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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-08
(45)【発行日】2024-02-19
(54)【発明の名称】細胞分化方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240209BHJP
C12N 1/02 20060101ALI20240209BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240209BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N1/02
C12M3/00 A
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019093574
(22)【出願日】2019-05-17
(65)【公開番号】P2020184969
(43)【公開日】2020-11-19
【審査請求日】2022-04-18
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】平床 聖也
(72)【発明者】
【氏名】今富 伸哉
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 博之
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１７４９１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０１９７０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－１１７３５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－２３１７８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０３３７４２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｍ ３／００－ ３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
幹細胞を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示す培養器材上で未分化状態を維持しながら前培養する工程と、前記培養器材をＬＣＳＴ以下に冷却して前培養後の幹細胞を剥離・回収する工程と、
回収した前記前培養後の幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養する工程と、
を含んでなる幹細胞の分化方法であって、
前記培養器材の器材表面に、ＬＣＳＴを示す温度応答性ブロック共重合体が被覆されてあり、
前記温度応答性ブロック共重合体が２－メトキシエチルアクリレートの繰返し単位と、ｎ－ブチルアクリレートの繰返し単位と、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドの繰返し単位を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記幹細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記幹細胞が軟骨細胞に分化することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞分化方法に関する。
【背景技術】
【0002】
幹細胞は自己をほぼ際限なく増やすことのできる自己複製能と様々な細胞に分化することのできる多分化能を持つことから再生医療分野への応用が期待されている。幹細胞を移植などの再生医療に応用するためには、一般的に体内に存在する幹細胞、又は体外で作製した幹細胞を細胞培養容器等で拡大培養し、培養容器上で目的細胞へ分化させる必要がある。培養容器上での幹細胞の分化は、従来、目的細胞への分化に適した分化誘導因子を添加した分化誘導培地で培養する方法で行われている（例えば、特許文献１参照）。しかし、分化誘導培地による分化誘導のみでは分化にかかる日数が長く、再生医療に必要な目的の分化細胞を十分量得るのが困難な状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０００－２８７６８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、細胞分化効率の優れた細胞分化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。
すなわち本発明の一態様は、
幹細胞を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示す培養器材上で培養する工程と、前記培養器材をＬＣＳＴ以下に冷却して前記幹細胞を剥離・回収する工程と、回収した前記幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養する工程と、を含んでなる幹細胞の分化方法である。
すなわち本発明の一態様は、
幹細胞を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示す培養器材上で培養する工程と、前記培養器材をＬＣＳＴ以下に冷却して前記幹細胞を剥離・回収する工程と、回収した前記幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養する工程と、を含んでなる幹細胞の分化方法である。
【発明の効果】
【0006】
本発明は、従来の幹細胞の分化方法に比べ、分化を促進できる。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【0008】
幹細胞とは、未分化状態で増殖できる自己複製能と別の種類の細胞に分化する能力を持っていれば特に限定はされず、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞又は各組織の前駆細胞などが挙げられ、間葉系幹細胞は特に好適に用いられる。
【0009】
間葉系幹細胞とは、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞並びにその前駆細胞の集団を意味する。間葉系幹細胞の由来として特に限定は無いが、骨髄、脂肪、歯髄、臍帯血、胎盤、滑膜などの組織由来やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞由来が挙げられ、特に骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。また、間葉系幹細胞の由来種にも特に限定は無く、ヒト、動物、植物であってもよい。
【0010】
幹細胞の分化誘導とは、幹細胞を未分化状態から分化を開始させることであり、未分化状態から、未分化状態では検出されない分化細胞特異的な分化マーカーが検出され得る状態とすることを含む。上述した分化マーカー及びその検出方法は適宜選択すればよいが、例えば、細胞膜に存在する糖、タンパク質などの細胞表面マーカー、細胞内に存在するｍＲＮＡ、タンパク質、酵素などの細胞内マーカー、細胞外に分泌されるペプチド、タンパク質、酵素、化合物などの細胞外マーカーなどが分化マーカーとして挙げられ、標識抗体を用いる方法（染色法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなど）、酵素活性を利用した染色法、ＲＴ－ＰＣＲ法などが検出方法として挙げられる。例えば、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化では、分化誘導により形成された軟骨細胞より分泌される細胞外基質を、アルシアンブルーを用いて染色することにより確認できる。
【0011】
下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解して透明の溶液になるが、この温度よりも高い温度では不溶化して白濁するか沈殿が生じ、相分離する温度である。本願明細書ではＬＣＳＴを示すことを、温度応答性を有するということがある。ＬＣＳＴは２０℃～４０℃の範囲にあることが好ましく、３０℃～４０℃の範囲にあることがさらに好ましい。ＬＣＳＴを示す繰返し単位とその水に対するＬＣＳＴは、例えば、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、又はＮ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）等が例示できる。ＬＣＳＴは水溶液の濃度で発現する温度が前後するが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドはＬＣＳＴ発現の濃度依存性が低いため好ましい。本発明におけるＬＣＳＴを示す培養器材に用いる繰返し単位は、１種類のみでもよく、２種類以上を組み合わせてあってもよい。また温度応答性を有するのであれば、ＬＣＳＴを示す繰返し単位の他に、異なる繰返し単位を含んでも良い。
【0012】
培養器材は、その製造方法に特に限定は無く、例えばＬＣＳＴを示す繰返し単位を電子線照射で重合して器材表面に被覆する方法、ＬＣＳＴを示す繰返し単位を含有する重合体を溶媒に溶解させた表面処理剤を器材に塗布して、膜を被覆する方法が挙げられる。前記重合体は特に限定は無いがその合成方法としては、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１～２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。培養器材を用いて培養・増殖した細胞は、一般的にトリプシンのようなタンパク質分解酵素により処理することで容器表面から剥離・回収する必要があるが、ＬＣＳＴを示す培養器材を用いることで周囲環境の温度降下による温度応答性重合体のゾル転移で器材表面の接着力を弱めて、タンパク質分解酵素を使わずに細胞を剥離させ、回収することができる。
【0013】
ＬＣＳＴを示す繰返し単位を含有する重合体の膜を用いる場合は、膜を構成する重合体の成分として、ＬＣＳＴを示す繰返し単位の他に膜を器材に固定するための繰返し単位を含むことが好ましい。例えばスチレンやその誘導体、２－メトキシエチルアクリレート、ｎ－プロピルアクリレート、ｎ－プロピルメタクリレート、ｎ－ブチルアクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート等を例示でき、２－メトキシエチルアクリレートの繰返し単位とｎ－ブチルアクリレートの繰返し単位とＮ－イソプロピルアクリルアミドの繰返し単位とを含んでなるブロック共重合体が特に好ましい。
【0014】
培養器材の形状は特に限定は無く、ディッシュ、フラスコ、マイクロウエルプレート、培養バッグ、チューブ、トレイ、培養槽などが挙げられる。これらの器材の材質も、特に限定されず、ガラスやポリプロピレン、ポリスチレン、ステンレスなどやそれらの組み合わせが挙げられる。
【0015】
培養器材表面には細胞外マトリックスを被覆してもよい。細胞外マトリックスの種類は特に限定は無く、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、又はラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドジェン１，２等を主成分として含有するマトリゲルを用いてもよく、これらを１種類のみでもよく、２種類以上を組み合わせてあってもよい。また、これら細胞外マトリックスのセグメントであってもよい。
【0016】
本発明の分化方法は以下の工程を含むことを特徴とする。
幹細胞を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示す培養器材上で培養する工程（以下、（Ａ）工程という。）
前記培養器材をＬＣＳＴ以下に冷却して前記幹細胞を剥離・回収する工程（以下、（Ｂ）工程という。）
回収した幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養する工程（以下、（Ｃ）工程という。）
幹細胞を、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示す培養器材上で培養する工程（以下、（Ａ）工程という。）
前記培養器材をＬＣＳＴ以下に冷却して前記幹細胞を剥離・回収する工程（以下、（Ｂ）工程という。）
回収した幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養する工程（以下、（Ｃ）工程という。）
【0017】
１．（Ａ）工程について
使用される培地の組成については、幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無く、基礎培地と血清からなり、抗生物質が含まれていても良い。基礎培地の種類は特に限定はなく、例えば、ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１０、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＲＰＭＩ１６４０などを用いることができる。血清の種類は特に限定はなく、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用されるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。培地中の血清濃度は特に限定はない。費用体効果から一般的には２０ｖｏｌ％以下の濃度で用いられることが多いが、２０ｖｏｌ％超の濃度であっても良い。また、未処理又は未精製の血清をいずれも含まず、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する無血清培地であってもよい。
細胞培養は、培養器材の表面に被覆された温度応答性重合体のＬＣＳＴよりも高い温度で行われるが、ヒト由来細胞を用いる場合は、高い培養効率を得ることを目的に体温付近で行うことが好ましく、３５～３９℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３６～３８℃の温度範囲で行うことがさらに好ましい。
幹細胞の培養密度は、幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無いが、間葉系幹細胞の場合では、例えば１．０×１０１～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、１．０×１０２～１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましい。その他の培養条件は特に限定されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってよい。
使用される培地の組成については、幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無く、基礎培地と血清からなり、抗生物質が含まれていても良い。基礎培地の種類は特に限定はなく、例えば、ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１２、Ｈａｍ’ｓＦ－１０、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＲＰＭＩ１６４０などを用いることができる。血清の種類は特に限定はなく、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用されるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。培地中の血清濃度は特に限定はない。費用体効果から一般的には２０ｖｏｌ％以下の濃度で用いられることが多いが、２０ｖｏｌ％超の濃度であっても良い。また、未処理又は未精製の血清をいずれも含まず、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する無血清培地であってもよい。
細胞培養は、培養器材の表面に被覆された温度応答性重合体のＬＣＳＴよりも高い温度で行われるが、ヒト由来細胞を用いる場合は、高い培養効率を得ることを目的に体温付近で行うことが好ましく、３５～３９℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３６～３８℃の温度範囲で行うことがさらに好ましい。
幹細胞の培養密度は、幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無いが、間葉系幹細胞の場合では、例えば１．０×１０１～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、１．０×１０２～１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましい。その他の培養条件は特に限定されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってよい。
【0018】
２．（Ｂ）工程について
培養器材から幹細胞を剥離・回収する方法は、周囲の温度を培養器材のＬＣＳＴよりも低い温度に変化させた後、細胞の自然剥離を待つ方法、タッピングや振盪による方法、細胞に局所的に衝撃を与える方法、セルスクレーパーを用いた方法、ピペッティング等を用いることができる。培養器材の冷却時の温度はＬＣＳＴから１℃以上低温であることが好ましい。温度を降下させる方法としては冷所保管、温かい培地を抜き取った後に冷却した液体を注ぐ方法が例示される。冷却した液体に特に限定はなく、培養液やその他の培地溶液、等張液など目的に応じて選択することができる。また、冷却時間は、５分以上６０分以下が好ましい。
培養器材から幹細胞を剥離・回収する方法は、周囲の温度を培養器材のＬＣＳＴよりも低い温度に変化させた後、細胞の自然剥離を待つ方法、タッピングや振盪による方法、細胞に局所的に衝撃を与える方法、セルスクレーパーを用いた方法、ピペッティング等を用いることができる。培養器材の冷却時の温度はＬＣＳＴから１℃以上低温であることが好ましい。温度を降下させる方法としては冷所保管、温かい培地を抜き取った後に冷却した液体を注ぐ方法が例示される。冷却した液体に特に限定はなく、培養液やその他の培地溶液、等張液など目的に応じて選択することができる。また、冷却時間は、５分以上６０分以下が好ましい。
【0019】
３．（Ｃ）工程について
用いる培養器材は特に限定は無く、培養器材表面に温度応答性重合体を被覆していてもよいし、していなくてもよい。
分化誘導培地の組成は特に限定は無く、基礎培地と血清に加え、幹細胞を目的細胞へ分化させる、分化誘導因子からなり、抗生物質が含まれていても良い。基礎培地の種類は特に限定はなく、上述した（Ａ）工程で用いられるような培地を用いることができる。培養細胞を目的細胞へ分化させる分化誘導因子としては繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＦＧ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）などがあるが、幹細胞の目的細胞への分化方法に応じて適宜選択すればよい。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えばＴＧＦ－β、ＩＧＦ、ＩＬ、デキサメサゾン、ＢＭＰなどが挙げられる。また、目的細胞に分化させるための市販の分化誘導培地を用いてもよい。市販の分化誘導培地は、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えば Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（株）製）が挙げられる。
分化方法は（Ｂ）工程で剥離・回収した幹細胞を用いれば特に限定は無く、当分野において通常行われる条件下で分化誘導を行ってよい。また、接着培養、浮遊培養、アテロコラーゲンなどのスキャホールドを用いた３次元培養など目的に応じて選択することができる。
分化誘導培地で細胞の分化を誘導する前に、幹細胞を培養し増殖させる工程を含んでいてもよい。当該工程で用いる培地は（Ａ）工程で用いる培地と同様に幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無く、基礎培地と血清からなり、抗生物質が含まれていても良い。
幹細胞の培養密度は、幹細胞が目的細胞への分化を阻害しなければよく、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えば、１．０×１０１～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、１．０×１０４～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましい。
分化誘導を行った細胞の分化状態の評価方法は特に限定は無いが、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞へ分化では、分化誘導により形成された軟骨細胞が分泌した細胞外基質を、アルシアンブルーを用いて染色することにより確認できる。
用いる培養器材は特に限定は無く、培養器材表面に温度応答性重合体を被覆していてもよいし、していなくてもよい。
分化誘導培地の組成は特に限定は無く、基礎培地と血清に加え、幹細胞を目的細胞へ分化させる、分化誘導因子からなり、抗生物質が含まれていても良い。基礎培地の種類は特に限定はなく、上述した（Ａ）工程で用いられるような培地を用いることができる。培養細胞を目的細胞へ分化させる分化誘導因子としては繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＦＧ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）などがあるが、幹細胞の目的細胞への分化方法に応じて適宜選択すればよい。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えばＴＧＦ－β、ＩＧＦ、ＩＬ、デキサメサゾン、ＢＭＰなどが挙げられる。また、目的細胞に分化させるための市販の分化誘導培地を用いてもよい。市販の分化誘導培地は、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えば Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（株）製）が挙げられる。
分化方法は（Ｂ）工程で剥離・回収した幹細胞を用いれば特に限定は無く、当分野において通常行われる条件下で分化誘導を行ってよい。また、接着培養、浮遊培養、アテロコラーゲンなどのスキャホールドを用いた３次元培養など目的に応じて選択することができる。
分化誘導培地で細胞の分化を誘導する前に、幹細胞を培養し増殖させる工程を含んでいてもよい。当該工程で用いる培地は（Ａ）工程で用いる培地と同様に幹細胞が目的細胞への分化能を維持したまま接着・増殖すれば特に限定は無く、基礎培地と血清からなり、抗生物質が含まれていても良い。
幹細胞の培養密度は、幹細胞が目的細胞への分化を阻害しなければよく、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化の場合では、例えば、１．０×１０１～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、１．０×１０４～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましい。
分化誘導を行った細胞の分化状態の評価方法は特に限定は無いが、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞へ分化では、分化誘導により形成された軟骨細胞が分泌した細胞外基質を、アルシアンブルーを用いて染色することにより確認できる。
【実施例】
【0020】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
【0021】
＜ブロック共重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名：ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ／Ｌ１）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名：ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ／Ｌ１）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
【0022】
＜ブロック共重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー製ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー製ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
【0023】
＜ブロック共重合体の合成例＞
２００ｍＬ２口フラスコに２－メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）０．６５０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加え、さらにシアノメチルドデシルトリチオカルボナトを３１．８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール１０ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
１回目の加熱撹拌後、ｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ）３．８４５ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
２回目の加熱撹拌後、上記にＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ ＬＣＳＴ＝３２℃）７．３５５ｇ（６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール８５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
３回目の加熱撹拌後、反応液を水で再沈精製し、減圧乾燥することで黄色固体を得た。得られた黄色固体をクロロホルムに溶解し、分液ロートを用いクロロホルム相を回収した。回収したクロロホルム相をエバポレーターで濃縮し、ヘプタンで再沈精製した。沈殿物をろ過で回収し、減圧乾燥することで、ブロック共重合体ｐｏｌｙ（ＭＥＡ－ＢＡ－ＩＰＡＡｍ）を８．２９５ｇ得た。得られたブロック共重合体の組成はＭＥＡ：ＢＡ：ＩＰＡＡｍ＝５：３０：６５（ｍｏｌ％）、Ｍｎは１１．８×１０４、Ｍｗ／Ｍｎは１．４５であった。
２００ｍＬ２口フラスコに２－メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）０．６５０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加え、さらにシアノメチルドデシルトリチオカルボナトを３１．８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール１０ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
１回目の加熱撹拌後、ｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ）３．８４５ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
２回目の加熱撹拌後、上記にＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ ＬＣＳＴ＝３２℃）７．３５５ｇ（６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルアルコール８５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
３回目の加熱撹拌後、反応液を水で再沈精製し、減圧乾燥することで黄色固体を得た。得られた黄色固体をクロロホルムに溶解し、分液ロートを用いクロロホルム相を回収した。回収したクロロホルム相をエバポレーターで濃縮し、ヘプタンで再沈精製した。沈殿物をろ過で回収し、減圧乾燥することで、ブロック共重合体ｐｏｌｙ（ＭＥＡ－ＢＡ－ＩＰＡＡｍ）を８．２９５ｇ得た。得られたブロック共重合体の組成はＭＥＡ：ＢＡ：ＩＰＡＡｍ＝５：３０：６５（ｍｏｌ％）、Ｍｎは１１．８×１０４、Ｍｗ／Ｍｎは１．４５であった。
【0024】
＜表面処理剤の調製＞
ブロック共重合体９０ｍｇに２－メトキシエタノールを１９．９１０ｇ添加し、撹拌で全て溶解させ、ブロック共重合体の０．４５ｗｔ％表面処理剤を調製した。
ブロック共重合体９０ｍｇに２－メトキシエタノールを１９．９１０ｇ添加し、撹拌で全て溶解させ、ブロック共重合体の０．４５ｗｔ％表面処理剤を調製した。
【0025】
＜培養器材の調製＞
ＩＷＡＫＩ組織培養用ディッシュ（φ６ｃｍ）の中央に表面処理剤を１００μＬ加え、スピンコータ―（ミカサ製、商品名ＭＳ－Ｂ２００）を用いて、回転数３，０００ｒｐｍ、回転時間６０秒の条件でスピンコートすることでブロック共重合体をコートした培養器材を調製した。この器材表面のブロック共重合体の被覆量を全反射型フーリエ変換型赤外分光（ＡＴＲ／ＦＴ－ＩＲ）法により測定した所、温度応答性ブロック分として０．５５μｇ／ｃｍ２であった。
ＩＷＡＫＩ組織培養用ディッシュ（φ６ｃｍ）の中央に表面処理剤を１００μＬ加え、スピンコータ―（ミカサ製、商品名ＭＳ－Ｂ２００）を用いて、回転数３，０００ｒｐｍ、回転時間６０秒の条件でスピンコートすることでブロック共重合体をコートした培養器材を調製した。この器材表面のブロック共重合体の被覆量を全反射型フーリエ変換型赤外分光（ＡＴＲ／ＦＴ－ＩＲ）法により測定した所、温度応答性ブロック分として０．５５μｇ／ｃｍ２であった。
【0026】
実施例１
培養器材に、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ロンザジャパン（株）製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ：ＰＴ－２５０１、Ｌｏｔ Ｎｕｍｂｅｒ：００００６０３５２５）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液にはウシ胎児血清（コロンビア産）を１０ｖｏｌ％含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。
７日間培養後、培養液を抜き、新たに４℃に冷却した培養液を加え、室温で１０分間冷却した。１０分後、ピペッターを用いて培養器材の培養面の全面に培養液を当てるようにピペッティングした後、細胞ごと培養液を回収した。回収した培養液を、１６０ｒｃｆ、２５℃、５分の条件で遠心後、上清を除き、培養液を５００μＬ加え懸濁した。得られた細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄ）に添加し、自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） II）を用いて、細胞数を測定した。
上記のように冷却によって剥離・回収した間葉系幹細胞を、１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを２００μＬ加えた浮遊培養用の９６ｗｅｌｌプレート（コーニング製、商品名Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） ９６－ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ Ｒｏｕｎｄ Ｂｏｔｔｏｍ Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２日間培養した。その後、培地をＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ（株）製）に交換し軟骨細胞への分化誘導を行った。
培養器材に、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ロンザジャパン（株）製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｄｅ：ＰＴ－２５０１、Ｌｏｔ Ｎｕｍｂｅｒ：００００６０３５２５）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液にはウシ胎児血清（コロンビア産）を１０ｖｏｌ％含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。
７日間培養後、培養液を抜き、新たに４℃に冷却した培養液を加え、室温で１０分間冷却した。１０分後、ピペッターを用いて培養器材の培養面の全面に培養液を当てるようにピペッティングした後、細胞ごと培養液を回収した。回収した培養液を、１６０ｒｃｆ、２５℃、５分の条件で遠心後、上清を除き、培養液を５００μＬ加え懸濁した。得られた細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄ）に添加し、自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） II）を用いて、細胞数を測定した。
上記のように冷却によって剥離・回収した間葉系幹細胞を、１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを２００μＬ加えた浮遊培養用の９６ｗｅｌｌプレート（コーニング製、商品名Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標） ９６－ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ Ｒｏｕｎｄ Ｂｏｔｔｏｍ Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２日間培養した。その後、培地をＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｐｒｏｍｏ Ｃｅｌｌ（株）製）に交換し軟骨細胞への分化誘導を行った。
【0027】
３日毎に該培地を交換しながら２５日間培養したところ球状の細胞凝集塊が観察された。細胞凝集塊をアルシアンブルー染色し、染色陽性の軟骨組織の直径を測定した。測定後、１５０μＬの６Ｍグアニジン塩酸塩でアルシアンブルーの色素を溶出させ細胞外基質量をプレートリーダー（コロナ電気（株）製、商品名：吸光グレーティングマイクロプレートリーダ ＳＨ－１３００ Ｌａｂ）を用いて６３０ｎｍの吸光度で測定した。その結果、軟骨組織の直径は１．７５ｍｍ、６３０ｎｍの吸光度は０．９１２であった。
【0028】
比較例１
培養器材から間葉系幹細胞を剥離・回収する際に４℃に冷却した培養液を加える代わりに、ＰＢＳで洗浄後、タンパク質分解酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を１ｍＬ加え、３７℃で１０分間静置した以外は実施例１と同様の方法で、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化誘導を行った。
培養器材から間葉系幹細胞を剥離・回収する際に４℃に冷却した培養液を加える代わりに、ＰＢＳで洗浄後、タンパク質分解酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名：ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ）を１ｍＬ加え、３７℃で１０分間静置した以外は実施例１と同様の方法で、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化誘導を行った。
【0029】
細胞凝集塊をアルシアンブルー染色し、染色陽性の軟骨組織の直径を測定した。測定後、１５０μＬの６Ｍグアニジン塩酸塩でアルシアンブルーの色素を溶出させ細胞外基質量を６３０ｎｍの吸光度で測定した。その結果、軟骨組織の直径は１．２２ｍｍ、６３０ｎｍの吸光度は０．３１４であった。
【0030】
【表1】
