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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-08
(45)【発行日】2024-02-19
(54)【発明の名称】免疫グロブリン結合性タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/315 20060101AFI20240209BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240209BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240209BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240209BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240209BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20240209BHJP
【ＦＩ】
C07K14/315 ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P21/02 C
C07K1/22
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020001882
(22)【出願日】2020-01-09
(65)【公開番号】P2021045116
(43)【公開日】2021-03-25
【審査請求日】2022-12-16
(31)【優先権主張番号】P 2019164399
(32)【優先日】2019-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】岩瀬 瑛大
(72)【発明者】
【氏名】山中 直紀
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０８１１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０２９１５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０９３４３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００６－３０４６３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３９５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２５１００（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３６８１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３３９２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０１４４４９６（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（a）～（c）から選択される、免疫グロブリン結合性タンパク質。
（a）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、免疫グロブリン結合性タンパク質。
（ｂ）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下（１）から（１９）のアミノ酸置換以外に１から５個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加を含み、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質よりもアルカリ耐性が向上していて、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（１８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換。
（１９）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換。
（ｃ）配列番号１８から２０、２２、２３、４８から５１、５４および５６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし前記（１）から（１９）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質よりもアルカリ耐性が向上していて、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。
【請求項2】
請求項１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項4】
請求項２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。
【請求項5】
宿主が大腸菌である、請求項４に記載の遺伝子組換え宿主。
【請求項6】
請求項４または５に記載の遺伝子組換え宿主を培養し請求項１または２に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
【請求項7】
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
【請求項8】
請求項７に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、アルカリに対する安定性に優れた免疫グロブリン結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。
【0003】
抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。
【0004】
精製工程では抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられる。前記担体で用いられるリガンドタンパク質として、抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有した、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）や連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇなどが多く用いられている。抗体医薬を製造する際は、その生産コストを低く保つため、これらアフィニティー担体は複数回使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、アフィニティー担体を再生させる。従って前記リガンドタンパク質は、前記再生工程を行なっても、抗体への結合性が維持されるだけの化学的安定性を有する必要がある。
【0005】
化学的安定性を有する、アフィニティー担体で用いられるリガンドタンパク質の一例として、ＳｐＡのドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定クロマトグラフィーリガンド（特許文献１）や、前記プロテインＡのドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＺのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から構成されるアフィニティークロマトリガンド（特許文献２）が挙げられる。また、ドメインＺにおいて２９番目のグリシンをアラニンに置換することで、構造が安定化することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特表２０１０－５０４７５４号公報
【文献】特開２０１２－２５４９８１号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題はアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳｐＡ）のドメインＣにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することでアルカリに対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
【0011】
［１］ブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される１以上のアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
【0012】
［２］以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記（１）から（５）および（１４）から（１７）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（６）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記（１）から（５）および（１４）から（１７）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、ならびに／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし前記（１）から（５）および（１４）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（６）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
【0013】
［３］以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載のタンパク質である、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）のアミノ酸置換を有するタンパク質
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｈ）前記（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（２）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）のアミノ酸置換を有するタンパク質
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、
（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、さらに前記アミノ酸置換の位置以外の１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質
（ｈ）前記（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに以下の（２）から（１７）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質：
（２）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がシステインに置換
（３）配列番号１の４７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（４）配列番号１の５０番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（５）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアスパラギンに置換
（６）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに置換
（７）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（８）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンに置換
（１０）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１１）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１３）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１４）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンに置換
（１５）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がトレオニンに置換
（１６）配列番号１の３９番目のセリンに相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（１７）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換。
【0014】
［４］配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号１０の７番目のリジンがバリンに置換
（ｉｉ）配列番号１０の３９番目のセリンがシステインに置換
（ｉｉｉ）配列番号１０の４７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ｉｖ）配列番号１０の５０番目のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１０の５８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換。
（ｉ）配列番号１０の７番目のリジンがバリンに置換
（ｉｉ）配列番号１０の３９番目のセリンがシステインに置換
（ｉｉｉ）配列番号１０の４７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（ｉｖ）配列番号１０の５０番目のリジンがアスパラギンに置換
（ｖ）配列番号１０の５８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換。
【0015】
［５］配列番号１８から２０、２２および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［４］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
【0016】
［６］配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、［２］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１８の３番目のイソロイシンがヒスチジンに置換
（ＩＩ）配列番号１８の４番目のアルギニンがトレオニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１８の３９番目のセリンがグリシンに置換
（ＩＶ）配列番号１８の４２番目のリジンがロイシンに置換
［７］配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［６］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
（Ｉ）配列番号１８の３番目のイソロイシンがヒスチジンに置換
（ＩＩ）配列番号１８の４番目のアルギニンがトレオニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１８の３９番目のセリンがグリシンに置換
（ＩＶ）配列番号１８の４２番目のリジンがロイシンに置換
［７］配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、［６］に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
【0017】
［８］［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0018】
［９］［８］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0019】
［１０］［８］に記載のポリヌクレオチドまたは［９］に記載の発現ベクターを含む、遺伝子組換え宿主。
【0020】
［１１］宿主が大腸菌である、［１０］に記載の遺伝子組換え宿主。
【0021】
［１２］［１０］または［１１］に記載の遺伝子組換え宿主を培養し［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
【0022】
［１３］不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［７］のいずれかに記載の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
【0023】
［１４］［１３］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
【発明の効果】
【0024】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はブドウ球菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣの特定位置におけるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したポリペプチドである。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上しており、抗体（免疫グロブリン）を分離するための吸着剤におけるリガンドタンパク質として有用である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0026】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。本明細書において「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有するタンパク質を意味する。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリンに対する結合性を有する。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合性を有するものであってもよい。本明細書では、免疫グロブリンに対する結合性を、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で測定できる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施できる。
【0027】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（以下、ＳｐＡと略）の免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。本明細書において、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有さないものを、「非改変型アミノ酸配列」ともいい、ＳｐＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有するものを、「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そうでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変されていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を有していてもよい。
【0028】
ＳｐＡの由来であるブドウ球菌属細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢが挙げられる。免疫グロブリン結合ドメインとしては、特に、ドメインＣが挙げられる。黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＥとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＥのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＤとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＤのアミノ酸配列を配列番号２５に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＡのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。また黄色ブドウ球菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのドメインＢとしては、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＢのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。すなわち非改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１、２４、２５、２６、および２７に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が挙げられる。
【0029】
また改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置におけるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。
【0030】
本明細書において、タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいい、タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」ともいう。またタンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」ともいう。
【0031】
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ｌｙｓ７Ｖａｌ（この表記は配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。言い換えると、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、（１）Ｌｙｓ７Ｖａｌ、（２）Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、（３）Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、（４）Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、（５）Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、（１４）Ａｓｎ３Ｈｉｓ、（１５）Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、（１６）Ｓｅｒ３９Ｇｌｙおよび（１７）Ｌｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、これらのアミノ酸置換から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのアミノ酸置換を有してよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０Ａｓｎ、Ｌｙｓ５８Ａｓｎ、Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有してもよい。中でもＬｙｓ７Ｖａｌは、アルカリに対する安定性が特に向上したアミノ酸置換である。そのため、Ｌｙｓ７Ｖａｌのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。
【0032】
なお、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、少なくとも１つのその他のアミノ酸置換をさらに有してもよい。他のアミノ酸置換としては、構造安定性が増すことが知られているＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）が挙げられる。また、Ｇｌｙ２９Ａｌａ以外の他のアミノ酸置換としては、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｖａｌ４０Ａｌａのアミノ酸置換が挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
【0033】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらアミノ酸置換の組み合わせは特に制限されない。
【0034】
アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
が挙げられる。
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ａｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；
が挙げられる。
【0035】
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、下記の免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。これらの免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上する点で好ましい。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換のアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｇｌｕ４７ＶａｌおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換のアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ４２ＬｅｕおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
【0036】
またアミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐと、以下の（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（ｉ）Ｌｙｓ７Ｖａｌ
（ｉｉ）Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ４７Ｖａｌ
（ｉｖ）Ｌｙｓ５０Ａｓｎ
（ｖ）Ｌｙｓ５８Ａｓｎ
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号１８から２０、２２および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
（ｉ）Ｌｙｓ７Ｖａｌ
（ｉｉ）Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ４７Ｖａｌ
（ｉｖ）Ｌｙｓ５０Ａｓｎ
（ｖ）Ｌｙｓ５８Ａｓｎ
すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（ｉ）から（ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号１８から２０、２２および２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
【0037】
またアミノ酸置換の組み合わせの別の具体例として、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐと、以下の（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（Ｉ）Ａｓｎ３Ｈｉｓ
（ＩＩ）Ｌｙｓ４Ｔｈｒ
（ＩＩＩ）Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ
（ＩＶ）Ｌｙｓ４２Ｌｅｕ
すなわち、発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１８に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
（Ｉ）Ａｓｎ３Ｈｉｓ
（ＩＩ）Ｌｙｓ４Ｔｈｒ
（ＩＩＩ）Ｓｅｒ３９Ｇｌｙ
（ＩＶ）Ｌｙｓ４２Ｌｅｕ
すなわち、発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１８に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｖａｌ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（Ｉ）から（ＩＶ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号４８から５１、５４および５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
【0038】
なお、ここで（ｉ）または（ｖ）を選択した場合、配列番号１０に含まれるＬｙｓ７ＧｌｕまたはＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換はＬｙｓ７ＶａｌまたはＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＬｙｓ７ＧｌｕまたはＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有さない。そして（Ｉ）または（ＩＩ）を選択した場合も同様、配列番号１８に含まれるＡｓｎ３ＩｌｅまたはＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換はＡｓｎ３ＨｉｓまたはＬｙｓ４Ｔｈｒのアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＡｓｎ３ＩｌｅまたはＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換を有さない。
【0039】
前記（ｉ）から（ｖ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１０を参照配列として適宜読み替えできる。また前記（Ｉ）から（ＩＶ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１８を参照配列として適宜読み替えできる。すなわち、例えば、ここでいう「Ｌｙｓ５８Ａｓｎ」は、配列番号１０の５８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されるアミノ酸置換として、「Ａｓｎ３Ｈｉｓ」は、配列番号１８の３番目のアスパラギン酸がヒスチジンに置換されるアミノ酸置換として、それぞれ読み替えできる。他のアミノ酸配列を参照配列とする場合も同様である。
【0040】
本明細書では、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である。
【0041】
また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
【0042】
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を追加的に有していてもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有していてもよい。
【0043】
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）またはバリアント（ｖａｒｉａｎｔ））によって生じるものも含まれる。
【0044】
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「相同性」とは、類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列に対する相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。前記「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。アミノ酸配列間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については上述の通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラムを利用して決定できる。
【0045】
また改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくとも前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらにＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列であってよい。
【0046】
また非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
【0047】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
【0048】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
【0049】
その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。
【0050】
「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。あるアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該あるアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ｌｙｓ７Ｖａｌのアミノ酸置換の場合、あるアミノ酸配列における「配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基」とは、当該あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該あるアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における７番目のリジンと同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアライメント特定できる。前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアライメントプログラムを利用して実施できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、いなくてもよい。
【0051】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が複数個の改変型アミノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。
【0052】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ酸配列（例えばオリゴペプチド）をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ酸配列の種類や長さは、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。
【0053】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、選択した免疫グロブリン結合ドメインに加えて、他の免疫グロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がドメインＣの改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、さらに、ＳｐＡのドメインＣのＮ末端側領域（ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）の一部を含んでいてもよく、ＳｐＡのドメインＣのＣ末端側領域の一部を含んでいてもよい。
【0054】
また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。
【0055】
また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる。
【0056】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、予め他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造された上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、上記のような他のアミノ酸配列を含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）をコードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させてもよい。また例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。
【0057】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現させることで製造できる。本明細書では、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
【0058】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列等の増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施できる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）であるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【0059】
また本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換を有するように変異を導入することによっても、取得できる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアント配列）を含むタンパク質が挙げられる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法、またはＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法で取得できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらのアミノ酸置換は、例えば、同時に、または順次、導入されてよい。例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換から選択される別の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するように変異を導入してもよい。また、ある位置のアミノ酸残基を２回以上改変してもよい。例えば、既にＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をさらにＬｙｓ５８Ａｓｎのアミノ酸置換を導入してもよい。
【0060】
またポリヌクレオチドは、上記例示したアミノ酸置換を生じる変異に限られず、バリアント配列の構築のための変異等の任意の変異を導入して、本発明のポリヌクレオチドまたはそれを取得するための材料として利用してよい。
【0061】
ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法が挙げられる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に制限されない。例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。
【0062】
また、ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、インバースＰＣＲ法も挙げられる。インバースＰＣＲ法は、まず目的とする遺伝子を挿入したポリヌクレオチドを変性させた後、変異プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行なう。伸長したポリヌクレオチドを制限酵素ＤｐｎＩを用いて選択的に切断し、新たに合成された遺伝子をリン酸化、ライゲーションを実施し、環化させることでポリヌクレオチドに変異を導入できる。
【0063】
さらにポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、前述したエラープローンＰＣＲ法やインバースＰＣＲ法以外にも、ポリヌクレオチドに変異原となる薬剤を作用させること、または、ポリヌクレオチドに紫外線を照射すること、ポリヌクレオチドに変異を導入する方法が挙げられる。変異原となる薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等の、当業者が通常用いる変異原性薬剤が挙げられる。このようなポリヌクレオチドへ変異を導入する方法は、上記例示したアミノ酸置換の導入に限られず、バリアント配列の構築（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の導入や、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化）にも利用できる。
【0064】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、その全長配列を一括して取得してもよく、その部分配列をそれぞれ取得して連結すること取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。
【0065】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主に本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることで製造できる。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主を、「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう。本発明の遺伝子組換え宿主は、本発明のポリヌクレオチドを含むことに依拠して、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主である。
【0066】
本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することで得られる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、例えば、本発明のポリヌクレオチドで遺伝子組換え（形質転換）された宿主であってよく、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主であってよく、また本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であってよい。遺伝子組換えに用いる宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることで本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌としては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
【0067】
本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に本発明の遺伝子組換え宿主に保持されていればよい。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモーターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。
【0068】
本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして宿主に導入できる。すなわち、本発明の遺伝子組換え宿主は、一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主であってよい。本明細書では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することで得られる。なお発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また前記適切な位置とは、発現ベクター複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。
【0069】
また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。
【0070】
本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なえる。例えば、宿主として大腸菌を選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等形質転換できる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。
【0071】
各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用できる。
【0072】
本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製できる。
【0073】
本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できる。また本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させ、当該発現したタンパク質を回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造できる。すなわち本発明は、例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現させた前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定できる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できるように設定できる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含有する培地を用いることができる。例えば、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン １％（ｗ／ｖ）、酵母エキス ０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム １％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無に基づき、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また、培地は、グリシン等の前記遺伝子組換え宿主から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であってよい。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。例えば、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭであってよい。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なえる。
【0074】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離して回収できる。なお、本明細書において「培養物」とは、培養で得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の遺伝子組換え宿主の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収できる。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作回収した後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することで細胞を破砕して、破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収できる。培養上清や細胞破砕物からの本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。そのような方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。
【0075】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用できる。すなわち、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤を用いて実施できる。本明細書では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤を、「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう。なお「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存化の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含まれる。不溶性担体は特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。
【0076】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、共有結合を介して不溶性担体に固定化できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化できる。すなわち、不溶性担体は、活性基を有していてよい。不溶性担体は、例えば、その表面に活性基を有していてよい。活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
【0077】
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
【0078】
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。
【0079】
また担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
【0080】
また担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0081】
また担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【0082】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
【0083】
また担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【0084】
本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃であってよい。
【0085】
本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、カラムに充填して免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。具体的には、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法を提供する。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお本明細書では、液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なお免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。前記平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱めることで、溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。そのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。
【0086】
このようにして免疫グロブリン（抗体）の分離を実施することで、例えば、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含有する画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常法で行なえる。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で行なえる。
【実施例】
【0087】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。また参考例および実施例４に記載のＳｐＡ９ｃ（配列番号２１）は、本発明を構成するものではない。
【0088】
実施例１ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の作製
（１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号記載の方法に基づき、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対し、構造安定化に寄与するＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）およびアルカリ安定性向上に関与するＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、およびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質ＳｐＡ６ａを発現可能なベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６ａを作製した。ＳｐＡ６ａのアミノ酸配列を配列番号２に、ＳｐＡ６ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号３に、それぞれ示す。
（１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号記載の方法に基づき、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対し、構造安定化に寄与するＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）およびアルカリ安定性向上に関与するＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、およびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質ＳｐＡ６ａを発現可能なベクターｐＥＴ－ＳｐＡ６ａを作製した。ＳｐＡ６ａのアミノ酸配列を配列番号２に、ＳｐＡ６ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号３に、それぞれ示す。
【0089】
（２）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐ（この表記はＳｐＡ６ａ作製時に配列番号１の５８番目のリジンが一度グルタミン酸に置換されたが、さらにアスパラギン酸に置換されたことを表す、以下同じ）を選択し、これら置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質（ＳｐＡ８ｃと命名）を設計した。
【0090】
（３）（２）で設計したＳｐＡ８ｃをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡ－３’）および配列番号１７（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で２分間熱処理することで行なった。
【0091】
【表1】
【0092】
（４）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩとで消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ニッポンジーン社製）を形質転換した。
【0093】
（５）得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃと命名）を抽出した。
【0094】
（６）得られた抽出物のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１４（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号１５（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【0095】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃにＳｐＡ８ｃをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ８ｃのアミノ酸配列を配列番号１０に、前記ＳｐＡ８ｃをコードするヌクレオチド配列を配列番号１１に、それぞれ示す。
【0096】
参考例１
ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＡｓｐおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＶａｌをＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ８ａと命名）
（ｂ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｃと命名）
（ｃ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｄと命名）
以下、（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＡｓｐおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８ＶａｌをＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ８ａと命名）
（ｂ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｃと命名）
（ｃ）ＳｐＡ６ａに対し、さらにＡｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ７ｄと命名）
以下、（ａ）から（ｃ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
【0097】
（ａ）ＳｐＡ８ａ
（ａ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ８ａを設計した。
（ａ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＶａｌ４０Ａｌａを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ８ａを設計した。
【0098】
（ａ－２）（ａ－１）で設計したＳｐＡ８ａをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１３（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。
【0099】
（ａ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ８ａと命名）を抽出した。
【0100】
（ａ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ８ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様な方法で行なった。
【0101】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ａにＳｐＡ８ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ８ａのアミノ酸配列を配列番号４に、ＳｐＡ８ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５に、それぞれ示す。
【0102】
（ｂ）ＳｐＡ７ｃ
（ｂ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｃを設計した。
（ｂ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｃを設計した。
【0103】
（ｂ－２）（ｂ－１）で設計したＳｐＡ７ｃをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１６（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様の方法で行なった。
【0104】
（ｂ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃと命名）を抽出した。
【0105】
（ｂ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。
【0106】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ７ｃにＳｐＡ７ｃをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ７ｃのアミノ酸配列を配列番号６に、ＳｐＡ７ｃをコードするヌクレオチド配列を配列番号７に、それぞれ示す。
【0107】
（ｃ）ＳｐＡ７ｄ
（ｃ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｄを設計した。
（ｃ－１）ＷＯ２０１９／０９３４３９号で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ３ＩｌｅおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ６ａ（配列番号２）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ７ｄを設計した。
【0108】
（ｃ－２）（ｃ－１）で設計したＳｐＡ７ｄをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号１２および配列番号１７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様の方法で行なった。
【0109】
（ｃ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄと命名）を抽出した。
【0110】
（ｃ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。
【0111】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ７ｄにＳｐＡ７ｄをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ７ｄのアミノ酸配列を配列番号８に、ＳｐＡ７ｄをコードするヌクレオチド配列を配列番号９に、それぞれ示す。
【0112】
実施例２ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価（その１）
（１）ＳｐＡ６ａ（配列番号２）、実施例１で作製したＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）ならびに参考例１で作製したＳｐＡ８ａ（配列番号４）、ＳｐＡ７ｃ（配列番号６）およびＳｐＡ７ｄ（配列番号８）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））に接種し、３７℃で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（１）ＳｐＡ６ａ（配列番号２）、実施例１で作製したＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）ならびに参考例１で作製したＳｐＡ８ａ（配列番号４）、ＳｐＡ７ｃ（配列番号６）およびＳｐＡ７ｄ（配列番号８）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））に接種し、３７℃で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【0113】
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0114】
（３）培養開始から２から３時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。
【0115】
（４）培養終了後、遠心分離で集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
【0116】
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２、４、６、８および１０）の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈した。希釈したタンパク質溶液の一部を採取し、一方には２Ｍ ＮａＯＨを、もう一方にはＴＢＳを、それぞれ前記採取したタンパク質溶液に対し等量添加し混合後、３５℃で１５時間静置した。
【0117】
（６）１５時間静置後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、アルカリ処理（２Ｍ ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を、下記ＥＬＩＳＡ法にて測定した。アルカリ安定性はアルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかった（未処理）ときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、評価した。
（６－１）ＴＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳを用いて１％（ｗ／ｖ）に調製したＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（メルク社製）を用いてブロッキングした。
（６－２）洗浄緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名））で９６ウェルマイクロプレートのウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃、１時間）。
（６－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（６－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ リン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（６－１）ＴＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳを用いて１％（ｗ／ｖ）に調製したＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（メルク社製）を用いてブロッキングした。
（６－２）洗浄緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名））で９６ウェルマイクロプレートのウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃、１時間）。
（６－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（６－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ リン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0118】
結果を表２に示す。ＳｐＡ８ａ（配列番号４）、ＳｐＡ７ｃ（配列番号６）、ＳｐＡ７ｄ（配列番号８）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）は、いずれもＳｐＡ６ａ（配列番号２）と比較し、残存活性が高くなっており、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。
【0119】
【表2】
【0120】
実施例３ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質へのランダム変異導入およびライブラリーの作製（その１）
以下に示す方法で、実施例１で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１１）に対し、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
以下に示す方法で、実施例１で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１１）に対し、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
【0121】
（１）実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｃを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲで変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｃ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は２．１６％であった。
【0122】
【表3】
【0123】
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
【0124】
（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【0125】
実施例４ アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）実施例３で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約３４００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
（１）実施例３で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約３４００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
【0126】
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。
【0127】
（３）培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で２５倍または４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ ＮａＯＨと等量混合し、６３℃または７１℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
【0128】
（４）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
【0129】
（５）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ８ｃと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
【0130】
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0131】
（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（６）に記載の方法で解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
【0132】
（５）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）に対するアミノ酸置換位置および１．０Ｍ ＮａＯＨを用いて３５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表４、表５および表６に示す。配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）７Ｖａｌ、Ｓｅｒ３９Ｃｙｓ、Ｇｌｕ４７Ｖａｌ、Ｌｙｓ５０ＡｓｎおよびＬｙｓ（Ａｓｐ）５８Ａｓｎのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
【0133】
【表4】
【0134】
【表5】
【0135】
【表6】
【0136】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、
Ｇｌｕ７１０Ｖａｌ（この表記は配列番号１０の７番目のグルタミン酸がバリンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号１８に、
Ｇｌｕ４７１０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号１９に、
Ｌｙｓ５０１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号２０に、
Ａｓｎ６１０Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｃと命名、本タンパク質は本発明を構成しない）のアミノ酸配列を配列番号２１に、
Ｓｅｒ３９１０Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号２２に、
Ａｓｐ５８１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号２３に、それぞれ示す。
Ｇｌｕ７１０Ｖａｌ（この表記は配列番号１０の７番目のグルタミン酸がバリンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号１８に、
Ｇｌｕ４７１０Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号１９に、
Ｌｙｓ５０１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号２０に、
Ａｓｎ６１０Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｃと命名、本タンパク質は本発明を構成しない）のアミノ酸配列を配列番号２１に、
Ｓｅｒ３９１０Ｃｙｓのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号２２に、
Ａｓｐ５８１０Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号２３に、それぞれ示す。
【0137】
参考例２ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の親和性評価
（１）センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に、非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、ＳｐＡ６ａ（配列番号２）またはＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）を固定化した。当該固定化はカルボキシ基をＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）で活性化し、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて１μｇ／ｍＬに調製したアミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質を添加して行なった。なお固定化反応後の残存したＮＨＳ基はエタノールアミンでブロッキングした。
（１）センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に、非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、ＳｐＡ６ａ（配列番号２）またはＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）を固定化した。当該固定化はカルボキシ基をＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）で活性化し、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて１μｇ／ｍＬに調製したアミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質を添加して行なった。なお固定化反応後の残存したＮＨＳ基はエタノールアミンでブロッキングした。
【0138】
（２）ランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）（ＧＥヘルスケア社製）を用いてヒト血漿由来ＩｇＧ１（メルク社製）を３．１ｎＭから２００ｎＭの濃度に希釈し、３０μＬ／ｍｉｎの流速で（１）で固定化したセンサーチップに添加した。測定ごとにセンサーチップ表面を１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液で再生し、ランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋で平衡化した。
【0139】
（３）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析し、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇモデルでフィッティングした。
【0140】
表７に、ヒトＩｇＧ１に対する非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）ならびにＳｐＡ６ａ（配列番号２）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）の解離定数ＫＤを示す。ＳｐＡ６ａ（配列番号２）およびＳｐＡ８ｃ（配列番号１０）のヒトＩｇＧ１に対する親和性は、非改変型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）とほぼ同等であることがわかる。
【0141】
【表7】
【0142】
実施例５ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質へのランダム変異導入およびライブラリーの作製（その２）
実施例４で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）を選択し、ＳｐＡ８ｄをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
実施例４で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）を選択し、ＳｐＡ８ｄをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
【0143】
（１）ＳｐＡ８ｄをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）をｐＥＴ－２８ａに挿入し得られた発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｄを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲで変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は２．１８％であった。
【0144】
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
【0145】
（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【0146】
実施例６ アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への部位特異的変異導入およびライブラリーの作製
以下に示す方法で、実施例３で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）に対し、インバースＰＣＲにより部位特異的にランダムな変異を導入した。変異導入箇所は、これまでの検討で安定性に有効な変異が多く取れた箇所を選択した。具体的には、配列番号１の３番目のアスパラギン、４番目のリジンまたは４２番目のリジンに対して実施した。
以下に示す方法で、実施例３で作製した免疫グロブリン結合性タンパク質ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２９）に対し、インバースＰＣＲにより部位特異的にランダムな変異を導入した。変異導入箇所は、これまでの検討で安定性に有効な変異が多く取れた箇所を選択した。具体的には、配列番号１の３番目のアスパラギン、４番目のリジンまたは４２番目のリジンに対して実施した。
【0147】
（１）発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ８ｄを鋳型ＤＮＡとして用い、インバースＰＣＲを行なった。インバースＰＣＲは、表８に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。なお各ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅの組成を表９に、各変異導入箇所への変異導入に用いたプライマーの組合せを表１０に、それぞれ示す。
【0148】
【表8】
【0149】
【表9】
【0150】
【表10】
【0151】
（２）得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断した。
【0152】
（３）制限酵素での処理後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。前記インバースＰＣＲにより、変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ８ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）に良好に変異が導入された。形成したコロニーの中から１００株選択し、任意の箇所に約１７種の変異が導入されたライブラリーを取得した。
【0153】
実施例７ アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）実施例５および６で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約１８００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
（１）実施例５および６で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体［遺伝子組換え大腸菌］）約１８００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
【0154】
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。
【0155】
（３）培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で５０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ ＮａＯＨと等量混合し、６４℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
【0156】
（４）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
【0157】
（５）アルカリ処理したときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理をしなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ８ｄと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
【0158】
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0159】
（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（６）に記載の方法で解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
【0160】
（５）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対するアミノ酸置換位置、および１Ｍ ＮａＯＨを用いて３５℃で１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表１１に示す。配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）４Ｔｈｒ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
【0161】
【表11】
【0162】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、Ｉｌｅ３１８Ｈｉｓ（この表記は配列番号１８の３番目のイソロイシンがヒスチジンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号４９に、
Ａｒｇ４１８Ｔｈｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｇと命名）のアミノ酸配列を配列番号５１に、
Ｓｅｒ３９１８Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号５０に、
Ｌｙｓ４２１８Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号４８に、それぞれ示す。なお、ＳｐＡ９ｆは実施例５（ランダム変異導入）で選択した株であり、ＳｐＡ９ｅ、ＳｐＡ８ｆおよびＳｐＡ８ｇは実施例６（部位特異的変異導入）で選択した株である。
Ａｒｇ４１８Ｔｈｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ８ｇと命名）のアミノ酸配列を配列番号５１に、
Ｓｅｒ３９１８Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号５０に、
Ｌｙｓ４２１８Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ９ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号４８に、それぞれ示す。なお、ＳｐＡ９ｆは実施例５（ランダム変異導入）で選択した株であり、ＳｐＡ９ｅ、ＳｐＡ８ｆおよびＳｐＡ８ｇは実施例６（部位特異的変異導入）で選択した株である。
【0163】
実施例８ アミノ酸置換の集積
実施例７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ９ｇと命名）
（ｂ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ 、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ１０ａと命名）
以下、（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロプリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
実施例７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ９ｇと命名）
（ｂ）ＳｐＡ８ｄに対し、さらにＡｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ 、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ１０ａと命名）
以下、（ａ）および（ｂ）に示す２種類の免疫グロプリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
【0164】
（ａ）ＳｐＡ９ｇ
（ａ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ９ｇを設計した。
（ａ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３ＨｉｓおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ９ｇを設計した。
【0165】
（ａ－２）（ａ－１）で設計したＳｐＡ９ｇをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５２（５’－ＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣ－３’）および配列番号５３（５’－ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。
【0166】
（ａ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇと命名）を抽出した。
【0167】
（ａ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。
【0168】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ９ｇにＳｐＡ９ｇをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ９ｇのアミノ酸配列を配列番号５４に、ＳｐＡ９ｇをコードするヌクレオチド配列を配列番号５５に、それぞれ示す。
【0169】
（ｂ）ＳｐＡ１０ａ
（ｂ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ１０ａを設計した。
（ｂ－１）実施例７で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ａｓｎ（Ｉｌｅ）３Ｈｉｓ、Ｓｅｒ３９ＧｌｙおよびＬｙｓ４２Ｌｅｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ１０ａを設計した。
【0170】
（ｂ－２）（ｂ－１）で設計したＳｐＡ１０ａをコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号５２および配列番号５３に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例１（３）と同様な方法で行なった。
【0171】
（ｂ－３）得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例１（４）と同様な方法で形質転換後、得られた形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）から実施例１（５）と同様な方法で発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａと命名）を抽出した。
【0172】
（ｂ－４）ｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（６）と同様の方法で行なった。
【0173】
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ１０ａにＳｐＡ１０ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ１０ａのアミノ酸配列を配列番号５６に、ＳｐＡ１０ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号５７に、それぞれ示す。
【0174】
実施例９ アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価（その２）
（１）ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）ならびに実施例８で作製したＳｐＡ９ｇ（配列番号５４）およびＳｐＡ１０ａ（配列番号５６）を発現する形質転換体を、実施例２（１）から（３）と同様な方法で培養した。
（１）ＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）ならびに実施例８で作製したＳｐＡ９ｇ（配列番号５４）およびＳｐＡ１０ａ（配列番号５６）を発現する形質転換体を、実施例２（１）から（３）と同様な方法で培養した。
【0175】
（２）培養終了後、遠心分離で集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
【0176】
（３）（２）で調製したタンパク質抽出液中の変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１８、５４および５６）の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈した。希釈したタンパク質溶液の一部を採取し、一方には２Ｍ ＮａＯＨを、もう一方にはＴＢＳを、それぞれ前記採取したタンパク質溶液に対し等量添加し混合後、３５℃で１５時間静置した。
【0177】
（６）１５時間静置後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、アルカリ処理（２Ｍ ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を、実施例２（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
【0178】
結果を表１２に示す。ＳｐＡ９ｇ（配列番号５４）およびＳｐＡ１０ａ（配列番号５６）は、いずれもＳｐＡ８ｄ（配列番号１８）と比較し、残存活性が高くなっており、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。
【0179】
【表12】
【配列表】