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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-27
(45)【発行日】2024-03-06
(54)【発明の名称】試料中に含まれる細胞の保持方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/24 20060101AFI20240228BHJP
G01N 1/04 20060101ALI20240228BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20240228BHJP
C12M 1/26 20060101ALN20240228BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/24
G01N1/04 H
C12M1/00 A
C12M1/26
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019234568
(22)【出願日】2019-12-25
(65)【公開番号】P2021101659
(43)【公開日】2021-07-15
【審査請求日】2022-11-16
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】松永 太一
(72)【発明者】
【氏名】長岡 正人
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１４９０３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】東ソー研究・技術報告，2018年，Vol. 62，p. 89-92
【文献】東ソー研究・技術報告，2015年，Vol. 59，p. 3-9
【文献】東ソー研究・技術報告，Vol. 58，2014年，p. 3-12
【文献】化学工学，2017年，Vol. 81, No. 3，p. 126-128
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｇ０１Ｎ １／００
Ｃ１２Ｍ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を保持可能な保持部と、導入口と、排出口と、を設けた基板を備えた細胞保持装置を用いた、細胞の保持方法であって、前記細胞を含む試料を、前記導入口より前記保持部に導入する工程と、
前記細胞を前記保持部に誘電泳動力を用いて保持させる工程と、
前記導入口からミネラルオイルまたは流動パラフィンである置換溶媒を導入し、前記試料の溶媒を排出口から排出させる工程と、
を含む前記方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法で保持部に保持された細胞を解析することを特徴とする、細胞の解析方法。
【請求項3】
請求項２に記載の方法で解析された細胞をキャピラリによる吸引吐出で回収することを特徴とする、細胞の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中に含まれる細胞の保持方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ライフサイエンス研究分野では、複数の細胞種を含む試料中より、標的の細胞を、単一細胞かつ生きた状態で検出および回収することが求められる。方法の一例として、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を用いる方法が挙げられる（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２０１９－１００９４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
特許文献１に記載の基板では、細胞保持空間に誘電泳動力を発生させる目的で、保持部と並行に配置した天板面に電極を設けている。そのため、保持部に保持された標的細胞をキャピラリ等による吸引で回収しようとする際、電極（天板）を外す工程が必要であり、当該工程で発生する振動等により保持部に保持された細胞が当該保持部外または別の保持部へ移動してしまうという課題があった。
さらに前述した方法では、細胞の生死にかかわらず保持部に保持されるため、生細胞を検出および回収しようする際、死細胞が混入する課題もあった。
本発明の目的は、死細胞の混入を抑え、かつ細胞の保持部への保持状態を安定的に維持することにある。
さらに前述した方法では、細胞の生死にかかわらず保持部に保持されるため、生細胞を検出および回収しようする際、死細胞が混入する課題もあった。
本発明の目的は、死細胞の混入を抑え、かつ細胞の保持部への保持状態を安定的に維持することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【0006】
すなわち本発明の一態様は、
細胞を保持可能な保持部と、導入口と、排出口と、を設けた基板を備えた細胞保持装置を用いた、細胞の保持方法であって、前記細胞を含む試料を、前記導入口より前記保持部に導入する工程と、前記細胞を前記保持部に保持させる工程と、前記導入口から置換溶媒を導入し、前記試料の溶媒を排出口から排出させる工程と、を含むことを特徴とする。
細胞を保持可能な保持部と、導入口と、排出口と、を設けた基板を備えた細胞保持装置を用いた、細胞の保持方法であって、前記細胞を含む試料を、前記導入口より前記保持部に導入する工程と、前記細胞を前記保持部に保持させる工程と、前記導入口から置換溶媒を導入し、前記試料の溶媒を排出口から排出させる工程と、を含むことを特徴とする。
【0007】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】
保持部に保持する細胞の一例として、ヒト由来の人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）もしくは胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）またはこれら細胞由来の分化細胞、ヒト由来の間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ細胞）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が挙げられる。
【0009】
細胞保持装置は、細胞を保持可能な保持部と、導入口と、排出口と、を設けた基板を備える。保持部は、凹部または貫通孔を有した形状であり、凹部を保持部とした場合、一端が保持させる細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有しており他端が底部を形成している態様とし、貫通孔を保持部とした場合、一端が保持させる細胞の全て、またはその一部を保持可能な大きさの開口部を有し他端が当該開口部よりも狭い開口部とするか、両端が保持させる細胞の一部を保持可能な大きさの開口部である態様とする。なお保持部の大きさ（径）を保持させる細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、検出した細胞の一細胞単位での回収および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。
導入口と排出口は、その形状や大きさに特に制限はないが、基板上で対極に位置するように配置されていることが好ましい。
導入口と排出口は、その形状や大きさに特に制限はないが、基板上で対極に位置するように配置されていることが好ましい。
【0010】
細胞を含む試料に用いられる溶媒は、細胞に対して等張かつ当該細胞の生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を維持可能な溶媒であれば特に限定はなく、一例として生理食塩水や、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液や、前記細胞の培養に用いた培養液が挙げられる。特に細胞を含む液体として、スクロースを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するスクロースの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２００ｍＭ以上３５０ｍＭ以下とするとよい。さらに前記細胞がＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞）といった血液中に含まれ得る細胞である場合、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの血液試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの血液成分を含み得る試料も、本発明における試料溶媒に含まれる。
【0011】
導入した試料中に含まれる細胞を保持部に保持させる方法は特に限定がなく、単に導入口から細胞を含む試料を導入するだけでもよいし、細胞を含む試料を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に当該細胞を保持させてもよい。中でも細胞を含む試料を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ当該細胞を保持させると、細胞を保持部へ効率的に保持できる点で好ましい。いずれの方法であっても、細胞は保持部に固定されているわけではなく、保持部内で沈降している状態である。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動力を発生させ、保持部に細胞を保持さればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ以下の間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２－０１３５４９号公報参照）。好ましい基板の一態様として、後述する図１および図２に示す基板１００や、特開２０１９－１００９４０号公報に開示の基板が挙げられる。
【0012】
置換溶媒は、前記試料溶媒とは異なり、試料中の細胞よりも密度が小さく、かつ動粘度が高い、具体的には３ｍｍ２／ｓ（３ｃＳｔ）以上の溶媒である。好ましい例としてミネラルオイル、流動パラフィン、パルミチン酸イソプロピルが挙げられる。
【0013】
置換溶媒は、基板の導入口から導入すれば、保持部内にある試料溶媒は押し出され、排出口から排出されるため、保持部内の溶媒が試料溶媒から置換溶媒へと置き換わる。導入する置換溶媒の量は、保持部の容積を考慮して十分な量を導入することが好ましい。
【0014】
保持部に保持された細胞は、当該細胞が有する特性に基づき検出を行うことが可能である。例えば、細胞の大きさや、細胞内に存在する顆粒もしくは小器官の存否などに基づき検出しても良く、抗体、アプタマー、タンパクリガンドなどによる標識や細胞核染色試薬などによる染色後、当該標識や染色像に基づき検出しても良い。細胞核染色試薬の好ましい例として、細胞膜を透過可能なＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）が挙げられる。検出対象細胞か否かの指標は、明確な数値で決定する必要はなく、例えば、検出対象細胞の画像データ（明視野像、標識像、染色試薬像）を教師データとした、人工知能（ＡＩ）による判定を行なってもよい。
【0015】
前述した方法で試料中に含まれる細胞を検出した後、検出した前記細胞をキャピラリによる吸引吐出で回収することで、試料中に含まれる特定細胞を一細胞単位で回収できる。前記キャピラリは、特定細胞の一細胞単位での回収が可能な態様であれば特に限定はなく、一例としてナノピペット、ピコピペット、ガラスキャピラリや特開２０１６－１４２６１６号公報に開示の微小粒子回収装置が挙げられる。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、試料中に含まれる死細胞を選択的に除去でき、かつ保持部への細胞保持状態を維持できるため、保持部に保持された細胞の検出および回収が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明の方法を実施可能な装置を構成する基板の一例を示した図（分解図）である。
【図4】実施例１の結果を示した図である。
【図5】実施例２の結果を示した図である。
【図6】実施例３の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
【0019】
図１に示す基板１００は、
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極２１・２２と、
電極２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞２００が導入される。電極２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞２００を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部５０に保持した細胞２００の回収を容易にするため、電極２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極２１・２２と、
電極２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞２００が導入される。電極２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞２００を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部５０に保持した細胞２００の回収を容易にするため、電極２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。
【0020】
【0021】
（１－１）細胞を標識する工程
検出対象細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を含む溶液を試料に添加することで、当該細胞と前記標識タンパク質との複合体を形成させる。
検出対象細胞が有するタンパク質を認識する標識タンパク質を含む溶液を試料に添加することで、当該細胞と前記標識タンパク質との複合体を形成させる。
【0022】
（１－２）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから、標識タンパク質３００と結合した検出対象細胞２１０および夾雑細胞２２０を含む試料を導入し、誘電泳動力６０を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。具体的には、信号発生器４０から電極２１・２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６０を発生させ、保持部５０へ検出対象細胞２１０および夾雑細胞２２０を導入する。信号発生器４０から電極２１・２２へ印加する交流電圧は、保持部５０に保持された細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ以下とし、電界強度を１×１０５以上５×１０５Ｖ／ｍ以下と特に好ましい。
図１に示す基板１００に設けた導入口１３ａから、標識タンパク質３００と結合した検出対象細胞２１０および夾雑細胞２２０を含む試料を導入し、誘電泳動力６０を利用してこれら細胞を保持部５０へ導入させる。具体的には、信号発生器４０から電極２１・２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６０を発生させ、保持部５０へ検出対象細胞２１０および夾雑細胞２２０を導入する。信号発生器４０から電極２１・２２へ印加する交流電圧は、保持部５０に保持された細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ以下とし、電界強度を１×１０５以上５×１０５Ｖ／ｍ以下と特に好ましい。
【0023】
（１－３）溶媒置換工程
導入口１３ａから、置換溶媒を導入することで、排出口１３ｂより残存試料が排出され、共に保持部５０内空間を置換溶媒で置換される。本工程により、検出対象細胞２１０のうち死細胞を選択的に除去できる。
導入口１３ａから、置換溶媒を導入することで、排出口１３ｂより残存試料が排出され、共に保持部５０内空間を置換溶媒で置換される。本工程により、検出対象細胞２１０のうち死細胞を選択的に除去できる。
【0024】
（１－４）検出対象細胞２１０を検出する工程
基板を移動させる手段（図示せず）で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部４００および計測部により、検出対象細胞２１０に結合した標識タンパク質由来の蛍光または発光および位置情報を取得し、検出対象細胞２１０の位置を検出する。
基板を移動させる手段（図示せず）で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部４００および計測部により、検出対象細胞２１０に結合した標識タンパク質由来の蛍光または発光および位置情報を取得し、検出対象細胞２１０の位置を検出する。
【0025】
（１－５）検出対象細胞２１０を回収する工程
検出部４００および計測部により検出した検出対象細胞２１０を回収するために、電極２２をスペーサ１３から取り外した後、キャピラリ５００で吸引することで、基板１００から検出対象細胞２１０を回収する。電極２２を取り外す際は、スペーサ１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１３が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、検出対象細胞２１０が破壊されるからである。
検出対象細胞２１０の吸引は、基板を移動させる手段およびノズルを移動させる手段（ともに図示せず）を用いて前記（１－３）の工程で検出した検出対象細胞２１０が保持されている保持部へキャピラリ５００の中心を移動させ、キャピラリ５００により液を吸引することで検出対象細胞２１０を回収する。なお、キャピラリ５００による検出対象細胞２１０の吸引位置を、検出対象細胞２１０を保持した保持部５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、検出対象細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には検出対象細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部５０の高さから垂直方向に保持部５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。
検出部４００および計測部により検出した検出対象細胞２１０を回収するために、電極２２をスペーサ１３から取り外した後、キャピラリ５００で吸引することで、基板１００から検出対象細胞２１０を回収する。電極２２を取り外す際は、スペーサ１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１３が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、検出対象細胞２１０が破壊されるからである。
検出対象細胞２１０の吸引は、基板を移動させる手段およびノズルを移動させる手段（ともに図示せず）を用いて前記（１－３）の工程で検出した検出対象細胞２１０が保持されている保持部へキャピラリ５００の中心を移動させ、キャピラリ５００により液を吸引することで検出対象細胞２１０を回収する。なお、キャピラリ５００による検出対象細胞２１０の吸引位置を、検出対象細胞２１０を保持した保持部５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、検出対象細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には検出対象細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部５０の高さから垂直方向に保持部５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。
【実施例】
【0026】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【0027】
実施例１ 溶媒置換による死細胞除去効果
（１）ｉＰＳ細胞の調製
（１－１）ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパン社製）を、ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ社製）をコートしたポリスチレンプレート（培養基材）上で、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて培養した。
（１－２）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）との混合液を添加し、１０分間３７℃で静置することによって、培養基材よりｉＰＳ細胞を剥離した。
（１－３）剥離したｉＰＳ細胞を、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地にＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製：濃度１０μＭ）を添加した培地（以下、ＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地）で回収した（ｉＰＳ細胞サンプル）。
（１）ｉＰＳ細胞の調製
（１－１）ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパン社製）を、ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ社製）をコートしたポリスチレンプレート（培養基材）上で、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて培養した。
（１－２）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）との混合液を添加し、１０分間３７℃で静置することによって、培養基材よりｉＰＳ細胞を剥離した。
（１－３）剥離したｉＰＳ細胞を、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地にＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製：濃度１０μＭ）を添加した培地（以下、ＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地）で回収した（ｉＰＳ細胞サンプル）。
【0028】
（２）蛍光標識による染色
（２－１）（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」を、細胞核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（富士フイルム和光純薬社製、１：５００）と死細胞染色試薬であるＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、１：２０００）とを含むＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地に３０分間室温で浸し染色した。
（２－２）染色後、２５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ（富士フイルム和光純薬社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、同仁化学研究所社製）および１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ社製）を含む電気伝導度の低い等張液（以下、ＤＥＰＢ１）を添加し、遠心分離（１６０×ｇ、５分間）した。
（２－３）上清を除去し、新たにＤＥＰＢ１を添加して遠心分離する操作を２回繰り返することで洗浄作業を行ない、得られたペレットをＤＥＰＢ１に懸濁させた。
（２－１）（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」を、細胞核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（富士フイルム和光純薬社製、１：５００）と死細胞染色試薬であるＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、１：２０００）とを含むＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地に３０分間室温で浸し染色した。
（２－２）染色後、２５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ（富士フイルム和光純薬社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、同仁化学研究所社製）および１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ社製）を含む電気伝導度の低い等張液（以下、ＤＥＰＢ１）を添加し、遠心分離（１６０×ｇ、５分間）した。
（２－３）上清を除去し、新たにＤＥＰＢ１を添加して遠心分離する操作を２回繰り返することで洗浄作業を行ない、得られたペレットをＤＥＰＢ１に懸濁させた。
【0029】
（３）誘電泳動の実施と溶媒置換前の細胞画像取得
（３－１）図１および図２に示す構成からなる基板１００に（２－３）で得られた懸濁液を導入した。本実施例で用いた基板１００が有する細胞保持手段１０には、直径３０μｍ、深さ４０μｍの保持部５０を中心間距離５０μｍの間隔で格子状に設けている。
（３－２）信号発生器４０より周波数１ＫＨｚの交流電圧を、電極２１・２２に１０分間印加することで、誘電泳動力を用いた保持部５０への細胞保持を行なった。
（３－３）保持部５０に保持された細胞の有する蛍光（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。
（３－１）図１および図２に示す構成からなる基板１００に（２－３）で得られた懸濁液を導入した。本実施例で用いた基板１００が有する細胞保持手段１０には、直径３０μｍ、深さ４０μｍの保持部５０を中心間距離５０μｍの間隔で格子状に設けている。
（３－２）信号発生器４０より周波数１ＫＨｚの交流電圧を、電極２１・２２に１０分間印加することで、誘電泳動力を用いた保持部５０への細胞保持を行なった。
（３－３）保持部５０に保持された細胞の有する蛍光（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。
【0030】
（４）溶媒置換
基板１００が有する導入口１３ａからＤＥＰＢ１またはミネラルオイル（Ｍｅｒｃｋ社製）を導入し、排出口１３ｂから基板内余剰溶液を排出することで、保持部５０を含む基板内空間の溶液全てを置換した。
基板１００が有する導入口１３ａからＤＥＰＢ１またはミネラルオイル（Ｍｅｒｃｋ社製）を導入し、排出口１３ｂから基板内余剰溶液を排出することで、保持部５０を含む基板内空間の溶液全てを置換した。
【0031】
（５）溶媒置換後の細胞画像取得
保持部５０に保持された細胞の有する蛍光（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。
保持部５０に保持された細胞の有する蛍光（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２およびＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス社製）を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。
【0032】
（６）溶媒置換前後での細胞の移動率算出
（３）および（５）で取得した細胞数を比較し、以下に示す除去率を算出した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２陽性の細胞は生細胞を示し、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ陽性の細胞は、死細胞を示す。
除去率［％］＝１００×［１－｛（５）溶媒置換後の細胞数／（３）溶媒置換前の細胞数｝］
結果を図５に示す。（４）の溶媒置換をミネラルオイルで行なうことで、死細胞を選択的に除去できた（死細胞除去率：２７．６１％、生細胞除去率：３．１３％）。一方、ＤＥＰＢ１で溶媒置換したときは、死細胞、生細胞ともほとんど除去されなかった（死細胞除去率：０．５９％、生細胞除去率：０．２４％）。
（３）および（５）で取得した細胞数を比較し、以下に示す除去率を算出した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２陽性の細胞は生細胞を示し、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ陽性の細胞は、死細胞を示す。
除去率［％］＝１００×［１－｛（５）溶媒置換後の細胞数／（３）溶媒置換前の細胞数｝］
結果を図５に示す。（４）の溶媒置換をミネラルオイルで行なうことで、死細胞を選択的に除去できた（死細胞除去率：２７．６１％、生細胞除去率：３．１３％）。一方、ＤＥＰＢ１で溶媒置換したときは、死細胞、生細胞ともほとんど除去されなかった（死細胞除去率：０．５９％、生細胞除去率：０．２４％）。
【0033】
実施例２ 溶媒置換による保持部への細胞保持効果
（１）ＭＣＲ－５細胞の調製
ｉＰＳ細胞よりサイズの大きな細胞としてＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児肺由来線維芽細胞：ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）（直径３０μｍ程度）を選択した。ＭＲＣ－５細胞を、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて培養後、実施例１（１－２）と同様な方法で剥離し、実施例１（１－３）と同様な方法で回収した（ＭＲＣ－５細胞サンプル）。
（１）ＭＣＲ－５細胞の調製
ｉＰＳ細胞よりサイズの大きな細胞としてＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児肺由来線維芽細胞：ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）（直径３０μｍ程度）を選択した。ＭＲＣ－５細胞を、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（富士フイルム和光純薬社製）を用いて培養後、実施例１（１－２）と同様な方法で剥離し、実施例１（１－３）と同様な方法で回収した（ＭＲＣ－５細胞サンプル）。
【0034】
（２）細胞核染色試薬による染色
（２－１）実施例１（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」または本実施例（１）で作製した「ＭＲＣ－５細胞サンプル」を、細胞核染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）を含むＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地に３０分間室温で浸すことで染色した。
（２－２）染色操作後、ＤＥＰＢ１を添加し、遠心分離（１６０×ｇ、５分間）した。
（２－３）上清を除去し、新たにＤＥＰＢ１を添加して遠心分離する操作を２回繰り返することで洗浄作業を行ない、得られたペレットをＤＥＰＢ１に懸濁させた。
（２－１）実施例１（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」または本実施例（１）で作製した「ＭＲＣ－５細胞サンプル」を、細胞核染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）を含むＳｔｅｍＦ＋Ｙ培地に３０分間室温で浸すことで染色した。
（２－２）染色操作後、ＤＥＰＢ１を添加し、遠心分離（１６０×ｇ、５分間）した。
（２－３）上清を除去し、新たにＤＥＰＢ１を添加して遠心分離する操作を２回繰り返することで洗浄作業を行ない、得られたペレットをＤＥＰＢ１に懸濁させた。
【0035】
（３）保持部への細胞保持
（３－１）図１および図２に示す基板１００に（３）で得られた懸濁液を導入した。前記基板１００は、直径３０μｍ、深さ４０μｍの保持部５０を中心間距離５０μｍの間隔で格子状に設けている。
（３－２）信号発生器４０より周波数１ＫＨｚの交流電圧を、電極２１・２２に１０分間印加することで、誘電泳動力を用いた保持部５０への細胞保持を行なった。
（３－１）図１および図２に示す基板１００に（３）で得られた懸濁液を導入した。前記基板１００は、直径３０μｍ、深さ４０μｍの保持部５０を中心間距離５０μｍの間隔で格子状に設けている。
（３－２）信号発生器４０より周波数１ＫＨｚの交流電圧を、電極２１・２２に１０分間印加することで、誘電泳動力を用いた保持部５０への細胞保持を行なった。
【0036】
（４）溶媒置換
基板１００に設けた導入口１３ａから、ＤＥＰＢ１またはミネラルオイル（Ｍｅｒｃｋ社製）を導入し、排出口１３ｂから余剰溶液を排出することによって保持部５０内空間の溶媒を置換した。
基板１００に設けた導入口１３ａから、ＤＥＰＢ１またはミネラルオイル（Ｍｅｒｃｋ社製）を導入し、排出口１３ｂから余剰溶液を排出することによって保持部５０内空間の溶媒を置換した。
【0037】
（５）細胞画像取得
保持部５０に保持された細胞が有する、細胞核染色試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）由来の蛍光を、蛍光顕微鏡を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。当該撮影後、電極２２を除去し、再び蛍光顕微鏡を用いて蛍光染色画像を撮影した。電極２２除去前後における細胞の位置を比較し、以下に示す式で移動率を算出した。
移動率［％］＝１００×［１－｛電極除去前後で位置が移動しなかった細胞数／電極除去前で検出した細胞数｝］
結果を図６に示す。（４）の溶媒置換をＤＥＰＢ１で行なったとき、電極２２除去操作により、ｉＰＳ細胞では３．７９％が、ＭＲＣ－５細胞では２３．６５％が、それぞれ移動した。一方、（４）の溶媒置換をミネラルオイルで行なったときは、電極２２除去操作を行なっても、ｉＰＳ細胞で０．１％、ＭＲＣ－５細胞で１．６７％と、ほとんど移動しなかった。
保持部５０に保持された細胞が有する、細胞核染色試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）由来の蛍光を、蛍光顕微鏡を用いてＣＭＯＳカメラで撮影した。当該撮影後、電極２２を除去し、再び蛍光顕微鏡を用いて蛍光染色画像を撮影した。電極２２除去前後における細胞の位置を比較し、以下に示す式で移動率を算出した。
移動率［％］＝１００×［１－｛電極除去前後で位置が移動しなかった細胞数／電極除去前で検出した細胞数｝］
結果を図６に示す。（４）の溶媒置換をＤＥＰＢ１で行なったとき、電極２２除去操作により、ｉＰＳ細胞では３．７９％が、ＭＲＣ－５細胞では２３．６５％が、それぞれ移動した。一方、（４）の溶媒置換をミネラルオイルで行なったときは、電極２２除去操作を行なっても、ｉＰＳ細胞で０．１％、ＭＲＣ－５細胞で１．６７％と、ほとんど移動しなかった。
【0038】
実施例３ 天板除去に伴う細胞の移動率に対する流動パラフィン置換の効果
（１）実施例１（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」を、実施例２（２）に記載の方法で細胞核染色試薬で染色し、実施例２（３）に記載の方法で保持部へ細胞を保持させた。
（２）置換溶媒を、２５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社製）および１％（ｖ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ―６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を含む電気伝導度の低い等張液（以下、ＤＥＰＢ２）、または流動パラフィン（低粘度タイプ：ナカライテスク社製）とした他は、実施例２（４）と同様な方法で溶媒置換した。
（３）実施例２（５）と同様な方法で、電極２２除去前後の蛍光画像を取得し、移動率を算出した。
結果を図７に示す。（２）の溶媒置換をＤＥＰＢ２で行なったとき、電極２２除去操作により６．６５％が移動していたが、（２）の溶媒置換を流動パラフィンで行なったときは、電極２２除去操作を行なっても移動率は０．１５％であった。
（１）実施例１（１）で作製した「ｉＰＳ細胞サンプル」を、実施例２（２）に記載の方法で細胞核染色試薬で染色し、実施例２（３）に記載の方法で保持部へ細胞を保持させた。
（２）置換溶媒を、２５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社製）および１％（ｖ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ―６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を含む電気伝導度の低い等張液（以下、ＤＥＰＢ２）、または流動パラフィン（低粘度タイプ：ナカライテスク社製）とした他は、実施例２（４）と同様な方法で溶媒置換した。
（３）実施例２（５）と同様な方法で、電極２２除去前後の蛍光画像を取得し、移動率を算出した。
結果を図７に示す。（２）の溶媒置換をＤＥＰＢ２で行なったとき、電極２２除去操作により６．６５％が移動していたが、（２）の溶媒置換を流動パラフィンで行なったときは、電極２２除去操作を行なっても移動率は０．１５％であった。
【符号の説明】
【0039】
１００：基板
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器（交流電圧）
５０：保持部
６０：誘電泳動力
２００：細胞
２１０：検出対象細胞
２２０：夾雑細胞
３００：標識タンパク質
４００：検出部（蛍光顕微鏡）
５００：キャピラリ
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器（交流電圧）
５０：保持部
６０：誘電泳動力
２００：細胞
２１０：検出対象細胞
２２０：夾雑細胞
３００：標識タンパク質
４００：検出部（蛍光顕微鏡）
５００：キャピラリ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
