特許 7441475 重水素化標識化合物およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-21

(45)【発行日】2024-03-01

(54)【発明の名称】重水素化標識化合物およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07B 59/00 20060101AFI20240222BHJP

   C07C 51/347 20060101ALI20240222BHJP

   C07C 69/587 20060101ALI20240222BHJP

   C07C 69/24 20060101ALI20240222BHJP

   C07C 53/126 20060101ALI20240222BHJP

   C07C 57/12 20060101ALI20240222BHJP

   C07C 67/20 20060101ALI20240222BHJP

   C07F 9/09 20060101ALI20240222BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240222BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20240222BHJP

【ＦＩ】

C07B59/00

C07C51/347

C07C69/587

C07C69/24

C07C53/126

C07C57/12

C07C67/20

C07F9/09 U

G01N27/62 V

C07B61/00 300

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022538046

(86)(22)【出願日】2021-07-21

(86)【国際出願番号】 JP2021027395

(87)【国際公開番号】W WO2022019336

(87)【国際公開日】2022-01-27

【審査請求日】2022-10-19

(31)【優先権主張番号】P 2020124674

(32)【優先日】2020-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】399086263

【氏名又は名称】学校法人帝京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110003421

【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】滝田 良

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 順子

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 康平

(72)【発明者】

【氏名】濱 弘太郎

(72)【発明者】

【氏名】横山 和明

【審査官】奥谷 暢子

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０６００８６３９（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／１８３５６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００６－５０５７７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２２６７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０８２７６２６９（ＣＮ，Ａ）

【文献】RODRIGUEZ,S. et al，Synthesis of gem-dideuterated tetradecanoic acids and their use in investigating the enzymatic trans，Journal of Organic Chemistry，2001年，Vol.66, No.24，p.8052-8058

【文献】HUTCHINS,R.O. et al.，Selective reductions of conjugated acetylenes with magnesium in methanol and methanol-d，Tetrahedron Letters，1989年，Vol.30, No.1，p.55-6

【文献】ONO,A. et al，Biosynthetic pathway for production of a conjugated dienyl sex pheromone of a Plusiinae moth, Thysan，Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002年，Vol.32, No.6，p.701-708

【文献】GOSALBO,L. et al，Synthesis of deuterated cyclopropene fatty esters structurally related to palmitic and myristic acid，Lipids，1993年，Vol.28, No.12，p.1125-30

【文献】NAVARRO,I. et al，Stereospecificity of the (E)- and (Z)-11 Myristoyl CoA Desaturases in the Biosynthesis of Spodoptera，Journal of the American Chemical Society，1997年，Vol.119, No.46，p.11335-11336

【文献】HISLOP,J. et al，Synthesis of deuterated γ-lactones for use in stable isotope dilution assays，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004年，Vol.52, No.23，p.7075-7083

【文献】CRANDALL,J.K.，Methyl(trifluoromethyl)dioxirane，e-EROS Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，2016年，p.1-11

【文献】LIU,W. et al，Site-Selective and Metal-Free Aliphatic C-H Oxidation Enabled Synthesis of [5,24,25-D3]-(25S)-Δ7-Da，Chemistry - A European Journal，2015年，Vol.21, No.14，p.5345-5349

【文献】OLDFIELD,E. et al，Spectroscopic studies of specifically deuterium labeled membrane systems. Nuclear magnetic resonance，Biochemistry，1978年，Vol.17, No.14，p.2727-40

【文献】MENDELSOHN,R. et al，CD2 rocking modes as quantitative infrared probes of one-, two-, and three-bond conformational disor，Biochemistry，1991年，Vol.30, No.35，p.8558-63

【文献】ZHAO,D. et al，Palladium-Catalyzed H/D Exchange Reaction with 8-Aminoquinoline as the Directing Group: Access to or，Journal of Organic Chemistry，2018年，Vol.83, No.15，p.7860-7866

【文献】LUO,F. et al，Palladium catalyzed arylation of C(sp3)-H bonds of carbonyl β-position in water，Huaxue Xuebao，2016年，Vol.74, No.10，p.805-810

【文献】佐治木弘尚，重水素標識化反応～「炭素－水素」結合を「炭素－重水素」に変換する～，化学と教育，2013年，61巻,８号，404-407

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｂ

Ｃ０７Ｃ

Ｃ０７Ｆ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

炭素数が１２個以上の重水素化された脂肪酸若しくはその誘導体または重水素化された脂肪酸をその構造の一部とする化合物からなる重水素化標識化合物であって、
前記脂肪酸のα位およびβ位が重水素化され、かつ、前記脂肪酸に存在する重水素の数が３個または４個であることを特徴とし、
前記誘導体が、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体、脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体または脂肪酸シリル誘導体であり、前記脂肪酸エステルが、アルキルエステルまたはアリールエステルであり、
前記化合物が、脂質または脂肪酸結合タンパク質であり、前記脂質が、コレステロールエステル、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質またはスフィンゴ脂質である、重水素化標識化合物（但し、前記炭素数が１２個以上の重水素化された脂肪酸がシクロプロペン基を有する脂肪酸、テトラデカン酸、（Ｚ）－１１－テトラデセン酸、（Ｅ）－１１－テトラデセン酸、（Ｚ）－１１－ノナデセン酸または（Ｚ）－７－ドデセン酸である重水素化標識化合物と、前記化合物がコラン酸である重水素化標識化合物とを除く。）。

【請求項2】

請求項１に記載の重水素化標識化合物の製造方法であって、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化する工程を含んでなる、製造方法。

【請求項3】

白金族金属触媒が、パラジウム触媒である、請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化する工程をさらに含んでなる、請求項３に記載の製造方法。

【請求項5】

重水素化された化合物を脱保護する工程をさらに含んでなる、請求項３または４に記載の製造方法。

【請求項6】

請求項１に記載の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法。

【請求項7】

請求項１に記載の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法。

【請求項8】

脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、請求項１に記載の重水素化標識化合物の使用。

【請求項9】

生体内代謝の解析方法における代謝物マーカーとしての、請求項１に記載の重水素化標識化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本願は、先行する日本国出願である特願２０２０－１２４６７４（出願日：２０２０年７月２１日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、重水素化標識化合物およびその製造方法に関する。本発明はまた、脂質またはその代謝物の定量方法および脂質代謝の解析方法に関する。

【背景技術】

【0003】

脂質は、炭水化物やタンパク質と並ぶ三大栄養素の一つであり、エネルギー源や生体膜の構成要素としてだけでなく、情報伝達物質等の多様な生理機能を有する。また、脂質の基本構成単位である脂肪酸は、長鎖の炭化水素骨格の末端にカルボキシ基を有するシンプルな構造でありながらも、炭素数や二重結合等の違いから様々な種類が存在し多彩な生理機能を発現することが知られている。例えば、疾患との関係では副腎白質ジストロフィーにおいて全身の組織で極長鎖脂肪酸の増加が認められ、トランス脂肪酸は健康への影響から世界保健機関（ＷＨＯ）は加工食品を製造する時に生じるトランス脂肪酸を２０２３年までに低減するよう各国政府に対し呼び掛けている。

【0004】

このように社会的にも注目度の高い脂肪酸の解析にはガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）や液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）が主に用いられている。しかしながら、ＧＣ－ＭＳやＬＣ－ＭＳにおいて内部標準物質となる安定同位体標識脂肪酸の種類は極めて限られているのが現状である。また、^１３炭素（^１３Ｃ）や重水素（^２Ｈ）等を用いた従来の脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法は、工程数が多いことや酸化脂肪酸への適用が難しいといった問題があった（特許文献１）。また、ルテニウム触媒により脂肪酸を重水素化標識する方法では不飽和結合の位置や数により反応結果が左右され、またトランス体には適用できないという問題があった（非特許文献１）。このため、脂質や脂肪酸の代謝解析に重要な脂肪酸の定量的な手法の確立が期待されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０１６－２２２５９０号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Vidovic et al., J. Org. Chem. 2017, 82, 13115-13120.

【発明の概要】

【0007】

本発明は、新規な重水素化標識化合物およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の新規な定量方法と、生体内代謝の新規な解析方法を提供することを目的とする。

【0008】

本発明者らは、脂肪酸の少なくともβ位を重水素化することで重水素化標識化合物を合成できること、そしてこの重水素化技術は多様な脂肪酸に適用可能であることを見出した。本発明者らはまた、前記重水素化標識化合物を使用して脂質代謝解析が可能であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

【0009】

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］脂肪酸の少なくともβ位が重水素化されたことを特徴とする、重水素化標識化合物。
［２］脂肪酸のα位がさらに重水素化された、上記［１］に記載の重水素化標識化合物。
［３］重水素の数が３個または４個である、上記［１］または［２］に記載の重水素化標識化合物。
［４］標識化合物が脂肪酸若しくはその誘導体または脂肪酸をその構造の一部とする化合物である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の重水素化標識化合物。
［５］脂肪酸の誘導体が、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体または脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体である、上記［４］に記載の重水素化標識化合物。
［６］脂肪酸エステルが、アルキルエステルまたはアリールエステルである、上記［５］に記載の重水素化標識化合物。
［７］脂肪酸をその構造の一部とする化合物が、脂質または脂肪酸結合タンパク質である、上記［４］に記載の重水素化標識化合物。
［８］脂質がコレステロールエステル、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質またはスフィンゴ脂質である、上記［７］に記載の重水素化標識化合物。
［９］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の製造方法であって、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化する工程を含んでなる、方法。
［１０］白金族金属触媒が、パラジウム触媒である、上記［９］に記載の製造方法。
［１１］脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化する工程をさらに含んでなる、上記［９］または［１０］に記載の製造方法。
［１２］重水素化された化合物を脱保護する工程をさらに含んでなる、上記［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法。
［１４］上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法。
［１５］脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の使用、または生体内代謝の解析方法における代謝物マーカーとしての、上記［１］～［８］のいずれかに記載の重水素化標識化合物の使用。

【0010】

本発明の重水素化標識化合物は、脂質や脂肪酸の定量分析や代謝解析等に広く用いることができる点で有利である。本発明の重水素化標識化合物はまた、重水素源として安価な重水やメタノール－ｄ_１を使用して合成できる点でも有利である。本発明の重水素化標識化合物はさらに、生体内に存在する脂肪酸や脂質と区別されるため、代謝物マーカーとして生体内代謝解析等に使用することができる点でも有利である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ホスファチジルコリン（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ_４）（ＰＣ １６：０／Ｄ_４－ｔｒａｎｓ－１８：２）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析の結果を示す。

【図2】図２は、活性化されたヒト血小板において生成されたホスファチジルコリン（ＰＣ）の代謝産物（派生物）の網羅的解析の結果（ボルケーノプロット）を示す。Ｅはトランス型、Ｚはシス型、ｐ値は有意確率を示す。

【図3】図３は、ヒト血小板における重水素化標識脂肪酸のアシル転移活性の立体特異性を示す。

【図4】図４Ａは、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性を示す（ｐは有意確率を示す）。図４Ｂは、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性の動的解析結果を示す。

【発明の具体的説明】

【0012】

＜＜定義＞＞
本発明において基の全部または一部としての「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を意味し、炭素数１～４のアルキルの場合、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。

【0013】

本発明において基の全部または一部としての「アルケニル」は、１個または複数個の二重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を意味する。

【0014】

本発明において「ハロゲン原子」としては、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、フッ素（Ｆ）、ヨウ素（Ｉ）が挙げられ、塩素、臭素、ヨウ素が好ましい。

【0015】

本発明において「置換されていてもよい」とは、置換される基または原子上の１または複数個の水素原子が別の基に置換されることを意味する。

【0016】

本発明において「芳香族炭化水素基」および「芳香族複素環基」は、芳香族の特性を有する環系化合物またはその部分をいい、例えば、π電子が４ｎ＋２個ある環状共役系を含む安定な構造を有する。芳香族炭化水素基は、６～１４員の不飽和炭素環であり、単環式であっても、２または３環式の芳香族縮合環基であってもよく、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレンが挙げられる。芳香族複素環基は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群から選択される１種または２種以上の異種原子を環員原子として含む、５～１４員の不飽和複素環であり、単環式であっても、２または３環式の芳香族縮合複素環基であってもよい。異種原子の個数は、１個または複数個とすることができ、例えば、１～４個、１～３個、１～２個または１個である。芳香族複素環基としては、例えば、ピリジン、キノリン、プリン、イソキノリン、オキサゾリンが挙げられる。

【0017】

＜＜重水素化標識化合物＞＞
本発明の重水素化標識化合物は、脂肪酸のα位とβ位のうち少なくともβ位が重水素化されたものである。本発明の重水素化標識化合物はまた、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよい。ここで、脂肪酸のα位、β位とは、脂肪酸の末端のカルボキシ基に最も近い炭素原子（α炭素）と、２番目に近い炭素原子（β炭素）をそれぞれいう。また、重水素化とは、α位またはβ位の炭素原子上の水素が重水素に置換されていることをいい、例えば、脂肪酸のβ位の重水素化とは、β位の炭素原子上の水素が重水素に置換されていることをいい、β位の炭素原子上に重水素が存在すること（炭素原子に重水素が結合していること）と同義である。

【0018】

本発明の重水素化標識化合物に存在する重水素の数は１～４個であり、本発明の重水素化標識化合物を内在性物質の影響を受けない標識化合物として提供する場合には、好ましくは３個または４個であり、より好ましくは４個である。本発明の重水素化標識化合物における脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個であり、α位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個である。本発明の好ましい態様においては、本発明の重水素化標識化合物における脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数は２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数は１または２個（より好ましくは２個）である。

【0019】

本発明の重水素化標識化合物は、脂肪酸またはその誘導体そのものであっても、脂肪酸をその構造の一部とする化合物であってもよい。本発明の重水素化標識化合物が、脂肪酸またはその誘導体そのものである場合には、該脂肪酸のβ位が重水素化されていることは前記の通りである。また、本発明の重水素化標識化合物が、脂肪酸をその構造の一部とするものである場合、１個または２個以上の脂肪酸を構造の一部とすることができる。本発明の重水素化標識化合物が１個の脂肪酸を構造の一部とする化合物である場合には、該脂肪酸のβ位が重水素化されている。また、本発明の重水素化標識化合物が２個以上の脂肪酸を構造の一部とする化合物である場合には、少なくとも１個の脂肪酸のβ位が重水素化されている。なお、２個以上の脂肪酸は一部または全部が同じ種類の脂肪酸であっても、異なる種類の脂肪酸であってもよい。

【0020】

本発明において「脂肪酸」は、不飽和度の観点からは飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれをも含むものである。脂肪酸はまた、炭素数（カルボキシ基の炭素を含む）の観点からは短鎖脂肪酸（炭素数２～４）、中鎖脂肪酸（炭素数５～１１）、長鎖脂肪酸（炭素数１２～２２）、極長鎖脂肪酸（炭素数２３以上）のいずれをも含むものである。脂肪酸の炭素数の下限は例えば２個、３個、５個、８個、１２個または１６個とすることができ、脂肪酸の炭素数の上限は例えば３６個、３０個または２５個とすることができ、これら炭素数の上限および下限は任意に組み合わせることができる。脂肪酸の炭素数は例えば２～３６個、２～３０個、２～２５個、３～３６個、３～３０個、３～２５個、８～２５個または１６～２５個とすることができる。不飽和脂肪酸はまた、シス型であってもトランス型であってもよい。本発明において「脂肪酸」は、炭化水素基上の１個または複数個（例えば１～３個または１～２個）の水素原子が、水酸基、アルコキシ基、エポキシ基、アミノ基、ハロゲン基、シアノ基、アルキルチオ、（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ基等の官能基（該官能基は同一であっても異なっていてもよい）により置換されたものも含む。脂肪酸の例としては、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノエライジン酸、リシノール酸、１３－ヒドロキシ－９Ｚ，１１Ｅ－オクタデカジエノイック酸（１３－ＨＯＤＥ）、（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ）、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、エルカ酸、イソプレノイド、９－ヒドロキシオクタデカン酸、（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸等が挙げられる。

【0021】

本発明において「脂肪酸の誘導体」は上述の脂肪酸を誘導体化してなる化合物をいい、例えば、脂肪酸エステル、脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体、脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体、脂肪酸シリル誘導体が挙げられる。脂肪酸の誘導体はＧＳ－ＭＳやＬＣ－ＭＳを用いた脂肪酸解析等において使用することができる点で有利である。

【0022】

本発明において「脂肪酸エステル」は、上述の脂肪酸をエステル化してなる化合物（エステル体）をいい、具体的には脂肪酸のカルボキシ基をエステル化してなる化合物をいう。脂肪酸エステルとしては、アルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル、ヘキシルエステルのような炭素数１～６（好ましくは炭素数１～４）のアルキルエステル）や、アリールエステル（例えば、フェニルエステルのような芳香族炭化水素エステル）が挙げられる。

【0023】

本発明において「脂肪酸ジメチルジスルフィド誘導体」は、上述の脂肪酸をジメチルジスルフィドを用いて誘導体化してなる化合物をいい、具体的には、脂肪酸の不飽和位（２つの炭素原子）にメチルスルフィド基が導入されてなる化合物をいう。メチルスルフィド基は、不飽和脂肪酸またはそのエステル体（例えば、メチルエステル）の不飽和位にジメチルジスルフィドを反応させることにより導入できる。

【0024】

本発明において「脂肪酸ジメチルオキサゾリン誘導体」は、上述の脂肪酸をジメチルオキサゾリン化してなる化合物をいい、具体的には、脂肪酸のカルボキシ部分にジメチルオキサゾリン基が導入されてなる化合物をいう。ジメチルオキサゾリン誘導体は、脂肪酸のエステル体（例えば、メチルエステル）と２－アミノ－２－メチルプロパノールを反応させることにより得ることができる。

【0025】

本発明において「脂肪酸シリル誘導体」は、上述の脂肪酸をシリル化してなる化合物（シリル体）をいい、具体的には脂肪酸のカルボキシ基をシリル化してなる化合物をいう。脂肪酸シリル誘導体は、脂肪酸とシリル化剤とを反応させることにより得ることができる。シリル化剤としては、トリメチルシリル化剤、ジメチルシリル化剤、ジメチルアルキルシリル化剤、ハロメチルシリル化剤、環状シリレン化剤が挙げられる。

【0026】

本発明において「脂肪酸をその構造の一部とする化合物」としては脂質、脂肪酸結合タンパク質が挙げられる。なお、前記タンパク質にはペプチドも含まれる。脂質の例としては、コレステロールエステル、アシルグリセロール（例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール）、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（本明細書中「ＰＣ」ということがある）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン）、糖脂質（例えば、ヘキソシルセラミド、スルファチド、ガングリオシド、グロボシド）、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン、セラミド、スフィンゴシン－１－リン酸）等が挙げられる。脂肪酸結合タンパク質の例としては、アミノ末端にミリスチン酸が共有結合してなるＩＩ型血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、システイン残基にパルミチン酸が共有結合してなるシナプス後膜肥厚タンパク質９５、セリン残基にオクタン酸が共有結合してなるグレリン、システイン残基にイソプレノイドが共有結合してなるＲａｂタンパク質等が挙げられる。

【0027】

本発明の重水素化標識化合物の好ましい態様によれば、後述の式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物が提供される。

【0028】

＜＜重水素化標識化合物の製造方法＞＞
本発明の重水素化標識化合物は、基質化合物に対する重水素化反応により製造することができる。ここで、重水素化反応工程は、脂肪酸のβ位に対する重水素化反応工程を少なくとも含むものであり、脂肪酸のα位の重水素化反応工程をさらに含んでいてもよい。脂肪酸のα位の重水素化反応工程と、脂肪酸のβ位の重水素化反応工程との両方を実施する場合、両工程の順序はいずれが先でもよい。

【0029】

＜脂肪酸のβ位に対する重水素化反応＞
本発明の製造方法における脂肪酸のβ位に対する重水素化反応は、脂肪酸アミドを白金族金属触媒の存在下で重水素化することにより実施することができる。ここで、白金族金属触媒としては、パラジウム触媒（例えば、酢酸パラジウム、トリフルオロ酢酸パラジウム、ピバル酸パラジウム、塩化パラジウム、アリルパラジウムクロリドダイマー、パラジウムアセチルアセトナート、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム、シクロペンタジエニルアリルパラジウムのようなパラジウム錯体、およびホスフィン配位子、Ｎ－ヘテロ環状カルベン配位子が配位したパラジウム錯体）、白金触媒（白金アセチルアセトナート、塩化白金のような白金錯体、およびホスフィン配位子、Ｎ－ヘテロ環状カルベン配位子が配位したパラジウム錯体）、ロジウム触媒、ルテニウム触媒等が挙げられ、反応性と価格の観点から好ましくは酢酸パラジウム、トリフルオロ酢酸パラジウム、ピバル酸パラジウムである。基質化合物に対する触媒量は０．０１～２当量（ｅｑ）（好ましくは０．１～１当量）の範囲とすることができる。

【0030】

上記重水素化反応においては重水素の供給源として重水素含有化合物を存在させてもよい。重水素の供給源としては、重水、メタノール－ｄ_１、メタノール－ｄ_４、エタノール－ｄ_１、エタノール－ｄ_６、イソプロパノール－ｄ_１、イソプロパノール－ｄ_８等が挙げられ、反応性、コスト、安全性の観点から重水が好ましい。

【0031】

本発明における白金族金属触媒を用いた重水素化反応は、塩基の存在下、溶媒中において実施することができる。使用可能な塩基としては、例えば、ピバル酸セシウム、酢酸セシウム、ピバル酸カリウム、酢酸カリウム、ピバル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ピバル酸リチウム、酢酸リチウム、ピバル酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピバル酸カルシウム、酢酸カルシウム、ピバル酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸セシウム、炭酸水素セシウム等が挙げられ、反応性の観点から好ましくはピバル酸セシウムである。また使用可能な溶媒としては有機溶媒が挙げられ、例えば、トルエン、ベンゼン、トリフルオロメチルベンゼン、ヘキサン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘプタン、塩化メチレン、クロロホルム等が挙げられ、反応性の観点からはトルエンが好ましい。

【0032】

本発明における白金族金属触媒を用いた重水素化反応はまた、０．０２～４当量（好ましくは０．２～２当量）の塩基の存在下、室温～１３０℃（好ましくは７０～９０℃）の温度、１～２４時間（好ましくは１７～１９時間）の条件下で撹拌することにより実施することができる。

【0033】

＜脂肪酸のα位に対する重水素化反応＞
本発明の製造方法における脂肪酸のα位に対する重水素化反応は、脂肪酸アミドを塩基の存在下で重水素化することにより実施することができる。ここで、塩基としては、炭酸塩（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸リチウム）、カルボン酸塩（例えば、酢酸塩）、炭酸水素塩、水酸化物塩、リン酸塩、アルカリ金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩）が挙げられる。

【0034】

脂肪酸のα位に対する重水素化反応は溶媒中で実施することができ、該溶媒は重水素の供給源ともなるものを使用することができる。その例としては、メタノール－ｄ_１、メタノール－ｄ_４、エタノール－ｄ_１、エタノール－ｄ_６、イソプロパノール－ｄ_１、イソプロパノール－ｄ_８、重水（Ｄ_２Ｏ）、アセトン－ｄ_６、クロロホルム－ｄ_１、アセトニトリル－ｄ_３、ジメチルスルホキシド－ｄ_６等が挙げられる。

【0035】

上記の脂肪酸のα位に対する重水素化反応は、０．１～３当量（好ましくは０．５～２当量）の塩基の存在下、室温～１２０℃（好ましくは７０～９０℃）の温度、１～２４時間（好ましくは１６～２０時間）の条件下で撹拌することにより実施することができる。

【0036】

＜脂肪酸アミドおよびその調製＞
脂肪酸アミドは、本発明の重水素化反応の基質となるものであればいずれも使用できるが、例えば、下記式（Ｉ）の化合物を使用することができる。
Ｒ^ａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（－Ｒ^ｂ）－Ｒ^ｃ・・・（Ｉ）
（上記式中、
Ｒ^ａは、脂肪酸のうちカルボキシ基に結合する炭化水素鎖を表し、
Ｒ^ｂは、水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、
Ｒ^ｃは、下記基（ｉ）、基（ｉｉ）または基（ｉｉｉ）：
（ｉ）２環式の９～１０員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１～４個の異種原子を含んでいてもよく、また、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基から選択される１種または２種以上により置換されていてもよい）；
（ｉｉ）フェニル基（このフェニル基は、下記（ａ）または（ｂ）：
（ａ）単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の異種原子を含んでいてもよい）；または
（ｂ）－Ｎ（－Ｒ^１１）（－Ｒ^１２）、－ＯＲ^１３、－ＳＲ^１４または－Ｃ（＝ＮＲ^１５）（－ＯＲ^１６）（Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒ^１５およびＲ^１６はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５または６員の複素環を形成してもよく、この複素環は１個または２個の炭素数１～４のアルキル基により置換されていてもよい）により置換されていてもよい）；または
（ｉｉｉ）－Ｘ－Ｚ（Ｘは－ＣＨ－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｚは単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の異種原子を含んでいてもよい）を表す）を表す。）

【0037】

Ｒ^ａは、例えば、アルキル基またはアルケニル基を表し、前記アルキル基または前記アルケニル基は１個または複数個（例えば１～３個または１～２個）の官能基（該官能基は同一であっても異なっていてもよく、例えば、水酸基、炭素数１～４のアルコキシ基、エポキシ基、アミノ基、ハロゲン基、シアノ基、炭素数１～４のアルキルチオ基および（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ基から選択することができる）で置換されていてもよい。Ｒ^ａが表すアルキル基およびアルケニル基の炭素数の下限は例えば１個、２個、４個、７個、１１個または１５個とすることができ、炭素数の上限は例えば３６個、３５個、３０個、２９個または２４個とすることができ、これら炭素数の上限および下限は任意に組み合わせることができる。Ｒ^ａが表すアルキル基およびアルケニル基の炭素数は例えば１～３６個、１～３０個、２～３５個、２～２９個、２～２４個、７～２４個または１５～２４個とすることができる。

【0038】

Ｒ^ｂは、好ましくは水素原子を表す。

【0039】

Ｒ^ｃが基（ｉ）を表す場合、Ｒ^ｃは、好ましくは２環式の１０員芳香族複素環基（この複素環は環員原子として１または２個の窒素原子を含んでいてもよい）を表し、より好ましくはキノリン、プリンを表し、さらに好ましくはキノリン－８－イル基、プリン－６－イルである。

【0040】

Ｒ^ｃが基（ｉｉ）を表す場合、Ｒ^ｃは、好ましくは
－ 単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１または２個の窒素原子、より好ましくは環員原子として１個の窒素原子を含んでいてもよい）により置換されたフェニル基；または
－ 基－Ｎ（－Ｒ^１１）（－Ｒ^１２）（Ｒ^１１およびＲ^１２は、同一または異なってもよく、水素原子またはメチルを表し、好ましくはＲ^１１およびＲ^１２はメチルを表す）、基－ＯＲ^１３（Ｒ^１３はメチルを表す）、基－ＳＲ^１４（Ｒ^１４はメチルを表す）または基－Ｃ（＝ＮＲ^１５）（－ＯＲ^１６）（Ｒ^１５およびＲ^１６はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒ^１５およびＲ^１６はそれらが結合している炭素原子と一緒になって５員の複素環を形成してもよく、この複素環は１個または２個のメチル基により置換されていてもよい）により置換されたフェニル基
を表す。

【0041】

Ｒ^ｃが基（ｉｉｉ）を表す場合、Ｒ^ｃは、好ましくは基－Ｘ－Ｚ（Ｘは－ＣＨ－または－Ｃ（＝Ｏ）－を表し、Ｚは単環式の６員の芳香族複素環基（この複素環は、好ましくは環員原子として１または２個の窒素原子、より好ましくは環員原子として１個の窒素原子を含んでいてもよい）を表す）を表す。

【0042】

Ｒ^ｃは、さらに好ましくは下記（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）および（Ｉｇ）のいずれかの基を表す。

【化1】

（上記式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、同一または異なってもよく、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、好ましくは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子またはカルボキシ基を表し、より好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６の１つまたは２つが、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、残りが水素原子を表し、さらに好ましくは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６の１つまたは２つが、同一または異なってもよく、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子またはカルボキシ基を表し、残りが水素原子を表す）；

【0043】

【化2】

（上記式中、Ｒ^７は、同一または異なってもよく、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、ベンジル基、アミノ基、芳香族炭化水素基および芳香族複素環基を表し、好ましくは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基またはベンジル基を表す）；

【0044】

【化3】

（上記基中、Ａは、基－Ｎ（－Ｒ^１１）（－Ｒ^１２）、基－ＯＲ^１３、基－ＳＲ^１４または基－Ｃ（＝ＮＲ^１５）（－ＯＲ^１６）を表し、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５およびＲ^１６は前記で定義した内容と同義であり、好ましくは、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４はメチルであり、Ｒ^１５およびＲ^１６は、同一または異なってもよく炭素数１～４のアルキルを表す）；

【0045】

【化4】

【0046】

式（Ｉ）の脂肪酸アミドのうち、反応性の観点からＲ^ｃが式（Ｉａ）の基を表すもの（８－キノリンアミドおよびその誘導体）が好ましい。

【0047】

本発明の重水素化反応の基質となる脂肪酸アミドは脂肪酸のアミド化反応により調製することができる。脂肪酸のアミド化は、例えば、脂肪酸とアミノ基を有する化合物とをカルボン酸とアミンの縮合反応により反応させて実施することができる。本発明では重水素化反応に先立って脂肪酸のアミド化反応を実施して重水素化反応の基質となる脂肪酸アミドを合成してもよい。脂肪酸のアミド化反応は、例えば、カルボン酸：Ｒ^ａ－ＣＯＯＨ（Ｒ^ａは前記で定義した内容と同義である）と、アミン：ＨＮ（－Ｒ^ｂ）（－Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは前記で定義した内容と同義である）とをカルボン酸とアミンの縮合反応により反応させて実施することができる。カルボン酸とアミンの縮合反応は公知であり、例えば、Yang, Q. et al., ACS Catal. 2017, 7, 5220-5224.やPeng, J.-B. et al., ACS Catal. 2019, 9, 2977-2893.等を参照して実施することができる。

【0048】

＜アミドの脱保護とエステルの加水分解＞
本発明の製造方法は、重水素化された脂肪酸アミドを脱保護して脂肪酸エステルへ変換し、続いて該エステルを加水分解する工程をさらに含んでもよい。脂肪酸アミドを脱保護する工程（脂肪酸エステルへの変換工程）は、公知の方法（例えば、Deguchi, T. et al., ACS Catal. 2017, 7, 3157-3161.）に従って実施することができる。また、エステルを加水分解する工程は、公知の方法（例えば、Meyer, M. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 430-439.）に従って実施することができる。具体的には後記の実施例の記載に従って実施することができる。

【0049】

アミドの脱保護とエステルの加水分解により本発明の重水素化標識化合物を得ることができる。製造された本発明の重水素化標識化合物としては、例えば、式（ＩＩ）：Ｒ^ａ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨ（Ｒ^ａは前記式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、脂肪酸のα位およびβ位のうち少なくともβ位が重水素化され、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよく、好ましくは、脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数が２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数が１または２個（より好ましくは２個）である）で表される重水素化標識脂肪酸が挙げられる。また、本発明においてはエステルの加水分解を行わず、本発明の重水素化標識脂肪酸のエステル体を得てもよい。製造された本発明の重水素化標識化合物のエステル体としては、例えば、式（ＩＩＩ）：Ｒ^ａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^ｄ（Ｒ^ａは前記式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｒ^ｄはアルキル基（例えば、炭素数１～６または炭素数１～４のアルキル基）またはアリール基（例えば、フェニル基のような芳香族炭化水素基）を表し、脂肪酸のα位およびβ位のうち少なくともβ位が重水素化され、脂肪酸のα位がさらに重水素化されていてもよく、好ましくは、脂肪酸のβ位の炭素原子上に存在する重水素の数が２個であり、かつ、α位の炭素原子上に存在する重水素の数が１または２個（より好ましくは２個）である）で表される重水素化標識脂肪酸エステルが挙げられる。

【0050】

＜重水素化標識脂質の合成例＞
本発明の重水素化標識化合物が脂質から構成される場合、該重水素化標識化合物は本発明の重水素化標識化合物である脂肪酸またはその誘導体を使用して合成することができる。脂質の合成方法は公知であり、脂肪酸として本発明の重水素化標識脂肪酸またはその誘導体を用いる以外は公知の方法に従って本発明の重水素化標識脂質を合成することができる。

【0051】

本発明の重水素化標識脂質は、本発明の重水素化標識脂肪酸またはその誘導体を出発物質として公知の方法により合成することができる。例えば、コレステロールエステルはKomura, K. et al., Synthesis. 2008, 3407-3410.の記載に従って、アシルグリセロールはManhas, S. et al., Green Chem. 2019, 21, 5363-5367.の記載に従って、リン脂質はAcharya, H. P. et al., Synlett. 2005, 2015-2018.の記載に従って、それぞれ合成することができる。

【0052】

＜＜重水素化標識化合物を用いた定量方法＞＞
本発明の重水素化標識化合物は安定同位体標識化合物であるため、質量分析の内部標準物質として使用することができる。すなわち本発明によれば、本発明の重水素化標識化合物を質量分析の内部標準物質として使用することを特徴とする、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法が提供される。本発明によればまた、脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法における質量分析の内部標準物質としての、本発明の重水素化標識化合物の使用が提供される。一般に、対象試料中の脂質等の目的物質の質量分析では標準物質を指標としてその定量を行うが、対象試料に含まれる夾雑物等がイオン化に影響を与え正確に定量できない場合がある。このため、目的物質と化学的性質や構造が類似した物質を内部標準物質として使用することで、イオン化の影響を補正し目的物質を正確に定量することが可能となる。従来は脂質やその代謝物の内部標準物質は種類が少なく限定されるものであったが、本発明の定量方法および本発明の使用によればこれまで正確な定量が困難であった脂質やその代謝物についても正確な定量ができる点で有利である。

【0053】

本発明の脂質若しくは脂肪酸結合タンパク質またはそれらの代謝物の定量方法は、（Ａ）対象試料、標準物質および本発明の重水素化標識化合物を含む質量分析用試料を調製する工程と、（Ｂ）前記質量分析用試料を質量分析により解析（分析）する工程とを含んでいてもよい。対象試料としては、例えば、血液、尿等の体液、皮膚、口腔粘膜、外科的手術によって得られる組織の他、食品、化粧品、医薬品が挙げられる。

【0054】

＜＜重水素化標識化合物を用いた生体内代謝の解析方法＞＞
本発明の重水素化標識化合物は安定同位体標識化合物であるため、代謝物マーカーとして使用することもできる。すなわち本発明によれば、本発明の重水素化標識化合物を代謝物マーカーとして使用することを特徴とする、生体内代謝の解析方法（分析方法）が提供される。本発明によればまた、生体内代謝の解析方法（分析方法）における代謝物マーカーとしての、本発明の重水素化標識化合物の使用が提供される。脂肪酸に存在する水素を重水素で置換しても化学的性質は基本的に同じであり、生体内や生体外の評価系における標識化合物を質量分析や核磁気共鳴（ＮＭＲ）等で容易に検出することが可能である。このため、例えば、本発明の重水素化標識化合物をモデル動物に投与することにより、あるいは、生体外の評価系（例えば、生体から単離した細胞、組織、器官および臓器；再生医工学技術により調製された組織、器官および臓器；培養細胞；微生物；酵素等）に使用することにより、生体内の代謝過程や代謝産物の動態をトレースすることができる。解析対象となる生体内代謝としては、脂質代謝、糖代謝等の生体内物質代謝が挙げられる。本発明の解析方法および本発明の使用によれば、これまで正確な定量が困難であった脂質の代謝メカニズムの解析をすることができる点で有利である。

【0055】

本発明の脂質代謝の解析方法は、（Ｃ）対象に本発明の標識化合物を投与するか、または生体外の評価系に本発明の標識化合物を使用する工程と、（Ｄ）対象または評価系における前記標識化合物の存在を検出または解析（分析）する工程とを含んでいてもよい。対象における標識物質の存在の検出または解析は、対象から採取した体液や組織について実施しても、対象に対して直接実施してもよい。前記対象としては、例えば、動物モデルが挙げられる。前記評価系としては、例えば、生体から単離した細胞、組織、器官および臓器；再生医工学技術により調製された組織、器官および臓器；培養細胞；微生物；酵素等が挙げられる。標識物質の存在の検出および解析は、例えば、質量分析やＮＭＲにより実施することができる。分析手法に適した試料の調製は公知の方法に従って実施することができる。本発明の脂質代謝の解析方法および本発明の使用は、少なくとも工程（Ｄ）をイン・ビトロで実施することができる。

【実施例】

【0056】

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【0057】

測定機器等
本実施例（例１～１８）では、以下の測定機器等を使用した。ＮＭＲスペクトルは、ＮＭＲ分光計（AVANCE HD 400、Bruker）で取得した。化学シフトはδ（ｐｐｍ）値で表され、結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で表される。^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランまたは溶媒残留シグナルを参照した。略語は次のものを使用した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ－ｓ＝ブロードシングレット。ＩＲスペクトルは分光光度計（Cary 630 FTIR、Agilent）、ＥＳＩ質量分析スペクトルは質量分析計（micrOTOF-II、Bruker）、融点は融点測定器（ＭＰ－２１型、ヤマト科学）で測定した。すべての化学物質は試薬グレードのものであり、受領時の状態で使用した。すべての反応は、１０ｍＬスクリューキャップチューブ、シュレンクチューブ、若しくはナスフラスコで行った。各反応における生成物の精製は、中圧分取液体クロマトグラフシステム（EPCLC-W-Prep 2XY、山善）とカートリッジカラム（Purif-Pack（登録商標）-EX、照光サイエンス）を、若しくはシリカゲル（DIOLシリカ、富士シリシア）を使用して順相カラムクロマトグラフィーにより行った。

【0058】

本実施例（例１～１６）では、各種脂肪酸について重水素化を行った。また、本実施例（例１７）では、重水素化標識脂肪酸を使用して重水素化脂質の合成を行った。さらに、本実施例（例１８～２１）では、重水素化標識脂肪酸を使用して脂質代謝解析を行った。以下、順に説明する。

【0059】

例１：重水素化標識脂肪酸（リノール酸）の製造
（１）（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミドの調製

【化5】

【0060】

リノール酸（１．４０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．１ｍＬ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で５０ｍＬシェンクチューブに入れた。０℃に冷却後、塩化オキサリル（０．８５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩攪拌し反応させた。次に、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。アルゴン雰囲気下の別のフレームドライしたフラスコで、８－アミノキノリン（７２１ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．８７ｍＬ、６．２５ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液を０℃に冷却した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（９．０ｍＬ）中の酸塩化物の溶液を、カニューレを介して溶液に滴下した。室温で一晩攪拌した後、反応を１Ｎ ＨＣｌでクエンチし、ＮａＨＣＯ_３水溶液と塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。そして、得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率４４％、８８４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Perez-Gomez, M. et al., Organometallics. 2019, 38, 973-980.）に記載されているものと一致することが確認された。

【0061】

無色油: R_f 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.31-5.39 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00-2.07 (m, 4H), 1.83 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.27-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)

【0062】

（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１２Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化6】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0063】

上記（１）で得られた化合物に対してまずβ位の重水素化を行い、次いでα位の重水素化を行って表題の化合物を得た。具体的には下記アおよびイの手順に従って行った。

【0064】

ア β位の重水素化
まず、β位の重水素化を行った。上記（１）で得られた化合物（２０５．９ｍｇ、０．５０６ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１１．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）およびピバル酸セシウム（２３．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。トルエン（５．０ｍＬ、０．１Ｍ）を加えてアミドを溶解させた後、その混合物に重水（Ｄ_２Ｏ）（０．５０ｍＬ）を加えた。８０℃で１８時間攪拌して反応させ、進行をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）でモニターした。反応混合物を室温に冷却し、分離漏斗に移し、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）で希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗β位－重水素化標識化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗精製した。

【0065】

イ α位の重水素化
続いて、上記アで得られたβ位－重水素化標識化合物（１８８．６ｍｇ、約０．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６３．７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、およびメタノール－ｄ_１（ＣＨ_３ＯＤ、２．３ｍＬ、０．２Ｍ）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。８０℃で１８時間攪拌して反応させ、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し分離漏斗に移し、ＡｃＯＥｔで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題化合物を得た（収率７８％、１６２．２ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９７％と確認された。

【0066】

無色油: R_f 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.12 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.40-7.55 (m, 3H), 5.32-5.38 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.0 Hz, 2H), 2.52 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.00-2.07 (m, 4H), 1.77-1.80 (m, 0.08H, 96%D), 1.27-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 130.2, 130.0, 128.0, 127.9 (overlapped), 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.0-37.4 (m, α-CD₂), 31.5, 29.6, 29.3 (overlapped), 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 25.6, 24.4-25.2 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₄D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 433.3127, found 433.3139.
IR (ATR-IR, neat) 3555, 3008, 2922, 2851, 2848, 1685, 1520, 1383, 1327, 1264, 1163, 969, 913, 824, 790, 753, 678 cm^-1.

【0067】

（３）重水素化エステル化合物（リノール酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートメチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化7】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0068】

公知文献（Deguchi, T. et al. T., ACS Catal. 2017, 7, 3157-3161.）の記載に従って、上記（２）で得られた化合物の８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した。具体的には以下の手順に従って行った。

【0069】

上記（２）で得られた化合物（３８．４ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）（８．０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）およびＭｅＯＨ－ｄ_１（ＣＨ_３ＯＤ、０．９ｍＬ、０．１Ｍ）を粗いＮ_２パージとともに１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。１００℃で１６時間撹拌して反応させ、進行を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびＥＳＩ－ＭＳによりモニターした。反応混合物を分離漏斗に移し、ＡｃＯＥｔで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。そして、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８５％、２３．８ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0070】

無色油: Rf 0.74 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.30-5.42 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.02-2.07 (m, 4H), 1.60 (overlapped with H₂O), 1.30-1.36 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 130.2, 130.1, 128.1, 127.9, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD₂), 31.5, 29.6, 29.4, 29.1, 28.9, 27.2, 27.2, 25.6, 23.7-24.5 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₀D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 321.2702, found 321.2710.
IR (ATR-IR, neat) 3008, 2922, 2855, 1737, 1461, 1260, 1193, 1085, 719 cm^-1.

【0071】

（４）重水素化標識脂肪酸（リノール酸－２，２，３，３－ｄ_４（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイック酸－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化8】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0072】

公知文献（Meyer, M. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 430-439.）を参考に、上記（３）で得られた化合物を加水分解によりカルボン酸に変換し、表題の重水素化リノール酸－ｄ_４を得た。具体的には以下の手順に従って行った。

【0073】

上記（３）で得られたエステル化合物（２３．８ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（０．８０ｍＬ）およびメタノール－ｄ_１（ＣＨ_３ＯＤ、０．２７ｍＬ）を粗いＮ_２パージとともに１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。０℃に冷却した後、ＮａＯＤ／Ｄ_２Ｏ溶液（Sigma-Aldrich、４０ｗｔ％、３０μＬ）を反応混合物に加えた。混合物を０℃で５分間および室温で２時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応を１Ｎ ＨＣｌでクエンチし、ジエチルエーテルで希釈し、分離した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル（富士シリシア化学）、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノール酸－ｄ_４を得た（収率９０％、２０．４ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。

【0074】

無色油: R_f 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.30-5.42 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 6.4, 6.8 Hz, 2H), 2.32 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.02-2.08 (m, 4H), 1.59-1.63 (m, 0.11H, 94%D), 1.24-1.39 (m, 14H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.1, 130.2, 130.0, 128.1, 127.9, 32.9-33.8 (m, α-CD₂), 31.5, 29.6, 29.4, 29.1 (overlapped), 28.8, 27.2, 27.2, 25.6, 23.6-24.4 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 283.2581, found 283.2579.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3009, 2922, 2855, 1707, 1481, 1409, 1293, 947, 839, 719 cm^-1.

【0075】

例２：重水素化標識脂肪酸（ステアリン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）ステアラミドの調製

【化9】

ステアリン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ステアリン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率７７％、１．５７ｇ、３．８３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Qian, P. et al., Chem. Lett. 1999, 28, 1229-1230.、Gou, Q. et al., J. Org. Chem. 2015, 80, 3176-3186.）に記載されているものと一致していることが確認された。

【0076】

白色固体: R_f 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J =7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.25-1.42 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)

【0077】

（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）ステアラミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化10】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0078】

上記（１）で得られた化合物（１２３．２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６５％、８０．６ｍｇ、０．１９５ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９３％と確認された。

【0079】

白色固体: R_f 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.75-1.82 (m, 0.14H, 93%D), 1.25-1.42 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-38.0 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7 (overlapped), 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 24.5-25.4 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₈D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 437.3440, found 437.3430
IR (ATR-IR, neat) 3339, 2956,2914, 2848, 1662, 1524, 1487, 1379, 1323, 1267, 1167, 837, 790, 760, 723 cm^-1.
mp 62-63 ℃.

【0080】

（３）重水素化エステル化合物（ステアリン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化11】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0081】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２９．４ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７５％、１６．２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0082】

白色固体: R_f 0.81 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.59 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.57-1.59 (m, 0.07H, 97%D), 1.18-1.21 (m, 28H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.4, 50.4, 32.1-32.8 (m, α-CD₂), 30.9, 28.7 (overlapped), 28.7, 28.6, 28.6, 28.6, 28.4, 28.3, 28.2, 28.0, 27.9, 22.7-23.6 (m, β-CD₂), 21.7, 13.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₄D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 303.3196, found 303.3198.
IR (ATR-IR, neat) 2952, 2915, 2844, 1737, 1461, 1275, 1193, 1096, 850, 719, 671 cm^-1.
mp 38-39 ℃.

【0083】

（４）重水素化標識脂肪酸（ステアリン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化12】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0084】

上記（３）で得られた化合物（１５．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題の重水素化ステアリン酸－ｄ_４を得た（収率８８％、１３．１ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。

【0085】

白色固体: R_f 0.81 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ2.32 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.59-1.62 (m, 0.12H, 94%D), 1.26-1.30 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.0, 130.0, 129.7, 32.9-33.6 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7(overlapped), 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 28.9, 28.8, 23.5-242 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₈H₃₁D₄O₂ ⁺ [M+Na]⁺ 287.2894, found 287.2893.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 2956, 2915, 2848, 1696, 1481, 1409, 1320, 1197, 951, 891, 719, 664 cm^-1.
mp 68-69 ℃.

【0086】

例３：重水素化標識脂肪酸（オレイン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）オレアミドの調製

【化13】

【0087】

オレイン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。オレイン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題化合物を得た（収率８７％、１．７７ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Ano, Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12984-12986.）に記載されているものと一致していることが確認された。

【0088】

無色油: R_f 0.57 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.33-5.35 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00-2.05 (m, 4H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.44 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)

【0089】

（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）オレアミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化14】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0090】

上記（１）で得られた化合物（１２２．６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７８％、９８．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。

【0091】

無色油: R_f 0.57 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.14 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.54 (m, 3H), 5.30-5.38 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.98-2.01 (m, 4H), 1.77-1.79 (m, 0.07H, 97%D), 1.26-1.42 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 130.0, 129.8, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.6 (m, α-CD₂), 31.9, 29.8 (overlapped), 29.7, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 27.2, 24.4-25.4 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₆D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 435.3284, found 435.3276.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3004, 2922, 2851, 1685, 1521, 1382, 1327, 1264, 824, 790, 753 cm^-1.

【0092】

（３）重水素化エステル化合物（オレイン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化15】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0093】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（５８．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８７％、３７．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0094】

無色油: R_f 0.70 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.30-5.39 (m, 2H), 3.37 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.99-2.03 (m, 2H), 1.59-1.65 (m, 0.09H, 96%D), 1.27-1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 130.0, 129.8, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD₂), 31.3, 29.8, 29.7, 29.5, 29.3, 29.1, 28.9, 27.2, 27.2, 23.2-24.7 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₂D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 323.2859, found 323.2852.
IR (ATR-IR, neat) 3004, 2922, 2851, 1741, 1461, 1260, 1193, 1085, 850, 813, 723 cm^-1.

【0095】

（４）重水素化標識脂肪酸（オレイン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化16】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0096】

上記（３）で得られた化合物（１８．４ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化オレイン酸－ｄ_４を得た（収率７１％、１２．４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0097】

無色油: R_f 0.28 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.30-5.39 (m, 2H), 2.32-2.33 (m, 0.07H, 97%D), 1.99-2.04 (m, 4H), 1.57-1.63 (m, 0.08H, 96%D), 1.27-1.31 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.0, 130.0, 129.7, 33.1-33.7 (m, α-CD₂), 31.9, 29.8, 29.7, 29.5, 29.3, 29.1, 29.1, 28.8 (overlapped), 27.2, 27.2, 23.5-24.2 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₉D₄O₂ ^- [M-H]^- 285.2737, found 285.2730.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3004, 2922, 2851, 1707, 1461, 1409, 1297, 947, 723 cm^-1.

【0098】

例４：重水素化標識脂肪酸（エライジン酸）の製造
（１）（Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデク－９－エナミドの調製

【化17】

【0099】

エライジン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。エライジン酸（１．４１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題化合物を得た（収率８６％、１．７６ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）。本化合物はCAS No. [1453491-93-4]（Pan, F. et al., Org. Lett. 2013, 15, 4758-4761.）として知られているが、スペクトルデータは報告されていない。

【0100】

白色固体: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.33-5.38 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.96 (m, 4H), 1.80 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.46 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 130.5, 130.2, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 38.3, 32.6, 32.6, 31.9, 29.7 (overlapped), 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 29.0, 25.7, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₄₁N₂O⁺ [M+H]⁺ 409.3213, found 409.3198.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1662, 1521, 1484, 1423, 1379, 1320, 1260, 1167, 958, 824, 787, 757, 719, 678 cm^-1.
mp 37-38 ℃.

【0101】

（２）重水素化標識化合物（（Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデク－９－エナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化18】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0102】

上記（１）で得られた化合物（１２２．６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、重水素化された生成物を得た（収率７６％、９４．１ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0103】

白色固体: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.56 (m, 3H), 5.33-5.43 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.96 (m, 4H), 1.77-1.81 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.42 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 130.4, 130.2, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.8 (m, α-CD₂), 32.6, 32.6, 31.9, 29.7 (overlapped), 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 29.2, 29.0, 24.4-25.2 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₆D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 435.3284, found 435.3278.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1659, 1521, 1379, 1320, 1271, 962, 823, 790, 757, 723 cm^-1.
mp 35-36 ℃.

【0104】

（３）重水素化エステル化合物（エライジン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化19】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0105】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２５．６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８５％、１５．９ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0106】

無色油: R_f 0.73 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.33-5.43 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.95-1.97 (m, 2H), 1.60 (overlapped with H₂O), 1.26-1.29 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.4, 129.5, 129.2, 50.4, 32.1-32.6 (m, α-CD₂), 28.6, 28.5, 28.5, 28.3, 28.2, 28.0, 27.9, 27.8, 22.7-23.6 (m, β-CD₂), 21.7, 13.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₂D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 323.2859, found 323.2849.
IR (ATR-IR, neat) 2922, 2851, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 989, 805, 723 cm^-1.

【0107】

（４）重水素化標識脂肪酸（エライジン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化20】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0108】

上記（３）で得られた化合物（１５．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）を加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化エライジン酸－ｄ_４を得た（収率９０％、１２．９ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0109】

白色粘着固体: R_f 0.25 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.33-5.43 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.94-1.
97 (m, 4H), 1.60-1.65 (m, 0.10H, 95%D), 1.26-1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.0, 130.5, 130.2, 32.9-33.6 (m, α-CD₂), 32.6, 32.6, 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.9, 28.8, 23.4-24.2 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₉D₄O₂ ^- [M-H]^- 285.2737, found 285.2738.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3034, 2960, 2919, 2848, 1711, 1468, 1420, 1375, 1312, 1059, 962, 872, 731, 667 cm^-1.
mp 41 ℃.

【0110】

例５：重水素化標識脂肪酸（リノエライジン酸）の製造
（１）（９Ｅ，１２Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミドの調製

【化21】

【0111】

リノエライジン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ステアリン酸（２８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率９０％、１８１．２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）。

【0112】

無色油: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.35-5.45 (m, 4H), 2.65-2.66 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.24-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 131.1, 131.0, 128.7, 128.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 38.3, 35.7, 32.6, 31.4, 29.5, 29.2, 29.2, 29.0, 25.7, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₈N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 429.2876, found 429.2875.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2851, 1689, 1521, 1484, 1424, 1383, 1323, 1260, 1189, 969, 828, 790, 752 cm^-1.

【0113】

（２）重水素化標識化合物（（９Ｅ，１２Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化22】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0114】

上記（１）で得られた化合物（１３１．４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された生成物を得た（収率７５％、９８．５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９７％と確認された。

【0115】

無色油: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.55 (m, 3H), 5.38-5.42 (m, 4H), 2.65-2.66 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.77-1.83 (m, 0.10H, 95%D), 1.24-1.41 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.9 (m, α-CD₂), 35.6, 32.5, 31.4, 29.5, 29.2, 29.0 (overlapped), 24.6-25.4 (m, β-CD₂), 22.5, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₄D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 433.3127, found 433.3139.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3023, 2922, 2851, 1685, 1521, 1424, 1383, 1327, 1264, 969, 917, 824, 790, 753, 678 cm^-1.

【0116】

（３）重水素化エステル化合物（リノエライジン酸メチル２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化23】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0117】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２１．０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８６％、１３．１ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0118】

無色油: R_f 0.62 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 2.66-2.67 (m, 2H), 2.27 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.97-1.99 (m, 4H), 1.60 (overlapped with H₂O), 1.26-1.35 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 131.1, 130.9, 128.7, 128.6, 51.4, 35.6, 33.0-33.9 (m, α-CD₂), 32.5, 32.5, 31.4, 29.5, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 23.7-24.7 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₀D₄NaO2⁺ [M+Na]⁺ 321.2702, found 321.2700.
IR (ATR-IR, neat) 3023, 2922, 2855, 1737, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 969, 805, 727 cm^-1.

【0119】

（４）重水素化標識脂肪酸（リノエライジン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化24】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0120】

リノエライジン酸メチル－ｄ_４（３７．５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノエライジン酸－ｄ_４を得た（収率７３％、２６．０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９４％と確認された。

【0121】

白色粘着固体: R_f 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 2.62-2.71 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.96-2.00 (m, 4H), 1.58-1.61 (m, 0.11H, 94%D), 1.25-1.38 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.2, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 35.7, 32.9-33.6 (m, α-CD₂), 32.6, 32.5, 31.4, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.8, 23.4-24.4 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 283.2581, found 283.2582.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3023, 2922, 2855, 1707, 1461, 1409, 1293, 1088, 985, 839, 727 cm^-1.
mp 28-29 ℃.

【0122】

例６：重水素化標識脂肪酸（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ））の製造
（１）（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製

【化25】

【0123】

ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ（３８５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率７０％、３７７ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）。

【0124】

無色油: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.14 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.16 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.46 (m, 16H), 0.86-0.89 (m, 12H), 0.04 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.8, 136.3, 134.6, 131.7, 128.1, 128.0, 127.5, 124.4, 121.6, 121.3, 116.4, 73.2, 38.4, 38.3, 31.9, 29.7, 29.3, 29.3, 29.1, 27.7, 25.9, 25.7, 25.0, 22.6, 18.3, 14.1, -4.3, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₃₃H₅₂N₂O₂SiNa⁺ [M+Na]⁺ 559.3690, found 559.3695.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3004, 2926, 2855, 1689, 1521, 1484, 1383, 1323, 1252, 1074, 984, 828, 675 cm^-1.

【0125】

（２）重水素化標識化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化26】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0126】

上記（１）で得られた化合物（２０１．１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６９％、１３８．９ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。

【0127】

無色油: R_f 0.55 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.05H, 97%D), 2.16 (dt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.77-1.81 (m, 0.05H, 97%D), 1.26-1.56 (m, 16H), 0.86-0.89 (m, 12H), 0.04 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.8, 136.3, 134.6, 131.7, 128.1, 127.9, 127.4, 124.4, 121.5, 121.3, 116.4, 73.2, 38.4, 37.0-37.9 (m, α-CD₂), 31.8, 29.7, 29.3, 29.1, 29.0, 27.7, 25.9, 24.9, 24.4-25.1 (m, β-CD₂), 22.6, 18.3, 14.1, -4.3, -4.8
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₃₃H₄₈D₄N₂O₂SiNa⁺ [M+Na]⁺ 563.3941, found 563.3944.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2855, 1685, 1521, 1383, 1327, 1252, 1074, 984, 835, 734 cm^-1.

【0128】

（３）重水素化エステル化合物（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥメチル－２，２，３，３－ｄ_４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノエートメチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化27】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0129】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（１５４．６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６２％、７６．９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0130】

無色油: R_f 0.68 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.15 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.13-2.18 (m, 2H), 1.58 (overlapped with H₂O), 1.27-1.52 (m, 6H), 0.86-0.90 (m, 12H), 0.05 (m, 3H), 0.02 (m, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 136.9, 131.7, 128.3, 124.5, 73.3, 51.5, 38.5, 33.0-33.8 (m, α-CD₂), 32.0, 29.7, 29.2, 29.2, 29.0, 27.8, 27.5, 26.0, 25.1, 23.8-24.7 (m, β-CD₂), 22.7, 18.3, 14.2, -4.2, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₅H₄₄D₄NaO₃Si⁺ [M+Na]⁺ 451.3516, found 451.3506.
IR (ATR-IR, neat) 3008, 2948, 2930, 2855, 1741, 1461, 1435, 1360, 1252, 1193, 1077, 984, 951, 835, 775, 734 cm^-1.

【0131】

（４）重水素化標識脂肪酸（ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ_４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクトデカ－９，１１－ジエノン酸－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化28】

【0132】

ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥメチル－２，２，３，３－ｄ_４（９１．４ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～８０／２０）、表題の重水素化ＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥを得た（収率９４％、８２．８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0133】

無色油: R_f 0.17 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.41 (dd, J = 14.8, 10.8 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 14.8, 6.0 Hz, 1H), 5.39 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 4.15 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.13-2.18 (m, 2H), 1.58-1.61 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.49 (m, 16H), 0.86-0.90 (m, 12H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.2, 136.8, 131.6, 128.2, 124.4, 73.2, 38.4, 32.9-33.7 (m, α-CD₂), 31.8, 29.6, 29.1, 29.0, 28.8, 27.7, 25.9, 25.0, 23.4-24.4 (m, β-CD₂), 22.6, 18.3, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₂₄H₄₂D₄O₃SiNa⁺ [M+Na]⁺ 437.3359, found 437.3349.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2400 (br), 3008, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1361, 1297, 1252, 1074, 984, 947, 872, 835, 775, 731, 671 cm^-1.

【0134】

例７：重水素化標識脂肪酸（エルカ酸）の製造
（１）（Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）ドコス－１３－エナミドの調製

【化29】

【0135】

エルカ酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。エルカ酸（８８０ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、表題化合物を得た（収率７０％、８４０ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲデータは、公知文献（Sun, W.-W. et al., Org. Lett. 2013, 16, 480-483.）に記載されているものと一致していることが確認された。

【0136】

無色油: R_f 0.43 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.43-7.56 (m, 3H), 5.31-5.38 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.99-2.06 (m, 4H), 1.91 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.26-1.45 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)

【0137】

（２）重水素化標識化合物（（Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）ドコス－１３－エナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化30】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0138】

上記（１）で得られた化合物（７１．５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、重水素化された表題の化合物を得た（収率８３％、５９．９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。

【0139】

無色油: R_f 0.43 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.31-5.38 (m, 2H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 1.93-2.01 (m, 4H), 1.77-1.80 (m, 0.07H, 97%D), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 129.9 (overlapped), 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 37.3-38.0 (m, α-CD₂), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6 (overlapped), 29.6, 29.5 (overlapped), 29.4, 29.3 (overlapped), 29.1, 27.2, 24.5-25.2 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₃₁H₄₄D₄N₂NaO⁺ [M+Na]⁺ 491.3910, found 491.3914.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 2922, 2815, 1685, 1521, 1383, 1327, 1263, 824, 790, 753, 723, 678 cm^-1.

【0140】

（３）重水素化エステル化合物（エルカ酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（１３Ｚ）－１３－ドコセン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化31】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0141】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２９．２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８３％、１８．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0142】

無色油: R_f 0.71 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.31-5.39 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.97-2.06 (m, 2H), 1.58 (overlapped with H₂O), 1.26-1.29 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 129.9, 129.9, 51.4, 33.0-33.9 (m, α-CD₂), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.3 (overlapped), 29.2, 29.0, 28.9, 27.2, 23.7-24.6 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₃H₄₀D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 379.3485, found 379.3472.
IR (ATR-IR, neat) 3004, 2922, 2851, 1741, 1481, 1260, 1193, 1074, 805, 723 cm^-1.

【0143】

（４）重水素化標識脂肪酸（エルカ酸－２，２，３，３－ｄ_４（（１３Ｚ）－１３－ドコセン酸－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化32】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0144】

上記（３）で得られた化合物（１７．７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化エルカ酸－ｄ_４を得た（収率９５％、１６．２ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９７％と確認された。

【0145】

白色粘着固体: R_f 0.31 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.31-5.39 (m, 2H), 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.97-2.06 (m, 4H), 1.55-1.65 (m, 0.07H, 97%D), 1.26-1.34 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.1, 129.9, 129.9, 32.9-33.7 (m, α-CD₂), 31.9, 29.8, 29.7, 29.7 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.5, 29.5, 29.3 (overlapped), 29.2, 28.8, 27.2, 23.7-24.4 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₂₂H₃₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 341.3363, found 341.3359.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3001, 2915, 2848, 1692, 1469, 1405, 1293, 1234, 1185,1059, 947, 723 cm^-1.
mp 30-31 ℃.

【0146】

例８：重水素化標識脂肪酸（パルミチン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）パルミタミドの調製

【化33】

【0147】

パルミチン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化をスキーム４の反応に基づいて行った。具体的には下記の手順に従って行った。パルミチン酸（１２９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、８－アミノキノリン（７９ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１２５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、およびＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）を室温でアルゴン雰囲気下の５０ｍＬシェンクチューブに入れた。一晩撹拌した後、反応をＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、塩水で洗った。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題化合物を得た（収率８７％、１６６．３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）。

【0148】

白色固体: R_f 0.41 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.80-8.82 (m, 2H), 8.17 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.46-7.56 (m, 3H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J =7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.25-1.47 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 38.3, 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.4 29.3, 25.7, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₅H₃₉N₂O⁺ [M+H]⁺ 383.3057, found 383.3053.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2915, 2848, 1659, 1521, 1484, 1424, 1379, 1320, 1252, 1170, 824, 787, 753, 719 cm^-1.
mp 57-58 ℃.

【0149】

（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）パルミタミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化34】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0150】

上記（１）で得られた化合物（３８．３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率８１％、３１．２ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。

【0151】

白色固体:R_f0.41(n-hexane/AcOEt=4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.55 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.77-1.80 (m, 0.04H, 98%D), 1.25-1.42 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.5, 121.3, 116.4, 37.3-38.0 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7 (overlapped), 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 24.4-25.4 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₅H₃₄D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 409.3127, found 409.3124.
IR (ATR-IR, neat) 3291, 2956, 2915, 2848, 1655, 1520, 1423, 1379, 1319, 1267, 1162, 823, 787, 753, 719 cm^-1.
mp 55-56 ℃.

【0152】

（３）重水素化エステル化合物（パルミチン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（ヘキサデカン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化35】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0153】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（９．７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６６％、４．５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0154】

白色ろう状個体: R_f 0.71 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.66 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.58 (m, 0.10H, 95%D), 1.25-1.28 (m, 24H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 51.4, 33.0-33.6 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 28.9, 23.8-24.7 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₇H₃₀D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 297.2702, found 297.2695.
IR (ATR-IR, neat) 2956, 2922, 2855, 1741, 1465, 1435, 1260, 1193, 1077, 1025, 801, 719 cm^-1.

【0155】

（４）重水素化標識脂肪酸（パルミチン酸－２，２，３，３－ｄ_４（ヘキサデカン酸－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化36】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0156】

上記（３）で得られた化合物（２５．２ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化パルミチン酸－ｄ_４を得た（収率８２％、１９．７ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0157】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.59-1.62 (m, 0.10H, 95%D), 1.26-1.30 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.3, 32.9-33.8 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.4, 29.4, 29.2, 28.8, 23.5-24.2 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₆H₂₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 259.2581, found 259.2580.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2400 (br), 2956, 2915, 2848, 1692, 1469, 1413, 1312, 1200, 951, 891, 719, 664 cm^-1.
mp 62-63 ℃.

【0158】

例９：重水素化標識脂肪酸（リシノール酸）の製造
（１）（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデック－９－エナミドの調製

【化37】

【0159】

リシノール酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。リシノール酸（３０３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、純度８０％、関東化学）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより２回精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率１４％、６２．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）。

【0160】

無色油: R_f 0.35 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.80-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.53-5.59 (m, 1H), 5.37-5.43 (m, 1H), 3.58-3.64 (m, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.4 Hz, 2H), 2.03-2.06 (m, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.28-1.48 (m, 18H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 133.3, 127.9, 127.5, 125.3, 121.6, 121.3, 116.4, 71.5, 38.2, 36.9, 35.4, 31.8, 29.6, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 27.4, 25.7, 25.6, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₄₀N₂O₂Na⁺ [M+Na]⁺ 447.2982, found 447.2986.
IR (ATR-IR, neat) 3351, 3004, 2922, 2851, 1677, 1521, 1484, 1383, 1323, 1254, 1062, 828, 790, 757, 690 cm^-1.

【0161】

（２）重水素化標識化合物（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデック－９－エナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化38】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0162】

上記（１）で得られた化合物（２７．５ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率５３％、１４．７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0163】

無色油: R_f 0.35 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.54 (m, 3H), 5.53-5.59 (m, 1H), 5.37-5.43 (m, 1H), 3.58-3.64 (m, 1H), 2.53 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.20 (dd, J = 6.8, 6.4 Hz, 2H), 2.03-2.06 (m, 2H), 1.77-1.80 (m, 0.10H, 95%D), 1.25-1.48 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 133.4, 127.9, 127.5, 125.5, 121.6, 121.3, 116.4, 71.5, 37.1-37.8 (m, α-CD₂), 36.9, 35.4, 31.8, 29.6, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 27.4, 25.7, 24.4-25.3 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₆D₄N₂O₂Na⁺ [M+Na]⁺ 451.3233, found 451.3229.
IR (ATR-IR, neat) 3350, 3004, 2922, 2851, 1677, 1520, 1484, 1383, 1327, 1263, 1047, 828, 790, 767 cm^-1.

【0164】

（３）重水素化エステル化合物（リシノール酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エノエート－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化39】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0165】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２１．７ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６１％、９．７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0166】

無色油: R_f 0.54 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.53-5.60 (m, 1H), 5.37-5.44 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.61-3.65 (m, 1H), 2.27 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 1.58 (overlapped with H₂O), 1.25-1.48 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 133.4, 125.2, 71.5, 51.4, 36.9, 35.4, 32.9-33.8 (m, α-CD₂), 31.8, 29.6, 29.4, 29.1, 29.1, 28.8, 27.4, 25.7, 23.7-24.6 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₂D₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 339.2808, found 339.2806.
IR (ATR-IR, neat) 3437 (br), 3008, 2922, 2855, 1737, 1461, 1435, 1267, 1193, 1122, 1081, 1044, 857, 805, 723 cm^-1.

【0167】

（４）重水素化標識脂肪酸（リシノール酸－２，２，３，３－ｄ_４（（Ｒ，Ｚ）－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エノン酸－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化40】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0168】

上記（３）で得られた化合物（１４．０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～６０／４０）、表題の重水素化パルミチン酸－ｄ_４を得た（収率８９％、１１．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９３％と確認された。

【0169】

無色油: R_f 0.54 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.52-5.59 (m, 1H), 5.36-5.43 (m, 1H), 3.59-3.65 (m, 1H), 2.30 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.21 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 2.05 (td, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 1.58-1.61 (m, 0.15H (overlapped), ca. 93%D), 1.25-1.49 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.4, 133.4, 125.2, 71.6, 36.8, 35.3, 32.9-33.7 (m, α-CD₂), 31.8, 29.5, 29.3, 29.0, 28.9, 28.7, 27.3, 25.7, 23.4-24.4 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₈H₃₀D₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 325.2651, found 325.2655.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2400 (br), 3011, 2922, 2855, 1707, 1461, 1405, 1290, 1123, 1077, 1033, 947, 857, 801, 723 cm^-1.

【0170】

例１０：重水素化標識脂肪酸（１３－ＨＯＤＥ）の製造
（１）（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製

【化41】

【0171】

１３－ＨＯＤＥのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。１３－ＨＯＤＥ（１０２．３ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより２回精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題化合物を得た（収率２７％、３８．８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）。

【0172】

無色油: R_f 0.32 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 6.49 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.18 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.80-1.83 (m, 2H), 1.23-1.61 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 136.0, 134.6, 132.8, 128.0, 127.9, 127.5, 125.7, 121.6, 121.4, 116.5, 72.9, 38.2, 37.4, 31.8, 29.5, 29.2, 29.1, 28.9, 27.6, 25.6, 25.1, 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₈N₂O₂Na⁺ [M+Na]⁺ 445.2825, found 445.2823.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3004, 2922, 2851, 1677, 1525, 1484, 1383, 1323, 1260, 1066, 984, 947, 828, 790, 753 cm^-1.

【0173】

（２）重水素化標識化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化42】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0174】

上記（１）で得られた化合物（３８．８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った（第２工程は２１時間）。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６４％、２５．０ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９３％、β位が９４％と確認された。

【0175】

無色油: R_f 0.32 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 6.49 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.14H, 93%D), 2.18 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.77-1.81 (m, 0.13H, 94%D), 1.23-1.61 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 136.0, 134.5, 132.8, 127.9, 127.8, 127.5, 125.7, 121.6, 121.4, 116.5, 72.8, 37.2-37.7 (m, α-CD₂), 37.3, 31.8, 29.4, 29.1, 28.9, 27.6, 25.1, 24.5-25.2 (m, β-CD₂), 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₄D₄N₂O₂Na⁺ [M+Na]⁺ 449.3077, found 449.3073.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3004, 2922, 2851, 1677, 1521, 1484, 1383, 1327, 1263, 1047, 984, 947, 828, 790 cm^-1.

【0176】

（３）重水素化エステル化合物（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシオクタデカ－９，１１－ジエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化43】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0177】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（２４．０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率６０％、１０．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0178】

無色油: R_f 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.48 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.16 (dt, J = 6.8, 6.4 Hz, 1H), 3.13 (s, 3H), 2.27 (br-s, 0.13H, 94%D), 2.18 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.25-1.64 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 136.0, 132.8, 127.8, 125.7, 72.9, 51.5, 37.3, 33.1-33.8 (m, α-CD₂), 31.8, 29.5, 29.0, 29.0, 28.8, 27.7, 25.1, 23.7-24.6 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₀D₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 337.2651, found 337.2650.
IR (ATR-IR, neat) 3448 (br), 3008, 2926, 2855, 1737, 1461, 1435, 1267, 1193, 1126, 1081, 1048, 984, 951, 913, 854, 854, 731 cm^-1.

【0179】

（４）重水素化標識脂肪酸（１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ_４（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－ヒドロキシオクタデカ－９，１１－ジエン酸－２，２，３，３－ｄ_４））

【化44】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0180】

上記（３）で得られた化合物（１７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素１３－ＨＯＤＥ－ｄ_４を得た（収率８４％、１４．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0181】

無色油: R_f 0.13 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ 6.49 (dd, J = 15.1, 11.2 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 15.1, 6.8 Hz, 1H), 5.43 (dt, J = 11.2, 7.6 Hz, 1H), 4.17 (dt, J = 6.8, 6.4 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.12H, 94%D), 2.17-2.18 (m, 2H), 1.26-1.63 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.3, 135.7, 132.8, 127.8, 125.8, 73.0, 37.3, 32.6-33.8 (m, α-CD₂), 31.8, 29.3, 28.8, 28.8, 28.6, 27.6, 25.1, 23.4-24.4 (m, β-CD₂), 22.6, 14.0
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₈H₂₈D₄O₃Na⁺ [M+Na]⁺ 323.2495, found 323.2494.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2300 (br), 3012, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1290, 1267, 1126, 1051, 1018, 984, 947, 910, 835, 731 cm^-1.

【0182】

例１１：重水素化標識脂肪酸（リノレン酸）の製造
（１）（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２，１５－トリエナミドの調製

【化45】

【0183】

リノレン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。リノレン酸（９７０ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、表題化合物を得た（収率７６％、１．０７ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）。

【0184】

無色油: R_f 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.42-7.53 (m, 3H), 5.28-5.42 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.03-2.09 (m, 4H), 1.78-1.84 (m, 2H), 1.35-1.46 (m, 8H), 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.9, 130.3, 128.3, 127.9, 127.7, 127.7, 127.4, 127.1, 121.5, 121.3, 116.4, 38.2, 29.6, 29.3, 29.3, 29.2, 27.2, 25.7, 25.6, 25.5, 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₇N₂O⁺ [M+H]⁺ 405.2900, found 405.2903.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2922, 2851, 1689, 1521, 1484, 1383, 1323, 1260, 828, 790, 682 cm^-1.

【0185】

（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１２，１５－トリエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化46】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0186】

上記（１）で得られた化合物（３３．３ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８２／１８）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６８％、２２．７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９５％と確認された。

【0187】

無色油: R_f 0.39 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 5.30-5.42 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.53 (br-s, 0.07H, 97%D), 2.03-2.09 (m, 4H), 1.77-1.81 (m, 0.10H, 95%D), 1.35-1.44 (m, 8H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.6, 131.9, 130.3, 128.3 (overlapped), 127.9, 127.7, 127.4, 127.1, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.9 (m, α-CD₂), 29.6, 29.3, 29.2, 29.0, 27.2, 25.6, 25.5, 24.4-25.2 (m, β-CD₂), 20.5, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₂D₄N₂ONa⁺ [M+Na]⁺ 431.2971, found 431.2961.
IR (ATR-IR, neat) 3354, 3008, 2960, 2922, 2851, 1684, 1521, 1383, 1327, 1264, 913, 828, 790 cm^-1.

【0188】

（３）重水素化エステル化合物（リノレン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエネートメチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化47】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0189】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（３２．１ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（３３．６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７２％、１６．８ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0190】

無色油: R_f 0.77 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.28-5.43 (m, 6H), 3.67 (s, 3H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.27 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.03-2.12 (m, 4H), 1.58 (overlapped with H₂O), 1.25-1.35 (m, 8H), 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 132.0, 130.3, 128.3, 128.3, 127.7, 127.1, 51.4, 33.0-33.8 (m, α-CD₂), 29.6, 29.1, 28.9, 28.9, 27.2, 25.6, 25.5, 23.7-24.5 (m, β-CD₂), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₂₈D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 319.2546, found 319.2539.
IR (ATR-IR, neat) 3012, 2960, 2926, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1085, 1021, 984, 798, 705 cm^-1.

【0191】

（４）重水素化標識脂肪酸（リノレン酸－２，２，３，３－ｄ_４（（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエン酸－２，２，３，３－ｄ_４））

【化48】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0192】

上記（３）で得られた化合物（１６．３ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化リノレン酸－ｄ_４を得た（収率８９％、１３．９ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0193】

無色油: R_f 0.17 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.28-5.43 (m, 6H), 2.79-2.82 (m, 4H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.03-2.12 (m, 4H), 1.60 (br-s, 0.10H, 95%D), 1.32-1.35 (m, 8H), 0.98 (m, J = 7.6 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.9, 132.0, 130.3, 128.3, 128.3, 127.8, 127.1, 32.9-33.6 (m, α-CD₂), 29.6, 29.1, 28.8, 28.2, 27.2, 25.6, 25.5, 23.4-24.4 (m, β-CD₂), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₅D₄O₂ ^- [M-H]^- 281.2424, found 281.2416.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2500 (br), 3012, 2926, 2855, 1707, 1461, 1405, 1260, 1174, 1074, 973, 723 cm^-1.

【0194】

例１２：重水素化標識脂肪酸（アラキドン酸）の製造
（１）（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４－テトラエナミドの調製

【化49】

【0195】

アラキドン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。アラキドン酸（５００ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率９２％、６４９ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）。

【0196】

無色油: R_f 0.44 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.80 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.45-7.53 (m, 3H), 5.31-5.46 (m, 8H), 2.78-2.83 (m, 6H), 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.23 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.26-1.36 (m, 6H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.5, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 130.5, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 127.9, 127.9, 127.6, 127.4, 121.6, 121.3, 116.4, 37.5, 31.5, 29.3, 27.2, 26.7, 25.7, 25.6, 25.6, 25.4, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₉H₃₉N₂O⁺ [M+H]⁺ 431.3057, found 431.3057.IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2952, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1481, 1383, 1323, 1148, 828, 790, 686 cm^-1.

【0197】

（２）重水素化標識化合物（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４－テトラエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化50】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0198】

上記（１）で得られた化合物に対してまずβ位の重水素化を行い、次いでα位の重水素化を行って表題の化合物を得た。具体的には下記アおよびイの手順に従って行った。

【0199】

ア β位の重水素化
まず、β位の重水素化を行った。上記（１）で得た化合物（３３．９ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１７．７ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）およびピバル酸セシウム（３６．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を空気下で１０ｍＬのスクリューキャップチューブに入れた。トルエン（０．８ｍＬ、０．１Ｍ）を加えてアミドを溶解し、Ｄ_２Ｏ（０．０８ｍＬ）を混合物に加えた。反応は８０℃で１時間撹拌して行い、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（３３．７ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ）およびＤ_２Ｏ（０．８ｍＬ）を反応に加えた。３０分間撹拌した後、混合物を分液漏斗に移し、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗β位－重水素化標識化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗精製した。

【0200】

イ α位の重水素化
続いて、上記アで得られたβ位－重水素化標識化合物（２９．５ｍｇ、約０．０６８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（９．４ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、およびメタノールｄ_１（ＣＨ_３ＯＤ、０．３４ｍＬ、０．２Ｍ）を空気下で１０ｍＬスクリューキャップチューブに入れた。反応は８０℃で１８時間攪拌して行い、進行をＥＳＩ－ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し、分離漏斗に移し、酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された生成物を得た（収率６７％、２２．６ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が８８％と確認された。

【0201】

無色油: R_f 0.44 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.79-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.53 (m, 3H), 5.34-5.45 (m, 8H), 2.79-2.83 (m, 6H), 2.55 (br-s, 0.10H, 95%D), 2.22 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.86-1.92 (m, 0.24H, 88%D), 1.26-1.38 (m, 6H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.6, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 130.5, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 127.9, 127.9, 127.6, 127.4, 121.6, 121.3, 116.4, 36.3-37.2 (m, α-CD₂), 31.5, 29.3, 27.2, 26.5, 25.7, 25.6, 25.6, 24.4-25.3 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₉H₃₅D₄N₂O⁺ [M+H]⁺ 435.3308, found 435.3303.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2952, 2922, 2851, 1684, 1521, 1383, 1327, 1264, 917, 824, 790 cm^-1.

【0202】

（３）重水素化エステル化合物（アラキドン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４－テトラエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化51】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0203】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（５２．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（５１．３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７５％、２８．９ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が残Ｈ_２Ｏピークとの部分的なオーバーラップがあり約９１％と確認された。

【0204】

無色油: R_f 0.76 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.31-5.43 (m, 8H), 3.67 (s, 3H), 2.80-2.84 (m, 6H), 2.29 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.09 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.04 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.66-1.71 (m, ca. 0.17H, 91%D), 1.24-1.40 (m, 6H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.1, 130.5, 128.9, 128.9, 128.6, 128.2, 128.2, 127.9, 127.5, 51.5, 32.3-33.2 (m, α-CD₂), 31.5, 29.3, 27.2, 26.3, 25.6, 25.6, 25.6, 23.6-24.7 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₁H₃₀D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 345.2702, found 345.2705.
IR (ATR-IR, neat) 3012, 2960, 2926, 2855, 1737, 1655, 1435, 1394, 1260, 1193, 1167, 1111, 1077, 1044, 1006, 969, 917, 846, 816, 708 cm^-1.

【0205】

（４）重水素化標識脂肪酸（アラキドン酸－２，２，３，３－ｄ_４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４－テトラエン酸－２，２，３，３－ｄ_４））

【化52】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0206】

上記（３）で得られた化合物（２３．８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の重水素化アラキドン酸－ｄ_４を得た（収率９３％、２１．２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９５％、β位が９０％と確認された。

【0207】

無色油: R_f 0.18 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.31-5.44 (m, 8H), 2.80-2.87 (m, 6H), 2.34 (br-s, 0.11H, 95%D), 2.12 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 1.66-1.71 (m, ca. 0.20H, 90%D), 1.26-1.39 (m, 6H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.0, 130.5, 129.1, 128.7, 128.6, 128.3, 128.1, 127.9, 127.6, 32.4-33.1 (m, α-CD₂), 31.5, 29.3, 27.2, 26.2, 25.6, 25.6, 23.3-24.2 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₂₀H₂₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 307.2581, found 307.2582.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3012, 2960, 2926, 2855, 1707, 1461, 1409, 1297, 1178, 1107, 1047, 928, 839, 705 cm^-1.

【0208】

例１３：重水素化標識脂肪酸（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））の製造
（１）（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタミドの調製

【化53】

【0209】

ＥＰＡのカルボキシ基の８－キノリンアミド化を反応時間を２時間としたこと以外は例１（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ＥＰＡ（１．１６ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率７２％、１．１８ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）。

【0210】

淡黄色油: Rf 0.61 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.80-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.45-7.54 (m, 3H), 5.27-5.49 (m, 10H), 2.79-2.84 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.22 (td, J = 7.6, 6.4 Hz, 2H), 2.07 (dq, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.91 (tt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 0.96 (t, J = 7.6 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.5, 148.0, 138.3, 136.3, 134.5, 132.0, 129.1, 128.9, 128.5, 128.2, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.4, 127.0, 121.5, 121.3, 116.4, 37.5, 26.7, 25.7, 25.6, 25.5, 25.5, 25.4, 20.5, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₉H₃₇N₂O⁺ [M+H]⁺ 429.2900, found 429.2898.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2960, 2922, 1689, 1521, 1484, 1461, 1387, 1323, 1260, 1148, 828, 790, 686 cm^-1.

【0211】

（２）重水素化標識化合物（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化54】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0212】

上記（１）で得られた化合物（１７．５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の重水素化を例１２（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、重水素化された表題の化合物を得た（収率９１％、１６．１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９２％、β位が８５％と確認された。

【0213】

淡黄色油: R_f 0.61 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.43-7.54 (m, 3H), 5.27-5.49 (m, 10H), 2.79-2.84 (m, 8H), 2.55 (br-s, 0.16H, 92%D), 2.22 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.07 (dq, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.86-1.92 (m, 0.31H, 88%D), 0.96 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.6, 148.1, 138.3, 136.4, 134.5, 132.0, 129.1, 128.9, 128.5, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.5, 127.0, 121.6, 121.4, 116.4, 36.5-37.2 (m, α-CD₂), 26.6, 26.5, 25.7, 25.6, 25.5, 24.4-25.3 (m, β-CD₂), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₉H₃₂D₄N₂NaO⁺ [M+Na]⁺ 455.2971, found 455.2963.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3008, 2960, 2922, 1685, 1521, 1383, 1327, 1263, 917, 824, 790, 753, 686 cm^-1.

【0214】

（３）重水素化エステル化合物（エイコサペンタエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４））の調製

【化55】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0215】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（４６．８ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）について、ニッケルビス（２，２，６，６－テトラメチル－３，５－ヘプタンジオネート）を５０ｍｏｌ％とし、反応後にピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム（４６．２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えて後処理をしたこと以外は例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率４７％、１６．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９１％と確認された。

【0216】

無色油: R_f 0.67 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.28-5.43 (m, 10H), 3.67 (s, 3H), 2.79-2.86 (m, 8H), 2.29 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.04-2.10 (m, 4H), 1.66-1.72 (m, 0.19H, 91%D), 0.98 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.1, 132.0, 128.9, 128.8, 128.6, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.0, 51.4, 32.3-33.2 (m, α-CD₂), 26.3, 25.6 (overlap), 25.6, 25.5, 23.6-24.5 (m, β-CD₂), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₁H₂₈D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 343.2546, found 343.2544.
IR (ATR-IR, neat) 3015, 2963, 2933, 2874, 1741, 1454, 1435, 1390, 1267, 1193, 1167, 1111, 1077, 921, 805, 708 cm^-1.

【0217】

（４）重水素化標識脂肪酸（エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）－２，２，３，３－ｄ_４（（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタエン酸－２，２，３，３－ｄ_４））

【化56】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0218】

上記（３）で得られた化合物（１５．３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の重水素化エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）－ｄ_４を得た（収率９６％、１４．１ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９４％、β位が９１％と確認された。

【0219】

無色油: R_f 0.16 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.28-5.44 (m, 10H), 2.80-2.88 (m, 8H), 2.33-2.34 (m, 0.13H, 94%D), 2.04-2.13 (m, 4H), 1.67-1.70 (m, 0.18H, 91%D), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.6, 132.1, 129.0, 128.8, 128.6, 128.3, 128.2, 128.2, 128.1, 127.9, 127.0, 32.2-33.2 (m, α-CD₂), 26.2, 25.6 (overlap), 25.5, 25.5, 23.3-24.1 (m, β-CD₂), 20.6, 14.3
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₂₀H₂₅D₄O₂ ^- [M-H]^- 305.2424, found 305.2424.
IR (ATR-IR, neat) 3400-2500 (br), 3012, 2967, 2926, 2870, 1707, 1409, 1297, 1174, 1110, 1070, 928, 835, 794, 701 cm^-1.

【0220】

例１４：重水素化標識脂肪酸（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸）の製造
（１）Ｎ－（キノリン－８－イル）ペンタコサ－１０，１２－ジイナミドの調製

【化57】

【0221】

ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸（７４９ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥ
ｔ＝１００／０～７０／３０）、表題化合物を得た（収率８９％、８９０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）。

【0222】

薄桃色固体: R_f 0.50 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.79 (br-s, 1H), 8.77-8.79 (m, 2H), 8.14 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.42-7.54 (m, 3H), 2.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.21 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.80 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.24-1.53 (m, 30H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 77.6, 77.5, 65.3, 65.3, 38.2, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 28.8, 28.4, 28.3, 25.6, 22.7, 19.2, 19.2, 14.1.
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₃₄H₄₉N₂O⁺ [M+H]⁺ 501.3839, found 501.3839.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3042, 2915, 2851, 1681, 1528, 1484, 1424, 1387, 1331, 1260, 1100, 824, 790, 749, 682 cm^-1.
mp 46-47 ℃.

【0223】

（２）重水素化標識化合物（Ｎ－（キノリン－８－イル）ペンタコサ－１０，１２－ジイナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化58】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0224】

上記（１）で得られた化合物（１８３．８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のβ位の重水素化は例１（２）アに記載した手順と同様の手順で行い、α位の重水素化は高い重水素化含有量を得るために例１（２）イに記載した手順と同様の手順を２回繰り返して行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率６０％、１１１．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0225】

白色固体: R_f 0.50 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.80 (m, 2H), 8.15 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 2H), 7.43-7.55 (m, 3H), 2.53 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.23 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.76-1.80 (m, 0.09H, 96%D), 1.25-1.54 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.4, 134.6, 127.9, 127.5, 121.6, 121.3, 116.4, 77.6, 77.5, 65.3, 65.3, 37.0-37.8 (m, α-CD₂), 31.9, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.8, 28.4, 28.3, 24.4-25.3 (m, β-CD₂), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₃₄H₄₅D₄N₂O⁺ [M+H]⁺ 505.4090, found 505.4091.
IR (ATR-IR, neat) 3347, 3045, 2919, 2851, 1677, 1528, 1484, 1424, 1387, 1327, 1264, 824, 749, 719, 678 cm^-1.
mp 46-47 ℃.

【0226】

（３）重水素化エステル化合物（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化59】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0227】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（７６．３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率８０％、４７．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９５％と確認された。

【0228】

白色固体: R_f 0.80 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.67 (s, 3H), 2.24 (t, J = 7.0 Hz, 4.09H, overlapped with a-CD₂), 1.58 (br-s, 0.08H, 96%D), 1.51 (tt, J = 7.2, 7.0 Hz, 4H),1.26-1.41 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.3, 77.6, 77.4, 65.3, 65.2, 51.4, 32.9-33.7 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.8, 28.8, 28.4, 28.3, 23.7-24.6 (m, β-CD₂), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₆H₄₀D₄NaO₂ ⁺ [M+H]⁺ 415.3485, found 415.3486.
IR (ATR-IR, neat) 2922, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1088, 1051, 1006, 850, 813, 723 cm^-1.
mp 28-29 ℃.

【0229】

（４）重水素化標識脂肪酸（ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化60】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0230】

上記（３）で得られた化合物（４７．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、表題の重水素化ペンタコサ－１０，１２－ジイン酸－ｄ_４を得た（収率＞９９％、４６．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９６％と確認された。

【0231】

白色固体: R_f 0.18 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.58 (br-s, 0.09H, 96%D), 1.51 (tt, J = 7.2, 7.0 Hz, 4H), 1.26-1.41 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 180.2, 77.6, 77.4, 65.3, 65.2, 32.9-33.7 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.9, 28.7, 28.8, 28.4, 28.3, 23.4-24.3 (m, β-CD₂), 22.7, 19.2, 19.2, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₂₅H₃₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 377.3363, found 377.3352.
IR (ATR-IR, neat) 3200-2500 (br), 3022 (br), 2919, 2848, 2684, 1689, 1461, 1420, 1331, 1189, 1115, 1051, 999, 932, 895, 842, 723, 678 cm^-1.
mp 28-29 ℃.

【0232】

例１５：重水素化標識脂肪酸（９－ヒドロキシオクタデカン酸）の製造
（１）９－ヒドロキシ－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカンアミドの調製

【化61】

９－ヒドロキシオクタデカン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。９－ヒドロキシオクタデカン酸（１８０．３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～５０／５０）、表題化合物を得た（収率６５％、１６６．８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）。

【0233】

白色固体: R_f 0.16 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.81 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 3.54-3.60 (m, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.26-1.47 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 127.9, 127.4, 121.5, 121.3, 116.4, 71.9, 38.2, 37.5, 37.5, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.2, 25.7, 25.6, 25.6, 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₄₂N₂O₂Na⁺ [M+Na]⁺ 449.3138, found 449.3135.
IR (ATR-IR, neat) 3289 (br), 2922, 2851, 1666, 1521, 1487, 1465, 1424, 1379, 1320, 1260, 1193, 1107, 1074, 824, 790, 753, 723 cm^-1.
mp 73 ℃.
（２）重水素化標識化合物（９－ヒドロキシ－（Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカンアミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化62】

（上記式中、Ｄは重水素である。）
上記（１）で得られた化合物（８５．３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～５０／５０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７１％、６０．７ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９８％、β位が９６％と確認された。

【0234】

無色油: R_f 0.14 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.82 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 3.55-3.60 (m, 1H), 2.53 (br-s, 0.04H, 98%D), 1.77-1.81 (m, 0.08H, 96%D), 1.26-1.47 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.4, 136.4, 134.6, 128.0, 127.5, 121.5, 121.3, 116.5, 71.9, 37.0-38.0 (m, α-CD₂), 37.5, 37.5, 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 29.0, 25.7, 25.6, 24.4-25.3 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₉D₄N₂O₂ ⁺ [M+H]⁺ 431.3570, found 431.3570.
IR (ATR-IR, neat) 3289 (br), 2915, 2851, 1662, 1521, 1485, 1461, 1428, 1379, 1323, 1271, 1163, 1133, 1096, 1025, 980, 913, 869, 824, 790, 749, 708 cm^-1.
mp 73-74 ℃.

【0235】

（３）重水素化エステル化合物（９－ヒドロキシオクタデカン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）

【化63】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0236】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（４１．６ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９５／５～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率５８％、１７．７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％と確認され、β位は残Ｈ_２Ｏピークとの部分的なオーバーラップにより＞９３％と確認された。

【0237】

白色固体: R_f 0.45 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.66 (s, 3H), 3.55-3.60 (m, 1H), 2.27 (br-s, 0.05H, 97%D), 1.57-1.60 (m, <0.14H (overlapped), >93%D), 1.26-1.46 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 72.0, 51.4, 37.5, 37.5, 32.9-33.8 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.8, 25.7, 25.6, 23.9-24.6 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₄D₄NaO₃ ⁺ [M+Na]⁺ 341.2964, found 341.2964.
IR (ATR-IR, neat) 3370 (br), 2922, 2855, 1741, 1461, 1430, 1338, 1290, 1174, 1133, 1074, 1040, 947, 906, 876, 850, 723, 671 cm^-1.
mp 48-49 ℃.

【0238】

（４）重水素化標識脂肪酸（９－ヒドロキシオクタデカン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化64】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0239】

上記（３）で得られた化合物（１７．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝９０／１０～６０／４０）、表題の重水素化９－ヒドロキシオクタデカン酸－ｄ_４を得た（収率９５％、１４．５ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９７％、β位が９３％と確認された。

【0240】

白色固体: R_f 0.08 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 3.56-3.62 (m, 1H), 2.31 (br-s, 0.06H, 97%D), 1.57-1.62 (m, 0.14H, 93%D), 1.26-1.30 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.3, 72.1, 37.5, 37.4, 32.9-33.6 (m, α-CD₂), 31.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.4, 29.3, 29.1, 28.7, 25.6, 25.5, 23.5-24.5 (m, β-CD₂), 22.7, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₃₁D₄O₃ ^- [M-H]^- 303.2843, found 303.2843.
IR (ATR-IR, neat) 3500-2500 (br), 3042, 2915, 2848, 2583, 1692, 1465, 1409, 1320, 1193, 1133, 1103, 1025, 951, 906, 842, 723, 664 cm^-1.
mp 73-74 ℃.

【0241】

例１６：重水素化標識脂肪酸（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸）の製造
（１）（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミドの調製

【化65】

（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸のカルボキシ基の８－キノリンアミド化を例８（１）に記載した手順と同様の手順で行った。（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸（９７．６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に対し、最終的にシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６５／３５）、表題化合物を得た（収率８４％、１１８．２ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）。

【0242】

無色油: R_f 0.60 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.0 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.82 (dt, J = 7.6, 7.2 Hz, 2H), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 171.9, 148.1, 138.3, 136.3, 134.7, 134.6, 129.9, 128.7, 127.9, 127.4, 125.6, 121.5, 121.3, 116.4, 38.2, 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.3, 29.3, 29.1, 28.9, 27.7, 25.7, 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₉N₂O⁺ [M+H]⁺ 407.3057, found 407.3057.
IR (ATR-IR, neat) 3358, 3019, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1457, 1428, 1383, 1327, 1260, 1163, 984, 947, 828, 790, 757, 723, 675 cm^-1.

【0243】

（２）重水素化標識化合物（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエナミド－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化66】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0244】

上記（１）で得られた化合物（６３．８ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）の重水素化を例１（２）アおよびイに記載した手順と同様の手順で行った。最終的に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～６０／４０）、重水素化された表題の化合物を得た（収率７１％、４６．０ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。

【0245】

無色油: R_f 0.48 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9.80 (br-s, 1H), 8.78-8.81 (m, 2H), 8.16 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 2H), 7.44-7.56 (m, 3H), 6.29 (dd, J = 15.0, 10.8, 1.0 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.0, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.53 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.77-1.80 (m, 0.05H, 98%D), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 172.0, 148.1, 138.3, 136.4, 134.7, 134.6, 129.9, 128.7, 127.9, 127.4, 125.6, 121.5, 121.3, 116.4, 37.1-37.7 (m, α-CD₂), 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.2, 29.1, 29.0, 28.9, 27.7, 24.4-25.2 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₂₇H₃₅D₄N₂O⁺ [M+H]⁺ 411.3308, found 411.3311.
IR (ATR-IR, neat) 3355, 3015, 2922, 2855, 1689, 1521, 1484, 1461, 1428, 1383, 1327, 1264, 1163, 984, 947, 828, 790, 753, 723, 678 cm^-1.

【0246】

（３）重水素化エステル化合物（（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸メチル－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化67】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0247】

上記（２）で得られた重水素化標識化合物（３２．３ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）について、例１（３）に記載した手順と同様の手順で、８－アミノキノリン部位を脱保護（エステルに変換）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～７５／２５）、表題のエステル化合物を得た（収率７０％、１６．４ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％と確認されたが、β位は残Ｈ_２Ｏピークとのオーバーラップにより確認できなかった。

【0248】

無色油: R_f 0.72 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.2 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.65 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 3.66 (s, 3H), 2.26 (br-s, 0.09H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.60 (overlapped with H₂O), 1.24-1.48 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 174.4, 134.8, 129.9, 128.7, 125.6, 51.4, 32.8-33.8 (m, α-CD₂), 32.9, 31.7, 29.7, 29.4, 29.1, 29.1, 28.9, 28.9, 27.6, 23.7-24.5 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₁₉H₃₀D₄NaO₂ ⁺ [M+Na]⁺ 321.2702, found 321.2702.
IR (ATR-IR, neat) 3019, 2952, 2922, 2855, 1741, 1461, 1435, 1260, 1193, 1174, 1081, 984, 947, 805, 727 cm^-1.

【0249】

（４）重水素化標識脂肪酸（（９Ｚ，１１Ｅ）－オクタデカ－９，１１－ジエン酸－２，２，３，３－ｄ_４）の調製

【化68】

（上記式中、Ｄは重水素である。）

【0250】

上記（３）で得られた化合物（１４．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）について、例１（４）に記載した手順と同様の手順で加水分解した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ｎ－ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１００／０～８０／２０）、表題の（９Ｚ，１１Ｅ）－Ｎ－（キノリン－８－イル）オクタデカ－９，１１－ジエン酸－ｄ_４を得た（収率９７％、１３．０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）。^１ＨＮＭＲ分析により重水素化率はα位が９６％、β位が９８％と確認された。

【0251】

無色油: R_f 0.36 (n-hexane/AcOEt = 4/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.29 (ddd, J = 15.2, 10.8, 1.2 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 10.8, 10.8 Hz, 1H), 5.66 (dt, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.29 (dt, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 2.31 (br-s, 0.08H, 96%D), 2.15 (dt, J = 7.2, 6.8 Hz, 2H), 2.09 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 1.58-1.65 (m, 0.04H, 98%D), 1.25-1.42 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 179.7, 134.8, 129.9, 128.7, 125.6, 32.8-33.5 (m, α-CD₂), 32.9, 31.8, 29.7, 29.4, 29.1, 29.0, 28.9, 28.8, 27.6, 23.5-24.2 (m, β-CD₂), 22.6, 14.1
HRMS (ESI (-)) m/z calcd for C₁₈H₂₇D₄O₂ ^- [M-H]^- 283.2581, found 283.2579.
IR (ATR-IR, neat) 3300-2500 (br), 3019, 2922, 2855, 1701, 1461, 1409, 1297, 1088, 11025, 984, 947, 835, 805, 727 cm^-1.

【0252】

例１７：重水素化標識脂質（（Ｒ）－２－（（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ _４ ）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）の合成
例１７では、下記スキームに示すように重水素化標識脂肪酸を使用して表題の化合物を合成した。

【化69】

【0253】

１－ヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（東京化成工業、１１．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）およびＴＢＳ－１３－ＨＯＤＥ－２，２，３，３－ｄ_４（１９．１ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬシュレンクチューブに入れて、トルエン共沸により乾燥させた。室温でアルゴン雰囲気下、２、４、６－トリクロロベンゾイルクロリド（２１．６μＬ、０．１３８ｍｍｏｌ）、１－メチルイミダゾール（１１μＬ、０．１３８ｍｍｏｌ）、およびＣＨ_２Ｃｌ_２（０．５ｍＬ）を加え、３６時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応後、揮発成分を全て減圧留去した。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／メタノール＝１００／０～７０／３０）、（Ｒ）－２－（（（Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）－１３－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）オクタデカ－９，１１－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ_４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートを得た（収率５５％、１１．３ｍｇ、０．０１２７ｍｍｏｌ）。

【0254】

白色ろう様固体: R_f 0.17 (CH₂Cl₂/methanol = 1/1)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.41 (dd, J = 15.2, 11.2 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 11.2, 10.8 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 1H), 5.38 (dt, J = 10.8, 7.6 Hz, 1H), 5.21 (br-s, 1H), 4.37-4.40 (m, 3H), 4.10-4.16 (m, 2H), 3.93-4.03 (m, 4H), 3.41 (s, 9H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H, α-CH₂ of palmitate moiety and α-CD₂ of TBS-13-HODE moiety), 2.15 (dt, J = 7.6, 6.8 Hz, 2H), 1.56-1.59 (m, 2H, β-CH₂ of palmitate moiety and β-CD₂ of TBS-13-HODE moiety), 1.44-1.50 (m,2H), 1.25-1.36 (m, 38H), 0.86-0.90 (m, 15H), 0.05 (s, 3H), 0.03 (s, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.6, 173.2, 136.9, 131.5, 128.2, 124.3, 73.2, 70.1 (d, J = 6.4 Hz), 66.2 (br-s), 63.9 (br-s), 62.7, 59.7 (br-s), 54.5, 38.4, 34.1, 33.5-34.0 (m, α-CD₂), 31.9, 31.8, 29.7, 29.7, 29.7, 29.7, 29.6, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 28.9, 27.7, 27.7 , 25.9, 25.0, 25.0, 24.9, 23.6-24.5 (m, β-CD₂), 22.7, 22.6, 18.3, 14.1, 14.1, -4.3, -4.7
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₄₈H₉₀D₄NO₉PSiNa⁺ [M+Na]⁺ 914.6579, found 914.6593.
IR (ATR-IR, neat) 2952, 2922, 2855, 1737, 1651, 1461, 1364, 1252, 1170, 1059, 969, 872, 835, 775, 671 cm^-1.

【0255】

例１８：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（１）
例１８では、下記スキームに示すように重水素化標識脂肪酸を使用してホスファチジルコリン（（Ｒ）－２－（（（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ_４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ_４）を合成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析により生体内由来の脂肪酸（脂質）との区別が可能か検討した。

【化70】

【0256】

リゾホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ－ＰＣ）（１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）（東京化成工業、１１．４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、リノエライジン酸－２，２，３，３－ｄ_４（１２．７ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰＯ（１８．７ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬシュレンクチューブに入れて、トルエン共沸により乾燥させた。アルゴン雰囲気下、ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．５ｍＬ）を加え溶解させた後、ＭＮＢＡ（４６.５ｍｇ、０.１３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。進行はＴＬＣによりモニターした。反応後、揮発成分を全て減圧留去した。得られた化合物をシリカゲフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し（ＤＩＯＬシリカゲル、溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／メタノール＝１００／０～８０／２０）、を得た（収率５０％、９．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）。

【0257】

白色ろう状固体: R_f 0.11 (n-hexane/AcOEt = 2/3)
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.35-5.46 (m, 4H), 5.17-5.22 (m, 1H), 4.40 (dd, J = 12.0, 2.4 Hz, 1H) 4.32 (br-s, 2H), 4.12 (dd, J = 12.0, 7.6 Hz, 1H), 3.89-3.99 (m, 2H), 3.81 (br-s, 2H), 3.37 (s, 9H), 2.65-2.68(m, 2H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H, a-position (CH₂) of palmitate moiety and a-position (CD₂) of linoelaidate moiety), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.53-1.60 (m, 2H, b-position (CH₂) of palmitate moiety and b-position (CD₂) of linoelaidate moiety), 1.25-1.44 (m, 38H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 173.6, 173.3, 131.1, 130.9, 128.7, 128.5, 70.5 (d, J_P-C = 7.8 Hz), 66.5 (d, J_P-C = 5.1 Hz), 63.4 (d, J_P-C = 7.7 Hz), 63.0, 59.3 (d, J_P-C = 4.6 Hz), 54.5, 35.7, 34.1, 33.0-33.9 (m, α-CD₂ of linoelaidate moiety), 32.6, 32.6, 31.9, 31.4, 30.9, 29.7 (overlapped), 29.7 (overlapped), 29.6 (overlapped), 29.4, 29.4, 29.2, 29.2 (overlapped), 29.2, 29.1, 28.9, 24.9, 23.7-24.7 (m, β-CD₂ of linoelaidate moiety), 22.7, 22.6, 14.1, 14.1
HRMS (ESI (+)) m/z calcd for C₄₂H₇₆D₄NNaO₈P⁺ [M+Na]⁺ 784.5765, found 784.5765.
IR (ATR-IR, neat) 3377 (br), 3027, 2960, 2922, 2855, 1733, 1495, 1469, 1349, 1252, 1174, 1092, 1059, 965, 924, 876, 816, 734 cm^-1.

【0258】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に質量分析装置（ＭＳ）をつなげたＬＣ－ＭＳ装置を用いて行った。ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を用い、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。InertSustain C18 Metal-free column（ジーエルサイエンス）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表１に示す通りであった。

【0259】

【表1】

【0260】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を行った結果は、図１に示す通りであった。主要ピークＡ（ｍ／ｚ １８５）はホスホコリン（ｍ／ｚ １８４）とは対応せず、一重水素化ホスホコリンが割り当てられることが確認された。ピークは、ホスファチジルコリン（（Ｒ）－２－（（（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイル－２，２，３，３－ｄ_４）オキシ）－３－（パルミトイルオキシ）プロピル（２－（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート）がマススペクトロメトリー中で断片化され、ケテン種を生じる際に形成される（Hsu FF and Turk J., J Am Soc Mass Spectrom, 2003）。重要なことに、一重水素化ホスホコリンの１８５ｍ／ｚのピークは四重水素化脂肪酸を有するホスファチジルコリンに限定的に検出され、設計通りα位に重水素元素を有することが確認された。この結果から、１８５ｍ／ｚのピークは、生体内における代謝物マーカーとして利用することが可能であり、重水素化リン脂質を生体内由来リン脂質から区別することができることが確認された。

【0261】

例１９：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（２）
例１９では、重水素化標識脂肪酸を使用してヒト血小板の脂質代謝解析を行った。活性化された血小板は多数の脂質代謝物を産生することが知られており、ＰＣに取り込まれる脂肪酸の種類について検討した。

【0262】

（１）方法
ア ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析
ヒト静脈血より単離した血小板をタイロード液にサスペンドし、メチルベータシクロデキストリン（Sigma）中に溶解したにリノール酸－Ｄ_４またはメチルベータシクロデキストリン中に溶解したリノエライジン酸－Ｄ_４を終濃度３０μＭとなるように添加し、さらに、トロンビン（０．００１ユニット）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。そして、Bligh EG, et al., Can. J. Biochem. Physiol, 1959に記載の方法に従って活性化されたヒト血小板から脂質を抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて解析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析は、ＬＣとして、Nexera XR HPLCシステム（島津製作所）を用い、ＭＳとして、QTRAP4500（Sciex）を用いた。カプセルパックＣ１８ ＡＣＲカラム（大阪ソーダ）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表２に示す通りであった。一重水素化ホスホコリンの１８５ ｍ／ｚをプロダクトイオンとして生成する分子種を、多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring）法を用いて網羅的に測定することで、添加したリノール酸－Ｄ_４もしくはリノエライジン酸－Ｄ_４を含むＰＣ分子種を検出した。また、ホスホコリンの１８４ ｍ／ｚをプロダクトイオンとして生成する分子種を、多重反応モニタリング法を用いて網羅的に測定することで、添加したリノール酸－Ｄ_４もしくはリノエライジン酸－Ｄ_４を含まない、血小板に内在的に存在するＰＣ分子種を検出した。

【0263】

【表2】

【0264】

イ 脂質代謝解析
ＬＣ－ＭＳによって、リノール酸－Ｄ_４もしくはリノエライジン酸－Ｄ_４を含むＰＣ分子種を網羅的に検出し、検出された各ＰＣ分子種について、リノール酸－Ｄ_４添加時とリノエライジン酸－Ｄ_４添加時で比較した。比較して得た変動比（ｒａｔｉｏ）と有意確率（ｐ値）を、それぞれｌｏｇ_２と－ｌｏｇ_１０に換算し、それぞれをＸ軸、Ｙ軸の値として図表を作成することで、ボルケーノプロットを得た。

【0265】

ウ ホスファチジルコリン（ＰＣ）形成のスキーム
血小板内における重水素化標識脂肪酸（脂肪酸－Ｄ_４）を含むＰＣ形成のスキームを下記に示す。

【化71】

【0266】

（２）結果
結果は、図２および表３に示す通りであった。図２は、ＬＣ－ＭＳによる解析結果をボルケーノプロットしたものであり、重水素化標識脂肪酸（リノール酸－Ｄ_４またはリノエライジン酸－Ｄ_４）と生体内由来脂肪酸（リノール酸またはリノエライジン酸）のそれぞれの代謝プロファイルを解析するために、ｍ／ｚ １８５およびｍ／ｚ １８４のプロダクトイオンをスキャニングすることによりホスファチジルコリン（ＰＣ）の種類について網羅的に解析した結果を示す。リノール酸－Ｄ_４およびリノエライジン酸－Ｄ_４の派生物を比較した結果、生体外由来脂肪酸（重水素化標識脂肪酸）と生体内由来脂肪酸のそれぞれについてＰＣ種として１７種と３種の成分を検出した（図２の太線で囲んだ箇所）。そして、ＭＳ／ＭＳ解析を進めた結果、２０種のＰＣのうち１１種を同定した（表３、図２のナンバリングしたプロット）。プロット＃１のＰＣは、ＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノエライジン酸－Ｄ_４（トランス型））が、ＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／リノール酸－Ｄ_４（シス型））と比較して、多いことが確認された。一方で、プロット＃５では、リノール酸－Ｄ_４（シス型）が酸化されて取り込まれＰＣ（構成脂肪酸：パルミチン酸／ＨＯＤＥ－Ｄ_４）として存在することが確認された。これらの結果から、活性化された血小板ではリノエライジン酸－Ｄ_４（トランス型）とリノール酸－Ｄ_４（シス型）の代謝プロファイルは異なることが示された。

【0267】

【表3】

【0268】

例２０：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（３）
例２０では、ＰＣにリノエライジン酸－Ｄ_４が効率的に取り込まれるメカニズムについて検討した。

【0269】

（１）方法
血小板におけるシス型脂肪酸とトランス型脂肪酸の立体特異性について検討した。重水素化標識脂肪酸がＰＣにおけるグリセロール骨格のｓｎ－１位またはｓｎ－２位に結合するかを解析するために、血小板から抽出した脂質分画をホスホリパーゼＡ_１（ＰＬＡ_１）またはホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）でインキュベートした。ＰＣはＰＬＡ_１およびＰＬＡ_２によりそれぞれ２－アシル－ＬＰＣおよび１－アシル－ＬＰＣに分解される（次のスキーム参照）。

【化72】

【0270】

ＰＬＡ_１反応として、例１９（１）アに記載の方法により得た血小板由来の脂質分画を酢酸バッファー中に懸濁し、ＰＬＡ_１（アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来、Sigma）と、ジエチルエーテルを添加して、４度条件下で一晩撹拌した。１％のギ酸入りメタノールを添加し、遠心後、上清を回収した。回収した上清を固相抽出カラム（Waters）にアプライし、水とクロロホルムを用いて洗浄後、１％のギ酸入りメタノールで溶出した。ＰＬＡ₂反応として、例１９（１）アに記載の方法により得た血小板由来の脂質分画を０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むトリスバッファー中に懸濁し、ＰＬＡ₂（アピス・メリフェラ（Apis mellifera）由来、Sigma）を添加して、４度条件下で一晩撹拌した。反応液を固相抽出カラム（Waters）にアプライし、水とクロロホルムを用いて洗浄後、メタノールで溶出した。溶出して得た反応液中の２－アシル－ＬＰＣおよび１－アシル－ＬＰＣは、ＬＣ－ＭＳ装置を用いて行った。なお、ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。カプセルパックＣ１８ ＡＣＲカラム（大阪ソーダ）をＨＰＬＣカラムとして用い、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表４に示す通りであった。

【0271】

【表4】

【0272】

結果は、図３に示す通りであった。リノエライジン酸－Ｄ_４（トランス型）は、リノール酸－Ｄ_４（シス型）と比較してＰＣのｓｎ－１位とｓｎ－２位の両方で有意に多くＰＣに取り込まれることが確認された（図３Ａ）。一方、エライジン酸－Ｄ_４（トランス型）は、オレイン酸－Ｄ_４（シス型）と比較して、やや多めにＰＣに取り込まれる傾向があった（図３Ｂ）。これらの結果から、リノエライジン酸－Ｄ_４（トランス型）とエライジン酸－Ｄ_４（トランス型）の代謝プロファイルは異なり、それぞれのトランス脂肪酸の代謝プロセスはそれらの構造特性によって異なることが示唆された。

【0273】

例２１：重水素化標識脂肪酸を使用した脂質代謝解析（４）
例２１では、ＬＰＣにＨＯＤＥを転移させるアシルトランスフェラーゼの酵素活性ついて検討した。

【0274】

（１）方法
１０％の牛胎児血清を添加したＤ－ＭＥＭ（富士フィルム和光純薬）中で培養したＨＥＫ２９３細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Thermo）内にＡＧＰＡＴ２およびＡＧＰＡＴ７をクローニングして得た発現プラスミドを、リポフェクション法により導入した。リポフェクション用試薬としては、リポフェクトアミン２０００（Thermo）を用いた。４８時間後、細胞を回収し、トリスバッファー中に懸濁させ、チップ式ソニケーターで細胞を破砕することで細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を１００，０００ｇの回転速度で１時間遠心分離し、細胞膜画分を得た。３μｇのタンパク量に相当する細胞膜画分、アシルトランスフェラーゼアクセプター分子として１－アシル－パルミチン酸－ＬＰＣ（終濃度２６μＭ）と、アシルトランスフェラーゼドナー分子としてＤ４―ＨＯＤＥ―ＣｏＡ（終濃度１０μＭ）を混合した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、総脂質分画はBligh EG, et al., Can. J. BIochem. Physiol, 1959に記載の方法により抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて、反応産物を測定した。なお、ＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ_４は、オキサリルクロリドを用いてＨＯＤＥ－Ｄ_４とＣｏＡを縮合反応させることにより得た。

【0275】

動態解析（kinetic analysis）は、上記方法によって得た細胞膜画分について、０．０５μｇのタンパク量に相当する細胞膜画分、アシルトランスフェラーゼアクセプター分子として１－アシル－パルミチン酸－ＬＰＣ（終濃度１０μＭ）と、アシルトランスフェラーゼドナー分子としてＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ_４（終濃度０μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．１μＭ、０．２μＭまたは１μＭ）を混合した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、総脂質分画はBligh EG, et al., Can. J. BIochem. Physiol, 1959に記載の方法により抽出し、ＬＣ－ＭＳを用いて、反応産物を測定した。ＬＣ－ＭＳ条件は、ＬＣとして、Ultimate 3000 ultra high performance LC system（Thermo）を、ＭＳとして、Q-Exactive Orbitrap（Thermo）を用いた。InertSustainC18メタルフリーカラム（ジーエルサイエンス）をＨＰＬＣカラムとして用い、アセトニトリル、メタノール、水およびイソプロパノールから構成される移動相を用いてグラジエント溶出した。分析条件は表１と同様とした。測定結果について、Ｘ軸をＨＯＤＥ－ＣｏＡ－Ｄ_４量、Ｙ軸をｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質とするグラフ上に表記し、ミカエリス・メンテン式を用いて回帰曲線を作成することで、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘを得た。

【0276】

（２）結果
結果は、図４に示す通りであった。ＡＧＰＡＴ７は、ＡＧＰＡＴ２または対照と比較して有意に高いＨＯＤＥ－Ｄ_４転移活性を有することが確認された（図４Ａ）。また、ＡＧＰＡＴ７のＨＯＤＥ転移活性の動態解析の結果、Ｋ_ｍとＶ_ｍａｘは７１．２ｎＭと１．２５ｎｍｏｌ／分／ｍｇと算出された（図４Ｂ）。

【0277】

以上の例１８～２１の結果から、本発明の重水素化標識脂肪酸を使用して生体サンプルの脂質代謝解析が可能であることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】