特許 7426820 食後血糖値上昇抑制用組成物及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-25

(45)【発行日】2024-02-02

(54)【発明の名称】食後血糖値上昇抑制用組成物及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/125 20160101AFI20240126BHJP

   A23K 10/10 20160101ALI20240126BHJP

   A23K 20/163 20160101ALI20240126BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20240126BHJP

   A61K 31/715 20060101ALI20240126BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20240126BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240126BHJP

【ＦＩ】

A23L33/125

A23K10/10

A23K20/163

A23L2/00 F

A61K31/715

A61K35/747

A61P3/10

A23L2/52 101

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2019238369

(22)【出願日】2019-12-27

(65)【公開番号】P2021106503

(43)【公開日】2021-07-29

【審査請求日】2022-09-02

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-03090

(73)【特許権者】

【識別番号】711002926

【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】足立 典子

(72)【発明者】

【氏名】樋口 淳一

(72)【発明者】

【氏名】小川 哲弘

(72)【発明者】

【氏名】山口 敏幸

(72)【発明者】

【氏名】福留 博文

(72)【発明者】

【氏名】酒井 史彦

【審査官】川崎 良平

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－１４２２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００９／０６６６８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平０６－２１７７１３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｋ １０／００－４０／３５

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

Ａ６１Ｋ ３１／００－３６／９０６８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物。

【請求項2】

ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法であって、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株を培養する工程を含むことを特徴とする食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法。

【請求項3】

請求項１に記載の食後血糖値上昇抑制用組成物を含む、食後血糖値上昇抑制用食品組成物。

【請求項4】

請求項１に記載の食後血糖値上昇抑制用組成物を含む、食後血糖値上昇抑制用医薬組成物。

【請求項5】

請求項１に記載の食後血糖値上昇抑制用組成物を含む、食後血糖値上昇抑制用飼料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ）由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物に関する。また、本発明は、前記食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

厚生労働省の発表では、２０１５年の日本国内の糖尿病患者数は約３１６万人となり、糖尿病の疑いのあるヒトたちを含めると約２０００万人と報告されている。さらに、糖尿病は先進国のみならず発展途上国においても蔓延しており、世界的にもますます大きな問題となっている。
でんぷんやショ糖などの消化・吸収される糖質を摂取すると血糖値が上昇するが、正常な場合はインスリンのはたらきにより食後２時間経つと正常値（１１０ｍｇ／ｄＬ未満）に戻る。一方、糖尿病、または境界域のヒトでは、食後２時間でも血糖値が正常値に戻らない（食後高血糖）。そのような食後高血糖の状態が長く続くと、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中などの重症な合併症につながるリスクが高くなる。
したがって、食後の高血糖が糖尿病発症の危険因子であるだけでなく、心血管系疾患発症の危険因子と認識されている（非特許文献１）。

【0003】

食後の高血糖を抑制するために、様々な医薬品が開発されてきた。α－グリコシダーゼ阻害薬であるアカルボース（非特許文献２）やボグリボース（非特許文献３）は、食後高血糖を抑制する医薬品として糖尿病患者の治療に広く使用されている。
一方、正常、または境界域のヒトが糖尿病の発症リスクを下げるために、食後の高血糖を抑制する様々な食品成分やサプリメントなども開発されてきた。
でんぷん由来の食物繊維である難消化性デキストリンは、食事とともに摂取すると、食事に含まれる炭水化物（でんぷん、ショ糖）の吸収を遅延させ、食後血糖値の上昇を緩やかにすることが報告されている（非特許文献４）。また以前より、水溶性難消化性多糖類が、血糖値上昇抑制効果を有することが報告されてきた（非特許文献５）。しかし、水溶性難消化性多糖類であればどんなものでもよい訳ではなく、その効果を有する難消化性多糖類は全体の一部であり、それらが有する抑制効果と物性（粘性）との間には、関連性はないことも報告されてきた（非特許文献６）。

【0004】

様々な発酵食品に利用されている乳酸菌は、食品としての日持ち向上や風味付与だけではなく、ヒトの健康増進に大きく貢献することで注目されている。乳酸菌の中には多糖類を産生するものもあり、醗酵食品の物性付与や保健効果も有することが明らかとなっている。一方、乳酸菌が産生する多糖自身が血糖値上昇抑制効果を有するか否かは不明である。多糖産生性のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＦＣ株で調製した醗酵乳が、マウスの血糖値上昇を抑制することが報告されている。しかしながら、その効果が多糖類によるものかは明らかではない。また、多糖を産生するその他の菌種でも同様に効果があるのかは不明である（非特許文献７）。
既に報告されている食後血糖値上昇抑制効果を有する食品素材を醗酵食品などに添加すれば、期待される効果を有する食品を製造することは可能である。しかしながら、この場合は、もともとの発酵食品が保有する風味や物性に与える影響が大きくなり、配合設計する上で大きな制約となることが課題であった。また、外部から新たな食品素材を添加することは、コスト上の問題も発生していた。
我々は既に、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ） ＳＢＴ２１７１株が産生する多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物を見出している。当該菌株が産生する多糖を含む飲食品を食することで、食後血糖値の上昇を抑制することが可能となる。一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスが産生する多糖以外に乳酸菌が産生する多糖で食後血糖値上昇を抑制するものは存在しないため、例えば食後血糖値上昇を抑制する発酵乳を製造するには、ラクトバチルス・ヘルベティカスを使用するしか選択肢がなかった。発酵製品は使用する微生物によって製品の物性や風味が大きく異なるため、製品設計上は使用可能な微生物の選択肢が広がることが望まれる。
さらに、一般的な乳酸菌の多糖は高い粘性を有するため、それを利用した食品では物性が大きく変化してしまい、望ましい物性が得られなくなることも問題となっていた。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株が産生する多糖も高い粘性を有しており、それを用いた食品では粘度が高まる現象が見られる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２００５－２８９８４７

【非特許文献】

【0006】

【文献】門脇孝、2009、糖尿病：診断と治療の進歩、日本内科学会雑誌、98:717-724

【文献】坂本敬子、田嶼尚子、2005、〔-グルコシダーゼ阻害薬アカルボース、日本臨牀、63（増刊号2）：451-456

【文献】中村二郎、2005、〔-グルコシダーゼ阻害薬ボグリボース、日本臨牀、63（増刊号2）：457-461

【文献】若林茂、1992、難消化性デキストリンの耐糖能に及ぼす影響 第Ｉ報：消化吸収試験および糖負荷試験による検討、日本内分泌学会誌、68：623-635

【文献】Jenkins, DJ.ら、1977、Decrease in postprandial insulin and glucose concentrations by guar and pectin、Annals of Internal Medicine、86(1)：20-23

【文献】奥恒行、藤田温彦、細谷憲政、1983、グルコマンナン、プルランならびにセルロースの血糖上昇抑制効果の比較、日本栄養・食糧学会誌、36(4):301-303

【文献】Mori, M.,ら、Beneficial effect of viscous fermented milk on blood glucose and insulin responses to carbohydrates in mice and healthy volunteers: preventive geriatrics approach by “Slow Calorie”, 2012, Geriatrics, DOI:10.5772/35426

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、食後血糖値上昇を抑制する多糖を産生する唯一の乳酸菌であるラクトバチルス・ヘルベティカス以外の菌種で同様の効果を有する多糖を産生し、且つその多糖の粘度がラクトバチルス・ヘルベティカスが産生する多糖の粘度よりも低いという条件を満たすような多糖産生性の乳酸菌が期待されていた。そのような多糖類が見出せれば、その多糖類を産生する乳酸菌で発酵・製造した食品自身を食することで、食後の血糖値上昇抑制効果が期待できる。また、効果を有する多糖類の含有物や、乳酸菌の培養物、それらの処理物などを利用した新たな機能性食品の製造が可能となる。
本発明の課題は、食後血糖値の上昇を抑制する多糖類を産生する乳酸菌を見出し、当該乳酸菌が産生する多糖類の含有物、該乳酸菌の培養物、それらの処理物の少なくとも一つを含有することを特徴とする食後血糖値上昇抑制用組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ラクトバチルス・ヘルベティカス以外の菌種で食後血糖値上昇抑制効果を有する多糖を産生する乳酸菌を鋭意探索した結果、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ）由来の多糖類に有効性を見出した。本発明者らは、ラクトバチルス・ヘルベティカスに関しては、特願２０１８－１３１７２６号として既に特許出願を行っている。
すなわち、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスの培養物から多糖類を調製し、その多糖類と麦芽糖を含む溶液、または麦芽糖のみを含む溶液をマウスに経口投与した後、経時的に血糖値を測定した。その結果、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類と麦芽糖を含む溶液を投与したマウスでは、麦芽糖のみを含む溶液を投与したマウスと比較して投与後の血糖値の上昇が抑制された。
本発明者らは、前記特願２０１８－１３１７２６号において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＳＢＴ００９８等の数種の乳酸菌株に由来する多糖類に関して、食後血糖値上昇抑制効果が見受けられなかったことを報告している。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの亜種であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ由来の多糖類において、食後血糖値上昇抑制効果が見いだされたのは驚きである。
また、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類とラクトバチルス・ヘルベティカス由来の多糖類について、それらの水溶液の粘度を測定した結果、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類の方がラクトバチルス・ヘルベティカス由来の多糖類よりも顕著に粘度が低いことが明らかとなった。
このように、本発明者らはラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類が食後血糖値の上昇抑制効果を有することを見出した。さらに、すでに知られているラクトバチルス・ヘルベティカス由来の多糖類よりも食品への応用面で優れていることを見出した。本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物では、糖尿病の発症、重篤な合併症である心血管系疾患の発症、そしてメタボリックシンドロームの発症を予防、改善することができる。
したがって、本発明は、以下の通りである。
＜１＞ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物。
＜２＞ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスを培養する工程を含むことを特徴とする食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法。
＜３＞＜１＞に記載の食後血糖値上昇抑制用組成物を含む、食後血糖値上昇抑制用食品組成物、医薬組成物、及び飼料組成物。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、新たな食後血糖値上昇抑制用組成物として、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ２６６４由来の多糖類と麦芽糖をマウスに投与したときのマウスの血糖値の経時的な変化と曲線下面積である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用組成物、それを有する飲食品、医薬品について以下に詳細を説明する。

【0012】

（食後血糖値上昇抑制用組成物）
本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類を含む組成物を用いることができる。

【0013】

（食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法）
本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物の有効成分であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類の製造方法について説明する。
本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物の有効成分であるラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖類は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスを培養することによって得ることができる。
培養に用いる菌は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスに属する菌であればどのようなものでもよいが、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株が好ましい。ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株を利用した醗酵乳や乳酸菌飲料が製造可能であり、該乳酸菌の産生する多糖類を含む飲食品の製造が可能である。つまり、該乳酸菌の産生する多糖類を多く含有する飲食品を食することで、食後血糖値の上昇を抑制することも可能となる。ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス菌は、本発明の効果が得られる限りにおいて、単独で培養してもよく、他の菌と共培養してもよい。

【0014】

本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスの分泌物に含まれる多糖類を有効成分として用いる。多糖類とは、単糖類（グルコース及びマンノースなど）及び小糖類（二糖類、及びオリゴ糖など）以外の糖類を意味する。本明細書において「多糖類」には、多糖類に他の物質（タンパク質、脂質等）が結合しているものも含まれる。

【0015】

培養に用いる培地は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスに属する菌を培養できるものであればどのようなものでもよい。ヒトが摂取するのであれば食品由来成分からなるものが好ましく、また、培養により得られた多糖類の純度を調整して用いる場合は、固体培地よりも液体培地が好ましい。
培養条件は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスに属する菌が多糖を産生するような条件であればどのようなものでもよい。後述する多糖の定量法と組み合わせて、得ようとする多糖の量や培養設備に応じて所望の条件を設定すれば良い。具体的には、培養温度は、例えば２０℃～５５℃、２０℃～５０℃、又は２０℃～４５℃である。培養時間は、例えば１時間～1週間、４時間～７２時間、又は８時間～４８時間である。培養速度及び製造効率の観点から、２０℃～５０℃で４時間～７２時間、好ましくは２０℃～４５℃で８時間～４８時間培養することが好ましい。

【0016】

以下に、食後血糖値上昇抑制用組成物に用いる多糖類の製造方法を説明する。以下では、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスに属する菌としてラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４、培地として脱脂乳培地を用い、得られた多糖を精製する態様を一例として示す。

【0017】

滅菌した脱脂乳にラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４を接種し、３７℃で１６時間培養する。培養物にトリクロロ酢酸を最終濃度１０％となるように添加し、１時間、室温で攪拌する。遠心によって得た上清に２倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置する。遠心によって得られた沈殿物を冷７０％エタノールで２回洗浄した後、沈殿物を超純水に溶解し、３日間超純水に対して透析する。透析内液にＤＮａｓｅ Ｉと ＲＮａｓｅを添加し、３７℃で６時間インキュベートすることで含まれる核酸を分解する。続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加して３７℃で１６時間インキュベートし、含まれるタンパク質を分解する。加熱処理により酵素を不活性化し、遠心によって不溶物を除去した後に２倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置する。遠心によって得られた沈殿物を冷７０％エタノールで２回洗浄した後、超純水に溶解し、３日間透析する。透析内液の凍結乾燥で得られた粉末が、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４の産生する多糖類である。
得られた多糖類の糖含量は、一般的な糖含量の測定に用いられるフェノール硫酸法により測定できる。

【0018】

（食後血糖値上昇抑制効果の評価）
本発明のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス由来の多糖による食後血糖値上昇抑制効果は、でんぷん、マルトデキストリン、麦芽糖、ショ糖、乳糖、ブドウ糖、果糖ブドウ糖液糖のうちいずれかを投与した場合と、これら糖質のうちいずれかと該乳酸菌の多糖類を投与した場合における血糖値の経時的な変化、または得られた血糖値の経時的な変化（曲線）から求められる曲線下面積を比較し、多糖類の投与により血糖値の上昇が抑制された場合に、本発明の食後血糖値上昇抑制効果があると評価することができる。

【0019】

上述のとおり、本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス培養することにより得ることができるが、培養されたものをそのまま本発明の有効成分として用いても、培養物中の多糖類の純度を所望のものに調製したうえで用いることもできる。すなわち、本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティス菌体（生菌体又は死菌体）と共に用いてもよく、又は多糖類のみを抽出して飲食品、飼料等に添加することもできる。

【0020】

製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥するほか、加熱乾燥して粉末にしてもよい。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスが産生する多糖の血糖値上昇抑制効果を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを食前または食事とともに経口的に投与することが望ましい。

【0021】

本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、食前食後または食事とともに、例えば食前６０分～食後５分の間に摂取することで、食後血糖値上昇抑制効果を達成し得るので、血糖値上昇抑制用飲食品としても使用することができる。本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、食後血糖値上昇抑制用飲食品として食事とともに経口投与することが好ましい。また、血糖値を上昇させる糖分などの栄養素・成分と予め混合して用いることが好ましい。本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスをスターターとして含む発酵乳又はチーズのように内部において有効成分である多糖類を発生させる飲食品と、多糖類を外部から添加する飲食品の両方を含む。本発明の食後血糖値上昇抑制用飲食品の形態としては、食後の血糖値の上昇抑制効果を妨げない範囲でどのようなものでもよく、当該乳酸菌の産生した多糖類自体、および当該乳酸菌の培養物、培養して得られた醗酵乳、チーズ自体、さらにこれらの多糖類、醗酵乳、チーズなどを素材として使用し、パンやスナック菓子、ケーキ、プリンなどにしてもよく、飲料、発酵乳、麺類、ソーセージなどの飲食品、さらには、各種粉乳のほか、乳幼児食品、栄養組成物などに配合することも可能である。

【0022】

本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物の効果を発揮させるためには、成人の場合、該乳酸菌の産生した多糖類の量として０．０１～１０ｇ摂取を食前または食事とともに摂取することが望ましい。例えば、液体の場合には、０．１～２５０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましく、固体の場合には、０．１～５００ｍｇ／ｇとすることが好ましい。また、本発明の血糖値上昇抑制用組成物を配合して、医薬品に使用する場合も一日の投与量にあわせて適宜調節すればよい。乳酸菌の産生する多糖類は、古来、醗酵乳やチーズに含まれるものであり、本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は安全性に問題は無いという特徴がある。

【0023】

本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物では、好ましくは、食後１５分まで、食後３０分まで、食後６０分まで、又は食後１２０分までの血糖値上昇レベルを有意に抑制することができる。本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、好ましくは、食後３０分時点において、食後血糖値上昇抑制用組成物を投与した対象において、投与しなかった対象と比較して、血漿中グルコース濃度を５分の４以下に抑制することができる。本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、好ましくは、食後血糖値上昇抑制用組成物を投与した健康な対象において、投与３０分後であっても血漿中グルコース濃度を正常値（１４０ｍｇ／ｄＬ未満）に維持することができる。

【0024】

本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、安全性に問題は無く、どのような対象に対しても投与することが可能である。例えば、乳児、幼児、未成年、成人、及び６５歳以上の高齢者等に対して投与することができる。また、健常人に対しても投与することができるが、糖尿病や心血管系疾患発症を発症する可能性のある対象又は既に発症している対象に対しても投与することができる。ヒト以外の動物には、飼料として与えることも可能である。
本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物は、以下の測定条件で粘度を測定した場合、１０ｃｐ以下であることができる。
・本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物を水に溶解して０．５質量％溶液とする
・測定直前まで３７℃の恒温器内に静置する。
・Ｂ型粘度計（東機産業社製：ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ ＴＶＢ－１０）を用いて粘度を測定する。ローターはＳｐｉｎｄｌｅ Ｎｏ．Ｍ２（推奨粘度範囲：１０～１０００ｃＰ）を用い、回転速度６０ｒｐｍで３０秒後の粘度を３７℃で測定する。

【0025】

（食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法）
本発明の食後血糖値上昇抑制用組成物の製造方法は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスを培養する工程を含む。培養後、必要に応じて、産生された多糖類を抽出して食後血糖値上昇抑制用組成物を得る工程及び／又は産生された多糖類を濃縮する工程等を含んでもよい。

【0026】

本発明の実施態様である実施例を用いて、以下に本発明を説明する。本発明は、以下の実施態様に限定されるものではない。なお、特に説明のない限り、％は質量％を示す。

【0027】

〔実施例１〕乳酸菌の産生する多糖類の調製方法
前培養したラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスの培養物を１０００ｍＬの脱脂乳に３％播種し、３７℃で１６時間培養した。培養後、培養物に１００％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸（Ｗａｋｏ）を最終濃度１０％となるように添加し、１時間、室温で攪拌した。遠心（１８，４８０×ｇ，１０ｍｉｎ，１０℃）によって得た上清に２倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置した。遠心（５，２５１×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）によって得られた沈殿物を冷７０％エタノールで２回洗浄した後、沈殿物を超純水に溶解し、３日間透析（スペクトラ／ポア６、ＭＷＣＯ３．５－５ｋＤａ）した。終濃度２μｇ／ｍＬ（１ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））となるようにＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社製； ＃１１ ２８４ ９３２ ００１）とＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製；Ｒ４８７５－１００ＭＧ）を添加して、３７℃で６時間インキュベートした。続いて、終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるようにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ社製； Ｐ６５５６－１００ＭＧ）を添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。９０℃、１０分間の加熱処理により酵素を不活性化した後に遠心（４７，９００×ｇ，１０ｍｉｎ，１０℃）によって不溶物を除いた。上清に２倍量の冷エタノールを加え、４℃で一晩静置した。遠心（５，２５１×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）によって得られた沈殿物を冷７０％エタノールで２回洗浄した後、超純水に溶解し、３日間透析した。透析内液を凍結乾燥し、多糖類を得た。得られた多糖類の糖含量は、フェノール硫酸法によってブドウ糖換算で測定した。

【0028】

〔試験例１〕乳酸菌・ビフィズス菌の産生する多糖溶液の粘度測定
２５ｍＬチューブ（ＩＷＡＫＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３６３－０２５）に各０．５％多糖溶液を入れ、測定直前まで３７℃の恒温器内に静置した。多糖溶液の粘度は、Ｂ型粘度計（東機産業社製：ＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ ＴＶＢ－１０）を用いて測定した。ローターはＳｐｉｎｄｌｅ Ｎｏ．Ｍ２（推奨粘度範囲：１０～１０００ｃＰ）を用い、回転速度６０ｒｐｍで３０秒後の粘度を３７℃で測定した。結果は表１に示した。

【表1】

【0029】

〔試験例２〕多糖の食後血糖値上昇抑制効果の評価方法
ＩＣＲマウス（７～１２週齢、オス：日本クレア社）を試験前日から１６時間絶食させ、試験当日の絶食時体重に群間で差がないように２群に分けた（ｎ＝１２／群）。コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）には麦芽糖溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）を１０μｌ／ｇマウス体重で投与し、多糖類投与群にはマルトース溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ）と多糖溶液（１５ ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を１０μｌ／ｇマウス体重で投与した。採血はガラス毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，２－０００－０４４－Ｈ，ヘパリンコート済）を用いて尾静脈から０ｍｉｎ（絶食時）および糖負荷後１５，３０，６０，１２０，１８０ｍｉｎと経時的に採取した。血液を遠心し、血漿中のグルコース濃度をグルコースＣＩＩ－テストワコー（Ｗａｋｏ）を用いて測定した。結果を図１に示す。

【0030】

ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株由来の多糖類と麦芽糖の混合液、または麦芽糖のみの溶液をマウスに経口投与した結果、投与１５分、３０分、および１２０分後の血糖値の上昇レベルは、多糖類の投与により統計的に有意に抑制された。また、曲線下面積（iＡＵＣ）についても、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株由来の多糖を投与したほうが、多糖を投与しない場合よりも有意に低下した。これらの結果から、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４株由来の多糖類は、麦芽糖投与後の血糖値の上昇を抑制する効果があることが明らかとなった。

【0031】

〔実施例２〕サプリメントの製造
実施例１で得られた多糖類粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の食後血糖値上昇抑制用サプリメントを製造した。

【0032】

〔実施例３〕飲料の製造
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の食後血糖値上昇抑制用飲料を製造した。

【表2】

【0033】

〔実施例４〕医薬品（カプセル剤）の製造
表３に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明の食後血糖値上昇抑制用医薬品を含むカプセル剤を製造した。

【0034】

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0035】

本発明によれば、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４由来の多糖類を有効成分とする新たな食後血糖値上昇抑制用組成物、及び該多糖類を有効成分とする食後血糖値上昇抑制用飲食品又は医薬品を提供することが可能となった。

【受託番号】

【0036】

[寄託生物材料への言及]
（１）ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ラクティスＳＢＴ２６６４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ）ＳＢＴ２６６４株
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
２０１９年１２月１７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
ＮＩＴＥ ＡＰ－０３０９０（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターより、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ ＳＢＴ２６６４株をＮＩＴＥ ＡＰ－０３０９０として受領した旨を通知する受領書を、２０１９年１２月１７日に受領した。）

【図1】