特許 7440073 生存細菌の検出方法及びそのためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-19

(45)【発行日】2024-02-28

(54)【発明の名称】生存細菌の検出方法及びそのためのキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6841 20180101AFI20240220BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240220BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20240220BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240220BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6841 Z

C12Q1/6844 Z ZNA

C12N15/10 120Z

C12M1/34 B

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020128968

(22)【出願日】2020-07-30

(65)【公開番号】P2022025844

(43)【公開日】2022-02-10

【審査請求日】2023-02-13

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和元年８月９日 ｂｉｏＲχｉｖウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／７２９６１６ｖ２．ｆｕｌｌ）に発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和２年６月１５日 Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０２０年）１０：９５８８に発表

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】岡村 好子

(72)【発明者】

【氏名】高橋 宏和

(72)【発明者】

【氏名】堀尾 京平

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－１８３０６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０２４１７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０３３８５５０５（ＣＮ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２００９－００７８１３６（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００６３７７０（ＫＲ，Ａ）

【文献】特開平０８－１３１１９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００１／００７６４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Appl. Environ. Microbiol.，2005年，Vol.71, No.12，pp.7933-7940

【文献】Scientific Reports，2018年，8:7770

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｍ １／００－１／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の生存細菌を検出する方法であって、
前記試料に対して限外ろ過膜を用いたろ過を行うことによって、前記試料中の前記生存細菌を濃縮する濃縮ステップと、
前記限外ろ過膜によりトラップされた生存細菌が有する標的ＲＮＡと、該標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブとを前記細菌の菌体内でハイブリダイズし、前記標的ＲＮＡをプライマーとし、前記ＤＮＡプローブを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＨａ－ＲＣＡ）法により前記菌体内で一本鎖ＤＮＡの増幅を行う増幅ステップと、
前記増幅ステップにより増幅された一本鎖ＤＮＡに標識プローブを前記菌体内でハイブリダイズする標識ステップと、
前記標識ステップにより標識された一本鎖ＤＮＡを検出する検出ステップとを備え、
前記増幅ステップ、前記標識ステップ及び前記検出ステップは、いずれも前記限外ろ過膜上で行い、
前記限外ろ過膜は、遠心式フィルタであることを特徴とする生存細菌の検出方法。

【請求項2】

前記増幅ステップの前に、前記限外ろ過膜によりトラップされた生存細菌に対して細胞透過処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の生存細菌の検出方法。

【請求項3】

前記標識プローブは、蛍光標識試薬、ビオチン又は酵素により標識されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の生存細菌の検出方法。

【請求項4】

前記標識プローブは蛍光プローブであり、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により前記一本鎖ＤＮＡを検出することを特徴とする請求項３に記載の生存細菌の検出方法。

【請求項5】

前記限外ろ過膜は、１００ｋＤａ以上の分子量の物質をトラップする限外ろ過膜であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の生存細菌の検出方法。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の生存細菌の検出方法を行うためのキットであって、
前記限外ろ過膜と、
前記標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブと、
前記ＲＨａ－ＲＣＡ法を行うための酵素と、
前記一本鎖ＤＮＡを標識するための標識プローブとを備えていることを特徴とするキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生存細菌の検出方法及びそのためのキットに関し、特にローリングサークル増幅法を利用した生存細菌の検出方法及びそのためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞培養に関連する製品や食品等は、日本薬局方やその業界において指定された手法によってコンタミネートしている細菌の存否が試験され、細菌の生存数が基準値以下であれば、出荷が認められる。その方法の１つが専用培地を使用したコロニー形成法であるが、コロニー形成に数日を要し、結核菌に至っては１ヶ月を要する。このため、即日で判定できるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）やループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）等の遺伝子増幅法が提案されているが、これらの方法は細菌に係るＤＮＡを検出するため、死菌由来のＤＮＡからもシグナルが発生してしまう。よって、生死を明確に区別できる即日判定法が求められている。

【0003】

細菌の生死判別には、ＲＮＡを検出する方法が知られている。ＲＮＡは分解しやすい分子で、死菌体内又は壊れた細胞から放出されたＲＮＡ分子は速やかに分解されるため、生死判別のマーカーになっている。一方、ＲＮＡはＰＣＲやＬＡＭＰの直接の鋳型として利用できない。そのため逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＲＴ）を経由することによりｃＤＮＡに変換することが必須となる。上述の食品業界では、近年ノロウイルスについて唯一ＲＴ－ＰＣＲが公定法として認められたが、その理由は、これまでの所ノロウイルスの培養法が確立されておらず、また自然界においてノロウイルスの塩基配列はＤＮＡとして存在しないためである。しかしながら、微生物のＲＮＡ配列は基本的にＤＮＡ配列と同じであり、ＲＮＡ溶液から完全にＤＮＡを取り除くことが非常に困難なため、ＲＴ－ＰＣＲ等の遺伝子検査は公定法としては認められていない。唯一、「公衆浴場における浴槽水等のレジオネラ属菌検査方法について」（薬生衛発０９１９第１号）により、ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＰＣＲ（ｖＰＣＲ）が定量ＰＣＲとの組み合わせによって、近年に認められた。ｖＰＣＲ法は、ＤＮＡ抽出前に薬剤により死菌由来ＤＮＡを増幅の鋳型として使用できないようにしてから反応を行うが、一部生菌のＤＮＡも阻害してしまうことを考慮に入れながらの使用が認められている。しかしながら、上記の通り一部生菌のＤＮＡも阻害してしまうことで生菌を検出できない可能性が残るため、より高い厳格性が求められる医療製品等の検査には好ましくない手法である。

【0004】

以上のような問題がある中で、以前に本発明者らは、ＲＮａｓｅ ＨによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を認識する原理に基づいたＲＮａｓｅ Ｈ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＨａ－ＲＣＡ）でＲＮＡのみを直接検出することができる「ＲＮＡ検出方法」を発明した（特許文献１及び非特許文献１を参照）。具体的に、この方法は、標的ＲＮＡに相補的なパドロック型のＤＮＡプローブを用いて、当該プローブを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＤＮＡリガーゼを用いて当該プローブを環状化した後にＲＮａｓｅＨを用いて標的ＲＮＡにニックを形成し、ニックが形成された標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化されたＤＮＡプローブを鋳型としてローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡの増幅を行うものであり、当該増幅によって標的ＲＮＡの有無を検出するものである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０１８－１８３０６５号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Scientific Reports, 8, 7770.(2018)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記方法は、直接にＲＮＡを検出する方法であるため、この方法を細菌の菌体内で、すなわちｉｎ－ｓｉｔｕで行うことは、試料中の細菌の検出方法に応用するのは好適であると考えられる。しかしながら、試料中に存在する細菌数が微小である場合であっても確実に検出できるかは不明であり、偽陰性の結果が得られるおそれもある。また、そのような場合に、試料に対して遠心分離処理を行って細菌を濃縮する方法が考えられるが、遠心回収を利用したとしても、試料中の全ての生存細菌を必ずしも回収できるわけではなく、試料中の本来の生存細菌数を評価できない問題もある。

【0008】

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、所定の製品（試料）中の生存細菌を回収し損なうことなく、試料中における生存細菌を高精度且つ高感度で検出できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記の目的を達成するために、本発明に係る生存細菌の検出方法では、試料に対して限外ろ過処理をした後に、ＲＨａ－ＲＣＡ法を利用して、試料中の生存細菌を高精度且つ高感度で検出できるようにした。

【0010】

具体的に、本発明に係る生存細菌の検出方法は、前記試料に対して限外ろ過膜を用いたろ過を行うことによって、前記試料中の前記生存細菌を濃縮する濃縮ステップと、前記限外ろ過膜によりトラップされた生存細菌が有する標的ＲＮＡと、該標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブとを前記細菌の菌体内でハイブリダイズし、前記標的ＲＮＡをプライマーとし、前記ＤＮＡプローブを鋳型として、ＲＮａｓｅ Ｈ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＨａ－ＲＣＡ）法により前記菌体内で一本鎖ＤＮＡの増幅を行う増幅ステップと、前記増幅ステップにより増幅された一本鎖ＤＮＡに標識プローブを前記菌体内でハイブリダイズする標識ステップと、前記標識ステップにより標識された一本鎖ＤＮＡを検出する検出ステップとを備えていることを特徴とする。

【0011】

本発明に係る生存細菌の検出方法によると、ＲＨａ－ＲＣＡ法を試料中における細菌の菌体内で行うことにより、生存細菌が有する標的ＲＮＡを鋳型として一本鎖ＤＮＡが増幅されるか否かによって、試料中の細菌の有無を判別できる。すなわち、菌体内のＲＮＡを直接に標的として検出するため、高精度で試料中の細菌の有無を判別することができる。さらに、本発明では、ＲＨａ－ＲＣＡ法を行う前に、試料に対して限外ろ過膜を用いて試料中の生存細菌を濃縮するため、試料中の生存細菌を回収し損なうことなく、試料中の生存細菌の検出を高感度で行うことができる。

【0012】

本発明に係る生存細菌の検出方法において、前記増幅ステップの前に、前記限外ろ過膜によりトラップされた生存細菌に対して細胞透過処理を行うことが好ましい。

【0013】

このようにすると、増幅ステップ以降のステップを菌体内で効率的に行うことができる。

【0014】

本発明に係る生存細菌の検出方法において、前記標識プローブは、蛍光標識試薬、ビオチン又は酵素により標識され得る。

【0015】

本発明に係る生存細菌の検出方法において、前記標識プローブは蛍光プローブであり、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｉｓｈ）法により前記一本鎖ＤＮＡを検出することが好ましい。

【0016】

このようにすると、細菌中で増幅された一本鎖ＤＮＡを容易に検出することができる。

【0017】

本発明に係る生存細菌の検出方法において、前記限外ろ過膜は、１００ｋＤａ以上の分子量の物質をトラップする限外ろ過膜であることが好ましい。

【0018】

このようにすると、試料中の細菌のみを効率よく濃縮できると共に、濃縮ステップ以後のステップを限外ろ過膜上で行う場合、ＲＨａ－ＲＣＡにより増幅された一本鎖ＤＮＡは、１００ｋＤａを遥かに超える分子量を有するため、膜上にトラップされて残る一方で、未反応のＤＮＡプローブや標識プローブは、１００ｋＤａ未満であるため限外ろ過膜を通過して膜上に残存しない。従って、検出ステップにおいて望まれないバックグラウンドを抑制することができて、より高感度で標識された所望の一本鎖ＤＮＡを検出することができる。

【0019】

本発明に係る生存細菌の検出方法において、前記増幅ステップ、前記標識ステップ及び前記検出ステップは、いずれも前記限外ろ過膜上で行うことが好ましい。

【0020】

このようにすると、試料の限外ろ過処理の後のステップを全て限外ろ過膜上で行うことができるため、各ステップの操作を簡便にすることができ、上述のように検出ステップにおいて望まれないバックグラウンドを抑制することができて、より高感度で標識された所望の一本鎖ＤＮＡを検出することができる。

【0021】

上記本発明に係る生存細菌の検出方法を行うためのキットは、前記限外ろ過膜と、前記標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブと、前記ＲＨａ－ＲＣＡ法を行うための酵素と、前記一本鎖ＤＮＡを標識するための標識プローブとを備えていることを特徴とする。

【0022】

本発明に係るキットによると、上記本発明に係る生存細菌の検出方法を簡便に行うことができて、上述のように試料中の生存細菌の有無を高精度且つ高感度で検出することができる。

【発明の効果】

【0023】

本発明に係る生存細菌の検出方法及びそのためのキットによると、試料中の生存細菌を回収し損なうことなく、試料中の生存細菌の有無を高精度且つ高感度で検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の一実施形態に係る生存細菌の検出方法を説明するための概略図である。

【図2】本発明の一実施形態におけるＲＨａ－ＲＣＡ法を説明するための概略図である。

【図3】実施例に係る生存細菌の検出方法における検出ステップの結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0026】

本発明に係る一実施形態は、生存細菌の検出方法であり、当該方法は、図１に示すように、試料に対して限外ろ過膜を用いたろ過を行うことによって、試料中の生存細菌を濃縮する濃縮ステップと、限外ろ過膜によりトラップされた生存細菌が有する標的ＲＮＡと、該標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブとを細菌の菌体内でハイブリダイズし、前記標的ＲＮＡをプライマーとし、前記ＤＮＡプローブを鋳型として、ＲＨａ－ＲＣＡ法により菌体内で一本鎖ＤＮＡの増幅を行う増幅ステップと、増幅ステップにより増幅された一本鎖ＤＮＡに標識プローブを菌体内でハイブリダイズする標識ステップと、標識ステップにより標識された一本鎖ＤＮＡを検出する検出ステップとを備えている。

【0027】

本実施形態において、試料とは、生存細菌が存在するか否かを評価する対象であり、例えば図１に示すような細胞培養培地等の細胞培養に関する製品や食品等である。

【0028】

本実施形態において、生存細菌とは、生存している細菌であり、その種は特に限定されず、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌やブレビバチルス菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）等のグラム陽性菌であってもよい。

【0029】

本実施形態において、限外ろ過とは、対象を限外ろ過膜に通してろ過する処理であり、本実施形態において用いられる限外ろ過膜は、細菌をトラップできる構成の膜であれば特に限定されないが、公称分画分子量（ＮＭＷＬ）が１００ｋＤａ程度であることが好ましい。このような限外ろ過膜としては、以下のものに限定されないが、例えばカップ型の限外ろ過膜や９６ウェルフォーマットの限外ろ過膜等が好適に用いられ、具体的に例えばアミコンウルトラ０．５ｍＬ遠心式フィルター（メルク）等を用いることができる。このような限外ろ過膜を採用することで、細菌や後のステップで増幅される一本鎖ＤＮＡ等をトラップする一方で、後のステップで用いられるプローブのうち未反応のプローブを通過させることができる。そうすると、限外ろ過膜上で、後の増幅ステップ、標識ステップ及び検出ステップを行うことができ、上記の通り増幅された一本鎖ＤＮＡを膜上にトラップできる一方で、未反応プローブを通過させることができるため、膜上で一本鎖ＤＮＡを検出する際のバックグラウンドを低減することができる。

【0030】

本実施形態において、ＲＨａ－ＲＣＡ法とは、ＲＮａｓｅＨを利用したローリングサークル型ＤＮＡ増幅法であり、その詳細は、上記特許文献１に記載の通りである。具体的に、ＲＨａ－ＲＣＡ法は、図２に示すように、標的ＲＮＡ１０１と、標的ＲＮＡ１０１の内部配列に相補的なパドロック型のＤＮＡプローブ１０２とをハイブリダイズするハイブリダイズ工程Ｓ１と、標的ＲＮＡ１０１とハイブリダイズされたＤＮＡプローブ１０２をＤＮＡ結合酵素（ＤＮＡリガーゼ）１０３により環状化する環状化工程Ｓ２と、ＤＮＡプローブ１０２を環状化した後、ハイブリダイズされている標的ＲＮＡ１０１に、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）１０４を用いてニックを形成するニック形成工程Ｓ３と、ニックが形成された標的ＲＮＡをプライマー１０１Ａとし、環状化されたＤＮＡプローブ１０２を鋳型として、ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）１０５を用いたローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡ１０６の増幅を行う増幅工程Ｓ４とを備えている。

【0031】

パドロック型のＤＮＡプローブは、例えばＤＮＡ合成機によって合成されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。ＤＮＡプローブは、標的ＲＮＡの内部配列に相補的な配列を有し、標的ＲＮＡとハイブリダイズ可能であれば、どのようなものを用いることもできる。本実施形態において、標的ＲＮＡの内部配列とは、標的ＲＮＡの３’末端を含まない配列である。ＤＮＡプローブの配列は、全体が標的ＲＮＡと相補性を有していても、一部のみが標的ＲＮＡと相補性を有していてもよい。ＤＮＡプローブの大きさは、特に限定されないが、好ましくは３０ｂｐ～２０ｋｂ程度であり、より好ましくは５０ｂｐ～２０００ｂｐ程度である。なお、パドロック型のＤＮＡプローブと、標的ＲＮＡとのハイブリダイズは、標的ＲＮＡ及びプローブＤＮＡの組み合わせを考慮して、適宜最適な条件を設定すればよい。

【0032】

標的ＲＮＡとハイブリダイズされたＤＮＡプローブ（ＲＮＡ－ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）の環状化は、ＤＮＡ結合酵素（ＤＮＡリガーゼ）を用いて行うことができる。具体的には、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ又はＳｐｌｉｎｔＲ ｌｉｇａｓｅを用いて行うことができる。

【0033】

ＤＮＡプローブを環状化した後、標的ＲＮＡにおけるハイブリダイズしている部分に、ＲＮａｓｅＨを用いてニックを形成する。これにより、標的ＲＮＡにおけるＤＮＡプローブとハイブリダイズしている部分に３’末端が形成される。ハイブリダイズしている標的ＲＮＡにニックを形成する観点から、ＲＮａｓｅＨの濃度は好ましくは０．００３ユニット（Ｕ）以上、より好ましくは０．０３Ｕ以上とする、ハイブリダイズした標的ＲＮＡの
完全な分解が生じないようにする観点から、好ましくは３Ｕ以下、より好ましくは０．３Ｕ以下とする。

【0034】

ニック部分（３’末端）からローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡの増幅（伸長）を行う。ローリングサークル型ＤＮＡ増幅法は、ハイブリダイズした後にニックを形成した標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化されたＤＮＡプローブを鋳型として一本鎖ＤＮＡの伸長を行う。一本鎖ＤＮＡの伸長において、ＤＮＡの鎖置換（strand displacement）活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることが好ましい。「鎖置換活性」とは、ＤＮＡを複製していく過程において伸長方向に二本鎖のＤＮＡが既に形成されている場合、相補鎖を５’側から引き剥がして鋳型を一本鎖にしながら、一本鎖となった鋳型に対して新たな相補鎖を合成してゆく活性を意味する。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることにより、鋳型である環状化されたＤＮＡプローブの相補鎖が直列に繰り返し連結された高分子量の一本鎖ＤＮＡが得られる。

【0035】

鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、特に限定されないが、例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（New England BioLabs社他）、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ(タカラバイオ社他)、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(New England BioLabs社他)、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(タカラバイオ社)、ＰｙｒｏＰｈａｇｅＴＭ ３１７３ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Lucigen社）等を用いることができる。中でもｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、室温程度の常温で反応が行えると共に、ＤＮＡ合成速度が高いため好ましい。

【0036】

一本鎖ＤＮＡの増幅において使用される鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の量（濃度）は、使用する酵素の種類によって至適化することが好ましい。例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの場合、好ましくは終濃度約０．０２５ｎｇ／μＬ～１μｇ／μＬ、より好ましくは終濃度約５ｎｇ／μＬ～２０ｎｇ／μＬとすることができる。

【0037】

一本鎖ＤＮＡの増幅は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により反応温度を設定することができる。例えば、反応温度は一定の常温とすることができる。本開示における「常温」とは、２５℃～６５℃を意味する。具体的に、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合は、反応温度を好ましくは２５℃～４２℃とする。また、耐熱性酵素を使用して行う場合は、反応温度を好ましくは５５℃～６５℃とする。耐熱性酵素を使用する場合は、環状ＤＮＡプローブ鎖における標的ＲＮＡと相補的な部分の長さは約３０オリゴヌクレオチド以上であることが好ましい。

【0038】

本実施形態のＲＮＡ検出方法においては、一本鎖ＤＮＡの増幅を一定温度で行うことができるため、サーマルサイクラーを用いる必要がない。

【0039】

一本鎖ＤＮＡの増幅において、緩衝成分、マグネシウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する反応液を使用することができる。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、トリス塩酸又はトリス酢酸が好適に使用できる。マグネシウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム又は酢酸マグネシウムが好適に使用できる。塩化マグネシウムの場合その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。また、カリウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム又は酢酸カリウムが好適に使用できる。塩化カリウムの場合その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～５０ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭである。また、アンモニウム塩としては、特に限定はないが、例えば、硫酸アンモニウム又は酢酸アンモニウムが好適に使用できる。その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～６０ｍＭ、より好ましくは約４０ｍＭである。ＤＮＡ増幅の基質となるｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、好ましくは約０．５ｍＭ～２ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭである。この他、反応液中には伸長反応の安定化を目的とした添加物を添加してもよい。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を好ましくは約０．５ｍＭ～５ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ加えることができる。さらに、長時間反応に際し、副産物として生成される、ＤＮＡ合成反応の阻害剤であるピロリン酸を除去するためにピロフォスファターゼを加えることによって合成効率を上げることもできる。ピロフォスファターゼは約０．０２Ｕ／反応、添加することが好ましい。

【0040】

本実施形態において、上記ＲＨａ－ＲＣＡ法を細菌の菌体内で行い、すなわちｉｎ ｓｉｔｕで行う。このため、予め細菌に対して細胞透過処理を行うことが好ましい。細胞透過処理は、各工程で用いられるプローブ等の材料が菌体内を容易に透過できるようになればその処理は特に限定されず、本技術分野において通常用いられている固定化処理及び透過処理を組み合わせて利用することができ、例えばパラホルムアルデヒドを用いて固定化した後にリゾチームを用いて透過処理をすることができる。

【0041】

また、本実施形態において、以上に説明したＲＨａ－ＲＣＡ法は、濃縮ステップを行った限外ろ過膜上にて行うことが好ましい。そうすると、上述したように、各ステップの操作を簡便に行うことができ、未反応プローブを通過させることができるため、膜上で一本鎖ＤＮＡを検出する際にバックグラウンドを低減することができる。

【0042】

上記ＲＨａ－ＲＣＡ法により一本鎖ＤＮＡの増幅を行った後、標識ステップにおいて、増幅した一本鎖ＤＮＡを検出できるようにするために、一本鎖ＤＮＡの標識化を行う。本実施形態では、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｉｓｈ）法を利用する。具体的に、増幅した一本鎖ＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識試薬（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Invitrogen社）、Ａｌｅｘａ５６８（Thermo Fisher Scientific社）等）を用いて、増幅した一本鎖ＤＮＡを標識化する。より具体的には、上記一本鎖ＤＮＡに相補的な配列を有し、蛍光標識化されたオリゴヌクレオチドを、上記増幅した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせることにより一本鎖ＤＮＡを標識化することができる。その後、検出ステップにおいて、例えば蛍光顕微鏡等を利用して、上記蛍光標識された一本鎖ＤＮＡを検出する。なお、本実施形態では、標識ステップにおいて、蛍光プローブを用いる例について説明したが、当然に他の標識手段を用いることもでき、例えばビオチン、又はペルオキシターゼやルシフェラーゼといった酵素を利用した標識手段を用いることもできる。

【0043】

仮に、検出ステップにおいて、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡが検出されなかった場合、試料中に標的ＲＮＡが存在しない、すなわち生存細菌が存在しないと評価でき、一方、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡが検出された場合、試料中の生存細菌が存在すると評価できる。このように、本実施形態に係る方法を用いると、試料中の生存細菌を回収し損なうことなく、高精度且つ高感度で試料中の生存細菌の有無を簡便に評価することができる。

【0044】

本発明に係る他の実施形態は、上記生存細菌の検出方法を行うためのキットであり、当該キットは、限外ろ過膜と、標的ＲＮＡと相補的な核酸配列を有するパドロック型ＤＮＡプローブと、ＲＨａ－ＲＣＡ法を行うための酵素と、一本鎖ＤＮＡを標識するための標識プローブとを備えている。

【0045】

本実施形態において、限外ろ過膜、パドロック型ＤＮＡプローブ、ＲＨａ―ＲＣＡ法を行うための酵素及び一本鎖ＤＮＡを標識するための標識プローブの具体的な説明は、上述した内容と同一であるため省略する。

【0046】

本実施形態に係るキットによると、上記本発明に係る生存細菌の検出方法を行うための材料を備えているため、上記方法を簡便に行うことができて、上述のように試料中の生存細菌を回収し損なうことなく、試料中の生存細菌の有無を高精度且つ高感度で評価することができる。

【実施例】

【0047】

以下に、本発明に係る生存細菌の検出方法について詳細に説明するための実施例を示す。本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉの検出を上記本発明に係る生存細菌の検出方法を用いて行った。

【0048】

（濃縮ステップ）
まず、Ｅ．ｃｏｌｉを含む培地を準備し、当該培地を限外ろ過膜であるアミコンウルトラ０．５ｍＬ遠心式フィルター（ＮＭＷＬ：１００ｋＤａ，メルク）に添加した。その後、４％パラホルムアルデヒドを加え１４０００×ｇで２５℃、５分間の遠心分離処理を行った。ろ液を除去し、再度上記フィルダー上に４％パラホルムアルデヒドを加え、ボルテックスにより懸濁して１５分間静置した（固定処理）。その後、再度上記条件で遠心分離処理を行ってろ液を除去した。その後、７０％エタノールを加えて上記条件で遠心分離処理を行ってろ液を除去し、再度７０％エタノールを加え、ボルテックスにより懸濁して６０分間静置した。その後、再度上記条件で遠心分離処理を行ってろ液を除去した後に、２５μｇ／ｍＬのリゾチームを加えて上記条件で遠心分離処理を行った。ろ液を除去した後に、再度２５μｇ／ｍＬのリゾチームを加えてボルテックスにより懸濁して１０分間静置した（細胞透過処理）。その後、上記条件で遠心分離処理を行ってろ液を除去した。

【0049】

（増幅ステップ）
上記濃縮ステップの後に、上記フィルター上において、２０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム及び５０ｍＭのグルタミン酸カリウムを含むバッファーに１００ｐｍｏｌのパドロック型プローブを混合した溶液を１００μｌ加えた。なお、当該パドロック型プローブの配列は以下の通りである。
ＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴ（配列番号１）

【0050】

その後、９５℃で１分間インキュベート後、３０℃で３０分以上緩やかに冷却し、その後に３０℃で１０分間インキュベートすることで、パドロック型ＤＮＡプローブを細菌の菌体内の標的ＲＮＡにハイブリダイズさせた。続いて、５０μｌのライゲーション混合液（２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１０ｍＭのジチオトレイトール及び２５ユニットのＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ（New EnglandBioLads社）を加え、３７℃で１０分間インキュベートすることによりパドロック型ＤＮＡプローブの環状化を行った。

【0051】

次に、２０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、８０ｍＭの硫酸アンモニウム、１０ｍＭのグルタミン酸カリウム、２．０ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、０．００４ユニットのピロフォスファターゼ（New England BioLads社）、０．０６ユニットのＲＮａｓｅＨ（バイオアカデミア）及び５００ｎｇのＤＮＡフリーｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（関東化学）を含む１００μｌの反応混合液と１５０μｌの上記環状化されたＤＮＡプローブを含む混合液とを混合した。混合後、３０℃で２時間インキュベートすることにより一本鎖ＤＮＡの増幅反応を行った。その後、６５℃で１０分間インキュベートすることにより、酵素の不活化処理を行った。

【0052】

不活化処理の後、遠心分離処理を行い、ＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離処理を行いろ液を除去した。この操作により、未反応のプローブはフィルターを通過してろ液に含まれることとなる。

【0053】

（標識ステップ）
上記洗浄の後に、Ａｌｅｘａ標識されたオリゴヌクレオチドをフィルター上に加え、３７℃で３時間ハイブリダイズさせた。なお、当該オリゴヌクレオチドは５’側にＡｌｅｘａ５６８で標識され、当該オリゴヌクレオチドの配列は、ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣ（配列番号２）である。その後、遠心分離処理を行い、ＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離処理を行いろ液を除去した。この操作により、未反応のプローブはフィルターを通過してろ液に含まれることとなる。

【0054】

（検出ステップ）
上記標識ステップの後に、位相差対物レンズ（CFI PlanApo DM 100×(Nikon)）及びＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ Ｖ３カメラ（浜松ホトニクス）を備えた蛍光顕微鏡（Nikon ECLIPSE E600）を用いて観察した。その結果を図３に示す。図３では、便宜上、特に強い赤色蛍光が認められた箇所の一部に白矢印を付けたが、白矢印の箇所以外にも細菌と重なる位置の多くに赤色蛍光が見られた。従って、本発明に係る方法を利用することにより、標的ＲＮＡを有する菌体内で正常に一本鎖ＤＮＡを増幅できることが分かった。

【0055】

以上のように、本発明に係る生存細菌の検出方法によると、菌体内のＲＮＡを直接に標的として検出するため、高精度で試料中の細菌の有無を判別することができ、ＲＨａ－ＲＣＡ法を行う前に、試料に対して限外ろ過膜を用いて試料中の生存細菌を濃縮するため、試料中の生存細菌の検出を高感度で行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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