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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-14
(45)【発行日】2024-02-22
(54)【発明の名称】ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ切断方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240215BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20240215BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
C12N9/22 ZNA
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020049242
(22)【出願日】2020-03-19
(65)【公開番号】P2021145616
(43)【公開日】2021-09-27
【審査請求日】2022-12-28
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発／植物の生産性制御に係る共通基盤技術開発ゲノム編集の国産技術基盤プラットフォームの確立」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮岸 真
(72)【発明者】
【氏名】猪股 梨華
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－０００１１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－１２５６８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／１０８５７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００５／０８３０７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００５－２７００９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Runjhun Saran et al.，Searching for a DNAzyme Version of the Leadzyme，J Mol Evol，2015年，Vol.81，pp.235-244
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００ － ９／９９
１５／００ － １５／９０
Ｃ４０Ｂ １０／００
４０／０２
４０／０６ － ４０／１０
５０／０６
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素であり、標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、第１のアーム領域と前記コア領域との間及び第２のアーム領域と前記コア領域との間はそれぞれ直に接しており、
前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、若しくは５’－ＧＧ－３’である塩基配列からなる領域であり、かつ、前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、若しくは５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列からなる領域であるか、又は、
前記コア領域が、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、若しくは５’－ＧＣＡ－３’である塩基配列からなる領域であり、かつ、前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＧＡＡＧ－３’である塩基配列からなる領域である、
ＤＮＡ酵素。
【請求項2】
前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、請求項１に記載のＤＮＡ酵素。
【請求項3】
前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ酵素。
【請求項4】
亜鉛存在下において標的ＲＮＡをＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含み、前記ＤＮＡ酵素が、前記標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、第１のアーム領域と前記コア領域との間及び第２のアーム領域と前記コア領域との間はそれぞれ直に接しており、
前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、若しくは５’－ＧＧ－３’である塩基配列からなる領域であり、かつ、前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、若しくは５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列からなる領域であるか、又は、
前記コア領域が、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、若しくは５’－ＧＣＡ－３’である塩基配列からなる領域であり、かつ、前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＧＡＡＧ－３’である塩基配列からなる領域である、ＤＮＡ酵素である、
ＲＮＡ切断方法。
【請求項5】
前記切断工程における亜鉛濃度が０．０１～３０ｍＭである、請求項４に記載のＲＮＡ切断方法。
【請求項6】
前記切断工程におけるｐＨが５．５～９である、請求項４又は５に記載のＲＮＡ切断方法。
【請求項7】
前記ＤＮＡ酵素の前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、請求項４～６のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
【請求項8】
前記ＤＮＡ酵素において、前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、請求項４～７のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ切断方法に関し、より詳しくは、亜鉛存在下で標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素及び亜鉛存在下で標的ＲＮＡをＤＮＡ酵素で切断せしめるＲＮＡ切断方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素活性を有するＲＮＡであるリボザイムが見い出されて以降、これまで、様々なリボザイムが発見されている（Ｃ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒ－Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ，１９８３，３５，ｐ．８４９－８５７（非特許文献１）等）。リボザイムは、基質ＲＮＡと相補的な塩基対を形成することによって基質ＲＮＡと結合し、これを切断するが、このとき、マグネシウムやカルシウム等の金属を必要とすることが知られている。
【0003】
また近年では、酵素活性を有するＤＮＡであるデオキシリボザイム（ＤＮＡ酵素）も見い出されている。ＤＮＡ酵素は、リボザイムよりも化学的に安定で調製や取り扱いが容易である。また、特定のＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素は、有害遺伝子のｍＲＮＡを切断する遺伝子治療等のツールとしても注目が集まっている。
【0004】
このようなＤＮＡ酵素としては、例えば、米国特許第１０２８７５７８号明細書（特許文献１）において、１０－２３ＤＮＡ酵素及び８－１７ＤＮＡ酵素から選択されるＤＮＡ酵素がリンカーを介してナノ粒子に結合した化合物が開示されており、オーストラリア特許第１９９８９４０３８号明細書（特許文献２）において、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の構造の核酸が開示されている。また、Ｊｉｎｇ Ｌｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，ｐ．４８１－４８８（非特許文献２）においては、亜鉛依存型のＲＮＡ切断活性を有するＤＮＡ酵素が開示されており、Ｈｏｎｇｚｈｏｕ Ｇｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，２４，ｐ．９１２１－９１２９（非特許文献３）においては、亜鉛存在下でＤＮＡ切断活性を有するＤＮＡ酵素（Ｉ－Ｒ３等）が開示されている。
【0005】
しかしながら、従来のＤＮＡ酵素では、活性中心となるコア配列の塩基数が多いため（例えば、非特許文献２に記載のＤＮＡ酵素では、５’－Ｘ３ＡＧＣＹ３ＴＣＧＡＡ－３’の１４塩基）、前記コア配列を含むＤＮＡ酵素の大量調製や、基質配列によっては基質核酸との正確なホールディングが困難となる場合があり、よりシンプルで短いコア配列を有するＤＮＡ酵素の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】米国特許第１０２８７５７８号明細書
【文献】オーストラリア特許第１９９８９４０３８号明細書
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｃ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒ－Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ，１９８３，３５，ｐ．８４９－８５７
【文献】Ｊｉｎｇ Ｌｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，ｐ．４８１－４８８
【文献】Ｈｏｎｇｚｈｏｕ Ｇｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，２４，ｐ．９１２１－９１２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、活性中心の塩基数が十分に少ない、特定のＲＮＡを切断することが可能なＤＮＡ酵素、及びそれを用いたＲＮＡ切断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、先ず、ビーズに結合させたＤＮＡ中に３塩基のＲＮＡ（５’－ｇａａ－３’）が挿入されてなる基質核酸と、同基質核酸のＤＮＡの配列と二本鎖を形成するＤＮＡ中に１０塩基のＤＮＡ（Ｎ×１０）からなるランダム領域が挿入されてなる核酸（ライブラリ核酸）からなる核酸ライブラリーと、をそれぞれ合成した。なお、前記二本鎖を形成するＤＮＡ配列は、ＤＮＡ切断活性を有するＤＮＡ酵素（例えば、非特許文献３に記載のＩ－Ｒ３等）の基質－ＤＮＡ酵素の配列を基に構築した。次いで、これらを用いてＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法によるスクリーニングを行うことにより、ＲＮＡ切断活性を有するＤＮＡ酵素を取得した。すなわち、前記基質核酸と前記核酸ライブラリー中のライブラリ核酸とをアニーリングさせると、当該ライブラリ核酸のランダム領域がＲＮＡ切断活性中心を含む場合には、前記基質核酸のＲＮＡ部分が切断されて当該ＲＮＡ切断活性中心を含むライブラリ核酸が溶液中に再リリースされる。これを利用して、前記再リリースされたライブラリ核酸をＰＣＲで増幅して配列を解析することにより、前記核酸ライブラリーから、ＲＮＡ切断活性中心を含むＤＮＡ酵素を取得した。さらに、本発明者らは、前記ＲＮＡ切断活性中心を含むランダム領域を最小化することにより、当該活性中心の塩基数を２～３塩基にまで、十分に少なくすることに成功した。
【0010】
また本発明者らは、このＤＮＡ酵素は前記基質核酸の塩基を全てＲＮＡの塩基に置き換えても当該基質核酸の切断活性を有する、すなわち確かにＲＮＡ切断活性を有するＤＮＡ酵素であり、特に亜鉛存在下で、基質配列特異的に触媒活性（エンドリボヌクレアーゼ活性）を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
かかる知見により得られた本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素であり、
標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、
ＤＮＡ酵素。
［２］
前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、又は５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列を含む領域である、
［１］に記載のＤＮＡ酵素。
［３］
前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、［１］又は［２］に記載のＤＮＡ酵素。
［４］
前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ酵素。
［５］
亜鉛存在下において標的ＲＮＡをＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含み、
前記ＤＮＡ酵素が、前記標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、ＤＮＡ酵素である、
ＲＮＡ切断方法。
［６］
前記切断工程における亜鉛濃度が０．０１～３０ｍＭである、［５］に記載のＲＮＡ切断方法。
［７］
前記切断工程におけるｐＨが５．５～９である、［５］又は［６］に記載のＲＮＡ切断方法。
［８］
前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、又は５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列を含む領域である、
［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
［９］
前記ＤＮＡ酵素の前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、［５］～［８］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
［１０］
前記ＤＮＡ酵素において、前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、［５］～［９］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
［１］
亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素であり、
標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、
ＤＮＡ酵素。
［２］
前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、又は５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列を含む領域である、
［１］に記載のＤＮＡ酵素。
［３］
前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、［１］又は［２］に記載のＤＮＡ酵素。
［４］
前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のＤＮＡ酵素。
［５］
亜鉛存在下において標的ＲＮＡをＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含み、
前記ＤＮＡ酵素が、前記標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、ＤＮＡ酵素である、
ＲＮＡ切断方法。
［６］
前記切断工程における亜鉛濃度が０．０１～３０ｍＭである、［５］に記載のＲＮＡ切断方法。
［７］
前記切断工程におけるｐＨが５．５～９である、［５］又は［６］に記載のＲＮＡ切断方法。
［８］
前記標的ＲＮＡの被切断領域が、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、又は５’－ＵＡＧ－３’である塩基配列を含む領域である、
［５］～［７］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
［９］
前記ＤＮＡ酵素の前記第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数が、それぞれ独立に、４塩基以上である、［５］～［８］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
［１０］
前記ＤＮＡ酵素において、前記第１のアーム領域、前記コア領域、及び前記第２のアーム領域の合計塩基数が１０～３７塩基である、［５］～［９］のうちのいずれか一項に記載のＲＮＡ切断方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、活性中心の塩基数が十分に少ない、特定のＲＮＡを切断することが可能なＤＮＡ酵素、及びそれを用いたＲＮＡ切断方法を提供することが可能となる。本発明のＤＮＡ酵素は、活性中心の塩基数が十分に少ないことにより、より安価で提供することができ、かつ、より安定に様々な配列の基質核酸を認識することができる。さらに、本発明のＤＮＡ酵素は、亜鉛存在下において特異的に機能するため、細胞内における使用や亜鉛の検出等にも有効である。また、本発明のＤＮＡ酵素は、核酸アプタマー等と結合させることにより、アロストリックリボザイムのように、ターゲット分子を検出するシステムとして使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施例の「１．核酸酵素の取得」において用いた基質核酸及びライブラリ核酸の構成を示す模式図である。
【図2】実施例の「１．核酸酵素の取得」におけるスクリーニングの手法を示す模式図である。
【図3】スクリーニングでピックアップした核酸酵素候補（ｓ１～ｓ５）による基質核酸（Ｓｕｂ１）の切断活性確認の変性アクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図4】スクリーニングでピックアップした核酸酵素と基質核酸との間において想定される二次構造を示す模式図である。
【図5】実施例の「２．核酸酵素の最小化」において用いた核酸酵素（ｓ１、ｓ６、ｓ７）及び基質核酸の構成を示す模式図である。
【図6】実施例の「２．核酸酵素の最小化」における、核酸酵素（ｓ１、ｓ６、ｓ７、ＩＲ３）による基質核酸（Ｓｕｂ２）の切断活性確認の変性アクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図7】実施例の「２．核酸酵素の最小化」における、核酸酵素（ｓ１）による基質核酸（Ｓｕｂ３）の切断活性確認の変性アクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図8】実施例の「３．核酸酵素の特性解析」においてｐＨ依存性評価で得られた、反応液のｐＨと切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフである。
【図9】実施例の「３．核酸酵素の特性解析」において亜鉛濃度依存性評価で得られた、反応液のＺｎイオン濃度（Ｚｎ（ｍＭ））と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフである。
【図10】実施例の「３．核酸酵素の特性解析」において金属イオン選択性評価で得られた、反応液の金属種及びその濃度（ｍＭ）と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフである。
【図11】実施例の「４．核酸酵素の反応速度解析」において得られた、反応時間と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフである。
【図12】実施例の「５．核酸酵素のコア領域の配列依存性評価」において得られた、置換したコア領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２－３’）と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフである。
【図13】実施例の「６．核酸酵素の切断部位の解析」において用いた自己切断型核酸酵素の構成を示す模式図である。
【図14】実施例の「６．核酸酵素の切断部位の解析」において得られた、ＬＣ－Ｍａｓｓスペクトル解析の結果を示すグラフである。
【図15】実施例の「７．基質の被切断領域の配列依存性評価」における、核酸酵素（ｓ７）による基質核酸（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ４～Ｓｕｂ６）の切断活性確認の変性アクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図16】実施例の「７．基質の被切断領域の配列依存性評価」において得られた、置換した塩基配列（基質コア置換配列）と切断残存率との関係を示すグラフである。
【図17】実施例の「８．核酸酵素のスクリーニングによる再取得」において用いた基質核酸及びライブラリ核酸の構成を示す模式図である。
【図18】実施例の「８．核酸酵素のスクリーニングによる再取得」において得られた、ランダム領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３－３’）とそのリード数（Ｎｕｍｂｅｒ）との関係を示すグラフ（ａ）、ランダム領域の塩基配列と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係（ｂ）を示すヒートマップである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0015】
本発明のＤＮＡ酵素は、
亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素であり、
標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、
ＤＮＡ酵素である。また、本発明のＲＮＡ切断方法は、亜鉛存在下において標的ＲＮＡを前記ＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含む、方法である。
亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する活性を有するＤＮＡ酵素であり、
標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第１のアーム領域、コア領域、及び前記標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域とハイブリダイズ可能な第２のアーム領域、を５’側からこの順で含み、かつ、前記コア領域が、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’である塩基配列を含む７塩基以下の領域である、
ＤＮＡ酵素である。また、本発明のＲＮＡ切断方法は、亜鉛存在下において標的ＲＮＡを前記ＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含む、方法である。
【0016】
（ＤＮＡ酵素）
「ＤＮＡ酵素」とは、酵素活性（触媒活性）を有する一本鎖ＤＮＡであり、「デオキシリボザイム」、「触媒ＤＮＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＤＮＡ）」、「ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）」としても知られている。本発明において、「ＤＮＡ］とは、２個以上のデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。
「ＤＮＡ酵素」とは、酵素活性（触媒活性）を有する一本鎖ＤＮＡであり、「デオキシリボザイム」、「触媒ＤＮＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＤＮＡ）」、「ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）」としても知られている。本発明において、「ＤＮＡ］とは、２個以上のデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。
【0017】
本発明のＤＮＡ酵素は、ＲＮＡを標的として、当該標的ＲＮＡを切断する活性（エンドリボヌクレアーゼ活性）を有するものであり、当該活性を有している限り、その全部又は一部に修飾核酸を含むものであってもよい。
【0018】
本明細書において、「修飾核酸」とは、非天然ヌクレオチドにより構成される核酸、又は非天然核酸をいう。ここで、「非天然ヌクレオチド」とは、天然には存在しない人工的な化学修飾を塩基又は糖を含むヌクレオチドであって、天然のヌクレオチドと同様の性質／構造を有するものをいう。種々の非天然ヌクレオチドが公知であり、例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’－デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β－Ｌ－デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾（例えば、置換五単糖（２’－Ｏ－メチルリボース、２’－デオキシ－２’－フルオロリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、１’， ２’－デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖、置換六単糖、α－アノマー糖等）を有するヌクレオシドを含む非天然ヌクレオチドが挙げられる。また、本明細書における非天然ヌクレオチドは、塩基アナログ又は修飾塩基を含むヌクレオチドであってもよい。前記塩基アナログには、例えば、２－オキソ（１Ｈ）－ピリジン－３－イル基、５位置換－２－オキソ（１Ｈ）－ピリジン－３－イル基、２－アミノ－６－（２－チアゾリル）プリン－９－イル基、２－アミノ－６－（２－チアゾリル）プリン－９－イル基、２－アミノ－６－（２－オキサゾリル）プリン－９－イル基が挙げられる。前記修飾塩基には、例えば、修飾ピリミジン（例えば、５－ヒドロキシシトシン、５－フルオロウラシル、４－チオウラシル）、修飾プリン（例えば、６－メチルアデニン、６－チオグアノシン）、及びその他の複素環塩基が挙げられる。また、本明細書において、「非天然核酸」とは、その骨格に天然には存在しない人工的な化学修飾が導入された核酸アナログであって、天然の核酸と同様の性質／構造を有するものをいう。非天然核酸には、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋化核酸、モルホリノ核酸、トリアゾール連結核酸、メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡが挙げられる。
【0019】
本発明のＤＮＡ酵素は、第１のアーム領域及び第２のアーム領域と、第１のアーム領域及び第２のアーム領域に挟まれたコア領域と、を含む。すなわち、本発明のＤＮＡ酵素は、５’側から、第１のアーム領域、コア領域、及び第２のアーム領域をこの順で含む。
【0020】
本発明のＤＮＡ酵素における「コア領域」は、ＲＮＡ切断の活性中心となる塩基配列を含む領域を示す。このようなＲＮＡ切断の活性中心となる塩基配列（以下、場合により「コア配列」という）としては、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＧＡ－３’、５’－ＧＴ－３’、５’－ＧＧ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＧＣＴ－３’、又は５’－ＣＣＡ－３’であることが好ましく、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、又は５’－ＧＣＡ－３’であることがより好ましく、５’－ＡＣ－３’、５’－ＡＡ－３’、５’－ＡＴ－３’、５’－ＡＧ－３’、５’－ＧＣ－３’、又は５’－ＡＣＡ－３’であることがさらに好ましく、５’－ＡＣ－３’であることが特に好ましい。
【0021】
本発明に係るコア領域には、本発明の効果が阻害されない限り、前記コア配列の他に、第１のアーム領域との間、及び／又は、第２のアーム領域との間に、さらに他の塩基（介在塩基）を含んでいてもよい。このような介在塩基が含まれる場合、その塩基数としては、１コア領域あたり、５塩基以下であることが好ましく、１～３塩基であることが好ましい。また、本発明に係るコア領域の全塩基数（前記コア配列の塩基数と前記介在塩基数との合計）としては、７塩基以下であることが好ましく、２～６塩基であることが好ましい。本発明のＤＮＡ酵素において、第１のアーム領域と前記コア配列との間、及び／又は、第２のアーム領域と前記コア配列との間は、かかる介在塩基を介して接していてもよいが、ＤＮＡ酵素をより最小化する観点からいずれも直に接していることが好ましい。
【0022】
前記コア領域の５’側に隣接する第１のアーム領域は標的ＲＮＡの被切断領域の３’側に隣接する領域（以下、場合により「基質３’領域」という）と、前記コア領域の３’側に隣接する第２のアーム領域は標的ＲＮＡの被切断領域の５’側に隣接する領域（以下、場合により「基質５’領域」という）と、それぞれハイブリダイズ可能な領域である。
【0023】
本発明において、前記基質３’領域及び基質５’領域とそれぞれ「ハイブリダイズ可能な領域」とは、典型的には、当該基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列に対してそれぞれ相補的な塩基配列からなる領域を示すが、当該基質３’領域及び基質５’領域とそれぞれハイブリダイズする限り完全に相補的でなくともよい。
【0024】
本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列としては、互いに独立して、それぞれ、第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を４塩基以下（好ましくは４塩基）とする場合には、後述する基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（４塩基以下）に対してそれぞれ相補的、すなわち、配列相補性が１００％であることが好ましい。
【0025】
他方、互いに独立して、それぞれ、第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を５～６塩基とする場合には、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（５～６塩基）に対して、それぞれ、そのうちの４～６塩基に対して相補的であることが好ましい。また、この場合には、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（５～６塩基）に対して、少なくとも、６５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列相補性を有していることが好ましい。
【0026】
さらに、互いに独立して、それぞれ、第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を７塩基以上とする場合には、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（７塩基以上）に対して、それぞれ、そのうちの４塩基～全長に対して相補的であることが好ましい。また、この場合には、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（７塩基以上）に対して、少なくとも、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列相補性を有していることが好ましい。
【0027】
或いは、互いに独立して、それぞれ、第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を５塩基以上とする場合には、それぞれ、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列の全長（５塩基以上）に対して相補的な塩基配列の１～複数個所において、連続して１～５塩基（好ましくは１～３塩基）の塩基が挿入、欠失、又は置換されたものであってもよい。なお、前記配列相補性は、当業者であれば公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いて適宜計算することができる。
【0028】
本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、標的ＲＮＡの被切断領域の両端に位置する基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列に合わせて、適宜設計することができる。
【0029】
本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数としては、それぞれ独立に、４塩基以上であることが好ましく、６塩基以上であることがより好ましく、９塩基以上であることがさらに好ましい。本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基数の上限としては、特に限定されず、基質３’領域及び基質５’領域にそれぞれ上記の条件でハイブリダイズする限り多くすることができるが、例えば、サイズの最小化という観点からは、１５塩基が挙げられる。
【0030】
本発明のＤＮＡ酵素のサイズとしては、標的ＲＮＡを切断する活性を有するものであれば特に限定はされないが、サイズの最小化という観点から、第１のアーム領域、コア領域、及び第２のアーム領域の合計塩基数の下限を、好ましくは１０塩基、より好ましくは１２塩基、さらに好ましくは１４塩基とすることができる。第１のアーム領域、コア領域、及び第２のアーム領域の合計塩基数の上限としては特に限定されないが、例えば、サイズの最小化という観点からは、３７塩基が挙げられる。
【0031】
本発明のＤＮＡ酵素としては、本発明の効果が阻害されない限り、第１のアーム領域の５’側、及び／又は、第２のアーム領域の３’側に、基質３’領域及び基質５’領域とのハイブリダイズに寄与しない領域をさらに含んでいてもよい。この場合のＤＮＡ酵素のサイズとしては、特に制限されない。
【0032】
このようなＤＮＡ酵素を得る方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法によって適宜得ることができる。例えば、標的ＲＮＡの塩基配列に基づく第１のアーム領域及び第２のアーム領域並びに上記のコア領域の塩基配列から、市販の合成機によって化学的に合成して合成ＤＮＡを取得する方法、大腸菌等の宿主細胞で前記合成ＤＮＡを挿入したプラスミドを増殖させてプラスミドとして取得する方法、前記合成ＤＮＡからＰＣＲ等による増幅によって取得する方法が挙げられる。
【0033】
本発明のＤＮＡ酵素としては、本発明の効果が阻害されない限り特に制限されず、例えば、ペプチド、ペプチド疑似物、ウイルス由来タンパク質、コレステロール、ステロイド、コレステロール誘導体、脂肪、ビタミン、ビオチン、葉酸、レチン酸、タンパク質、フェリチン、ＬＤＬ、インスリン、抗体、糖若しくはオリゴ糖、ポリエチレングリコール、及びアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種に結合していてもよい。
【0034】
また、本発明のＤＮＡ酵素としては、本発明の効果が阻害されない限り特に制限されず、例えば、プラスチックプレートなどのプレート、ニトロセルロースなどの繊維状物質、金属粒子やラテックス粒子などの粒子といった固相に結合して固定されていてもよい。
【0035】
（標的ＲＮＡ）
本発明において、「標的ＲＮＡ」とは、本発明のＤＮＡ酵素により触媒作用を受ける（切断される）ＲＮＡであって、本発明のＤＮＡ酵素の基質に相当するＲＮＡを示す。また、本発明において、「ＲＮＡ」とは、２個以上のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。
本発明において、「標的ＲＮＡ」とは、本発明のＤＮＡ酵素により触媒作用を受ける（切断される）ＲＮＡであって、本発明のＤＮＡ酵素の基質に相当するＲＮＡを示す。また、本発明において、「ＲＮＡ」とは、２個以上のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。
【0036】
本発明に係る標的ＲＮＡとしては、一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。一本鎖ＲＮＡは、下記の被切断領域を有し、本発明のＤＮＡ酵素に切断されうるものであれば特に制限されず、ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造等の３次元構造を有するものであってよく、その全部又は一部に前記修飾核酸を含むものであってもよい。また、天然由来のＲＮＡであっても、市販の合成機によって化学合成されたＲＮＡ、或いは、試験管内で転写によって合成されたＲＮＡであってもよい。天然の一本鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡやｔＲＮＡなどが挙げられる。
【0037】
また、本発明に係る標的ＲＮＡの一部はＤＮＡであってもよい。本発明に係る標的ＲＮＡとしては、少なくとも下記の基質コア配列の５’側に隣接する１塩基はＲＮＡである必要があるが、それ以外においては、下記の基質５’領域、基質３’領域、及び被切断領域の全部又は一部の塩基はＤＮＡであってもよい。
【0038】
本発明に係る標的ＲＮＡは、本発明のＤＮＡ酵素に切断される被切断領域と、前記被切断領域の３’側に隣接する領域（基質３’領域）と、前記被切断領域の５’側に隣接する領域（基質５’領域）と、を含む。すなわち、本発明に係る標的ＲＮＡは、５’側から、基質５’領域、被切断領域、及び基質３’領域をこの順で含む。
【0039】
本発明に係る標的ＲＮＡにおける「被切断領域」は、本発明のＤＮＡ酵素に認識される塩基配列を含み、当該ＤＮＡ酵素に切断される領域を示す。このようなＤＮＡ酵素に認識される塩基配列（以下、場合により「基質コア配列」という）としては、５’－ＡＡＧ－３’、５’－ＣＡＧ－３’、又は５’－ＵＡＧ－３’であり、５’－ＡＡＧ－３’又は５’－ＣＡＧ－３’であることがより好ましく、５’－ＡＡＧ－３’であることがさらに好ましい。
【0040】
前記被切断領域には、本発明の効果が阻害されない限り、前記基質コア配列の他に、前記基質５’領域との間に、さらに他の塩基（介在塩基）を含んでいてもよい。このような介在塩基が含まれる場合、その塩基数としては、１０塩基以下であることが好ましく、１～３塩基であることがより好ましい。また、本発明に係る被切断領域の全塩基数（前記基質コア配列の塩基数と前記介在塩基数との合計）としては、１３塩基以下であることが好ましく、３～６塩基であることが好ましい。本発明に係る標的ＲＮＡにおいて、前記基質５’領域と前記基質コア配列との間は、かかる介在塩基を介して接していてもよいが、切断効率の観点から直に接していることが好ましい。
【0041】
本発明において、前記被切断領域の３’側に隣接する基質３’領域、及び前記被切断領域の５’側に隣接する基質５’領域は、それぞれ、本発明のＤＮＡ酵素の第１のアーム領域及び第２のアーム領域がハイブリダイズ可能な領域を示す。当該第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列に合わせて、適宜設計することができる。
【0042】
このような基質３’領域及び基質５’領域の位置、すなわち、本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域のハイブリダイズの対象となる基質３’領域及び基質５’領域の位置としては、少なくとも、前記基質３’領域は前記被切断領域の３’末に隣接する１塩基目から３’末方向に、前記基質５’領域は前記被切断領域の５’末に隣接する１塩基目から５’末方向に、互いに独立して、それぞれ、５０塩基目迄の範囲内にあることが好ましく、より好ましくは、前記１塩基目～１５塩基目迄の範囲内、前記１塩基目～９塩基目迄の範囲内、前記１塩基目～６塩基目迄の範囲内にあることが好ましい。
【0043】
前記基質３’領域及び基質５’領域の塩基数（本発明に係る第１のアーム領域及び第２のアーム領域のハイブリダイズの対象となる全長）としては、それぞれ独立に、４塩基以上であることが好ましく、６塩基以上であることがより好ましく、９塩基以上であることがさらに好ましい。前記基質３’領域及び基質５’領域の全長の上限としては、特に限定されず、長い範囲を選択して、これに合わせて第１のアーム領域及び第２のアーム領域を設計してもよいが、例えば、ＤＮＡ酵素のサイズの最小化という観点からは、１５塩基が挙げられる。
【0044】
また、本発明に係る標的ＲＮＡにおいて、上記の基質３’領域、被切断領域、及び基質５’領域の合計塩基数としては、特に限定されないが、サイズの最小化という観点から、その下限を、好ましくは１１塩基、より好ましくは１３塩基、さらに好ましくは１５塩基、さらにより好ましくは１７塩基とすることができる。前記基質３’領域、被切断領域、及び基質５’領域の合計塩基数の上限としては特に限定されないが、例えば、サイズの最小化という観点からは、それぞれ独立に、２５塩基、２３塩基、２１塩基が挙げられる。
【0045】
本発明に係る標的ＲＮＡとしては、本発明の効果が阻害されない限り、前記基質３’領域の３’側、及び／又は、前記基質５’領域の５’側に、第１のアーム領域及び第２のアーム領域とのハイブリダイズに寄与しない領域をさらに含んでいてもよく、これらの領域は、塩基配列や機能が既知でなくともよい。また、本発明に係る標的ＲＮＡのサイズとしては、上記の基質３’領域、被切断領域、及び基質５’領域を含むものであれば特に制限されない。
【0046】
さらに、本発明に係る標的ＲＮＡとしては、特に制限されず、目的に応じて、細胞内に存在するＲＮＡ又は細胞外に存在するＲＮＡとすることができる。細胞内に存在するＲＮＡとしては、内因性ＲＮＡであっても、外因性ＲＮＡであってもよい。内因性ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ，ノンコーディングＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等の、細胞内でゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡが挙げられる。外因性ＲＮＡとしては、例えば、細胞内に導入したＲＮＡやプラスミドベクター等によって細胞内で発現させたＲＮＡ、感染したウイルス由来のＲＮＡが挙げられる。細胞外に存在するＲＮＡとしては、細胞に由来するＲＮＡであっても、細胞外で転写させたＲＮＡであっても、化学合成したＲＮＡであってもよい。細胞内での外因性ＲＮＡの転写は、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞内に導入することにより行うことができる。
【0047】
このような標的ＲＮＡは試料中に含まれるものであってもよく、前記試料としては特に制限されず、例えば、化学合成したＲＮＡを含む溶液の他、各種生物（細胞、組織、器官、個体）及びその抽出液；ヒト及び動物の体液（唾液、涙、汗、尿、血液、リンパ液等）；植物生体液；生物培養液；環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）；固形物（土壌、燃え殻等）の懸濁液等を目的に応じて適宜用いることができる。また、前記試料としては、前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させる前に、適宜、希釈液で適宜希釈又は懸濁したものであっても、ｐＨ調整したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液である。
【0048】
（ＲＮＡ切断活性）
本発明のＤＮＡ酵素は、亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する酵素活性（ＲＮＡ切断活性、エンドリボヌクレアーゼ活性）を有する。なお、本発明において、ＤＮＡ酵素が前記ＲＮＡ切断活性を有することは、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ酵素と標的ＲＮＡとを反応液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中、３７℃で１時間静置後に当該反応液を電気泳動等することにより、前記標的ＲＮＡの断片の存在を指標として確認することができる。
本発明のＤＮＡ酵素は、亜鉛存在下において標的ＲＮＡを切断する酵素活性（ＲＮＡ切断活性、エンドリボヌクレアーゼ活性）を有する。なお、本発明において、ＤＮＡ酵素が前記ＲＮＡ切断活性を有することは、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ酵素と標的ＲＮＡとを反応液（例えば、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中、３７℃で１時間静置後に当該反応液を電気泳動等することにより、前記標的ＲＮＡの断片の存在を指標として確認することができる。
【0049】
本発明のＤＮＡ酵素は、亜鉛存在下でＲＮＡ切断活性を有する亜鉛依存型酵素である。このときの至適亜鉛濃度としては、前記標的ＲＮＡ、前記ＤＮＡ酵素、及び亜鉛を含む反応系において、０．０１～３０ｍＭであることが好ましく、０．１～３．０ｍＭであることがより好ましく、０．２～２．０ｍＭであることがさらに好ましく、０．５～１．５ｍＭであることがさらにより好ましい。
【0050】
また、本発明のＤＮＡ酵素の至適ｐＨとしては、前記標的ＲＮＡ、前記ＤＮＡ酵素、及び亜鉛を含む反応系において、５．５～９であることが好ましく、６．５～８であることがより好ましく、７．０～７．５であることがより好ましい。本発明のＤＮＡ酵素の前記標的ＲＮＡとの反応温度及び反応時間としては、適宜調整することができる。
【0051】
本発明のＤＮＡ酵素は、前記標的ＲＮＡの被切断領域のうちの少なくとも１箇所を切断する。このような切断箇所としては、前記基質コア配列の５’側、すなわち、基質コア配列が５’側からＡＡＧである場合にはその５’側１塩基目のＡと当該Ａの５’側に隣接する塩基との間、基質コア配列が５’側からＣＡＧである場合にはその５’側１塩基目のＣと当該Ｃの５’側に隣接する塩基との間、基質コア配列が５’側からＵＡＧである場合にはその５’側１塩基目のＵと当該Ｕの５’側に隣接する塩基との間が挙げられる。
【0052】
（ＲＮＡ切断方法）
本発明のＲＮＡ切断方法は、亜鉛存在下において前記標的ＲＮＡを本発明のＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含む方法である。本発明のＲＮＡ切断方法として、より具体的には、
前記標的ＲＮＡと本発明のＤＮＡ酵素とを接触させ、前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とをハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
亜鉛存在下において、前記標的ＲＮＡを前記ＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程と、
を含む方法であることが好ましい。前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させた後、これに亜鉛を添加すること等により、前記ハイブリダイズ工程の後に前記切断工程を行ってもよいが、前記ハイブリダイズ工程と前記切断工程とは、亜鉛存在下で前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させ、切断、解離を繰り返すことにより同時に行うこともできる。
本発明のＲＮＡ切断方法は、亜鉛存在下において前記標的ＲＮＡを本発明のＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程を含む方法である。本発明のＲＮＡ切断方法として、より具体的には、
前記標的ＲＮＡと本発明のＤＮＡ酵素とを接触させ、前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とをハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
亜鉛存在下において、前記標的ＲＮＡを前記ＤＮＡ酵素で切断せしめる切断工程と、
を含む方法であることが好ましい。前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させた後、これに亜鉛を添加すること等により、前記ハイブリダイズ工程の後に前記切断工程を行ってもよいが、前記ハイブリダイズ工程と前記切断工程とは、亜鉛存在下で前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させ、切断、解離を繰り返すことにより同時に行うこともできる。
【0053】
本発明のＲＮＡ切断方法は、細胞内において行っても、無細胞系において行ってもよい。本発明のＲＮＡ切断方法の場となる「細胞内」としては、真核細胞又は原核細胞内であることが好ましく、より好ましくは真核細胞内である。前記真核細胞としては、例えば、動物細胞（哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞等）、植物細胞、藻細胞、酵母が挙げられ、前記真正細菌細胞としては、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、乳酸菌、高度好熱菌が挙げられ、前記古細菌細胞としては、メタン菌、高度好塩菌、超好熱菌、高熱好酸菌が挙げられる。これらの細胞は、生体外で培養した状態（例えば、培地中又は培地上にて生育している細胞）であっても、生体内に存在する状態であってもよい。
【0054】
また、本発明のＲＮＡ切断方法の場となる「無細胞系」とは、生きた細胞（前記真核細胞、原核細胞）のない系を示す。本発明に係る無細胞系としては、前記標的ＲＮＡとＤＮＡ酵素とが接触可能な系であれば特に制限されず、例えば、緩衝液内；前記真核細胞又は原核細胞の細胞破砕液内、細胞抽出液内；細胞上清、生体の尿、血液（血清）、唾液等の試料の破砕液内、抽出液内等が挙げられる。
【0055】
前記ハイブリダイズ工程において、前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させる方法としては特に制限されない。細胞内においては、例えば、前記標的ＲＮＡを含む細胞に対して前記ＤＮＡ酵素を直接導入する方法が挙げられる。また、前記標的ＲＮＡを含む細胞として、細胞内に存在するＲＮＡが上記の外因性ＲＮＡである場合には、細胞内に標的ＲＮＡが直接導入されたものであっても、標的ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターの導入により細胞内で転写されたものであってもよい。
【0056】
上記の細胞にＤＮＡ酵素、標的ＲＮＡ、又は標的ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを導入する方法としては、当業者であれば、細胞の種類などに応じて、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ジーンガン法、リン酸カルシウム法、リポソーム法（リポフェクション法）、ナノパーティクル法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウィルス等）、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、熱ショック法（塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）等が挙げられる。このような方法は、「Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．Ｄａｖｉｓｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６」など、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【0057】
また、前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを接触させる方法として、無細胞系においては、例えば、標的ＲＮＡの溶液とＤＮＡ酵素の溶液とを混合すればよい。これらの溶液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が好ましい。
【0058】
前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素とを細胞内又は無細胞系で接触させることにより、前記標的ＲＮＡの基質３’領域と前記ＤＮＡ酵素の第１のアーム領域、及び、前記標的ＲＮＡの基質５’領域と前記ＤＮＡ酵素の第２のアーム領域、がそれぞれハイブリダイズされる。
【0059】
前記切断工程においては、亜鉛を共存させることにより、前記標的ＲＮＡを前記ＤＮＡ酵素で切断せしめることができる。前記亜鉛としては、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の状態であることが好ましい。
【0060】
前記亜鉛を共存させる方法として、細胞内においては、例えば、亜鉛の塩化物、硫化物、酸化物等の亜鉛化合物の溶液を、上記のＤＮＡ酵素を導入した又はする細胞を含む培地に添加する方法、亜鉛酸化物のナノパーティクルにＤＮＡ酵素を封入し、細胞に導入する方法（例えば、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１９ Ｍａｙ ２７；５８（２２）：７３８０－７３８４．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１９０２７１４．）が挙げられる。
【0061】
前記亜鉛を共存させる方法として、無細胞系においては、例えば、亜鉛の塩化物、硫化物、酸化物等の亜鉛化合物の溶液を前記標的ＲＮＡと前記ＤＮＡ酵素との混合溶液に添加するか、前記亜鉛化合物を前記標的ＲＮＡの溶液及び／又は前記ＤＮＡ酵素の溶液に予め添加しておくことが好ましい。前記各溶液の溶媒としては、前記緩衝液が挙げられる。
【0062】
このような切断工程における亜鉛濃度、ｐＨとしては、その好ましい範囲も含めて、前記ＤＮＡ酵素において述べたとおりである。
【0063】
さらに、このような切断工程における温度としては、例えば、２５～６５℃であることが好ましく、３０～５０℃であることがより好ましく、３５～４２℃であることがさらに好ましい。
【0064】
また、前記切断工程における時間としては、例えば、１０～３６０分間であることが好ましく、２０～１２０分間であることがより好ましく、３０～９０分間であることがさらに好ましい。
【0065】
（ＤＮＡ酵素、ＲＮＡ切断方法の利用）
本発明のＤＮＡ酵素は、標的ＲＮＡの被切断領域の１箇所を塩基配列特異的に切断することができるため、標的ＲＮＡの被切断領域（好ましくは基質コア配列）の両端の基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列に基づいて第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を調製することにより、当該標的ＲＮＡの切断工程を含む様々な方法に用いることができる。
本発明のＤＮＡ酵素は、標的ＲＮＡの被切断領域の１箇所を塩基配列特異的に切断することができるため、標的ＲＮＡの被切断領域（好ましくは基質コア配列）の両端の基質３’領域及び基質５’領域の塩基配列に基づいて第１のアーム領域及び第２のアーム領域の塩基配列を調製することにより、当該標的ＲＮＡの切断工程を含む様々な方法に用いることができる。
【0066】
例えば、標的ｍＲＮＡの一塩基多型を検出する方法として、本発明のＤＮＡ酵素の塩基配列特異性を利用し、ＲＣＡ法、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法と組み合わせて、検出することが可能である。また、本発明のＤＮＡ酵素のＲＮＡ切断活性を利用して、標的ｍＲＮＡを切断し、その切断されたｍＲＮＡをプライマーとして用い、ＲＣＡ法、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法と組み合わせて検出するシステムを構築することもできる。
【0067】
さらに、細胞内で特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的ＲＮＡとすることにより、当該特定のタンパク質に由来する機能を制御して、当該細胞やそれを含む組織、器官、個体の形質を変化させる方法（例えば、ヒトにおける疾患（ウイルス感染症、癌等）の予防や治療、モデル動物における疾患の発症、植物の品種改良、魚類の筋肉量増大、微生物における物質生産の増大）に用いることができる。また、例えば、疾患の原因となる遺伝子（癌遺伝子等）、ウイルス、病原菌のＲＮＡを標的ＲＮＡとすることにより、当該疾患の予防及び／又は治療方法に用いることもできる。さらに、例えば、二次構造が未知のＲＮＡを標的ＲＮＡとすることにより、その二次構造を分析する方法等に利用することもできる。
【0068】
さらに、本発明のＤＮＡ酵素のＲＮＡ切断活性は、亜鉛の存在に特異的に依存するため、例えば、標的ＲＮＡの切断活性を指標とする試料中の亜鉛検出方法にも用いることができる。かかる方法では、前記試料に本発明のＤＮＡ酵素とその標的ＲＮＡとを添加するとこれらがハイブリダイズし、前記試料中に亜鉛が存在する場合には前記標的ＲＮＡが切断されるため、当該標的ＲＮＡの切断が確認された場合には前記試料中に亜鉛が存在していると判定することができる。前記試料としては、亜鉛が存在しうる試料であれば特に制限されない。
【0069】
また、本発明のＤＮＡ酵素のＲＮＡ切断活性は、例えば、Ｙｏｎｇｙｕｎ Ｚｈａａｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２４９２に記載されているようなＲＮＡ増幅による標的ＲＮＡの検出方法にも用いることができる。
【0070】
さらに、本発明のＤＮＡ酵素のＲＮＡ切断活性は、アプタマーとＤＮＡ酵素とを結合させてアロステリック核酸酵素を作製し、前記アプタマーのターゲット分子を検出するバイオセンサーにも用いることができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ７，ｐ．５１９－５２７（２０１１））。さらに、このアロステリック核酸酵素をＤＮＡコンピューターに応用することも可能である（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１９，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．３，ｐ．１０９４－１１０９）。
【0071】
また、本発明は、上記の各方法に用いるための本発明のＤＮＡ酵素を含むキットも提供する。これらキットには、当該ＤＮＡ酵素の標的ＲＮＡ；酵素反応に必要な緩衝液、亜鉛化合物、ｐＨ調整剤等の試薬をさらに備えていてもよい。前記ＤＮＡ酵素、標的ＲＮＡ、試薬の標品としては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
【0072】
さらに、本発明は、前記ＤＮＡ酵素を有効成分として含む医薬組成物も提供することができる。この医薬組成物は、標的ＲＮＡが原因となって生じる疾病の予防及び／又は治療のために用いられるものであることが好ましい。このような標的ＲＮＡとしては、例えば、ウイルスや病原菌のＲＮＡや、各種疾患に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ、遺伝子（癌遺伝子等）のＲＮＡ等が挙げられる。
【実施例】
【0073】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0074】
１．核酸酵素の取得
１０塩基のランダム領域を含む核酸ライブラリーを合成し、基質核酸を用いて、ＲＮＡを切断する核酸酵素をＳＥＬＥＸ法によるスクリーニングにより取得した。図２に、スクリーニング方法の模式図を示す。先ず、図１に示すように、ＤＮＡ中に３塩基のＲＮＡ（５’－ｇａａ－３’）が挿入されてなる基質核酸（基質核酸１、配列番号：１）を化学合成し、その３’側にビオチン（ビオチン２）を結合させてビオチン化し、ビーズ（ストレプトアビジンビーズ５）に結合させた（図２の（Ｉ））。また、図１に示すように、基質核酸１のＤＮＡの配列と二本鎖（二本鎖４）を形成するＤＮＡ中に１０塩基のＤＮＡ（Ｎ×１０）からなるランダム領域が挿入されてなる核酸（以下、「ライブラリ核酸（ライブラリ核酸３１）」という。）からなる核酸ライブラリー（核酸ライブラリー３）を化学合成した。次いで、核酸ライブラリー３中のライブラリ核酸３１の前記ランダム領域の両側と、基質核酸１とで、アニーリングにより二本鎖を形成させた（図１、図２の（ＩＩ））。ライブラリ核酸３１がＲＮＡ切断活性を有するランダム領域を含む場合には、基質核酸１のＲＮＡ部分が切断され、当該ランダム領域を含むライブラリ核酸３１が溶液中に再リリースされる（図２の（ＩＩＩ）、（ＩＶ））。
１０塩基のランダム領域を含む核酸ライブラリーを合成し、基質核酸を用いて、ＲＮＡを切断する核酸酵素をＳＥＬＥＸ法によるスクリーニングにより取得した。図２に、スクリーニング方法の模式図を示す。先ず、図１に示すように、ＤＮＡ中に３塩基のＲＮＡ（５’－ｇａａ－３’）が挿入されてなる基質核酸（基質核酸１、配列番号：１）を化学合成し、その３’側にビオチン（ビオチン２）を結合させてビオチン化し、ビーズ（ストレプトアビジンビーズ５）に結合させた（図２の（Ｉ））。また、図１に示すように、基質核酸１のＤＮＡの配列と二本鎖（二本鎖４）を形成するＤＮＡ中に１０塩基のＤＮＡ（Ｎ×１０）からなるランダム領域が挿入されてなる核酸（以下、「ライブラリ核酸（ライブラリ核酸３１）」という。）からなる核酸ライブラリー（核酸ライブラリー３）を化学合成した。次いで、核酸ライブラリー３中のライブラリ核酸３１の前記ランダム領域の両側と、基質核酸１とで、アニーリングにより二本鎖を形成させた（図１、図２の（ＩＩ））。ライブラリ核酸３１がＲＮＡ切断活性を有するランダム領域を含む場合には、基質核酸１のＲＮＡ部分が切断され、当該ランダム領域を含むライブラリ核酸３１が溶液中に再リリースされる（図２の（ＩＩＩ）、（ＩＶ））。
【0075】
この図２に示すサイクルを３サイクル行った。溶液中に再リリースされたライブラリ核酸３１は、下記のプライマー：
フォワードプライマー：配列番号：２３
リバースプライマー：配列番号：２４
を用いてＰＣＲで増幅した。３サイクル後に増幅された核酸について、シークエンサー（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）により配列を解析した。得られた約３万リードの配列から、上位４６５配列をＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＥＭ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）により解析して近似配列を有するクラスターの配列を抽出し、その中から、核酸酵素の候補となる下記の表１に示す配列を５つ任意にピックアップした（ｓ１～ｓ５、配列番号：２～６）。表１には、上記の基質核酸（Ｓｕｂ１）も併せて示す。また、表１には、ネガティブコントロールとして、基質核酸と同じ配列のＤＮＡは切断するが、ＲＮＡ配列は切断しないことが知られている核酸酵素（非特許文献３に記載のＩ－Ｒ３、ＩＲ３、配列番号：７）も併せて示す。
フォワードプライマー：配列番号：２３
リバースプライマー：配列番号：２４
を用いてＰＣＲで増幅した。３サイクル後に増幅された核酸について、シークエンサー（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）により配列を解析した。得られた約３万リードの配列から、上位４６５配列をＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＥＭ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）により解析して近似配列を有するクラスターの配列を抽出し、その中から、核酸酵素の候補となる下記の表１に示す配列を５つ任意にピックアップした（ｓ１～ｓ５、配列番号：２～６）。表１には、上記の基質核酸（Ｓｕｂ１）も併せて示す。また、表１には、ネガティブコントロールとして、基質核酸と同じ配列のＤＮＡは切断するが、ＲＮＡ配列は切断しないことが知られている核酸酵素（非特許文献３に記載のＩ－Ｒ３、ＩＲ３、配列番号：７）も併せて示す。
【0076】
なお、特に断りのない限り、以下の表及び図中、大文字のＡ、Ｔ、Ｃ、ＧはそれぞれＤＮＡの塩基を示し、小文字のａ、ｕ、ｃ、ｇはそれぞれＲＮＡの塩基を示し、以下の表中、下線部はランダム領域を示す。
【0077】
【表1】
【0078】
次いで、ピックアップした各核酸酵素候補のＲＮＡ切断活性を確認した。ピックアップした各核酸酵素候補（ｓ１～ｓ５）又はＩＲ３と、基質核酸（Ｓｕｂ１）とをそれぞれアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲル（変性アクリルアミドゲル）に電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、基質核酸の切断活性を確認した。結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）を図３に示す。
【0079】
図３に示したように、ピックアップした全ての核酸酵素候補（ｓ１～ｓ５：実施例１～実施例５）では切断された基質核酸の断片が確認され、いずれも基質核酸（Ｓｕｂ１）の切断活性を有する核酸酵素であった。
【0080】
２．核酸酵素の最小化
上記の「１．核酸酵素の取得」で得られた核酸酵素配列におけるコンセンサス配列を用いた二次構造の考察から、例えば図４に示すように、ランダム領域の５’側から３塩基目～６塩基目の配列（例えば、図４では５’－ＣＡＡＣ－３’）が基質核酸と二本鎖を形成している可能性が考えられた。この場合、ランダム領域（例えば、図４のランダム領域６）の５’側から７塩基目～１０塩基目の配列は、バルジ構造となり、核酸酵素の活性に寄与しないことが想定される。このことを実験的に実証するために、上記の「１．核酸酵素の取得」で得られた核酸酵素配列中、最も出現頻度の多かった配列（ｓ１、図５の（ａ））から、ランダム領域の７塩基目～１０塩基目を欠失させた核酸酵素（ｓ６、配列番号：８、実施例６、図５の（ｂ））、並びに、ｓ６からさらに５塩基目及び６塩基目を基質鎖と二本鎖を形成するように置換した核酸酵素（ｓ７、配列番号：９、実施例７、図５の（ｃ））をそれぞれ化学合成した。また、切断活性をより定量的に解析するために、基質核酸として、Ｓｕｂ１の３’側をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）でラベルした基質核酸（Ｓｕｂ２）を化学合成した。さらに、Ｓｕｂ２の配列を全てＲＮＡ配列に置換した基質核酸（Ｓｕｂ３、配列番号：１０）も化学合成した。各核酸酵素及び基質核酸を下記の表２に示す。
上記の「１．核酸酵素の取得」で得られた核酸酵素配列におけるコンセンサス配列を用いた二次構造の考察から、例えば図４に示すように、ランダム領域の５’側から３塩基目～６塩基目の配列（例えば、図４では５’－ＣＡＡＣ－３’）が基質核酸と二本鎖を形成している可能性が考えられた。この場合、ランダム領域（例えば、図４のランダム領域６）の５’側から７塩基目～１０塩基目の配列は、バルジ構造となり、核酸酵素の活性に寄与しないことが想定される。このことを実験的に実証するために、上記の「１．核酸酵素の取得」で得られた核酸酵素配列中、最も出現頻度の多かった配列（ｓ１、図５の（ａ））から、ランダム領域の７塩基目～１０塩基目を欠失させた核酸酵素（ｓ６、配列番号：８、実施例６、図５の（ｂ））、並びに、ｓ６からさらに５塩基目及び６塩基目を基質鎖と二本鎖を形成するように置換した核酸酵素（ｓ７、配列番号：９、実施例７、図５の（ｃ））をそれぞれ化学合成した。また、切断活性をより定量的に解析するために、基質核酸として、Ｓｕｂ１の３’側をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）でラベルした基質核酸（Ｓｕｂ２）を化学合成した。さらに、Ｓｕｂ２の配列を全てＲＮＡ配列に置換した基質核酸（Ｓｕｂ３、配列番号：１０）も化学合成した。各核酸酵素及び基質核酸を下記の表２に示す。
【0081】
【表2】
【0082】
各核酸酵素（ｓ１、ｓ６、ｓ７、ＩＲ３）と基質核酸（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ３）とをそれぞれアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０ｍＭ ＺｎＣｌ２（－）又は１ｍＭ ＺｎＣｌ２（＋））中で３７℃において１時間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲル（変性アクリルアミドゲル）に電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、基質核酸の切断活性を確認した。また、電気泳動後にＧｅｌＤｏｃ（バイオラド社）を用いて画像を取得し、切断された基質核酸の画像濃度及び切断されなかった基質核酸（基質核酸）の画像濃度から、次式：
Ｃｌｅａｖａｇｅ（％）＝｛（切断された基質核酸の画像濃度）／（切断された基質核酸の画像濃度＋基質核酸の画像濃度）｝×１００
により、基質核酸の切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））を算出した。基質核酸としてＳｕｂ２を用いたときの電気泳動の結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）及び切断率を図６に、基質核酸としてＳｕｂ３を用いたときの電気泳動の結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）を図７に、それぞれ示す。
Ｃｌｅａｖａｇｅ（％）＝｛（切断された基質核酸の画像濃度）／（切断された基質核酸の画像濃度＋基質核酸の画像濃度）｝×１００
により、基質核酸の切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））を算出した。基質核酸としてＳｕｂ２を用いたときの電気泳動の結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）及び切断率を図６に、基質核酸としてＳｕｂ３を用いたときの電気泳動の結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）を図７に、それぞれ示す。
【0083】
図６に示したように、ｓ６及びｓ７のどちらの核酸酵素も切断活性を示し、本発明のＤＮＡ酵素の最小のコア配列が５’－ＡＣ－３’の２塩基であることがわかった。また、図７に示したように、基質核酸の全てをＲＮＡに置換した場合においても同様に切断活性を示すことが確認され、基質の最小の被切断領域の塩基配列（基質コア配列）は５’－ａａｇ－３’（Ｓｕｂ２では、５’側から２２塩基～２４塩基の５’－ａａＧ－３’）の３塩基であることがわかった。
【0084】
３．核酸酵素の特性解析
上記の核酸酵素ｓ７を例として、ｐＨ依存性、亜鉛濃度依存性、金属イオン選択性を評価した。先ず、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応液の組成を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２とし、反応液のｐＨを６、６．５、７、７．５、又は８としたこと以外は上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして基質核酸の切断率を算出し、ｐＨ依存性を評価した。反応液のｐＨと切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図８に示す。
上記の核酸酵素ｓ７を例として、ｐＨ依存性、亜鉛濃度依存性、金属イオン選択性を評価した。先ず、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応液の組成を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２とし、反応液のｐＨを６、６．５、７、７．５、又は８としたこと以外は上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして基質核酸の切断率を算出し、ｐＨ依存性を評価した。反応液のｐＨと切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図８に示す。
【0085】
また、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応液におけるＺｎイオン（ＺｎＣｌ２）の濃度を０、０．１、０．３、１、３、又は１０ｍＭとしたこと以外は上記のｐＨ依存性の評価と同様にして基質核酸の切断率を算出し、亜鉛濃度依存性を評価した。反応液のＺｎイオン濃度（Ｚｎ（ｍＭ））と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図９に示す。
【0086】
さらに、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応液の組成を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＸｍＭ 塩化金属としたこと以外は上記のｐＨ依存性の評価と同様にして基質核酸の切断率を算出し、金属イオン選択性を評価した。前記Ｘは０．１、１、又は１０であり、前記塩化金属は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＺｎＣｌ２、又はＢａＣｌ２である。反応液の金属種及びその濃度（ｍＭ）と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図１０に示す。
【0087】
図８に示したように、本発明のＤＮＡ酵素（例えば、ｓ７）は、至適ｐＨが５．５～９、より好ましくは６．５～８、さらに好ましくは７．０～７．５、の範囲にあることがわかった。
【0088】
また、図９、１０に示したように、本発明のＤＮＡ酵素（例えば、ｓ７）は、亜鉛（亜鉛イオン）の存在に特異的に依存するものであって、その至適亜鉛濃度が０．０１～３０ｍＭ、より好ましくは０．１～３．０ｍＭ、さらに好ましくは０．２～２．０ｍＭ、さらにより好ましくは０．５～１．５ｍＭ、の範囲にあることがわかった。
【0089】
４．核酸酵素の反応速度解析
上記の核酸酵素ｓ７を例として、反応速度を解析した。解析は、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で、３７℃において、０分、５分、２０分、６０分、又は１８０分間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲルに電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして切断率を算出した。反応時間と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図１１に示す。図１１に示したように、本発明のＤＮＡ酵素（例えば、ｓ７）の反応速度を表す反応速度定数ｋｏｂｓは０．２０±０．０１／ｍｉｎであった。
上記の核酸酵素ｓ７を例として、反応速度を解析した。解析は、核酸酵素ｓ７と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で、３７℃において、０分、５分、２０分、６０分、又は１８０分間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲルに電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして切断率を算出した。反応時間と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図１１に示す。図１１に示したように、本発明のＤＮＡ酵素（例えば、ｓ７）の反応速度を表す反応速度定数ｋｏｂｓは０．２０±０．０１／ｍｉｎであった。
【0090】
５．核酸酵素のコア領域の配列依存性評価
本発明のＤＮＡ酵素のコア領域の配列依存性を確認するために、核酸酵素ｓ７において、上記の「２．核酸酵素の最小化」で確認された最小のコア配列５’－ＡＣ－３’を異なる塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２－３’）に置換した１５の核酸酵素を化学合成し、酵素活性を確認した。すなわち、合成した各核酸酵素と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲルに電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして切断率を算出した。置換したコア領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２－３’）と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図１２に示す。また、図１２より、用いた核酸酵素の中で、特に活性を示した核酸酵素（ｓ８～ｓ１１、配列番号：１１～１４、実施例８～実施例１１）を下記の表３に示す。表３中、太斜字は、Ｎ１Ｎ２に対応する塩基配列を示す。
本発明のＤＮＡ酵素のコア領域の配列依存性を確認するために、核酸酵素ｓ７において、上記の「２．核酸酵素の最小化」で確認された最小のコア配列５’－ＡＣ－３’を異なる塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２－３’）に置換した１５の核酸酵素を化学合成し、酵素活性を確認した。すなわち、合成した各核酸酵素と基質核酸Ｓｕｂ２とをアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して反応させた。反応後の溶液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲルに電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、上記の「２．核酸酵素の最小化」と同様にして切断率を算出した。置換したコア領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２－３’）と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すグラフを図１２に示す。また、図１２より、用いた核酸酵素の中で、特に活性を示した核酸酵素（ｓ８～ｓ１１、配列番号：１１～１４、実施例８～実施例１１）を下記の表３に示す。表３中、太斜字は、Ｎ１Ｎ２に対応する塩基配列を示す。
【0091】
【表3】
【0092】
６．核酸酵素の切断部位の解析
核酸酵素の切断部位を調べるために、上記の核酸酵素ｓ７を基に、下記の表４及び図１３に示す自己切断型の核酸酵素（ｓ１２、配列番号：１５）を合成した。これを反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して切断させた後、切断後の核酸をＬＣ－Ｍａｓｓスペクトル解析により解析（ジーンデザイン株式会社）した。結果を図１４に示す。
核酸酵素の切断部位を調べるために、上記の核酸酵素ｓ７を基に、下記の表４及び図１３に示す自己切断型の核酸酵素（ｓ１２、配列番号：１５）を合成した。これを反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して切断させた後、切断後の核酸をＬＣ－Ｍａｓｓスペクトル解析により解析（ジーンデザイン株式会社）した。結果を図１４に示す。
【0093】
【表4】
【0094】
図１４に示したように、切断後の５’側は水酸基（図１４の（ａ））、３’側は２’，３’サイクリックリン酸構造（図１４の（ｂ））を有しており、ハンマーヘッドリボザイムで切断されたときと同様の切断反応であることが示唆された。また、自己切断型の核酸酵素（ｓ１２）の切断部位は５’側から１８塩基目のｇと１９塩基目のａとの間であり、上記の基質コア配列（５’－ａａＧ－３’）の直前であることがわかった。
【0095】
７．基質の被切断領域の配列依存性評価
本発明のＤＮＡ酵素が切断する基質の被切断領域の配列依存性を確認するために、Ｓｕｂ２において、基質コア配列５’－ａａｇ－３’（Ｓｕｂ２では、５’側から２２塩基～２４塩基の５’－ａａＧ－３’）のうちの１塩基を他のＲＮＡ又はＤＮＡに置換した基質核酸（Ｓｕｂ４～Ｓｕｂ６、配列番号：１６～１８）を化学合成した。各基質核酸を下記の表５に示す。
本発明のＤＮＡ酵素が切断する基質の被切断領域の配列依存性を確認するために、Ｓｕｂ２において、基質コア配列５’－ａａｇ－３’（Ｓｕｂ２では、５’側から２２塩基～２４塩基の５’－ａａＧ－３’）のうちの１塩基を他のＲＮＡ又はＤＮＡに置換した基質核酸（Ｓｕｂ４～Ｓｕｂ６、配列番号：１６～１８）を化学合成した。各基質核酸を下記の表５に示す。
【0096】
【表5】
【0097】
核酸酵素ｓ７と合成した各基質核酸（Ｓｕｂ２、Ｓｕｂ４～Ｓｕｂ６）とをそれぞれアニーリングさせた後、反応溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）中で３７℃において１時間静置して反応させた。反応後の反応液を、それぞれ、尿素を含む１８％のポリアクリルアミドゲルに電気泳動してＣｙｂｅｒＧｏｌｄで染色し、各基質核酸の切断活性を確認した。結果（変性アクリルアミドゲル電気泳動写真）を図１５に示す。
【0098】
さらに基質配列を網羅的に解析するため、Ｓｕｂ２において、上記の基質コア配列（５’－ａａｇ－３’）をランダムな配列に置換した基質核酸を化学合成し、それぞれ核酸酵素ｓ７で上記と同様に切断後、シークエンサー（ＭｉＳｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）により切断された配列（基質コア配列）の解析を行ない、次式：
切断残存率＝（切断後の各基質コア配列のリード数の割合）／（切断される前の各基質コア配列のリード数の割合）
により、各基質コア配列を有する基質核酸の切断残存率を算出した。置換した塩基配列（基質コア置換配列）と切断残存率との関係を示すグラフを図１６に示す。なお、図１６中、各基質コア置換配列は、５’側からのＲＮＡの塩基配列を示し、ＴはＵに置き換えて読むものとする。
切断残存率＝（切断後の各基質コア配列のリード数の割合）／（切断される前の各基質コア配列のリード数の割合）
により、各基質コア配列を有する基質核酸の切断残存率を算出した。置換した塩基配列（基質コア置換配列）と切断残存率との関係を示すグラフを図１６に示す。なお、図１６中、各基質コア置換配列は、５’側からのＲＮＡの塩基配列を示し、ＴはＵに置き換えて読むものとする。
【0099】
図１５に示したように、基質コア配列（５’－ａａｇ－３’）の５’側１塩基目をｃに置換した基質配列（Ｓｕｂ４、基質コア配列：５’－ｃａｇ－３’）は切断されたが、５’側から２塩基目、３塩基目をそれぞれｃ又はＣに置換した基質配列（Ｓｕｂ５、Ｓｕｂ６）は切断されなかった。また、図１６に示したように、基質コア配列（５’－ａａｇ－３’）を、５’－ｃａｇ－３’に置換した基質核酸に対して、特に高い切断活性が示されることがわかった。また、前記基質コア配列を５’－ｕａｇ－３’に置換した基質核酸に対しても約半分の切断活性が示されることがわかった。
【0100】
８．核酸酵素のスクリーニングによる再取得
核酸酵素ｓ７の類縁の核酸酵素を網羅的にする取得するため、図１７に示すように、核酸酵素ｓ７のＤＮＡ酵素のコア配列（５’－ＡＣ－３’）に代えて３塩基（５’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３－３’）のランダム領域を有するライブラリ核酸からなる核酸ライブラリーを化学合成した。また、下記の表６に示す、ＤＮＡ中に４塩基のＲＮＡ（５’－ｇａａｇ－３’）が挿入されてなる基質核酸（Ｓｕｂ７、配列番号：１９）を化学合成した。これらを用いたこと以外は上記の「１．核酸酵素の取得」と同様にして、図２に示すサイクルにより、溶液中に再リリースされたライブラリ核酸に含まれるランダム領域の塩基配列を解析した。得られたランダム領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３－３’）とそのリード数（Ｎｕｍｂｅｒ）との関係を示すグラフを図１８（ａ）に、当該ランダム領域の塩基配列と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すヒートマップを図１８（ｂ）に、それぞれ示す。
核酸酵素ｓ７の類縁の核酸酵素を網羅的にする取得するため、図１７に示すように、核酸酵素ｓ７のＤＮＡ酵素のコア配列（５’－ＡＣ－３’）に代えて３塩基（５’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３－３’）のランダム領域を有するライブラリ核酸からなる核酸ライブラリーを化学合成した。また、下記の表６に示す、ＤＮＡ中に４塩基のＲＮＡ（５’－ｇａａｇ－３’）が挿入されてなる基質核酸（Ｓｕｂ７、配列番号：１９）を化学合成した。これらを用いたこと以外は上記の「１．核酸酵素の取得」と同様にして、図２に示すサイクルにより、溶液中に再リリースされたライブラリ核酸に含まれるランダム領域の塩基配列を解析した。得られたランダム領域の塩基配列（５’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３－３’）とそのリード数（Ｎｕｍｂｅｒ）との関係を示すグラフを図１８（ａ）に、当該ランダム領域の塩基配列と切断率（Ｃｌｅａｖａｇｅ（％））との関係を示すヒートマップを図１８（ｂ）に、それぞれ示す。
【0101】
図１８（ａ）及び図１８（ｂ）に示したように、前記ランダム領域が５’－ＡＣＣ－３’である場合が一番セレクションにより濃縮されており、最も高い活性を有する核酸酵素であることが示唆された。この核酸酵素の配列は、核酸酵素ｓ７と同じ配列である。次いで、５’－ＡＣＡ－３’、５’－ＧＣＣ－３’、５’－ＴＣＡ－３’、５’－ＧＣＡ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＴＣ－３’、５’－ＡＧＣ－３’の配列の順に濃縮が確認され、これらの配列を含む核酸酵素も高い切断活性を有することがわかった。なお、５’－ＧＣＣ－３’、５’－ＡＡＣ－３’、５’－ＡＴＣ－３’、５’－ＡＧＣ－３’の配列を含む核酸酵素は、３塩基目のＣが上記の基質コア配列（５’－ａａｇ－３’）のｇと二本鎖を形成することから、それぞれ、核酸酵素ｓ１１、ｓ８、ｓ９、ｓ１０と同じ配列であるといえる。これら以外の基質核酸Ｓｕｂ７に対して新たに活性が確認された主な核酸酵素（ｓ１３～ｓ１５、配列番号：２０～２２、実施例１２～１４）を下記の表６に示す。
【0102】
【表6】
【産業上の利用可能性】
【0103】
以上説明したように、本発明によれば、活性中心の塩基数が十分に少ない、特定のＲＮＡを切断することが可能なＤＮＡ酵素、及びそれを用いたＲＮＡ切断方法を提供することが可能となる。本発明のＤＮＡ酵素は、活性中心の塩基数が十分に少ないことにより、より安価で提供することができ、かつ、より安定に基質核酸をホールディングさせることができる。さらに、本発明のＤＮＡ酵素は、亜鉛存在下において特異的に機能するため、細胞内における使用や亜鉛の検出等にも有効である。
【符号の説明】
【0104】
１…基質核酸、２…ビオチン、３…核酸ライブラリー、３１…ライブラリ核酸、４…二本鎖、５…ストレプトアビジンビーズ、６…ランダム領域。
【配列表フリーテキスト】
【0105】
配列番号：１
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ１
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１
配列番号：３
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ２
配列番号：４
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ３
配列番号：５
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ４
配列番号：６
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ５
配列番号：７
＜２２３＞ ネガティブコントロールＩＲ３
配列番号：８
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ６
配列番号：９
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ７
配列番号：１０
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ３
配列番号：１１
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ８
配列番号：１２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ９
配列番号：１３
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１０
配列番号：１４
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１１
配列番号：１５
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１２
＜２２３＞ １８～２０はＲＮＡを示す
配列番号：１６
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ４
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１７
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ５
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１８
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ６
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１９
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ７
＜２２３＞ ２１～２４はＲＮＡを示す
配列番号：２０
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１３
配列番号：２１
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１４
配列番号：２２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１５
配列番号：２３
＜２２３＞ フォワードプライマー
配列番号：２４
＜２２３＞ リバースプライマー
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ１
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１
配列番号：３
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ２
配列番号：４
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ３
配列番号：５
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ４
配列番号：６
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ５
配列番号：７
＜２２３＞ ネガティブコントロールＩＲ３
配列番号：８
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ６
配列番号：９
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ７
配列番号：１０
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ３
配列番号：１１
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ８
配列番号：１２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ９
配列番号：１３
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１０
配列番号：１４
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１１
配列番号：１５
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１２
＜２２３＞ １８～２０はＲＮＡを示す
配列番号：１６
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ４
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１７
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ５
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１８
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ６
＜２２３＞ ２１～２３はＲＮＡを示す
配列番号：１９
＜２２３＞ 基質核酸Ｓｕｂ７
＜２２３＞ ２１～２４はＲＮＡを示す
配列番号：２０
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１３
配列番号：２１
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１４
配列番号：２２
＜２２３＞ 核酸酵素ｓ１５
配列番号：２３
＜２２３＞ フォワードプライマー
配列番号：２４
＜２２３＞ リバースプライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】