ上記リスト中に示した量、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）を１．８μＬ、７０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞にＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を加え、全体量を１４μＬとした。このうちの１０μＬを１５００Ｖ １０ｍｓ ３回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件３）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１０、３０、１００又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
Ａ．材料
図１１に示した領域（Ｓ３、２０ｓ、２９ｓ、Ｓ８）を標的とするｓｇＲＮＡもしくはヒトゲノム中には標的配列が存在しないｓｇＲＮＡ（ｎｏ）を、以下の通り組み合わせ、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ ｍＲＮＡとともにＴＳＣＥＲ２細胞に導入した。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．３μＬずつ
Ｓ３／２０ｓ：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
２０ｓ／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３／Ｓ８：それぞれ１００μＭを０．４５μＬずつ
Ｓ３：１００μＭを０．９μＬ
２０ｓ：１００μＭを０．９μＬ
２９ｓ：１００μＭを０．９μＬ
Ｓ８：１００μＭを０．９μＬ
ｎｏ：１００μＭを０．９μＬ
また、各サンプルにおいてニックが入る位置を図１２に示した。各サンプルにおける切断パターン（図１Ａ～Ｈ参照）は以下の通りである。
Ｓ３／２０ｓ／Ｓ８： パターン５
Ｓ３／２９ｓ／Ｓ８： パターン６
Ｓ３／２０ｓ： パターン２（ａ）
２０ｓ／Ｓ８： パターン４（ｂ）
Ｓ３／Ｓ８： パターン１
Ｓ３：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
２０ｓ： ニックは一か所のみ
２９ｓ： ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
Ｓ８：ニックは、ドナーアリルの塩基とレシピエントアリルの対応塩基に各一か所
ｎｏ： ニックは発生しない
Ｂ．方法と結果
ｓｇＲＮＡをそれぞれ上記リスト中に示した量、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）を１．８μＬ、７０ｘ１０４個のＴＳＣＥＲ２細胞にＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を加え、全体量を１４μＬとした。このうちの１０μＬを１５００Ｖ １０ｍｓ ３回の条件でＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによりエレクトロポレーションを行った（エレクトロポレーション条件３）。１０％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃ ５％ＣＯ２にてオーバーナイト培養し、その後、５％ 馬血清／ＲＰＭＩ１６４０培地中で間培養した。エレクトロポレーションから１週間後、細胞の一部をＣＨＡＴ培地（１０μＭ ２－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、２００μＭ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］、１００ｎＭ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ［Ｓｉｇｍａ］、及び１７．５μＭ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ［Ｓｉｇｍａ］））に移し、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１０、３０、１００又は２００細胞となるように分注し、培養を続けた。また、プレーティング効率測定のため、５％ 馬血清－ＲＰＭＩ１６４０培地中の細胞を、９６プレートに１ ｗｅｌｌあたり１細胞となるように分注し、培養した。２－３週間後、コロニーを形成したｗｅｌｌの割合を測定した。
【0070】
結果を図１１に示した。外来性ＤＮＡを一切用いず、また、セルソーターによる細胞選択を行わない条件下で、レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／２０ｓ／Ｓ８（図１Ｇパターン５）において、３．４６±０．３４％と高い効率でサイミジンキナーゼ活性が回復した。レシピエントアリルに３箇所、ドナーアリルに３箇所ニックが入るサンプルＳ３／２９ｓ／Ｓ８（図１Ｇパターン６）においても、２．６４±０．５８％の細胞でサイミジンキナーゼ活性が回復した。また、ニックが標的ヌクレオチドから１０００ｂｐ以上離れた位置に、レシピエントアリルに２箇所、ドナーアリルに２箇所ニックが入るサンプルＳ３／Ｓ８（図１Ａパターン１）では、１．５４±０．４０％と、レシピエントアリルに１箇所、ドナーアリルに１箇所ニックが入るサンプルＳ３（０．１３３±０．０２６％）、２９ｓ（０．８４４±０．３０５％）、Ｓ８（０．７７３±０．２２１％）、レシピエントアリルに１箇所入り、ドナーアリルにニックが入らないサンプル２０ｓ（０．１４７±０．０２２％）よりも高い効率でサイミジンキナーゼ活性が回復した。
【産業上の利用可能性】
【0071】
以上説明したように、本発明によれば、部位特異的ニッカーゼによる一本鎖切断により誘導された相同染色体間の相同組換えを利用して、相同染色体間で異なる塩基を、いずれかの塩基に統一することが可能である。外来のドナーＤＮＡを用いない本発明は、その安全性の高さから、特に、ヘテロ変異に起因する疾患の遺伝子治療に大きく貢献し得る。
【配列表フリーテキスト】
【0072】
配列番号：１５～３６
・人工的な配列
・人工的な配列
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】