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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-13
(45)【発行日】2024-02-21
(54)【発明の名称】高生産性Ｆｃ結合性タンパク質、およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240214BHJP
C07K 14/735 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240214BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/735 ZNA
C12N15/70 Z
C12N1/21
C12P21/02 C
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2019202298
(22)【出願日】2019-11-07
(65)【公開番号】P2021073883
(43)【公開日】2021-05-20
【審査請求日】2022-10-13
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】000173762
【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所
(72)【発明者】
【氏名】畑山 耕太
(72)【発明者】
【氏名】穂谷 恵
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１９８８１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－１７８９０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１１１３９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０５６３７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０７６０６９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１）～（３）から選択される、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において以下の（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ａ）配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
（Ｂ）配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｃ）配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｄ）配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換を有し、
さらに前記（Ａ）から（Ｄ）に示すアミノ酸置換以外に１から３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
【請求項2】
以下の（４）～（６）から選択される、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において前記（Ａ）から（Ｄ）ならびに以下の（Ｅ）または／および（Ｆ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ｅ）配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
（Ｆ）配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換。
（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記（Ａ）から（Ｄ）ならびに（Ｅ）または／および（Ｆ）のアミノ酸置換を有し、
さらに前記（Ａ）から（Ｆ）に示すアミノ酸置換以外に１から３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（６）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記（Ａ）から（Ｄ）ならびに（Ｅ）または／および（Ｆ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（Ａ）から（Ｆ）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
【請求項3】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列における３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項4】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項7】
請求項６に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項8】
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項9】
請求項７または請求項８に記載の形質転換体を培養することにより請求項１～４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を生産する工程、および前記工程で生産されたＦｃ結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃレセプター（以下、ヒトＦｃＲｎという。）に由来し、免役グロブリンＧ（ＩｇＧ）やＩｇＧの定常領域であるＦｃ領域と他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質（以下、Ｆｃ融合タンパク質という。）に対し結合親和性を有するＦｃ結合性タンパク質に関するものである。より詳しくは、タンパク質工学的手法を用いて生産性を向上させたＦｃ結合性タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ヒトＦｃＲｎは、ＩｇＧの受容体であり、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する分子である。ヒトＦｃＲｎは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子であり、重鎖（α鎖）と、β２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献１）。ヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列（配列番号６）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５５８９９）などの公的データベースに公表されている。また、β鎖のアミノ酸配列（配列番号７）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１７６９）に公表されている。
【0003】
ヒトＦｃＲｎとＩｇＧ（Ｆｃ領域）の結合はｐＨ依存的であり、ｐＨ６．０－６．５で結合しｐＨ７．４以上で解離する。このｐＨ依存性はヒトＦｃＲｎの体内でのＩｇＧのリサイクリング機構や輸送機構に関与しており、ｐＨ依存的にヒトＦｃＲｎに結合・解離するＩｇＧおよびＦｃ融合タンパク質は体内寿命が長いことが知られている（非特許文献２）。ヒトＦｃＲｎのこの特徴を利用し、組換えヒトＦｃＲｎをリガンドとしたアフィニティーカラムを用いてヒトＩｇＧの体内寿命を評価する方法が知られている（非特許文献３）。
【0004】
前述した通り、組換えヒトＦｃＲｎはアフィニティーカラムのリガンドとして機能する特性を備えている。しかしながら、ヒトＦｃＲｎは熱やｐＨ変化などによりタンパク質変性が起こる傾向があった。そのため、特許文献１では、熱や酸に対する安定性が向上したヒトＦｃＲｎに由来したＦｃ結合性タンパク質が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１８－１８３０８７号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４－１８７，１９８９
【文献】Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９－１４６５７，１９９５
【文献】Ｆ．Ｃｙｍｅｒ等，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，９，１３０５－１３１７，２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、特許文献１に開示のＦｃ結合性タンパク質よりもさらに生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質、およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を構成するアミノ酸のうち特定の位置にあるアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換することにより、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は、以下の＜１＞から＜１１＞に記載の態様を包含する：
＜１＞
配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の（Ａ）から（Ｆ）のうち１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ａ）配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
（Ｂ）配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｃ）配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｄ）配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｅ）配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
（Ｆ）配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換。
＜１＞
配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の（Ａ）から（Ｆ）のうち１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ａ）配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
（Ｂ）配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｃ）配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｄ）配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｅ）配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
（Ｆ）配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換。
【0010】
＜２＞
以下の（１）～（３）の何れかに記載のタンパク質である、Ｆｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記１以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
以下の（１）～（３）の何れかに記載のタンパク質である、Ｆｃ結合性タンパク質：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記１以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
【0011】
＜３＞
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において前記（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、＜１＞または＜２＞に記載のＦｃ結合性タンパク質。
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において前記（Ａ）から（Ｄ）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、＜１＞または＜２＞に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【0012】
＜４＞
さらに前記（Ｅ）および／または（Ｆ）のアミノ酸置換を有する、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
さらに前記（Ｅ）および／または（Ｆ）のアミノ酸置換を有する、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
【0013】
＜５＞
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列における３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列における３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
【0014】
＜６＞
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
【0015】
＜７＞
＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
【0016】
＜８＞
＜７＞に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
＜７＞に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【0017】
＜９＞
＜８＞に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
＜８＞に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【0018】
＜１０＞
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、＜９＞に記載の形質転換体。
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、＜９＞に記載の形質転換体。
【0019】
＜１１＞
＜９＞または＜１０＞に記載の形質転換体を培養することにより＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を生産する工程、および第１工程で生産されたＦｃ結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
＜９＞または＜１０＞に記載の形質転換体を培養することにより＜１＞～＜６＞のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を生産する工程、および第１工程で生産されたＦｃ結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【0020】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0021】
本発明のＦｃ結合性タンパク質における、アミノ酸置換の基準となるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のアミノ酸配列（配列番号１）は、特開２０１８－１８３０８７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のアミノ酸配列と一致する。なお、配列番号１において、その１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカー配列であり、３４番目のイソロイシンから１３２番目のメチオニンまでがヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域［配列番号７（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ６１７６９）の２１番目から１１９番目の領域］であり、１３３番目のグリシンから１５７番目のセリンまでがＧＳリンカー配列であり、１５８番目のアラニンから４３１番目のセリンまでが７アミノ酸置換を有するヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域［配列番号６（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ５５８９９）の２４番目から２９７番目の領域のアミノ酸配列に相当し、かつそのうち（配列番号６）の７１番目のシステインがアルギニンに置換、７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、１５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換、１９２番目のアルギニンがロイシンに置換、１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、２３２番目のグルタミンがロイシンに置換および２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換された配列］であり、４３２番目から４３７番目まではポリヒスチジン配列である。
【0022】
なお「高生産性」とは、野生型（配列番号６および７に記載のヒトＦｃＲｎに比べて生産性が向上していることを意味してよく、好ましくは配列番号１に記載のヒトＦｃＲｎに比べて生産性が向上していることを意味してよい。ここで、向上するとは、比較対象（野生型または特許文献１に記載のヒトＦｃＲｎ）と比べて生産性が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上高くなることをいう。
【0023】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、
配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の（Ａ）から（Ｆ）のうち１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ａ）配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
（Ｂ）配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｃ）配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｄ）配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｅ）配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
（Ｆ）配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換。
配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の（Ａ）から（Ｆ）のうち１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む、Ｆｃ結合性タンパク質：
（Ａ）配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
（Ｂ）配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｃ）配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｄ）配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換、
（Ｅ）配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
（Ｆ）配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換。
【0024】
前記態様の具体例として、以下の（１）～（３）に示す、Ｆｃ結合性タンパク質が挙げられる。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記１以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４番目から４３１番目までのアミノ酸残基において、前記１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記１以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
【0025】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、少なくとも前記置換（Ｃ）が生じていることが好ましく、前記置換（Ａ）から置換（Ｄ）が全て生じていることが更に好ましい。
【0026】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前記の置換（Ａ）から置換（Ｄ）に記載の全てのアミノ酸置換に加え、前記の置換（Ｅ）および／または置換（Ｆ）に記載のアミノ酸置換が生じることで、形質転換体による生産性（発現量）がさらに向上する。
【0027】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前記の置換（Ａ）から置換（Ｆ）に記載の６つのアミノ酸置換が生じることで、前記の配列番号１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７に比べ、熱安定性が向上する。
【0028】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）および置換（Ｄ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｅ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｆ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、および
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）、置換（Ｅ）および置換（Ｆ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）および置換（Ｄ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｅ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｆ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、および
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列において置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）、置換（Ｅ）および置換（Ｆ）に記載のアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から４３１番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
が挙げられる。
【0029】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域結合性を有している限り、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることが好ましい。
【0030】
さらに、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域結合性を有している限り、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の担体に固定化する際に有用な、システインまたはリジンを含むオリゴペプチドからなる付加的なアミノ酸配列（以下、担体固定化用タグと呼ぶ。）を有していても良い。
【0031】
加えて、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【0032】
本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」、ならびに「アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよく、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、更に好ましくは１から２０個、特に好ましくは１から１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよい。また本明細書における「置換」、「欠失」、「挿入」および「付加」には、遺伝子が由来する生物（微生物も包含する）の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0033】
前記（２）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であってよく、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上であってよい。
【0034】
本明細書において、アミノ酸配列の「相同性」は、アミノ酸配列の「同一性」と同義である。ここで、アミノ酸配列の「同一性（相同性）」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化方法は、特に限定されないが、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知の配列比較プログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
【0035】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有してもよい。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
【0036】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の一例として、そのＮ末端側にＭａｌＥシグナルペプチドが付加され、かつそのＣ末端側にポリヒスチジンが付加された、
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
が挙げられる。
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｇ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質、
が挙げられる。
【0037】
次に、本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡとする。）および本発明のＤＮＡを含有する発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする。）について説明する。
【0038】
本発明のＤＮＡは、（Ｉ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用してヒトゲノムＤＮＡのＦｃＲｎをコードする領域をもとに改変して作製する方法、（ＩＩ）ヒトＦｃＲｎのアミノ酸配列（配列番号６および配列番号７）から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して作製する方法、または、（ＩＩＩ）例えば配列番号２から配列番号５に記載のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本発明のＦｃ結合性タンパク質の生産に利用する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、大腸菌を宿主として利用する場合、アルギニンではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシンではＡＴＡが、ロイシンではＣＴＡが、グリシンではＧＧＡが、プロリンではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドンを避けるように変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１９年５月３０日）を利用することによっても可能である。
【0039】
ＤＮＡ増幅法を用いて本発明のＤＮＡを作製する際は、エラープローンＰＣＲ法を用いた変異導入法を利用することができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＤＮＡに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ、好ましくは０．１から１ｍＭの濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことができる。
【0040】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【0041】
本発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のＤＮＡそのものを用いてもよいが、ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等）の適切な位置に本発明のＤＮＡを挿入した発現ベクター（本発明の発現ベクター）を用いると、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。また、ベクターに本発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態で挿入することが好ましい。
【0042】
本発明の発現ベクターとして使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＢＢＲベクター等のプラスミドベクターが例示できる。また本発明において使用するプロモータとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。
【0043】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする。）は、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。本発明の形質転換体として使用する宿主に特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌［ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等］、枯草菌等があげられる。なお、遺伝子工学に関する実験が容易な点および生産性の点で、大腸菌を宿主として用いることが好ましい。本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行えばよく、例えば、宿主として大腸菌［ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等］を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。
【0044】
本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し、調製すればよい。例えば本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
【0045】
次に、本発明のＦｃ結合性タンパク質の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）について説明する。本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を培養することで本発明のＦｃ結合性タンパク質を生産する工程（以下、第１工程という。）、第１工程で生産された本発明のＦｃ結合性タンパク質を培養物から回収する工程（以下、第２工程という。）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、第１工程において培養された本発明の形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
【0046】
本発明の製造方法における第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、必要な栄養源を補ったＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地等を使用することが好ましい。本発明の発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また、培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主が大腸菌である場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、本発明のＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。
【0047】
本発明の製造方法における第２工程では、第１工程で生産された本発明のＦｃ結合性タンパク質を培養物から一般的に知られた回収方法によって回収する。例えば本発明のＦｃ結合性タンパク質が培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加する等により細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すればよい。
【0048】
本発明の製造方法により回収された本発明のＦｃ結合性タンパク質の純度を向上したい場合には、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて行なうことがより好ましい。また、前記クロマトグラフィーにより精製した本発明のＦｃ結合性タンパク質の純度は当該技術分野において公知の方法を用いて調べればよく、一例として、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
【0049】
本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧへの結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法や表面プラズモン共鳴法等を用いて測定すればよい。
【発明の効果】
【0050】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている既知のＦｃ結合性タンパク質と比較し、生産性が向上している。特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている既知のＦｃ結合性タンパク質と同様に、本発明のＦｃ結合性タンパク質はＩｇＧまたはＦｃ融合タンパク質を分離するための吸着剤のリガンドとして有用であり、生産性の向上により工業的生産に適している。
【実施例】
【0051】
以下、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0052】
比較例１ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の製造と評価
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の製造
特開２０１８－１８３０８７号公報では、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７が開示されている。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（１－１）発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７の作製
特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を、当該公報に記載された方法で作製した。この発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を得た。
（１－２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の製造
前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１５０ｍＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧを添加し約１８時間振盪培養した。遠心操作により培養液から得られた菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液からのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（メルク製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７が高純度であることをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のタンパク質濃度はＭｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて定量した。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の生産性評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の生産性評価として、培養液１Ｌあたりの発現タンパク質量（発現量）を評価した。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の製造
特開２０１８－１８３０８７号公報では、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７が開示されている。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（１－１）発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７の作製
特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を、当該公報に記載された方法で作製した。この発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を得た。
（１－２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の製造
前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１５０ｍＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧを添加し約１８時間振盪培養した。遠心操作により培養液から得られた菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液からのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（メルク製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７が高純度であることをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認した。精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のタンパク質濃度はＭｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて定量した。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の生産性評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の生産性評価として、培養液１Ｌあたりの発現タンパク質量（発現量）を評価した。
【0053】
比較例１の（１－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した３０ｍＬのＴＢ培地に接種し（１００ｍＬバッフル付フラスコを使用）、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧを添加し約１８時間振盪培養した。遠心操作により培養液（２ｍＬ）から得られた菌体から、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を回収した。この可溶性タンパク質抽出液を適宜希釈し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を幾つかの濃度に調整し（１ウェルあたり１．５ｎｇから１５ｎｇの範囲）、濃度の標準としてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ゲルからメンブレンへタンパク質の転写を行ない、ウェスタンブロッティングによる検出を行った。検出抗体はＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ抗体、発色基質はＴＭＢを使用した。濃度既知である精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のバンドシグナル強度から検量線を作成し、可溶性タンパク質抽出液のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の濃度を定量した。本濃度を基に培養液１Ｌあたりの発現タンパク質量（発現量）を算出した。
【0054】
その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量は４５ｍｇ／Ｌであった（表１）。
【0055】
【表1】
【0056】
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の抗体に対する結合親和性評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトをヒト抗体製剤（人免疫グロブリン グロブリン筋注、日本薬局方製）、固相をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）をコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ、ＧＥヘルスケア製）を使用し、ＮＴＡにニッケルを固定した後、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７をセンサーチップに固定した（Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のＣ末端側のポリヒスチジンとニッケルの結合を利用）。抗体結合性の測定にはｐＨ６．０緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、カイネティクス解析はシングルサイクルカイネティクス法により行った。測定条件は表２に示す。解析はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、アナライト濃度（Ｃ）に対する平衡値（Ｒｅｑ）のプロットから解離定数（ＫＤ）の値を算出した。解離定数（ＫＤ）の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトをヒト抗体製剤（人免疫グロブリン グロブリン筋注、日本薬局方製）、固相をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）をコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ、ＧＥヘルスケア製）を使用し、ＮＴＡにニッケルを固定した後、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７をセンサーチップに固定した（Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のＣ末端側のポリヒスチジンとニッケルの結合を利用）。抗体結合性の測定にはｐＨ６．０緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用い、カイネティクス解析はシングルサイクルカイネティクス法により行った。測定条件は表２に示す。解析はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、アナライト濃度（Ｃ）に対する平衡値（Ｒｅｑ）のプロットから解離定数（ＫＤ）の値を算出した。解離定数（ＫＤ）の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。
【0057】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１０±４μＭ（ｎ＝３）であった。
【0058】
【表2】
【0059】
（４）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の熱安定性評価
（４－１）サンプル調製
比較例１の（１）で製造した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルター（メルク製）を使用してＤ－ＰＢＳ（－）緩衝液に置換し、タンパク質濃度を定量した（紫外線吸収法；Ａ２８０＝１．０を１．０ｍｇ／ｍＬとした）。
（４－２）熱安定性評価
熱安定性の評価はリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用してＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により行った。タンパク質濃度は０．２５から０．５ｍｇ／ｍＬの範囲、蛍光色素はＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ［終濃度０．５％（ｖ／ｖ）］、昇温温度は３０℃から８５℃、昇温速度は０．０２５℃／ｓの測定条件とした。変性中点の算出にはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｄｅｓｉｇｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．１．２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用した。
（４－１）サンプル調製
比較例１の（１）で製造した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルター（メルク製）を使用してＤ－ＰＢＳ（－）緩衝液に置換し、タンパク質濃度を定量した（紫外線吸収法；Ａ２８０＝１．０を１．０ｍｇ／ｍＬとした）。
（４－２）熱安定性評価
熱安定性の評価はリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用してＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により行った。タンパク質濃度は０．２５から０．５ｍｇ／ｍＬの範囲、蛍光色素はＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ［終濃度０．５％（ｖ／ｖ）］、昇温温度は３０℃から８５℃、昇温速度は０．０２５℃／ｓの測定条件とした。変性中点の算出にはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｄｅｓｉｇｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．１．２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用した。
【0060】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の変性中点は６０±２℃（ｎ＝２）であった。
【0061】
実施例１ 変異導入Ｆｃ結合性タンパク質からのＦｃ結合性タンパク質候補のスクリーニング
（１）Ｆｃ結合性タンパク質へのランダム変異導入とランダム変異体ライブリーの作製
比較例１の（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を鋳型として、配列番号１２および配列番号１３からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、特開２０１８－５０６１６号公報で開示されている方法で実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７－ＥＰとした。ＰＣＲ産物ｍ７－ＥＰは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている発現ベクターｐＥＴＭａｌＥとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，１５ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）で培養（３７℃で約１８時間）後、ＬＢ寒天培地上に形成されたコロニーをランダム変異体ライブリー（形質転換体）とした。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質候補のスクリーニング
（２－１）発現培養
前記（１）のランダム変異体ライブリー（形質転換体）および比較例１の（１－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７（比較対照として）をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。各前培養液１５μＬは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ培地５００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で振盪培養した。２時間後に培養温度を２０℃に切り替え、終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンをそれぞれ添加後、約１８時間振盪培養した。各培養液に対して遠心操作を行い、発現した組換えタンパク質を含む培養上清を得た。この培養上清サンプルに対して加熱処理（４６℃で１０分間）を行い、評価サンプルとした。
（２－２）抗体結合性評価を指標としたスクリーニング
抗体結合性評価として以下のＥＬＩＳＡ法を実施した。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質へのランダム変異導入とランダム変異体ライブリーの作製
比較例１の（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７を鋳型として、配列番号１２および配列番号１３からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、特開２０１８－５０６１６号公報で開示されている方法で実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７－ＥＰとした。ＰＣＲ産物ｍ７－ＥＰは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した特開２０１８－１８３０８７号公報で開示されている発現ベクターｐＥＴＭａｌＥとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，１５ｇ／Ｌ Ａｇａｒ）で培養（３７℃で約１８時間）後、ＬＢ寒天培地上に形成されたコロニーをランダム変異体ライブリー（形質転換体）とした。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質候補のスクリーニング
（２－１）発現培養
前記（１）のランダム変異体ライブリー（形質転換体）および比較例１の（１－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７（比較対照として）をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。各前培養液１５μＬは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ培地５００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で振盪培養した。２時間後に培養温度を２０℃に切り替え、終濃度０．０５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンをそれぞれ添加後、約１８時間振盪培養した。各培養液に対して遠心操作を行い、発現した組換えタンパク質を含む培養上清を得た。この培養上清サンプルに対して加熱処理（４６℃で１０分間）を行い、評価サンプルとした。
（２－２）抗体結合性評価を指標としたスクリーニング
抗体結合性評価として以下のＥＬＩＳＡ法を実施した。
【0062】
ヒトＩｇＧを含む抗体製剤（人免疫グロブリン グロブリン筋注、日本薬局方製）をＤ－ＰＢＳ（－）緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１８時間静置しＩｇＧを固定化した。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、２％（ｗ／ｖ）のＳｋｉｍ Ｍｉｌｋ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製）を含むＤ－ＰＢＳ（－）を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３０℃で２時間静置しブロッキングを行った。洗浄緩衝液［５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０］を用いて各ウェルを洗浄した。各ウェルに５０μＬ／ｗｅｌｌの評価サンプル調整緩衝液［２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）、３００ｍＭ 塩化ナトリウム］を添加した。続いて、前記（２－１）で調製した評価サンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、混合後、３０℃で１時間静置し、固定化ＩｇＧと反応させた。反応後、洗浄緩衝液を用いて各ウェルを洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）［２％（ｗ／ｖ）のＳｋｉｍ Ｍｉｌｋを含む洗浄緩衝液で希釈］を各ウェルに添加し、３０℃で１時間静置した。洗浄緩衝液を用いて各ウェルを洗浄し、５０μＬ／ｗｅｌｌのＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（セラケアライフサイエンシーズ社製）を各ウェルに添加した。５０μＬ／ｗｅｌｌの１Ｍ リン酸を添加することで発色反応を止め、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0063】
ＥＬＩＳＡ法の４５０ｎｍの吸光度は、抗体結合性を有する組換えタンパク質量と相関する。組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７（比較対照：Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を生産）の培養上清と比較し、顕著に吸光度が増加した形質転換体をランダム変異体ライブリーから選抜した。選抜されたそれぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質候補
前記（２）のスクリーニングの結果、以下のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。
（３－１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ（アミノ酸配列：配列番号１４）をコードする塩基配列（配列番号１５）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを取得した。
（３－２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ（アミノ酸配列：配列番号１６）をコードする塩基配列（配列番号１７）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを取得した。
（３－３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１（アミノ酸配列：配列番号２）をコードする塩基配列（配列番号８）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を取得した。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質候補
前記（２）のスクリーニングの結果、以下のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。
（３－１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ（アミノ酸配列：配列番号１４）をコードする塩基配列（配列番号１５）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ８ａ、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを取得した。
（３－２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ（アミノ酸配列：配列番号１６）をコードする塩基配列（配列番号１７）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂ、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを取得した。
（３－３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１（アミノ酸配列：配列番号２）をコードする塩基配列（配列番号８）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を取得した。
【0064】
参考例１ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの製造と評価
実施例１の（３－１）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａのアミノ酸配列（配列番号１４）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの製造
製造は、実施例１の（３－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの発現量は５０ｍｇ／Ｌであった。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１７±４μＭ（ｎ＝４）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例１の（３－１）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａのアミノ酸配列（配列番号１４）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの製造
製造は、実施例１の（３－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－１）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの発現量は５０ｍｇ／Ｌであった。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ａのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１７±４μＭ（ｎ＝４）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
【0065】
参考例２ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの製造と評価
実施例１の（３－２）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂのアミノ酸配列（配列番号１６）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの製造
製造は、実施例１の（３－２）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－２）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの発現量は３８ｍｇ／Ｌであった。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１６±６μＭ（ｎ＝４）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例１の（３－２）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂのアミノ酸配列（配列番号１６）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの製造
製造は、実施例１の（３－２）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－２）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの発現量は３８ｍｇ／Ｌであった。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ８ｂのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１６±６μＭ（ｎ＝４）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
【0066】
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の製造と評価
実施例１の（３－３）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１のアミノ酸配列（配列番号２）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の製造
製造は、実施例１の（３－３）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－３）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の発現量は６９ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）および置換（Ｄ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１を用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は８±３μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの製造と評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａのアミノ酸配列を配列番号３に示す。なお、配列番号３において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号３において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａをコードする塩基配列（配列番号９）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの作製は、下記の方法で行った。
実施例１の（３－３）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１のアミノ酸配列（配列番号２）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）が生じたアミノ酸配列である。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の製造
製造は、実施例１の（３－３）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の生産性評価
生産性評価は、実施例１の（３－３）に記載の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＦｃＲｎ＿ｍ１１を使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の発現量は６９ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）および置換（Ｄ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１を用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１１のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は８±３μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの製造と評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａのアミノ酸配列を配列番号３に示す。なお、配列番号３において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号３において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａをコードする塩基配列（配列番号９）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの作製は、下記の方法で行った。
【0067】
実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号１２および配列番号１８に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、比較例１の（１－１）と同様の方法によりＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｃＩで消化した。さらに、実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号１９および配列番号２０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、同様にＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理した比較例１の（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａには配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号９の塩基配列が含まれることを確認した。
【0068】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの製造は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの発現量は１２５ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｅ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１８±１１μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの製造と評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂのアミノ酸配列を配列番号４に示す。なお、配列番号４において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号４において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂをコードする塩基配列（配列番号１０）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの作製は、下記の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの発現量は１２５ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｅ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ａのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１８±１１μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの製造と評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂのアミノ酸配列を配列番号４に示す。なお、配列番号４において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号４において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂをコードする塩基配列（配列番号１０）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの作製は、下記の方法で行った。
【0069】
実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号１２および配列番号２１に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、比較例１の（１－１）と同様の方法によりＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｃＩで消化した。さらに、実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号２２および配列番号２０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、同様にＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの制限酵素消化産物を制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理した比較例１の（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂには配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１０の塩基配列が含まれることを確認した。
【0070】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの製造は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの発現量は１５９ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｆ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１５±８μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの発現量は１５９ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）および置換（Ｆ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂを用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１２ｂのヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１５±８μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
【0071】
実施例５ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の製造と評価
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３のアミノ酸配列を配列番号５に示す。なお、配列番号５において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換））および置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号５において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３をコードする塩基配列（配列番号１１）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３およびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３の作製は、下記の方法で行った。
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３のアミノ酸配列を配列番号５に示す。なお、配列番号５において、その１番目のメチオニンから４３１番目のセリンまでは、配列番号１の１番目のメチオニンから４３１番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換（Ａ）（配列番号１の２１４番目のバリンがアスパラギン酸に置換）、置換（Ｂ）（配列番号１の２３０番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｃ）（配列番号１の２４２番目のリジンがグルタミン酸に置換）および置換（Ｄ）（配列番号１の４００番目のリジンがグルタミン酸に置換）、置換（Ｅ）（配列番号１の３０６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換））および置換（Ｆ）（配列番号１の３１５番目のセリンがスレオニンに置換）が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号５において、その４３２番目のロイシンから４３９番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の製造
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３をコードする塩基配列（配列番号１１）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３およびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３の作製は、下記の方法で行った。
【0072】
実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号１２および配列番号１８に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、比較例１の（１－１）と同様の方法によりＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｃＩで消化した。さらに、実施例１の（３－３）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１１を鋳型として、配列番号２２および配列番号２０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、同様にＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの制限酵素消化産物を制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理した比較例１の（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７とライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３を得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３には配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１１の塩基配列が含まれることを確認した。
【0073】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の製造は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３を使用して比較例１の（１－２）と同様の方法で行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３を使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の発現量は１５６ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）、置換（Ｅ）および置換（Ｆ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３を用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１２±１μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
（４）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の熱安定性評価
精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３を用いて、比較例１の（４）と同様の方法で熱安定性評価を行った。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ１３を使用して比較例１の（２）と同様の方法で行った。比較例１の（１）で作製した精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７を濃度の標準として使用した。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の発現量は１５６ｍｇ／Ｌであり、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の発現量（４５ｍｇ／Ｌ）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）、置換（Ｅ）および置換（Ｆ）を有することで生産性が向上した（表１）。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３を用いて、比較例１の（３）と同様の方法で行った。その結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値は１２±１μＭ（ｎ＝３）であった。この値は、比較例１に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７のヒト抗体に対する解離定数（ＫＤ）の値（１０±４μＭ）に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
（４）Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の熱安定性評価
精製済みのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３を用いて、比較例１の（４）と同様の方法で熱安定性評価を行った。
【0074】
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ１３の変性中点は６４±２℃（ｎ＝２）であり、比較例１の（４）に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７の変性中点（６０±２℃）より高く、前記の置換（Ａ）、置換（Ｂ）、置換（Ｃ）、置換（Ｄ）、置換（Ｅ）および置換（Ｆ）を有することで熱安定性が向上したことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【0075】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ＩｇＧまたはＦｃ融合タンパク質を分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
【配列表】